JP6320375B2 - Jcウイルスのvp1タンパク質に対するヒトモノクローナル抗体 - Google Patents
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Description
以前に記載された方法(Plaisant、P.ら、ファージディスプレイコンビナトリアルベクターへのレパートリークローニングにより得られたHCV抗原に特異的なヒトモノクローナル組換えFabs(Human monoclonal recombinant Fabs specific for HCV antigens obtained by repertoire cloning in phage display combinatorial vectors).Res Virol、1997.148(2):165〜9頁)に類似した方法により、IgG1/kアイソタイプの、及び2×107エレメントの推定サイズを有するヒト抗体断片(一価Fab)のコンビナトリアルファージディスプレイライブラリーを、pPDファージミドベクターに構築した。ライブラリーは、ELISAによる抗VP1/JCV抗体の存在試験で血清が陽性を示した68歳男性の骨髄から生成した。ELISAは、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中100ng/ウェルの組換えJCV VP1タンパク質(Mad1、Abcam(登録商標))で96ウェルプレートをコーティングして実行した。幾つかの血清希釈液をVP1コートプレートに2連で添加した。プレートを37℃で1時間インキュベートし、次いで0.1%PBS/TWEEN 20で洗浄した。結合抗体を、ペルオキシダーゼ(HRP)とコンジュゲートした抗ヒトIgG1抗体(Sigma−Aldrich(登録商標))により検出した。
抗体の中和活性は、免疫蛍光により評価した。簡単に言えば、免疫蛍光を感染後6日で行った。スライドは、製造者のガイドラインに従って、メタノール/アセトン混合物(1:1比)で細胞を15分間室温で固定し、及び市販のAbcam(登録商標)マウス抗VP1抗体(1μg/ml)を一次抗体として、FITCコンジュゲートマウス抗Fab(Sigma−Aldrich(登録商標))を二次抗体として用いて調製した。
本発明の抗JCV VP1 GRE1抗体を免疫蛍光及び免疫組織化学アッセイで使用することにより、JCVの存在を生検試料において判定することができる。この抗体は、JCV VP1タンパク質に対する高い感受性及び特異性を実際に示したが、反対にBKV VP1に対する反応性を示さなかった。
ヒト抗JCV VP1 GRE1抗体を用いてELISAアッセイを行うために、ELISAプレート(Costar(登録商標))を、PBS中40ngのヒツジ抗ヒトFd抗体を含有する溶液25μl/ウェルで被覆し(1.6μg/ml最終濃度)、4℃で一晩インキュベートする。翌日、プレートを水で洗浄し、37℃で1時間、PBS−1%BSA(w/v)でブロックする。その後、40μlのGRE1(PBS/1% BSA中最終濃度約4ng/μl)をウェルごとに添加し、プレートを次いで37℃で1時間インキュベートする。ELISAマイクロプレート用の自動洗浄機(ETI−System Kasher、DiaSorin)により、PBS−0.1%Tween 20(Sigma−Aldrich(登録商標))で5回洗浄を行った後、試験生体試料の幾つかの希釈液(無希釈から開始して1:1000希釈までの、連続10倍希釈液)40μlを各ウェルに添加する。プレートを次いで37℃で1時間インキュベートする。以前に記載されているように数回洗浄を行った後、市販のマウス抗VP1抗体(PBS/BSAに希釈したAbcam(登録商標))の1:1000希釈液40μlを各ウェルに添加する。プレートを37℃で1時間休ませる。さらに洗浄後、マウスIgGのFc部分を結合し、西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートするヤギ抗体のポリクローナル調製物(ヤギで産生された抗マウスIgG(Fc特異的)−ペルオキシダーゼ抗体、Sigma−Aldrich(登録商標))40μl/ウェルを添加する。プレートを37℃で45分間インキュベートする。以前に記載されているようにPBS−Tween20による5回の洗浄を行った後、生じる酵素反応に対して40μlの基質(H2O2及び3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジンの1:1溶液、TMB基質キット、Thermo Scientific)を各ウェルに添加する。約15分後、40μl/ウェルの1N H2SO4(Carlo Erba)を添加して酵素活性をブロックし、比色反応を分光光度計(Model 680 Microplate Reader、Bio−Rad)により450nmの波長で測定する。
GRE1モノクローナル抗体により認識されるエピトープの(線形又は立体構造的)性質の定義
GRE1モノクローナル抗体により認識されるエピトープの(線形又は立体構造的)性質を定義するために、ウエスタンブロット及びDot Blotアッセイを変性タンパク質及び野生型タンパク質の両方で行った。
