CN116063470A - 一种对SARS-CoV-2变异株具有高亲和力的抗体 - Google Patents

一种对SARS-CoV-2变异株具有高亲和力的抗体 Download PDF

Info

Publication number
CN116063470A
CN116063470A CN202211252543.3A CN202211252543A CN116063470A CN 116063470 A CN116063470 A CN 116063470A CN 202211252543 A CN202211252543 A CN 202211252543A CN 116063470 A CN116063470 A CN 116063470A
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
cov
sars
antigen
fragment
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202211252543.3A
Other languages
English (en)
Inventor
王双
王荣娟
焦莎莎
陈奔
蒋雯
张锦超
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Maiwei Shanghai Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Maiwei Shanghai Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Maiwei Shanghai Biotechnology Co ltd filed Critical Maiwei Shanghai Biotechnology Co ltd
Publication of CN116063470A publication Critical patent/CN116063470A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本公开提供一种提高抗SARS‑CoV‑2抗体对SARS‑CoV‑2突变株结合能力的方法，包括：(1)对抗SARS‑CoV‑2抗体与抗原晶体复合物结构进行解析，确定抗原上与抗SARS‑CoV‑2抗体作用的位点、以及抗SARS‑CoV‑2抗体上与抗原作用的位点；(2)根据已有的SARS‑CoV‑2的自然突变位点，选择在抗原上的作用位点不易产生自然突变的抗SARS‑CoV‑2抗体作为出发抗体；(3)对可能与SARS‑CoV‑2的自然突变位点相互作用的抗SARS‑CoV‑2抗体上的位点进行突变；(4)选择与出发抗体相比，对SARS‑CoV‑2突变株结和力提高的突变抗体。

Description

一种对SARS-CoV-2变异株具有高亲和力的抗体
技术领域
本发明属于抗体工程领域，具体涉及一种针对冠状病毒的治疗性单抗，特别是涉及一种对抗SARS-CoV-2单抗进行突变、以提高对变异毒株亲和力的方法及获得的抗SARS-CoV-2单抗突变株。
背景技术
目前对于新型冠状病毒所致疾病没有特异治疗方法，需根据患者临床情况进行治疗。《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案(试行第五版)》公布，在重型、危重型病人治疗的其他治疗措施中，可采用恢复期血浆治疗。康复者血浆主要用于病情进展较快、重症、危重症新冠肺炎患者。原则上病程不超过3周；新冠病毒核酸检测阳性或临床专家判定患者存在病毒血症，在病情急性进展期应当尽早使用。尽管康复患者血浆疗法在临床上取得了一定的成效，然而由于抗原患者血浆来源有限、纯化抗体安全隐患高、特异性抗体效价不稳定。效价高、性能稳定、安全性好的单克隆抗体对于控制新冠状病毒疫情具有良好的应用前景。
目前现有文献已经公开或教导了针对新冠病毒RBD制备保护性中和单抗的报道。利用新冠病毒刺突蛋白RBD产生抗新冠病毒的保护性中和抗体已开始陆续进入临床。
尽管抗SARS-CoV-2中和性抗体药物的研究取得了很大的进展，但 SARS-CoV-2的变异速度快，《病毒学报》2月8日发布的一项新的研究显示，新型冠状病毒自流行至今，已演变出800余个不同亚型或分支。 SARS-CoV-2的不断变异导致中和性抗体的预防和治疗效果具有不稳定性，特别是SARS-CoV-2S蛋白关键位点的突变，容易导致目前针对S蛋白的中和性抗体对SARS-CoV-2的中和活性降低甚至丧失。
由此，对于变异速度快速的SARS-CoV-2具有良好治疗效果的中和性抗体药物有待研究。
发明内容
为解决上述问题，本公开提供一种提高抗SARS-CoV-2抗体对SARS-CoV-2 突变株结合能力的方法，包括：(1)对抗SARS-CoV-2抗体与抗原晶体复合物结构进行解析，确定抗原上与抗SARS-CoV-2抗体作用的位点、以及抗 SARS-CoV-2抗体上与抗原作用的位点；(2)根据已有的SARS-CoV-2的自然突变位点，选择在抗原上的作用位点不易产生自然突变的抗SARS-CoV-2抗体作为出发抗体；(3)对可能与SARS-CoV-2的自然突变位点相互作用的抗SARS-CoV-2抗体上的位点进行突变；(4)选择与出发抗体相比，对SARS-CoV-2 突变株结和力提高的突变抗体。本公开所述方法能够从根据最初的SARS-CoV-2 野生株制备的抗SARS-CoV-2抗体中，通过选择、突变快速获得对SARS-CoV-2 突变株具有高亲和力、高中和活性的新抗体。具体而言：
一方面，本发明提供一种提高抗SARS-CoV-2抗体或其片段对SARS-CoV-2 突变株结合能力的方法，包括：
(1)将候选抗SARS-CoV-2抗体或其片段与抗原的晶体复合物结合得到抗原抗体晶体复合物，并对所述抗原抗体晶体复合物进行结构解析，确定所述抗原上与所述候选抗SARS-CoV-2抗体或其片段作用的位点、以及所述候选抗 SARS-CoV-2抗体或其片段上与所述抗原作用的位点；
(2)根据已有的SARS-CoV-2的自然突变位点，选择在抗原上的作用位点不易产生自然突变的候选抗SARS-CoV-2抗体或其片段作为出发抗体或其片段；
(3)对可能与SARS-CoV-2的自然突变位点相互作用的出发抗体或其片段上的位点进行突变，以便得到突变后抗体或其片段；
(4)筛选与出发抗体或其片段相比，对SARS-CoV-2突变株结和力提高的突变后抗体或其片段。
根据本发明的实施例，所述候选抗SARS-CoV-2抗体或其片段是根据 SARS-CoV-2野生株抗原制备的抗SARS-CoV-2抗体或其片段。其中，需要说明的是，该SARS-CoV-2野生株是早期已有的SARS-CoV-2野生株抗原。
根据本发明的实施例，所述候选抗SARS-CoV-2抗体或其片段为结合 SARS-CoV-2S1蛋白RBD区的中和性抗体或其片段，优选地，所述中和性抗体或其片段为人源化抗体或其片段、人抗体或其片段。
根据本发明的实施例，出发抗体或其片段具有SEQ ID NO:1所示的轻链可变区氨基酸序列，和/或SEQ ID NO:2所示重链可变区氨基酸序列。
根据本发明的实施例，所述的抗原来自SARS-CoV-2的S1蛋白RBD区，抗原上与所述出发抗体或其片段作用的位点、以及所述出发抗体或其片段上与抗原作用的位点选自下列组中至少之一：
(1)所述抗原的Y369与所述出发抗体的重链Y102和G106之间具有范德华力作用，与所述出发抗体的重链Y107之间具有范德华力和氢键作用；
(2)所述抗原的A372与所述出发抗体的重链R110以及轻链的Y32和S93 之间具有范德华力作用，与所述出发抗体的轻链N92之间具有范德华力和氢键作用；
(3)所述抗原的S373与所述出发抗体的重链R110和轻链的Y32之间具有范德华力作用；
(4)所述抗原的F374与所述出发抗体的重链Y107之间具有范德华力作用，与所述出发抗体的重链R110和轻链Y32之间具有范德华力和氢键作用；
(5)所述抗原的S375与所述出发抗体的重链Y107、Y108、F109和E111 以及轻链的Y32之间具有范德华力作用，与所述出发抗体的重链R110之间具有范德华力和氢键作用；
(6)所述抗原的T376与所述出发抗体的重链Y107之间具有范德华力作用，与所述出发抗体的重链Y108之间具有范德华力和氢键作用；
(7)所述抗原的F377与所述出发抗体的重链G106之间具有范德华力作用，与所述出发抗体的重链Y107之间具有范德华力和氢键作用；
(8)所述抗原的K378与所述出发抗体的重链Y101、D103、S105、G106 和Y107之间具有范德华力作用；
(9)所述抗原的C379与所述出发抗体的重链S105之间具有范德华力和氢键作用；
(10)所述抗原的V382与所述出发抗体的重链S105之间具有范德华力作用；
(11)所述抗原的S383与所述出发抗体的重链S104之间具有范德华力作用；
(12)所述抗原的P384与所述出发抗体的重链S105之间具有范德华力作用；
(13)所述抗原的T385与所述出发抗体的重链S104之间具有范德华力作用；
(14)所述抗原的G404与所述出发抗体的重链Y108之间具有范德华力作用；
(15)所述抗原的D405与所述出发抗体的重链Y108之间具有范德华力作用；
(16)所述抗原的V407与所述出发抗体的重链Y108之间具有范德华力作用；
(17)所述抗原的R408与所述出发抗体的重链Y108之间具有范德华力和氢键作用；
(18)所述抗原的N437与所述出发抗体的重链E111和轻链N31之间具有范德华力作用；
(19)所述抗原晶的N439与所述出发抗体的轻链S52之间具有范德华力作用；
(20)所述抗原的N440与所述出发抗体的轻链S67之间具有范德华力作用；
(21)所述抗原的P499与所述出发抗体的轻链S52之间具有范德华力作用；
(22)所述抗原的N501与所述出发抗体的轻链S52之间具有范德华力作用；
(23)所述抗原的G502与所述出发抗体的轻链S53之间具有范德华力作用；
(24)所述抗原的V503与所述出发抗体的重链F109以及轻链Y49和A50 之间具有范德华力作用，与所述出发抗体的轻链S53之间具有范德华力和氢键作用；
(25)所述抗原的Q506与所述出发抗体的轻链S52之间具有范德华力作用；
(26)所述抗原的Y508与所述出发抗体的重链F109之间具有范德华力作用，与所述出发抗体的重链E111之间具有范德华力和氢键作用
根据本发明的实施例，所述SARS-CoV-2突变株具有选自S1蛋白RBD区中以下位点中的一个或多个位点的突变：
446G、501N、455L、417K、475A、505Y、493Q、453Y、486F、446G、 501N、417K、456F、477S、439N、520A、344A、382V、367V、330P、479P、 483V、494S、518L、444K、477S、341V、384P、354N、478T、408R、459S、 483V、476G、484E、385T、348A、506Q、334N、370N、373S、403R、411A、481N、508Y、414Q，
其中，所述突变包括缺失、取代、插入。
根据本发明的实施例，所述SARS-CoV-2突变株具有选自S蛋白RBD区中以下位点中的一个或多个突变：
446G>V、501N>Y、455L>F、417K>N、475A>V、505Y>C、493Q>L、453Y>F、 486F>L、446G>S、501N>T、417K>R、456F>L、477S>N/I/T、439N>K、520A>S、 344A>T/S、382V>L、367V>F/L、330P>S/A、479P>S、483V>A、494S>P/A、 518L>I、444K>N、477S>R、341V>I、384P>L、354N>K、478T>K/I/R、408R>K/I/T、 459S>Y/F、483V>I/F、476G>S000、484E>K/Q、385T>N/I、348A>T/S、506Q>K/*、 334N>K、370N>S、373S>L、403R>K、411A>S、481N>D、508Y>H、414Q>K/*/X。
第二方面，本发明提供一种结合SARS-CoV-2突变株的抗体或其片段。根据本发明的实施例，通过本发明前述任一项所述提高抗SARS-CoV-2抗体或其片段对SARS-CoV-2突变株结合能力的方法制备。
根据本发明的实施例，对SARS-CoV-2突变株具有高亲和力、和/或高中和活性。
第三方面，本发明提供一种结合SARS-CoV-2突变株的抗体或其片段，根据本发明的实施例，该抗体或其片段的轻链可变区和重链可变区的CDR区的氨基酸序列如下：
LCDR1：RASQGIX1NYLA，
LCDR2：AAX2SLQS，
LCDR3：LQHNSYPY，
HCDR1：SYAMN，
HCDR2：VISGSGX3X4TYYADSVRG，
HCDR3：GYX5YDSSGYYFREDAFDI；
其中，
X1选自S、Q、K，
X2选自S、N、Q，
X3选自G、Y，
X4选自S、Y、F，
X5选自Y、E。
根据本发明的实施例，所述抗体或其片段不是具有SEQ ID NO:1所示的轻链可变区，和SEQ ID NO:2所示重链可变区的抗体或其片段。
根据本发明的实施例，所述抗体或其片段的轻链可变区不具有SEQ ID NO:1所示的序列，且重链可变区不具有SEQ ID NO:2所示的序列。
根据本发明的实施例，所述抗体或其片段对SARS-CoV-2突变株的结合能力/中和能力，高于对早期SARS-CoV-2野生株的结合能力/中和能力、或与对 SARS-CoV-2野生株的结合能力/中和能力相当。
根据本发明的实施例，所述SARS-CoV-2突变株具有选自S1蛋白RBD区中以下位点或位点组合的突变：N501、K417/E484/N501、N439、L452、 E484/L452。
根据本发明的实施例，所述SARS-CoV-2突变株具有选自S1蛋白RBD区中以下位点或位点组合的突变：N501Y、K417N/E484K/N501Y、 K417T/E484K/N501Y、N439R、L452R、E484Q/L452R。
第四方面，本发明提供一种组合物。根据本发明的实施例，该组合物包含一种或多种选自前述任一项所述结合SARS-CoV-2突变株的抗体或其片段。
第五方面，本发明提供一种多核苷酸，其编码前述任一项所述结合SARS-CoV-2突变株的抗体或其片段。