人を感染させることができる主なポリオーマウイルスであるBKウイルスゲノム(BKV)とJCVゲノムの高いヌクレオチド配列相同性(約70%)は、文献に広範囲に記載されている。
2つのタンパク質間の大きな違い(電荷及び極性などの)を示し、及び本発明の抗体が2つのタンパク質に対して有する結合差に関与し得る残基を有する部分を同定するために、JCV VP1及びBKV VP1タンパク質のアミノ酸配列をClustalXプログラムにより整列させた。JCVとBKV VP1間で(電荷及び極性に関して)完全に異なる33個のアミノ酸残基をこの分析により同定した。
生体試料中(特に、脳脊髄液、血清、又は血漿中、ただしこれらに限定されない)の中和抗体の存在を判定するために、GRE1(中和抗体)により認識されるエピトープをELISAアッセイで使用した。迅速及び効果的な検出システムのセットアップは、2つの戦略を用いて行った。これらの一方は、競合ELISAアッセイを試料及びGRE1で行い、他方は、中和抗体により依然として認識され得るVP1の最小部分(元のタンパク質の50位と140位の間の残基を含む)を抗原として使用する。後者のアッセイの変形もセットアップし、GRE1により認識される部分とは異なるVP1部分を認識することができる抗体を反応からより効果的に取り去るために、試験生体試料を、GRE1により認識される残基でのみ変異されているVP1と液相で競合するように作製した。
試験生体試料中の他のヒト抗体とGRE1を区別するために、西洋ワサビペルオキシダーゼ(Sigma−Aldrich(登録商標))とコンジュゲートした市販のモノクローナル抗体FLAG(登録商標)M2によってのみ認識されるように、GRE1をアミノ酸配列DYKDDDDKとの遺伝子発現融合の方法により標識した。
GRE1モノクローナル抗体により認識されるエピトープを含有し、及びさらに立体構造的特徴を保持するVP1の最小部分を判定するために、Mad1株JCV由来のVP1をコードするヌクレオチド配列を、ランダムに切断されたVP1配列を得るようにDNaseで消化した。該モノクローナル抗体により依然として認識されるVP1部分を、GRE1に対するバイオパニングにより選択するために、様々なVP1部分をファージミドにクローニングした。GRE1により依然として認識される部分が決定されたら、該断片を特定のソフトウェアにより分析して立体構造をインシリコで決定し、これを完全長VP1タンパク質の立体構造と場合により比較した。
以前のアッセイのストリンジェンシーを増加させるために、タンパク質へのGRE1の結合に重要である残基において変異されたVP1と試験試料をプレインキュベートするステップを加えて、別のバージョンの実験をセットアップした。
Claims (13)
- JCウイルスを中和できる、JCウイルスのVP1タンパク質に対するヒトモノクローナル抗体であって、
少なくとも1つの重鎖可変領域及び少なくとも1つの軽鎖可変領域を含み、
前記重鎖可変領域が配列番号1の配列を有し、前記軽鎖可変領域が配列番号2の配列を有し、又は
前記重鎖可変領域が配列番号3の配列によりコードされ、前記軽鎖可変領域が配列番号4の配列によりコードされる、
上記抗体。 - 完全長免疫グロブリン、又は
Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv及び一本鎖抗体(scFv)からなる群から選択される機能的免疫グロブリン断片である、
請求項1に記載のヒトモノクローナル抗体。 - JCV感染症又はJCV感染症に関連する疾患の治療剤又は予防剤の製造における、請求項1又は2に記載のヒトモノクローナル抗体の使用。
- JCV感染症に関連する疾患が進行性多巣性白質脳症(PML)である、請求項3に記載の使用。
- 請求項1又は2に記載のモノクローナル抗体を含む医薬組成物。
- JCV感染症又はJCV感染症に関連する疾患の治療的又は予防的処置において使用するための、請求項5に記載の医薬組成物。
- JCV感染症に関連する疾患が進行性多巣性白質脳症(PML)である、請求項6に記載の使用のための医薬組成物。
- JCV感染症又はJCV感染症に関連する疾患の診断を補助するための、インビトロの方法であって、
請求項1又は2に記載のモノクローナル抗体と、JCVによる感染が疑われる患者から単離された生体試料を接触させるステップと、
JCV VP1抗原に対する前記モノクローナル抗体の結合を検出するステップと
を含む、上記方法。 - JCV感染症に関連する疾患が進行性多巣性白質脳症(PML)である、請求項8に記載の方法。
- 免疫学的ELISAアッセイ又は免疫学的蛍光アッセイ又は免疫組織化学アッセイである、請求項8又は9に記載の方法。
- JCV感染症又はJCV感染症に関連する疾患を診断するための免疫診断キットであって、請求項1又は2に記載のモノクローナル抗体、及びインビトロ免疫診断方法を行うための指示書を含む上記キット。
- JCV感染症に関連する疾患が進行性多巣性白質脳症(PML)である、請求項11に記載のキット。
- JCV感染症に罹患しているヒト患者におけるJCVウイルスを中和するための医薬組成物であって、請求項1又は2に記載のモノクローナル抗体の有効量を含む上記医薬組成物。
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