第六方面，本发明提供一种核酸构建体，其包含前述多核苷酸。
第七方面，本发明提供一种宿主细胞，其包含前述多核苷酸或前述核酸构建体。
第八方面，本发明提供前述任一项所述结合SARS-CoV-2突变株的抗体或其片段、前述组合物、前述多核苷酸、前述核酸构建体、前述宿主细胞在制备治疗SARS-CoV-2感染或新冠肺炎药物中的用途。
进一步，根据本发明的实施例，所述SARS-CoV-2感染或新冠肺炎是由 SARS-CoV-2野生株、和/或SARS-CoV-2突变株引起。
为更好理解本发明，首先定义一些术语。其他定义则贯穿具体实施方式部分而列出。
术语“冠状病毒”是指套式病毒目(Nidovirales)、冠状病毒科 (Coronaviridae)、冠状病毒属(Coronavirus)的成员。本发明所述冠状病毒主要涉及感染人的冠状病毒，包括HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、 HCoV-HKU1、SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2(2019-nCov)，本发明所述冠状病毒特别涉及SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2(2019-nCov)。
术语“特异性”是指在蛋白和/或其他生物异质群体中确定是否存在所述蛋白，例如本发明所述单抗与SARS-CoV-2RBD蛋白的结合反应。因此，在所指定的条件下，特定的配体/抗原与特定的受体/抗体结合，并且并不以显著的量与样本中存在的其它蛋白结合。
本文中的术语“抗体”意在包括全长抗体及其任何抗原结合片段(即，抗原结合部分)或单链。全长抗体是包含至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白，重链和轻链由二硫键连接。各重链由重链可变区(简称VH)和重链恒定区构成。重链恒定区由三个结构域构成，即CH1、CH2和CH3。各轻链由轻链可变区(简称VL)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域CL构成。VH和VL区还可以划分为称作互补决定区(CDR)的高变区，其由较为保守的框架区(FR)区分隔开。各VH和VL由三个CDR以及四个FR构成，从氨基端到羧基端以FR1、 CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4的顺序排布。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括多种免疫系统细胞(例如，效应细胞)和传统补体系统的第一组分(C1q)。
术语“单克隆抗体”或“单抗”是指单一分子组成的抗体分子制品。单克隆抗体组成呈现出对于特定表位的单一结合特异性和亲和力。
本文中的术语，抗体的“抗原结合片段”(或简称为抗体部分)，是指抗体的保持有特异结合抗原能力的一个或多个片段。已证实，抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段来实施。包含在抗体的“抗原结合部分”中的结合片段的例子包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1构成的单价片段；(ii)F(ab′)2片段，包含铰链区二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1构成的 Fd片段；(iv)由抗体单臂VL和VH构成的Fv片段；(v)由VH构成的dAb片段 (Ward et al.，(1989)Nature 341：544-546)；(vi)分离的互补决定区(CDR)；以及(vii) 纳米抗体，一种包含单可变结构域和两个恒定结构域的重链可变区。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由不同的基因编码，它们可以通过重组法经由使两者成为单蛋白链的合成接头而连接，其中VL和VH区配对形成单价分子(称为单链Fc(scFv)；参见例如Bird et al.，(1988)Science 242：423-426；and Huston et al.，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)。这些单链抗体也意在包括在术语涵义中。这些抗体片段可以通过本领域技术人员已知的常用技术而得到，且片段可以通过与完整抗体相同的方式进行功能筛选。
本发明的抗原结合片段包括能够特异性结合冠状病毒RBD的那些。抗体结合片段的实例包括例如但不限于Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、单链Fv(scFv) 片段和单结构域片段。
Fab片段含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab'片段与Fab片段的不同之处在于在重链CH1结构域的羧基末端处的少数残基的添加，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。通过切割在F(ab')2胃蛋白酶消化产物的铰链半胱氨酸处的二硫键产生Fab'片段。抗体片段的另外化学偶联是本领域普通技术人员已知的。Fab和F(ab')2片段缺乏完整抗体的片段可结晶(Fc)区，从动物的循环中更快速地清除，并且可能具有比完整抗体更少的非特异性组织结合(参见例如，Wahl等人，1983，J.Nucl.Med.24:316)。
如本领域通常理解的，“Fc”区是不包含抗原特异性结合区的抗体的片段可结晶恒定区。在IgG、IgA和IgD抗体同种型中，Fc区由两个相同的蛋白质片段组成，衍生自抗体的两条重链的第二和第三恒定结构域(分别为CH2和 CH3结构域)。IgM和IgE Fc区在每条多肽链中含有三个重链恒定结构域(CH2、 CH3和CH4结构域)。
“Fv”片段是含有完整靶识别和结合位点的抗体的最小片段。该区域由以紧密的非共价结合的一个重链和一个轻链可变结构域的二聚体(VH-VL二聚体)组成。在该构型中，每个可变结构域的三个CDR相互作用，以限定在VH-VL 二聚体的表面上的靶结合位点。通常，六个CDR对抗体赋予靶结合特异性。然而，在一些情况下，甚至单个可变结构域(或仅包含对于靶特异性的三个CDR 的Fv的一半)可以具有识别且结合靶的能力，尽管其亲和力低于整个结合位点。
“单链Fv”或“scFv”抗体结合片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单条多肽链中。一般地，Fv多肽进一步包含在VH和VL结构域之间的多肽接头，其致使scFv能够形成有利于靶结合的结构。
“单结构域片段”由对冠状病毒RBD显示出足够亲和力的单个VH或VL 结构域组成。在一个具体实施方案中，单结构域片段是骆驼化的(参见例如， Riechmann，1999，JournalofImmunological Methods 231:25–38)。
本发明的抗冠状病毒RBD的抗体包括衍生化抗体。例如，衍生化抗体通常通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护/封闭基团的衍生化、蛋白酶解切割、与细胞配体或其它蛋白质的连接来修饰。可以通过已知技术进行众多化学修饰中的任一种，所述技术包括但不限于特定的化学切割、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。另外，衍生物可以含有一种或多种非天然氨基酸，例如，使用ambrx技术(参见例如，Wolfson，2006，Chem.Biol. 13(10):1011-2)。
“人源抗体”包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体，并且包括从人免疫球蛋白文库或动物中分离的抗体，所述动物对于一种或多种人免疫球蛋白是转基因的，并且不表达内源免疫球蛋白。人抗体可以通过本领域已知的各种方法制备，所述方法包括使用衍生自人免疫球蛋白序列的抗体文库的噬菌体展示方法。参见美国专利号4,444,887和4,716,111；以及PCT公开WO 98/46645； WO 98/50433；WO 98/24893；WO 98/16654；WO 96/34096；WO96/33735；和 WO 91/10741。还可以使用不能表达功能性内源免疫球蛋白，但可以表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠来产生人抗体。参见例如，PCT公开WO 98/24893； WO92/01047；WO 96/34096；WO 96/33735；美国专利号5,413,923；5,625,126； 5,633,425；5,569,825；5,661,016；5,545,806；5,814,318；5,885,793；5,916,771；和5,939,598。另外，使用与上述类似的技术，公司例如LakePharma，Inc. (Belmont，CA)或Creative BioLabs(Shirley，NY)可以从事于提供针对所选抗原的人抗体。可以使用被称为“引导选择”的技术生成识别所选表位的全人抗体。在该方法中，选择的非人单克隆抗体，例如小鼠抗体，用于引导识别相同表位的完全人抗体的选择(参见，Jespers等人，1988，Biotechnology 12:899-903)。
术语“识别抗原的抗体”以及“对抗原特异的抗体”在本文中与术语“特异结合抗原的抗体”交替使用。
术语“高亲和性”对于IgG抗体而言，是指对于抗原的KD为1.0x10-6M以下，优选5.0x10-8M以下，更优选1.0x10-8M以下、5.0x10-9M以下，更优选1.0x10-9M 以下。对于其他抗体亚型，“高亲和性”结合可能会变化。例如，IgM亚型的“高亲和性”结合是指KD为10-6M以下，优选10-7M以下，更优选10-8M以下。
术语“Kassoc”或“Ka”是指特定抗体-抗原相互作用的结合速率，而术语“Kdis”或“Kd”是指特定抗体-抗原相互作用的离解速率。术语“KD”是指解离常数，由Kd与Ka比(Kd/Ka)得到，并以摩尔浓度(M)表示。抗体的KD值可以通过领域内已知的方法确定。优选的确定抗体KD的方式是使用表面等离子共振仪(SPR)测得的，优选使用生物传感系统例如BiacoreTM系统测得。
术语“EC50”，又叫半最大效应浓度，是指引起50％最大效应的抗体浓度。
与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下优点：
第一、针对新冠病毒SARS-CoV-2不断出现新的流行突变株的情况，提供了一种快速获得对SARS-CoV-2突变株具有高亲和力、高中和活性抗体的方法，克服了SARS-CoV-2变异速度快、中和性抗体药物研发速度慢的缺陷，从而能够以现有技术已经开发较为成熟的抗体药物为出发点，获得对流行变异株具有高亲和力的抗体药物。
第二，尽管不希望受到理论的约束，新冠病毒SARS-CoV-2产生变异的重要原因之一在于病毒受到宿主的免疫洗脱和治疗性药物的压力。根据 SARS-CoV-2入侵宿主的机制，现有技术中抗SARS-CoV-2治疗性抗体主要是基于SARS-CoV-2的S1蛋白RBD区的宿主受体结合区，以获得尽可能高的中和活性。本发明根据上述原理，选择同时结合于S1RBD中结构相对保守的非 ACE2结合区和部分ACE2结合区的抗体作为出发抗体，从而避免了 SARS-CoV-2受体结合区个别氨基酸位点的变化导致的中和活性丧失。
第三，本发明通过抗原-抗体复合物晶体结构解析，在分析SARS-CoV-2的 RBD抗原与其抗体相互作用位点的基础上，根据现有报道的流行突变株在RBD 区的变异情况，通过分子生物学分析设计获得了抗SARS-CoV-2抗体的突变方案，结果表明根据本发明所述方法制备的突变抗体对抗原的结合能力得到提高，从而能够有效中和/封闭B1.1.7、B1.135等多种流行突变株。
附图说明
通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。而且在整个附图中，用相同的参考符号表示相同的部件。在附图中：
图1：本发明实施例的MW06与S1RBD结合的亲和力测定结果。
图2：本发明实施例的Hm8Lm3与S1RBD结合的亲和力测定结果。
图3：本发明实施例的MW06和突变抗体Hm4Lm3/MW06m8假病毒中和活性测定结果。
图4：本发明实施例的MW06m8(Hm8Lm3)对不同流行突变株的假病毒中和活性。
具体实施方式
下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施方式。虽然附图中显示了本公开的示例性实施方式，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。
第一部分：主要的实验方法
示例性的，以下实施例所使用的重组蛋白及主要的实验方法如下：
1.S1RBD-his和S1RBD-mFc突变体的制备
将SARS-Cov-2 Spike RBD(QHD43416.1，319-533aa)基因克隆至C端带有His tag或mFc的真核表达载体中，构建C端带有His或mFc标签的 SARS-Cov-2 Spike RBD真核表达质粒。将质粒通过转染试剂293fectin(Cat: 12347019,Life Technologies)，转入HEK293细胞中，进行瞬时表达，4天后收集上清，采用HisTrap HP亲和层析柱(Cat:17-5248-01,GE)或Mabselect亲和层析柱(Cat:29-0491-04,GE)进行纯化，随后通过超滤浓缩管(Cat:VS0122,Sartorius Stedim)超滤，将buffer置换为PBS。并通过SEC-HPLC及SDS-PAGE确定SARS-Cov-2 Spike RBD的纯度及大小。
2.hACE2-hFc的制备
将human ACE2(NP_068576.1，1-615aa)基因克隆至C端带有human Fc tag 的真核表达载体中，构建human ACE2-hFc真核表达质粒。将该质粒通过转染试剂293fectin(Cat:12347019,Life Technologies)，转入HEK293细胞中，进行瞬时表达，4天后收集上清，采用Mabselect亲和层析柱(Cat:29-0491-04,GE)进行纯化，随后通过超滤浓缩管(Cat:VS0122,Sartorius Stedim)超滤，将pH6 的醋酸钠PBS置换为pH7.2的PBS。并通过SEC-HPLC及SDS-PAGE确定 human ACE2-hFc的纯度及大小。
3.亲和力测定
应用Fortebio蛋白相互作用系统测定MW06及突变体与S1-RBD蛋白抗原结合的亲和力,比较各突变体的亲和力变化。主要步骤如下：
利用Fortebio公司的Octet QKe system，采用抗人抗体Fc段的捕获抗体 (AHC)生物探针捕获测定抗体与单价S1RBD的结合和解离变化。测定时将4 μg/mL浓度的MW06及突变体流经AHC探针(Cat:18-5060，PALL)表面，时间为120s。不同浓度的S1RBD-His(60,45,30,15nM)作为流动相。结合时间为 300s，解离时间为300s。实验完毕，扣除空白对照响应值，用软件进行1：1 Langmuir结合模式拟合，计算抗原抗体结合的动力学常数。
4.结合活性测定
采用ELISA方法分析抗体与野生型S1RBD及各突变体的结合活性。实验步骤描述如下：包被SARS-CoV-2spike RBD及RBD mutants，浓度为10μg/ml； 100μl/孔；4℃过夜；5％BSA in PBS，37℃，120min,PBST洗板4次；将MW06 及突变体(起始浓度为1μg/mL，3倍连续稀释，12个梯度)重组蛋白加入包被孔中，100μl/孔，37℃恒温培养箱反应60min；PBST洗板4次；加二抗 HRP-anti-human Fc(1:5000)(Cat：109-035-098，Jackson Immuno Research)，37℃，45min，PBST洗板4次；TMB(Cat:ME142，北京泰天河生物)显色， 37℃，10min；2M HCL终止反应；读取并记录波长450nm下孔板的吸光度值。
5.阻断活性测定
采用竞争结合ELISA方法分析抗体对野生型S1RBD及各突变体与ACE2 结合的阻断活性。实验步骤描述如下：
1)、包板：包被由“2.hACE2-hFc的制备”制备得到的human ACE2-hFc(1-615)，浓度为0.75ug/ml；每孔100ul；4℃过夜；
2)、封闭：5％BSA in PBS，37℃,120min,PBST洗板4次；
3)、加一抗：100ul 100ng/ml SARS-CoV-2spike RBD-mFc/SARS-CoV spike RBD-mFc(由“1.S1RBD-his和S1RBD-mFc突变体的制备”制备得到)，加入 100ul待检测抗体(40ug/ml，3倍稀释，12个梯度)，略震荡混匀放置50min，加入ACE2包被孔，100ul/孔；37℃恒温培养箱反应60min；
4)、加二抗：HRP-anti-mouse IgG(1:5000)(Cat:115-035-071，Jackson ImmunoResearch)，37℃，45min，PBST洗板4次；
5)、显色：TMB(Cat:ME142，北京泰天河生物)显色，37℃，10min；
6)、终止：2M HCL终止反应；
7)、读数：读取并记录波长450nm下孔板的吸光度值。
6.假病毒中和活性分析
用DMEM完全培养基(10％FBS，0.4mg/ml geneticin)将假病毒颗粒稀释至1.0E4～2.0E4 TCID50·mL-1(500～1000TCID50·孔-1)，50μL每孔加入白底细胞板中，然后100μL每孔加入系列稀释的样品与假病毒进行中和反应， 37℃，5％ CO2培养箱孵育60min。设置不加病毒组为阴性对照CC值，不加供试品组为阳性对照VC值。在上述中和后的板内，加入100μL每孔的3×105个·mL-1的Huh 7/ACE细胞，置于37℃，5％ CO2培养箱中孵育20h～28h。取出细胞培养板，弃去细胞孔的培养上清，轻轻吸干，加入100μL每孔的荧光素酶底物(购自Perkinelmer,货号：6066769)，避光反应2min，置于酶标仪中采集化学发光信号。采用[1-(样品孔荧光均值-CC荧光均值)/(VC荧光均值-CC荧光均值)]*100％公式计算中和抑制率。以供试品工作浓度为X轴，中和抑制率为Y轴，选用四参数方程对供试品的假病毒中和活性进行分析。
第二部分：实施例
实施例1.出发抗体的选择与突变抗体的制备
针对现有技术中抗新冠病毒中和抗体、发明人前期研发的抗新冠病毒 SARS-CoV-2中和抗体进行序列分析。通过抗原抗体复合物结晶衍射分析、同源模建、分子结构对接等方式可获得各抗SARS-CoV-2中和抗体与S1 RBD结合的晶体复合物结构信息。结合早期的中和试验筛选确定，抗新冠中和抗体 MW06与S1RBD特异性结合，并阻断S1RBD与ACE2的结合发挥抗病毒中和作用。X-射线晶体衍射分析对MW06与S1RBD结合晶体复合物结构解析结构显示，MW06同时结合于S1RBD中结构相对保守的非ACE2结合区和部分 ACE2结合区(参见表1)，其结合表位特点使MW06能够对抗多种新冠流行突变，包括英国突变(N501Y)、南非突变(K417N/E484K/N501Y)、巴西突变 (K417T/E484K/N501Y)、苏格兰突变(N439R)、美国突变(L452R)以及印度突变(E484Q/L452R)，MW06适于作为出发抗体。
表1.MW06与S1RBD相互作用信息表
Figure BDA0003888182740000121
Figure BDA0003888182740000131
Figure BDA0003888182740000141
HB：氢键；SB：盐桥；VDW：范德华力(包括疏水相互作用)
抗体MW06的轻重链可变区氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，CDR的划分方式为Kabat。轻重链恒定区氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
SEQ ID NO.1MW06 VL:
DIQMTQSPSAMSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWFQQKPGKVPKRLIY AASSLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQHNSYPYTFGQGTK LEIK
轻链CDR1氨基酸：RASQGISNYLA(SEQ ID NO.5)
轻链CDR2氨基酸：AASSLQS(SEQ ID NO.6)
轻链CDR3氨基酸：LQHNSYPY(SEQ ID NO.7)
SEQ ID NO.2MW06 VH:
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMNWVRQAPGKGLEW VSVISGSGGSTYYADSVRGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYCCAKGYYYDSSGYYFREDAFDIWGQGTLVTVSS
重链CDR1氨基酸：SYAMN(SEQ ID NO.8)
重链CDR2氨基酸：VISGSGGSTYYADSVRG(SEQ ID NO.9)
重链CDR3氨基酸：GYYYDSSGYYFREDAFDI(SEQ ID NO.10)
SEQ ID NO.3轻链恒定区氨基酸序列
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSG NSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFN RGEC
SEQ ID NO.4重链恒定区氨基酸序列
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGV HTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCD KTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKF NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN KALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEA LHNHYTQKSLSLSPGK
根据国家生物信息中心-2019新型冠状病毒信息库数据(https://bigd.big.ac.cn/ncov)中基因组变异注释分析(https://bigd.big.ac.cn/ncov/variation/annotation) 功能，将所有S基因区域突变株信息表格进行下载后，对其中发生氨基酸突变的突变株进行筛选、汇总；并对其中突变位点属于RBD区域(319-533AA)的突变株进行进一步汇总，进一步分析ACE2结合区的突变株情况。同时根据表格中提供的突变株基因组位置信息，从基因组变异注释分析(https://bigd.big.ac. cn/ncov/variation/annotation)功能中查找到基因组位置对应的突变株详细信息，如突变株名称、数据来源、序列质量、采样地点、样本提供单位等信息。
根据MW06与S1RBD的晶体复合物解析结构，结合SARS-CoV-2流行突变株的突变位点信息，分别设计MW06的轻重链CDR区突变，抗体的其他区域序列未进行突变，获得的突变抗体的CDR区和突变位点如下(表2)，突变抗体的框架区及轻链恒定区和重链恒定区序列与MW06相同，对所有突变抗体通过分子克隆定点突变的方法进行重组表达载体构建，利用HEK293进行瞬转表达，ProteinA纯化后获得蛋白纯品。
表2.出发抗体轻、重链CDR区突变设计
Figure BDA0003888182740000151
Figure BDA0003888182740000161
实施例2.突变抗体对SARS-CoV-2S1-RBD的亲和力分析
2.1亲和力检测
采用第一部亲和力检测方法，应用Fortebio蛋白相互作用系统测定MW06 及突变抗体与S1-RBD蛋白抗原结合的亲和力,比较各突变抗体的亲和力变化。采用固定浓度60nM的S1RBD-His作为流动相，进行单线测定,以进行不同突变体间亲和力的相对比较。
结果如表3所显示，多个突变抗体亲和力得到明显提高，突变位点包括轻链CDR2的S52,重链CDR2的S57以及重链CDR3的Y101突变后分别对亲和力有不同程度改善叠加突变后的突变抗体Hm4Lm3和Hm8Lm3亲和力提高最明显。
表3.不同突变抗体亲和力测定结果
Figure BDA0003888182740000171
实施例3.MW06和突变抗体Hm8Lm3、Hm4Lm3的性能比较
采用第一部分“3.亲和力测定”、“4.结合活性测定”、“5.阻断活性测定”和“6.假病毒中和活性分析”相关实验方法，对实施例2得到的突变抗体 Hm4Lm3、Hm8Lm3与出发抗体MW06从亲和力、结合活性、阻断活性和假病毒中和活性进行系统比较。
综合亲和力、结合活性、阻断活性和假病毒中和活性如表4、图1-3所示。结果表明，突变抗体Hm4Lm3和Hm8Lm3亲和力明显提高、结合和阻断活性明显增强、同一体系下的假病毒实验比较结果显示中和活性也明显增强。
表4.MW06和突变抗体Hm8Lm3、Hm4Lm3的活性比较
Figure BDA0003888182740000181
实施例4.突变抗体Hm8Lm3对不同SARS-CoV-2突变株的结合活性分析
根据晶体复合物解析的相互作用信息，抗体MW06的关键结合部位位于相对保守的非ACE2结合区(360aa-440aa)，推测通过位阻效应阻断RBD与ACE2 的结合，因此具有抗突变的表位基础。
以Hm8Lm3为研究对象，通过fortebio和ELISA结合实验分析其对多个参与ACE2结合的关键位点以及流行突变株的S1RBD突变体的结合活性，结果如表5和表6所示。
表5.Hm8Lm3对不同S1RBD突变体(S1RBD-his)的亲和力分析
S1RBD突变体 KD(M) kon(1/Ms) kdis(1/s)
WT 5.79E-10 1.61E+05 9.32E-05
N501Y 1.97E-09 1.74E+05 3.42E-04
N439R 2.01E-09 1.47E+05 2.96E-04
L452R 9.27E-10 3.30E+05 3.06E-04
K417N N501Y E484K 7.20E-10 3.08E+05 2.21E-04
K417T N501Y E484K 2.71E-09 1.93E+05 5.23E-04 
表6.Hm8LM3对不同S1RBD突变体(S1RBD-his)的结合活性
Figure BDA0003888182740000182
Figure BDA0003888182740000191
表5-6的结果表明突变抗体Hm8Lm3对上述SARS-CoV-2的关键突变和流行突变体RBD均保持了与野生型相当的结合活性。
实施例5.突变抗体Hm8Lm3的广谱抗SARS-CoV-2突变阻断活性
采用第一部分方法描述中的竞争ELSIA检测Hm8Lm3突变体对 S1RBD-mFc及突变体与ACE2结合的阻断作用，结果如表7所示。
表7.Hm8Lm3对不同S1RBD突变体与ACE2结合的阻断作用
Figure BDA0003888182740000192
表7的结果表明突变抗体Hm8Lm3对一些ACE2结合关键位点及流行突变株的突变体与ACE2结合均具有较强的阻断作用，与野生型相比IC50无明显差异，进一步证实了MW06及突变抗体的广谱抗突变能力。
实施例6.突变抗体Hm8Lm3对英国株和南非株假病毒中和活性
利用假病毒系统检测Hm8Lm3对野生、英国和南非突变株假病毒的中和活性，主要试验材料如表8所示。
表8.假病毒中和试验主要试验材料
Figure BDA0003888182740000193
Figure BDA0003888182740000201
将梯度稀释的供试品加入到细胞白板内，与750TCID 50/孔的假病毒混合后，置于37℃，5％CO2培养箱内中和反应1h。待中和反应完成后，在上述培养板内分别加入Huh-7/ACE2细胞(2E5 cells/孔)，37℃，5％CO2孵育20～28 小时。取出细胞培养板，弃掉上清，按照100μl/孔加入荧光素酶分析试剂，避光反应2min后，进行酶标仪读数(结果如图4、表9所示)。
表9.Hm8Lm3对不同假病毒毒株的中和活性
Figure BDA0003888182740000202
图4、表9的试验结果显示，Hm8Lm3对野生型、英国株和南非株均具有良好的中和活性。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (20)

1.一种提高抗SARS-CoV-2抗体或其片段对SARS-CoV-2突变株结合能力的方法，其特征在于：包括：
(1)将候选抗SARS-CoV-2抗体或其片段与抗原的晶体复合物结合得到抗原抗体晶体复合物，并对所述抗原抗体晶体复合物进行结构解析，确定所述抗原上与所述候选抗SARS-CoV-2抗体或其片段作用的位点、以及所述候选抗SARS-CoV-2抗体或其片段上与所述抗原作用的位点；
(2)根据已有的SARS-CoV-2的自然突变位点，选择在所述抗原上的作用位点不易产生自然突变的所述候选抗SARS-CoV-2抗体或其片段作为出发抗体或其片段；
(3)对可能与所述SARS-CoV-2的自然突变位点相互作用的所述出发抗体或其片段上的位点进行突变，以便得到突变后抗体或其片段；
(4)筛选与所述出发抗体或其片段相比，对SARS-CoV-2突变株结和力提高的所述突变后抗体或其片段。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述候选抗SARS-CoV-2抗体或其片段是根据SARS-CoV-2野生株抗原制备的抗SARS-CoV-2抗体或其片段。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述候选抗SARS-CoV-2抗体或其片段为结合SARS-CoV-2的S1蛋白RBD区的中和性抗体或其片段，优选地，所述中和性抗体或其片段为人源化抗体或其片段、或人抗体或其片段。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述出发抗体或其片段具有SEQ ID NO:1所示的轻链可变区氨基酸序列，和/或SEQ ID NO:2所示重链可变区氨基酸序列。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述抗原来自SARS-CoV-2的S1蛋白RBD区，所述抗原上与所述出发抗体或其片段作用的位点、以及所述出发抗体或其片段上与所述抗原作用的位点选自下列组中至少之一：
(1)所述抗原的Y369与所述出发抗体的重链Y102和G106之间具有范德华力作用，与所述出发抗体的重链Y107之间具有范德华力和氢键作用；
(2)所述抗原的A372与所述出发抗体的重链R110以及轻链的Y32和S93之间具有范德华力作用，与所述出发抗体的轻链N92之间具有范德华力和氢键作用；
(3)所述抗原的S373与所述出发抗体的重链R110和轻链的Y32之间具有范德华力作用；
(4)所述抗原的F374与所述出发抗体的重链Y107之间具有范德华力作用，与所述出发抗体的重链R110和轻链Y32之间具有范德华力和氢键作用；
(5)所述抗原的S375与所述出发抗体的重链Y107、Y108、F109和E111以及轻链的Y32之间具有范德华力作用，与所述出发抗体的重链R110之间具有范德华力和氢键作用；
(6)所述抗原的T376与所述出发抗体的重链Y107之间具有范德华力作用，与所述出发抗体的重链Y108之间具有范德华力和氢键作用；
(7)所述抗原的F377与所述出发抗体的重链G106之间具有范德华力作用，与所述出发抗体的重链Y107之间具有范德华力和氢键作用；
(8)所述抗原的K378与所述出发抗体的重链Y101、D103、S105、G106和Y107之间具有范德华力作用；
(9)所述抗原的C379与所述出发抗体的重链S105之间具有范德华力和氢键作用；
(10)所述抗原的V382与所述出发抗体的重链S105之间具有范德华力作用；
(11)所述抗原的S383与所述出发抗体的重链S104之间具有范德华力作用；
(12)所述抗原的P384与所述出发抗体的重链S105之间具有范德华力作用；
(13)所述抗原的T385与所述出发抗体的重链S104之间具有范德华力作用；
(14)所述抗原的G404与所述出发抗体的重链Y108之间具有范德华力作用；
(15)所述抗原的D405与所述出发抗体的重链Y108之间具有范德华力作用；
(16)所述抗原的V407与所述出发抗体的重链Y108之间具有范德华力作用；
(17)所述抗原的R408与所述出发抗体的重链Y108之间具有范德华力和氢键作用；
(18)所述抗原的N437与所述出发抗体的重链E111和轻链N31之间具有范德华力作用；
(19)所述抗原晶的N439与所述出发抗体的轻链S52之间具有范德华力作用；
(20)所述抗原的N440与所述出发抗体的轻链S67之间具有范德华力作用；
(21)所述抗原的P499与所述出发抗体的轻链S52之间具有范德华力作用；
(22)所述抗原的N501与所述出发抗体的轻链S52之间具有范德华力作用；
(23)所述抗原的G502与所述出发抗体的轻链S53之间具有范德华力作用；
(24)所述抗原的V503与所述出发抗体的重链F109以及轻链Y49和A50之间具有范德华力作用，与所述出发抗体的轻链S53之间具有范德华力和氢键作用；
(25)所述抗原的Q506与所述出发抗体的轻链S52之间具有范德华力作用；
(26)所述抗原的Y508与所述出发抗体的重链F109之间具有范德华力作用，与所述出发抗体的重链E111之间具有范德华力和氢键作用。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述SARS-CoV-2突变株具有选自S1蛋白RBD区中以下位点中的一个或多个位点的突变：
446G、501N、455L、417K、475A、505Y、493Q、453Y、486F、446G、501N、417K、456F、477S、439N、520A、344A、382V、367V、330P、479P、483V、494S、518L、444K、477S、341V、384P、354N、478T、408R、459S、483V、476G、484E、385T、348A、506Q、334N、370N、373S、403R、411A、481N、508Y、414Q，
其中，所述突变包括缺失、取代、插入。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述SARS-CoV-2突变株具有选自S蛋白RBD区中以下位点中的一个或多个突变：
446G>V、501N>Y、455L>F、417K>N、475A>V、505Y>C、493Q>L、453Y>F、486F>L、446G>S、501N>T、417K>R、456F>L、477S>N/I/T、439N>K、520A>S、344A>T/S、382V>L、367V>F/L、330P>S/A、479P>S、483V>A、494S>P/A、518L>I、444K>N、477S>R、341V>I、384P>L、354N>K、478T>K/I/R、408R>K/I/T、459S>Y/F、483V>I/F、476G>S000、484E>K/Q、385T>N/I、348A>T/S、506Q>K/*、334N>K、370N>S、373S>L、403R>K、411A>S、481N>D、508Y>H、414Q>K/*/X。
8.一种结合SARS-CoV-2突变株的抗体或其片段，其特征在于：所述抗体或其片段通过权利要求1-7中任一项所述方法制备。
9.如权利要求8所述的抗体或其片段，其特征在于：对SARS-CoV-2突变株具有高亲和力、和/或高中和活性。
10.一种结合SARS-CoV-2突变株的抗体或其片段，其特征在于：所述抗体或其片段的轻链可变区和重链可变区的CDR区的氨基酸序列如下：
LCDR1：RASQGIX1NYLA，
LCDR2：AAX2SLQS，
LCDR3：LQHNSYPY，
HCDR1：SYAMN，
HCDR2：VISGSGX3X4TYYADSVRG，
HCDR3：GYX5YDSSGYYFREDAFDI；
其中，
X1选自S、Q、K，
X2选自S、N、Q，
X3选自G、Y，
X4选自S、Y、F，
X5选自Y、E。
11.如权利要求10所述的抗体或其片段，其特征在于：所述抗体或其片段的轻链可变区不具有SEQ ID NO:1所示的序列，且重链可变区不具有SEQ ID NO:2所示的序列。
12.如权利要求10或11所述的抗体或其片段，其特征在于：所述抗体或其片段对SARS-CoV-2突变株的结合能力/中和能力，高于对早期SARS-CoV-2野生株的结合能力/中和能力、或与对早期SARS-CoV-2野生株的结合能力/中和能力相当。
13.如权利要求10所述的抗体或其片段，其特征在于：所述SARS-CoV-2突变株具有选自S1蛋白RBD区中以下位点或位点组合的突变：N501、K417/E484/N501、N439、L452、E484/L452。
14.如权利要求13所述的抗体或其片段，其特征在于：所述SARS-CoV-2突变株具有选自所述S1蛋白RBD区中以下位点或位点组合的突变：N501Y、K417N/E484K/N501Y、K417T/E484K/N501Y、N439R、L452R、E484Q/L452R。
15.一种组合物，其包含一种或多种选自权利要求8-14中任一项所述结合SARS-CoV-2突变株的抗体或其片段。
16.一种多核苷酸，其编码权利要求8-14中任一项所述结合SARS-CoV-2突变株的抗体或其片段。
17.核酸构建体，其包含权利要求16所述的多核苷酸。
18.宿主细胞，其包含权利要求16所述的多核苷酸或权利要求17所述的核酸构建体。
19.权利要求8-14中任一项所述结合SARS-CoV-2突变株的抗体或其片段、权利要求15所述组合物、权利要求16所述多核苷酸、权利要求17所述核酸构建体、权利要求18所述宿主细胞在制备治疗SARS-CoV-2感染或治疗新冠肺炎药物中的用途。
20.如权利要求19所述的用途，其特征在于，所述SARS-CoV-2感染或所述新冠肺炎是由SARS-CoV-2野生株、和/或SARS-CoV-2突变株引起。
CN202211252543.3A 2021-10-14 2022-10-13 一种对SARS-CoV-2变异株具有高亲和力的抗体 Pending CN116063470A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2021111969678 2021-10-14
CN202111196967 2021-10-14

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116063470A true CN116063470A (zh) 2023-05-05

Family

ID=86170600

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202211252543.3A Pending CN116063470A (zh) 2021-10-14 2022-10-13 一种对SARS-CoV-2变异株具有高亲和力的抗体

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116063470A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112135626B (zh) 抗tigit抗体及其用途
CN112625136B (zh) 针对冠状病毒具有中和活性的双特异性抗体及其用途
WO2016110267A1 (zh) 具有共同轻链的双特异性抗体或抗体混合物
Monaco-Malbet et al. Mutual conformational adaptations in antigen and antibody upon complex formation between an Fab and HIV-1 capsid protein p24
RU2744274C1 (ru) Моноклональное антитело к RBD фрагменту в составе S белка вируса SARS-CoV-2
JP2019507103A (ja) 抗呼吸器合胞体ウイルスの完全ヒト抗体
CN114746440A (zh) 新型多肽复合物
CN113527473A (zh) 一种全人源单克隆抗体及其应用
CN114573695A (zh) 抗人b7-h3抗体及其应用
CN112480250B (zh) 一种抗人骨桥蛋白的抗体及其应用
KR20190093114A (ko) 중동호흡기증후군 코로나바이러스에 중화활성을 갖는 결합 분자
CN115087667B (zh) 特异性结合SARS-CoV-2的抗原结合蛋白
CN116063470A (zh) 一种对SARS-CoV-2变异株具有高亲和力的抗体
CN114907477A (zh) 抗人il-36r抗体及其应用
CN115715297A (zh) 抗flt3抗体和组合物
CN110563847A (zh) 用于治疗性用途的免疫检查点抑制剂
CN114426580B (zh) 抗csf-1r抗体及其产品、方法和用途
US20220251173A1 (en) Anti-hepatitis b virus antibodies and use thereof
CN114395042B (zh) 抗il-33人源化抗体及其应用
CN114790240B (zh) SARS-CoV-2中和性单克隆抗体及应用
CN114163528B (zh) Cd47结合分子及其应用
CN115337396A (zh) 一种全人源单克隆抗体组合及其应用
US20230331862A1 (en) Antibody specifically bound to glycosylated ceacam5
CN113527471A (zh) 一种SARS-CoV-2中和性单抗及其应用
CN117402237A (zh) 一种抗新型冠状病毒的双特异性抗体及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication