WO2005078087A1 - 破骨細胞関連タンパク質を標的とした抗体 - Google Patents

破骨細胞関連タンパク質を標的とした抗体 Download PDF

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Toshio Kukita
Yoshiharu Hiruma
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Definitions

  • the present invention relates to a substance useful as a therapeutic and / or prophylactic agent for bone metabolism disorder, a method for screening a substance useful as a therapeutic and / or prophylactic agent for bone metabolism disorder, and a method for examining bone metabolic disorder. And a method for treating or preventing bone metabolism disorders.
  • Bone is known as a dynamic organ that constantly remodels and resorbs to maintain its morphological changes and blood calcium levels.
  • bone formation by osteoblasts and bone resorption by osteoclasts are in equilibrium, and bone mass is kept constant.
  • bone metabolism is abnormal, such as osteoporosis (Endocrinological Review 13, 66-80, 1992, Principles of Bone Biology p87-102, 1996, Academic Press, New York) .
  • Osteoporosis is roughly classified into postmenopausal osteoporosis due to decreased estrogen secretion and senile osteoporosis due to aging.To elucidate the pathogenesis and develop therapeutic agents, bone resorption and bone Advances in basic research on the regulatory mechanisms of formation are essential.
  • Osteoclasts are polynuclear cells derived from hematopoietic stem cells, which release chloride and hydrogen ions to the bone-adhesive surface, thereby acidifying the gap between the cell and the bone-adhesive surface (American Journal of Physiology 260 , C1315-C1324, 1991). This results in the degradation of calcium phosphate and the activation of acidic proteases, resulting in bone resorption. Progresses.
  • Osteoclast precursor cells are expressed on the cell membrane of osteoblasts / stromal cells on the surface of bone.
  • ⁇ Differentiate into osteoclasts under the stimulation of RANKL (Receptor activator of NF- ⁇ B1 igand) (Procedings of the National Academy of Science of the Uited States of America 95, 3597-3602, 1998, Cell 93, 165-176, 1998).
  • RANKL is a membrane-bound factor produced by osteoblasts / stromal cells, and its expression is regulated by bone resorption factors, and RANKL differentiates from osteoclast precursor cells to multinucleated osteoclasts It was revealed that inducing
  • mice knocked out of RANKL developed typical marble disease, demonstrating that MNKL is a physiological osteoclast differentiation inducer (Nature '397, 315). -323, 1999).
  • Bisphosphonates and active vitamins are used as medicines to treat bone-related diseases and shorten the treatment period.
  • 3 calcitonin and its derivatives, hormone preparations such as E scan Torajio Ichiru, SERMs (Selective estrogen receptor modulators) , I-flop Rifurabon, vitamin K 2 (menatetrenone), calcium preparations, etc. are used.
  • these drugs are not always satisfactory in terms of therapeutic results, and the development of drugs with higher therapeutic effects has been desired.
  • Dendritic cells are specialized antigen-presenting cells of the immune system that are scattered throughout the body.
  • Dendritic cell-specific transmembrane proteins (hereinafter referred to as DC-STAMPj) is a protein cloned from a monocyte-derived DC cDNA library as a protein that penetrates the cell membrane of dendritic cells (European Journal of Immunology 30, 3585-3590, 2000)
  • DC-STAMPj Dendritic cell-specific transmembrane protein
  • DC-STAMP has seven transmembrane domains.
  • the splice variant in which the third exon is short in mice is considered to lack the seventh transmembrane domain, and is referred to as DC-STAMP ⁇ 7 below.
  • An object of the present invention is a gene specifically expressed in osteoporosis, rheumatoid arthritis, various bone metabolic abnormalities such as bone destruction seen in bone metastasis of cancer cells, a substance inhibiting the activity of osteoclasts, It is an object of the present invention to provide a novel method for testing a preventive or therapeutic agent for bone metabolism disorder, a substance that inhibits the activity of osteoclasts, a preventive agent for bone metabolism disorder, and a therapeutic agent for Z or treatment.
  • the present inventors aimed at elucidating the functions of osteoclast differentiation, maturation and activation in order to search for a substance having a therapeutic and / or prophylactic effect on bone metabolism disorders.
  • the present inventors have found that they are involved in osteocyte differentiation, maturation and activation, and found that suppression of DC-STAMP expression suppresses osteoclast differentiation, thus completing the present invention.
  • a method for detecting abnormal bone metabolism including the following steps 1) to 4):
  • a polynucleotide comprising a nucleotide sequence represented by at least one of SEQ ID NOs: 1, 3, and 5 in the sequence listing,
  • a method for detecting abnormal bone metabolism including the following steps 1) to 3):
  • the method for measuring the expression level of a polynucleotide is characterized in that it is a Northern plot method, a dot blot method, a slot plot method, RT-PCR, a liponuclease-protected assay or a run-on assay. (7), the method according to any one of (9) to (12),
  • the method for measuring the expression level of a polynucleotide is characterized by using a gene chip or an array made of a complementary DNA group derived from a specimen or a DNA consisting of a partial sequence of each DNA of the DNA group. , (7), the method according to any one of (9) to (12),
  • the method for measuring the expression level of a protein is the Western blot method, the dot blot method, the slot blot method, or the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA method).
  • a kit for detecting abnormal bone metabolism including at least one selected from the group consisting of 1) to 3) below:
  • a continuous oligonucleotide primer having a length of 15 to 30 bases for specifically amplifying a polynucleotide comprising a nucleotide sequence represented by at least one of SEQ ID NOs: 1, 3 and 5 in the sequence listing One;
  • Kit for detecting abnormal bone metabolism including the following 1) and 2): 1) an antibody which specifically binds to a protein consisting of the amino acid sequence shown in at least one of SEQ ID NOs: 2, 4, and 6 of the sequence listing and detects the protein;
  • a pharmaceutical composition for treating bone metabolism disorders comprising at least one of the antibodies according to (1) to (6).
  • Abnormal bone metabolism including an oligonucleotide having a nucleotide sequence complementary to any one of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 1, 3 and 5 of the sequence listing or a partial sequence thereof.
  • a method for screening a substance having a therapeutic effect and a Z or preventive effect on bone metabolism disorders comprising the following steps 1) to 4):
  • 3) a step of measuring the expression level of the polynucleotide or a partial polynucleotide thereof described in any one of the following in the total RNA fraction derived from the above step 1) and the total RNA fraction derived from the above step 2) ;
  • polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 and a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5 At least one polynucleotide,
  • a method for screening a substance having a therapeutic and / or prophylactic effect on bone metabolic disorders comprising the following steps 1) to 4):
  • a method for screening a substance having a therapeutic and / or prophylactic effect on bone metabolic disorders comprising the following steps 1) to 3):
  • a method for screening a substance having a therapeutic and / or prophylactic effect on bone metabolic disorders comprising the following steps 1) to 3):
  • the method for measuring the expression level of a polynucleotide is characterized in that it is a Northern plot method, a dot plot method, a slot plot method, RT-PCR, liponuclease protection atse or run-on atse.
  • the method for measuring the expression level of a polynucleotide uses a gene chip or an array made of a complementary DNA group derived from an animal tissue or an animal cell or a DNA comprising a partial sequence of each DNA of the DNA group.
  • FIG. 1 is a graph showing the differentiation of each RAW264 subclone cell into an osteoclast by RANKL stimulation.
  • FIG. 2 is a diagram showing the expression of DC-STAMP m-RNA during the differentiation of RAW-D cells into osteoclasts.
  • FIG. 3 is a diagram showing expression of DC-STAMP m-RNA in RAW-D cells stimulated with RANKL, TNF ⁇ and ⁇ -1a.
  • FIG. 4 shows the expression of DC-STAMP m-RNA in primary bone marrow cells stimulated with activated vitamin D3.
  • FIG. 5 is a graph showing suppression of differentiation of RAW-D cells into osteoclasts by DC-STAMP siRNA.
  • Figure 6 shows osteoclast formation from RAW-D cells due to forced expression of DC-STAMP protein. It is a graph which showed promotion. .
  • FIG. 7 is a graph showing the inhibition of osteoclast formation from RAW-D cells by an anti-DC-STAMP antibody.
  • FIG. 8 is a graph showing the inhibition of osteoclast formation from mouse bone marrow cells by an anti-DC-STAMP antibody.
  • FIG. 9 is a graph showing suppression of resorption cavity formation by an anti-DC-STAMP antibody.
  • FIG. 10 is a graph showing the expression profiles of human RANK, RANKL, cathepsin K and TRAP genes in giant cell tumors.
  • FIG. 11 is a graph showing the expression profile of human DC-STAMP gene in giant cell tumor.
  • FIG. 12 is a graph showing the inhibition of osteoclast formation from human peripheral blood mononuclear cells by an anti-DC-STAMP antibody.
  • hybridize under stringent conditions means that hybridization is performed at 68 ° C. in a commercially available hybridization solution ExpressHyb Hybridization Solution (manufactured by Clontech), or After performing hybridization at 68 ° C in the presence of 0.7-1.0 M NaC1 using a filter with the immobilized solution, 0.1-2 times concentration of SSC solution (1 time) The concentration of SSC is 150 mM NaCl and 15 mM sodium citrate) .Hybridize under the conditions that can be identified by washing at 68 ° C or equivalent conditions. To do.
  • the present inventors have found that DC-STAMP is specifically expressed in giant cell tumors.
  • the present inventors have also found that the expression level of DC-STAMP increases when monocyte-derived cell lines differentiate into osteoclasts.
  • the DC-STAMP used in the present invention may be human or non-human mammals (eg, guinea pigs, rats, mice, nits, egrets, bushes, higgies, mice, monkeys, etc.). Purified and used directly from sphere cells, dendritic cells or bone marrow cells, or Can be used by preparing the cell membrane fraction of the above-mentioned cells, and can also be obtained by synthesizing DC-STAMP in vitro or producing it in host cells by genetic manipulation.
  • human or non-human mammals eg, guinea pigs, rats, mice, nits, egrets, bushes, higgies, mice, monkeys, etc.
  • DC-STAMP In genetic engineering, specifically, after DC-STAMP is inserted into a vector that can express it, it is synthesized in a solution containing enzymes, substrates and energy substances necessary for transcription and translation, or other prokaryotes, Alternatively, the protein can be obtained by expressing DC-STAMP by transforming a eukaryotic host cell.
  • the nucleotide sequence of human DC-STAMP cDNA has been registered with GenBank under the accession number: NM-030788, and is also shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, and its amino acid sequence is the sequence shown in the sequence listing. This is indicated by the number 2.
  • the nucleotide sequence of the mouse DC-STAMP cDNA has a long sequence containing the third exon registered in GenBank under the accession number: AB109560, and is also shown in SEQ ID NO: 3 'in the sequence listing. The sequence is shown in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing.
  • the nucleotide sequence of the mouse DC-STAMP splice variant cDNA with a short third exon has been registered in GenBank with accession number: AB1 09561, and is also shown in SEQ ID NO: 5 in the sequence listing, and its amino acid The sequence is shown in SEQ ID NO: 6 in the sequence listing.
  • the cDNA of DC-STAMP can be obtained, for example, by using a cDNA library expressing DC-STAMP as a type III and using a primer to specifically amplify the cDNA of DC-STAMP, the polymerase chain reaction (hereinafter referred to as "PCR ”) (Saiki, RK, etal., Science, (1988) 239, 487-49).
  • a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence complementary to at least any one of the nucleotide sequences selected from SEQ ID NOs: 1, 3, and 5 in the sequence listing under stringent conditions
  • a polynucleotide encoding a protein having a biological activity equivalent to that of -STAMP is also included in the cDNA of DC-STAMP.
  • a splicing palant transcribed from a human or mouse DC-STAM locus or a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions thereto and has a biological activity equivalent to that of DC-STAMP Polynucleotides encoding other proteins are also included in the cDNA of DC-STAMP.
  • DC-STAMP In the amino acid sequence shown in at least any one selected from SEQ ID NOs: 2, 4, and 6 in the sequence listing, one or several amino acids are substituted, deleted, A protein consisting of an added amino acid sequence and having a biological activity equivalent to that of DC-STAMP is also included in DC-STAMP. Furthermore, it is transcribed from the human or DC-STAMP locus. In the amino acid sequence encoded by the splicing variant or in the amino acid sequence, one or several amino acids have been substituted, deleted, or added. DC-STAMP also includes proteins having a sequence and having the same biological activity as DC-STAMP.
  • DC-STAMP is considered to be involved in the pathological condition of humans with enhanced bone resorption, such as GCT. That is, by measuring the expression level of DC-STAMP in each cell and / or each tissue, it is possible to determine the state of a bone metabolic disorder considered to be caused by overexpression of DC-STAMP.
  • the bone metabolic disorders described herein include osteoporosis (postmenopausal osteoporosis, senile osteoporosis, secondary osteoporosis due to the use of steroid-immunosuppressive agents, osteoporosis associated with rheumatoid arthritis), joint osteoporosis.
  • Bone destruction in horses, cancerous hypercalcemia, bone destruction due to multiple myeloma or cancer metastasis, tooth loss due to periodontitis, osteolysis around artificial joint, bone destruction in chronic osteomyelitis, bone Includes, but is not limited to, Paget's disease, renal osteodystrophy, osteogenesis imperfecta, and the like.
  • the “specimen” to be used for the purpose of examining the expression level of DC-STAMP in the present invention includes blood, bone marrow, bone, body fluid, prostate, testis, penis, bladder, and kidney obtained from subjects and clinical samples. , Oral cavity, pharynx, lips, tongue, gingiva, nasopharynx, esophagus, stomach, small intestine, large intestine, colon, liver, bile, england, nose, lungs, soft tissue, skin, breast, uterus, ovaries, brain, upper It refers to tissue such as thyroid gland, lymph node, muscle, adipose tissue, or excrement, but In the present invention, blood or bone marrow is more preferred.
  • a method for detecting a bone metabolism abnormality using the expression level of the DC-STAMP gene is, specifically, a method including the following steps 1) to 4).
  • Step 1) Extracting all RA fractions from the sample collected from the subject; Extracting all RNA fractions from the sample is derived from humans obtained by a method appropriate to the appropriate experimental ethical standards. Either dissolve the tissue directly in the RNA extraction solvent (for example, one containing a component that inactivates liponuclease, such as phenol), or use a scraper to prevent cell destruction in the tissue. Immediately proceed to the RNA extraction step after recovering the cells by, for example, nicking or gently extracting the cells from the tissue using a protease such as trypsin.
  • RNA extraction solvent for example, one containing a component that inactivates liponuclease, such as phenol
  • RNA extraction methods include guanidine thiocyanate / cesium chloride ultracentrifugation method, guanidine thiocyanate / hot phenol method, guanidine hydrochloride method, and acid guanidine thiocyanoate / phenol 'Cloguchiform method (Chomczynski, P. and d Sacchi. , Anal. Biochem. (1987), 162, 156-159), but the guanidine thiocyanate-phenol-clonal form method is preferred.
  • RNA extraction reagents eg, ISO GEN (manufactured by Futtsubon Gene Co., Ltd.), Chojo 12 ⁇ reagent (manufactured by Gibco 'BRL)), etc., should be used according to the protocol attached to the reagents You can also.
  • the obtained total RNA fraction is further purified to only mRNA if necessary.
  • the purification method is not particularly limited.
  • a biotinylated The mRNA (d T) is adsorbed to the dT probe, and the paramagnetic particles on which streptavidin is immobilized capture the mRNA using the binding between the biotin and streptavidin.
  • mRNA can be purified.
  • a method in which mRNA is adsorbed on an oligo (dT) cellulose column and then eluted and purified may be employed.
  • the step of purifying these mRNAs is not essential, and the entire RNA fraction is used in subsequent steps as long as the expression of the target polynucleotide can be detected. You can also.
  • a normal person means a person having no abnormal bone metabolism. Whether a person is normal can be determined by measuring the concentration of DC-STAMP and determining whether or not the concentration falls within a numerical range that is determined in advance as a normal person. The expression level of DC-STAMP can also be determined. By determining the correlation between the degree of abnormal bone metabolism and the degree of formation of abnormal bone metabolism in normal subjects, it is possible to determine whether the subject is a normal person by measuring the expression level of DC-STAMP in a sample collected from the subject You can also. The preparation of the whole RNA fraction from a normal person can be performed in the same manner as in the above step 1).
  • Step 3) A step of measuring the expression level of the DC-STAMP gene in the total RNA fraction described in the above step 1) and the total RNA fraction described in the above step 2):
  • the expression level of the DC-STAMP gene is determined from a polynucleotide comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing or a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. And the amount of polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with the given polynucleotide.
  • Examples of the immobilized sample include the following.
  • a gene chip on which an antisense oligonucleotide synthesized based on a sequence or an mRNA sequence is immobilized can be used.
  • a gene chip manufactured by Affymetrix (Affymetrix) (Lip shutz, RJ et al., Nature Genet. (1999) 21, suppliment, 20-24) is used. Although it is possible to do so, it is not limited to this, and it may be produced based on a known method.
  • human-derived mRNA is preferable.
  • human U95 set or U133 set manufactured by Affymetrix can be used.
  • the present invention is not limited thereto, and for example, those derived from closely related animals can be used.
  • the cDNA or RT-PCR product is cloned by performing a reverse transcriptase reaction or PCR with primers prepared based on sequence information such as human EST database.
  • This cDNA and RT-PCR product can be obtained by using the subtraction method (Diatchenki, L., et al., Supra) with total RNA that differs in expression between humans with bone metabolism abnormalities and humans without bone metabolic abnormalities. Natl. Aca d. Sci. USA, (1996) 93, 6025-6030), differential display method (Liang, P., et al Nucleic Acids Res., (1992) 23, 3685-3690). ) May be used.
  • a commercially available array eg, Intelligene: manufactured by Yukara Bio Inc.
  • the above cDNA or RT-PCR product may be used with a commercially available spotter (eg, GMS41). 7 Alayer: manufactured by Takara Bio Inc.).
  • the labeling probe used is not a specific mRNA clone but a label of all expressed mRNAs.
  • unpurified mRNA may be used as a starting material for preparing a probe, it is preferable to use poly (A) + RNA purified by the above-described method.
  • poly (A) + RNA purified by the above-described method.
  • Affilimetrics Gene Chip A biotin-labeled cRNA probe is prepared according to the protocol (Affymetrix Expression Analysis Technical Manual) attached to the Affymetrix Gene Chip. Then, according to the protocol (expression analysis technology manual) attached to the gene chip manufactured by Affimetrics, the hybridization was performed using an analysis device (GeneChip Fluidics Station 400) manufactured by Affimetrics. Perform one-shot and analysis to detect and analyze luminescence by avidin. '(Mouth) Array:
  • cDNA is fluorescently labeled by adding d-UTP or the like labeled with a fluorescent dye (eg, Cy3, Cy5, etc.).
  • a fluorescent dye eg, Cy3, Cy5, etc.
  • hybridization and washing are performed according to the company's protocol, and a fluorescent signal detector (for example, GMS 418 Array Scanner Analyze after detecting the fluorescent signal with Karabio Co., Ltd.).
  • a fluorescent signal detector for example, GMS 418 Array Scanner Analyze after detecting the fluorescent signal with Karabio Co., Ltd.
  • the array to be used is not limited to a commercially available array, and may be a home-made array or a specially prepared array.
  • a labeled probe is prepared by adding a radioisotope (for example, d-CTP, etc.), and hybridization is performed by a conventional method. After performing hybridization and washing using, for example, an atlas system (manufactured by Clontech), which is a commercially available Phil Yuichi microarray, an analyzer (for example, atlas image: Clontech) is used. Detection and analysis.
  • a radioisotope for example, d-CTP, etc.
  • the method according to any one of the above (a) to (8) also hybridizes a probe from each human tissue to the same solid-phased sample. At this time, the hybridization conditions other than the probe used are the same. Fluorescently labeled probe When used, if each probe is labeled with a different fluorescent dye, a mixture of both probes can be hybridized to one immobilized sample at a time to read the fluorescence intensity (Brown, PO et al.). Nature Genet., (1999) 21, supplement, 33-37).
  • Step 4) Analyze the difference in the expression level of the gene measured in the above step 3) between the entire RNA fraction from the above step 1) and the total RNA fraction from the above step 2) And a step of detecting an abnormal bone metabolism of the subject according to the above step 1).
  • DC-STAMP Analysis of the difference in the expression level of DC-STAMP between a sample derived from a normal person and a sample derived from a subject indicates that abnormal bone metabolism may be present in a sample in which DC-STAMP expression is significantly increased. Is high, and abnormal bone metabolism can be detected.
  • the expression level is significantly increased, for example, when analysis is performed using Affimetrics 'gene chip and using Affimetrics' microarray Suite Ver. 3.0, DC- This refers to a case where the averagedifference value of the STAMP gene is significantly increased as compared to a sample derived from a normal person.
  • the concentration of the DC-STAMP gene is measured, and it is analyzed whether or not the value falls within a numerical range determined in advance as a normal value.
  • Bone metabolism abnormality can be detected by judging that it has bone metabolism abnormality, and the expression level of DC-STAMP gene and the shape of bone metabolism abnormality in normal people By examining the correlation of the adult in advance, it is possible to determine whether or not the subject is a normal person by measuring the expression level of the DC-STAMP gene in the sample collected from the subject.
  • a method for detecting a bone metabolic disorder using the expression level of DC-STAMP is a method including the following steps 1) to 3).
  • sample After removing insoluble substances by performing high-speed centrifugation as necessary, prepare the sample as a sample for ELISASAZRIA or a sample for Westin blot as follows.
  • the collected extract of blood or bone marrow tissue may be used as it is, or may be appropriately diluted with a buffer.
  • Western blotting for electrophoresis
  • Mix with a sample buffer solution eg, manufactured by Sigma.
  • a dot-slot plot for example, the collected blood or bone marrow tissue extract itself or appropriately diluted with a buffer is adsorbed directly to the membrane using a blotting device.
  • the sample can be precipitated by immunoprecipitation, a method utilizing ligand binding, or the like, and detected without immobilization, or the sample to be detected can be immobilized as it is.
  • the membrane used for the western blotting method, the dot blot method or the slot blot method may be a nitrocellulose membrane (for example, manufactured by Biorad), a nylon membrane (for example, , High Pounds-ECL (Amersham-Pharmacia), etc.), Cotton Membrane (eg, Plotabsorbent Filter-1 (Bio-Rad)), or Polyvinylidene Difluoride (PVDF) membrane (eg, Bio-Rad) And the like).
  • samples or their diluents for example, 0.0
  • a dedicated 96-well plate for example, Imnoplate / Maxisorp (manufactured by Nunc)
  • Add 5% sodium azide in phosphate-buffered saline diluted with PBS
  • Add 5% sodium azide in phosphate-buffered saline diluted with PBS
  • incubate at 4 ° C to room temperature overnight, or at 37 ° C for 1 to 3 hours. In this way, the protein is adsorbed on the bottom surface of the well and solidified.
  • Antibodies to DC-STAMP are selected from DC-STAMP or the amino acid sequence of DC-STAMP using a conventional method (for example, see Shinsei Chemistry Laboratory Course 1, Protein 1, pages 389-397, 1992).
  • An arbitrary polypeptide can be immunized to an animal, and the antibody produced in the living body can be collected and purified.
  • a monoclonal antibody can also be obtained by establishing a hybridoma by fusing an antibody-producing cell that produces an antibody against -STAMP with a myeloma cell.
  • DC-STAMP as an antigen can be obtained by producing a DC-STAMP gene in a host cell by genetic manipulation.
  • a vector capable of expressing the DC-STAMP gene may be prepared, introduced into a host cell to express the gene, and the expressed DC-STAMP may be purified.
  • a host cell expressing DC-STAMP or a membrane fragment thereof may be used as an antigen.
  • DC-STAMP The expression level of DC-STAMP consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. It is indicated by the expression level of the protein.
  • the expression level can be measured using the above-mentioned anti-DC-STAMP antibody by a known method such as the Westin blot method or the dot noslot method.
  • Step 2) Step 2) Step of measuring the expression level of the protein described in 1) above in a sample collected from a normal person:
  • the expression level of DC-STAMP in a sample collected from a normal person can be measured in the same manner as in the above step 1).
  • Step 3) A step of analyzing the difference between the expression level of the protein measured in the above step 1) and the expression level of the protein measured in the above step 2) to detect abnormal bone metabolism in the subject.
  • Analysis of the difference in the expression level of DC-STAMP between a sample derived from a normal person and a sample derived from a subject indicates that abnormal bone metabolism may be present in a sample in which the expression level of DC-STAMP is significantly increased. And it can be determined that the bone metabolism is abnormal.
  • the concentration of DC-STAMP is measured, and it is analyzed whether the value falls within the value range determined in advance as a normal value. If the value exceeds the range determined as a normal value, bone metabolism is measured. An abnormal bone metabolism can be detected by determining that there is an abnormality.
  • DC- in a sample collected from a subject can be detected by previously examining the correlation between the expression level of DC-STAMP and bone metabolism in normal humans. By measuring the expression level of STAMP, it can be determined whether or not the subject is a normal person.
  • the DC-STAMP gene and DC-STAMP are specifically expressed in giant cell tumors, and their expression levels increase when monocyte-derived cell lines differentiate into osteoclasts.
  • a complete cDNA library derived from cells expressing DC-STAMP is used according to a known method such as the colony hybridization method.
  • Obtain long cDNA This full-length cDNA is introduced into cells derived from humans or cells derived from non-human mammals (eg, cells derived from guinea pigs, rats, mice, birds, rabbits, pigs, pigs, sheep, pigs, monkeys, etc.). To determine whether or not cells will be affected.
  • a method of incorporating the obtained full-length cDNA into a virus vector and administering it to an animal can be mentioned.
  • cDNA is incorporated into a DNA virus such as a retrovirus, an adenovirus, an adeno-associated virus, a herpes virus, a vaccinia virus, a box virus, a polio virus, or an RNA virus.
  • a DNA virus such as a retrovirus, an adenovirus, an adeno-associated virus, a herpes virus, a vaccinia virus, a box virus, a polio virus, or an RNA virus.
  • a method to introduce Of these, methods using retrovirus, adenovirus, adeno-associated virus, and vaccinia virus are preferred.
  • Non-viral gene transfer methods include a method of directly administering expression plasmid into muscle (DNA vaccine method), and a method of liposomal gene transfer.
  • the method includes a DNA method, a Lipofection method, a microinjection method, a calcium phosphate method, and an electrophoresis method. Among them,
  • full-length cDNA is derived from a human-derived cell or a non-human mammal-derived cell (eg, guinea pig, rat, mouse, chicken, egret, pig, hidge, , Monkey-derived cells), monocyte-derived cells, lymph node-derived cells, muscle cells, hepatocytes, adipocytes, or skin cells, etc., and are highly expressed to achieve the functions of each target cell.
  • a human-derived cell or a non-human mammal-derived cell eg, guinea pig, rat, mouse, chicken, egret, pig, hidge, , Monkey-derived cells
  • monocyte-derived cells eg, lymph node-derived cells, muscle cells, hepatocytes, adipocytes, or skin cells, etc.
  • the cDNA is integrated into a vector containing an appropriate promoter and a sequence involved in expression of the gene, and the vector is used to transform a host cell.
  • a vertebrate cell expression promoter those having a promoter, an RNA splice site, a polyadenylation site, a transcription termination sequence, and the like, which are usually located upstream of the gene to be expressed, can be used.
  • a replication origin may be provided.
  • An example of such an expression vector is p SV 2 dhfr (Subramani, S.
  • the expression vector can be prepared by the following method: getylaminoethyl (DEAE) -dextran method (LuthDian, H. and Magnusson, G., Nucleic Acids Res., (1983) 11, 1295-1308), calcium phosphate-DNA coprecipitation method.
  • transgenic animals can be produced by genetic manipulation so that the target gene is highly expressed in normal animals, and it is possible to examine the effects on cell morphology.
  • Examples of the substance that suppresses the expression of DC-STAMP include an antisense nucleic acid and an siRNA against the DC-STAMP gene.
  • Substances that inhibit the function of DC-STAMP include antibodies that specifically bind to DC-STAMP.
  • the DC-STAMP gene and Z or DC-STAMP can be detected using a kit containing at least one selected from the group consisting of 1) to 5) below.
  • the primer described in 1) above is based on the nucleotide sequence of the DC-STAMP gene (the nucleotide sequence shown in SEQ ID NOS: 1, 3 and / or 5 in the Sequence Listing) and a commercially available primer design software (for example, It can be easily designed and amplified by a conventional method, such as using sin GCG package Version 10.2).
  • the probe according to 2) is a polynucleotide that specifically hybridizes to DC-STAMP, and has a length of 100 to 150 bases, preferably 300 to 600 bases. It is long.
  • These primers and probes can be labeled (eg, , An enzyme label, a radioactive label, a fluorescent label, etc.) or a linker may be added.
  • the solid-phased sample described in 3) above is prepared by immobilizing the probe described in 2) above on a solid phase such as a glass plate or nylon membrane.
  • a solid phase such as a glass plate or nylon membrane.
  • the method for preparing such a solid-phased sample has already been described in the section “(1) Detection method for bone metabolism abnormality using the expression level of DC-STAMP gene” in the section “2.
  • examples thereof include a gene chip, a cDNA array, an oligo array, and a membrane filter.
  • the kit of the present invention can further include a thermostable DNA polymerase, dNTP (a mixture of dATP, dCTP, dGTP, and dTTP) and a buffer.
  • dNTP a mixture of dATP, dCTP, dGTP, and dTTP
  • the heat-resistant DNA polymerase include Taq DNA polymerase, LAT aq DNA poymerase (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.), Tth DNA polymerase, and Pfu DNA polymerase.
  • the buffer is selected according to the DNA polymerase to be used, and Mg 2 + or the like is added as necessary.
  • the antibody described in 4) and 5) above is a method for detecting abnormal bone metabolism using (2) the expression level of DC-STAMP (the expression level of protein) in the section “2. Detection of abnormal bone metabolism” above. Method and the method described in “6. Production of anti-DC-STAMP antibody”.
  • the antibody may be label
  • the kit of the present invention can be used for the detection of the DC-STAMP gene and NO or DC-STAMP, and can also be used to determine the presence or absence of bone metabolism abnormalities and to screen for substances that inhibit the progression of bone metabolic abnormalities. Can be.
  • One embodiment of the present invention includes a method for screening a substance that inhibits differentiation into an osteoclast by measuring the expression level of the DC-STAMP gene and / or DC-STAMP.
  • a method for screening a substance having a therapeutic effect and / or a prophylactic effect on bone metabolic disorders by identifying a substance that inhibits the osteoclast differentiation promoting activity of DC-STAMP. can be mentioned.
  • test substance refers to the inhibition of differentiation into osteoclasts by the screening method of the present invention.
  • Test substances include compounds, metabolites of microorganisms, extracts of plant and animal tissues, derivatives thereof, and mixtures thereof.
  • nucleic acids or their derivatives including antisense oligonucleotides, ribozymes, dsRNA, siRNA, etc. designed to reduce the expression level of DC-STAMP can be used as test substances. is there.
  • the dose and concentration of the test substance can be set as appropriate, or a plurality of doses can be set, for example, by preparing a dilution series, and can be administered in an appropriate state such as a solid or liquid.
  • the cells can be added to a medium and cultured. When it is added to the medium, it may be added from the start of the culture, or may be added during the culture, and the number of additions is not limited to once.
  • the period for culturing in the presence of the test substance may be appropriately set, but is preferably 30 minutes to 2 weeks, and more preferably 30 minutes to 48 hours.
  • administration forms such as oral administration, intravenous injection, intraperitoneal injection, transdermal administration, and subcutaneous injection are used depending on the physical properties of the test substance.
  • the time from the administration of the test substance to the obtaining of the specimen can be appropriately selected. .
  • Cultured cells used in the screening method of the present invention may be normal cells or cells showing abnormal proliferation such as cancer cells, as long as they are mammalian cells expressing DC-STAMP.
  • Monocyte-derived cells RAW264.7 ATCC Cat. No TIB-71
  • RAW264 cells ECACC Cat. No. 85062803
  • RAW-D cells Watanabe et al., J. Endocrinol., (2004) 180, 193- 201
  • primary cultured cells derived from mouse bone marrow but are not limited thereto.
  • the mammalian species of the cultured cells are preferably humans, mice, or other mammals (guinea pigs, rats, nits, egrets, bushes, sheep, magpies, monkeys, etc.).
  • DC-STAMP mammalian cells overexpressing DC-STAMP as the cultured cells.
  • the DC-STAMP gene is introduced together with its promoter region to overexpress DC-STAMP.
  • a test substance is administered to a mammalian individual without using cultured cells, and then the organ or tissue cell extracted from the animal individual is treated with the test substance. And a method for detecting the expression of the DC-STAMP gene in the cell.
  • the organ or tissue for which gene expression is to be detected may be any organ or tissue that expresses DC-STAMP. It is preferably a tissue in which bone metabolism is abnormal, and more preferably bone marrow.
  • Non-human mammals can be used as the mammal species, preferably a mouse, rat or hamster, and more preferably a mouse or rat.
  • Animal models showing abnormal bone metabolism include ovariectomized animals, orchidectomized animals, tumor-bearing animals transplanted with tumor cells subcutaneously, intradermally, left ventricle, bone marrow, vein, or abdominal cavity, sciatic nerve-excised animals, adjuvant G model arthritis, collagen-induced arthritis model, glucocorticoid-induced osteoporosis model, aging-promoting mouse (SAMP6 mouse, Matsushita et al., Am. J. Pathol.
  • thyroid ⁇ Parathyroidectomy animals parathyroid hormone-related peptide (PTHrP) continuous infusion animals, osteoclastogenesis inhibitor (0CIF) knockout mice (Mizuno et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., (1998) 247, 610-615) and the like.
  • PTHrP parathyroid hormone-related peptide
  • osteoclastogenesis inhibitor (0CIF) knockout mice (Mizuno et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., (1998) 247, 610-615) and the like.
  • an animal model of tooth loss due to periodontal disease or an animal in which DC-STAMP is overexpressed can be used.
  • the test substance selected by screening is administered to the above animal model, and varies depending on bone metabolism abnormalities such as the number of osteoclasts in bone tissue, bone density, bone strength or blood Ca concentration. By measuring each parameter, the therapeutic effect and / or preventive effect of the test substance on abnormal bone metabolism can
  • the cultured cells used in the method of the present invention may be cultured under any conditions that can express DC-STAMP when RANKL and TNF-a; are added when no test substance is added.
  • known culture conditions are known for the cultured cells, and when the cells express DC-STAMP under such conditions, they may be cultured under such conditions.
  • the breeding condition of the animal when detecting the expression of DC-STAMP in an organ or tissue isolated from a mammalian individual, may be any condition that allows expression of DC-STAMP when no test substance is added.
  • test substances that suppress the expression of DC-STAMP gene and / or DC-STAMP are abnormal bone metabolism, preferably osteoporosis, rheumatoid arthritis and It is considered to be a substance having a therapeutic effect and / or a preventive effect on cancer and / or cancerous hypercalcemia.
  • Extraction of total RNA, measurement of DC-STAMP gene expression, and measurement of DC-STAMP expression from cultured cells are performed according to the method described in the section “2.Detection of abnormal bone metabolism” above. be able to.
  • cultured cells derived from mammals add an appropriate amount of RANKL and TNF-Q! Together with the test substance to the medium as necessary, and use RANKL and TNF- ⁇ in the control without the test substance. Is added in an appropriate amount.
  • a method using a mammalian-derived cultured cell for example, a method using a mammalian individual, and a method using a mammalian individual are as follows.
  • Mouth a step of extracting total RNA from cultured cells derived from mammals cultured in a medium to which no test substance is added;
  • the screening method using the measurement of the expression level of DC-STAMP includes the following steps for a method using cultured mammalian cells and a method using an individual animal, respectively.
  • Mouth a step of measuring the expression level of the DC-STAMP protein in the solid-phased protein; c) the expression level of the DC-STAMP detected in the above-mentioned mouth) and a mammal cultured in a medium to which no test substance is added. Analyzing the difference in the expression levels of all proteins obtained from cultured cells derived from animals to determine the therapeutic and / or preventive effects of the test substance on bone metabolism disorders.
  • Mouth a step of immobilizing all proteins obtained from cultured cells derived from mammals cultured in a medium to which no test substance is added;
  • Mouth Analyze the difference between the expression level of DC-STAMP measured in the above step a) and the expression level of the protein in rubber collected from a mammal individual to whom the test substance was not administered. Determining the therapeutic and / or preventive effect of the substance on bone metabolism disorders.
  • Mouth a step of measuring the expression level of the protein in a sample collected from a mammal individual to which the test substance has not been administered;
  • Mouth a step of measuring the expression level of the DC-STAMP protein in the solid-phased protein; c) the expression level of the DC-STAMP protein detected in the above-mentioned mouth) and a mammal to which the test substance was not administered Pray for differences in the expression level of the protein in specimens collected from individuals and determine the therapeutic and / or preventive effect of the test substance on bone metabolism disorders
  • a step of detecting the expression level of the DC-STAMP protein in the solid-phased protein described in the above step a) using an antibody or a ligand that specifically binds to the protein; Detecting the expression level of the DC-STAMP protein in the immobilized protein using an antibody or Rigakud that specifically binds to the protein; e) the expression level of the protein detected in c) above; A) analyzing the difference in the expression level of the protein detected in the above, and judging the therapeutic effect and / or the preventive effect of the test substance on abnormal bone metabolism.
  • the incidence of abnormal bone metabolism in the mammal administered the test substance is significantly reduced, the degree of abnormal bone metabolism is significantly smaller, and the survival rate of Z or Z is about 10% or more, preferably When the increase is about 30% or more, more preferably about 50% or more, the test substance can be selected as a compound having a therapeutic and / or preventive effect on bone metabolism disorders.
  • DC-STAMP or a polypeptide comprising at least six consecutive partial amino acid sequences thereof, or a derivative obtained by adding an arbitrary amino acid sequence or a carrier thereto, is used as an antigen for producing an anti-DC-STAMP antibody.
  • a polypeptide comprising at least six consecutive partial amino acid sequences thereof, or a derivative obtained by adding an arbitrary amino acid sequence or a carrier thereto is used as an antigen for producing an anti-DC-STAMP antibody.
  • DC-STAMP can be used by directly purifying it from blood cells or bone marrow cells, or a cell membrane fraction of these cells can be prepared and used.
  • DC-STAMP can be synthesized in vitro, or It can be obtained by producing it in a host cell by genetic manipulation.
  • Prokaryotic host cells include, for example, large intestine teeth (Escherichia coli) and Bacillus subtilis.
  • the host cell is transformed with a plasmid vector containing regulatory elements and a replicon or origin of replication from a species compatible with the host. Further, it is preferable that the vector has a sequence capable of imparting phenotypic (phenotypic) selectivity to the transformed cell.
  • K12 strain and the like are often used as Escherichia coli
  • PBR322 and pUC-based plasmids are generally used as the vector, but are not limited thereto, and various known strains and vectors may be used. Can be used.
  • promoters include tributophan (trp) promoter, lactose (lac) promoter, tryptophan lactose (tac) promoter, lipoprotein (lpp) promoter, and polypeptide chain elongation.
  • trp tributophan
  • lac lactose
  • tac tryptophan lactose
  • lpp lipoprotein
  • Tu (tufB) pro including promoters, and any promoter Can be used to produce
  • Bacillus subtilis for example, 207-25 strains are preferable, and as the vector, p TUB228 (Ohmura, K. et al. (1984) J. Biochem. 95, 87-93) is used. However, it is not limited to this. By linking a D D sequence that encodes the signal peptide sequence of ⁇ -amylase of Bacillus subtilis, extracellular secretory expression is also possible.
  • Eukaryotic host cells include cells such as vertebrates, insects, and yeast.
  • vertebrate cells include mouse monocyte-derived cells RAW264.7 (ATCC Cat. No TIB-71) and RAW264 cells (ECACC Cat. No. 85062803), RAW-D cells (Watanabe et al., J. Endocrinol., (2004) 180, 193-201), monkey COS cells (Gluzman, Y., Cell , (1981) 23, 175-182, AT CCCRL—165), mouse fibroblast NIH 3T 3 (ATCC No.
  • CRL 168 8
  • C HO Cells AT CCCCL-6 1
  • dihydro folate reductase deficient strains Urlaub, G. and Chasin, LA, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1980) 77, 4126-4220 are frequently used. But not limited to these.
  • a vertebrate cell expression promoter one having a promoter, an RNA splice site, a polyadenylation site, and a transcription termination sequence, which are usually located upstream of the gene to be expressed, can be used. It may have a replication origin.
  • the expression vector include pCDNA3.1 (produced by Impitogen) having a cytomegalovirus early promoter and pSV2dhfr (Subramani, S. et al.) Having an early promoter of SV40. al., Mo 1. Cell. Biol., (1981) 1, 854-864), but not limited thereto.
  • COS cells or NIH 3T3 cells are used as host cells.
  • an expression vector it has an SV40 origin of replication and is capable of autonomous growth in COS cells or NIH3T3 cells.
  • transcription promoters, transcription termination signals, and RNA splices A device having a site can be used.
  • the expression vector is prepared by the DE AE-dextran method (Luthman, H. and Magnusson, G., Nucleic Acids Res., (1983) 11, 1295-1308), calcium phosphate, Shim-DNA coprecipitation method (Graham, FL and van der Eb, AJ, Virology, (1973) 52, 456-457), and electric pulse perforation method (Neumann, E.
  • a vector capable of expressing the neo gene functioning as an antibiotic G418 resistant gene together with an expression vector, for example, a length of 3 ⁇ 11.6 0 (Sambrook, J. et al. (1989): “Molecular Cloning A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, NY) and p SV 2 neo (Southern, PJ and Berg, P., J. Mol. 'Appl. Genet , (1982) 1, 327-341), and selecting G418-resistant colonies to obtain transformed cells stably producing the polypeptide of interest. it can.
  • the transformant obtained as described above can be cultured according to a conventional method, and the culture produces the desired polypeptide in a cell, on a cell membrane, or extracellularly.
  • the medium used for the culture various types commonly used depending on the host cell used can be appropriately selected.
  • a medium such as a culture medium (hereinafter referred to as “DMEM”) to which serum components such as fetal calf serum are added as necessary can be used.
  • Recombinant proteins produced in the cells of the transformant, on the cell membrane, or outside the cells by the above culture can be separated by various known separation procedures utilizing the physical and chemical properties of the proteins. It can be purified.
  • Examples of the method include, for example, treatment with a normal protein precipitant, ultrafiltration, molecular sieving chromatography (gel filtration), adsorption chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, and high-speed chromatography.
  • Examples include various types of liquid chromatography such as liquid chromatography (HP LC), dialysis methods, and combinations thereof.
  • HP LC liquid chromatography
  • histidine consisting of 6 residues is buried in the recombinant protein to be expressed, so that the protein can be efficiently purified with a nickel affinity column.
  • a method for producing a monoclonal antibody will be described in detail along the above steps, but the method for producing the antibody is not limited thereto.
  • antibody-producing cells other than spleen cells and myeloma may be used.
  • DC-STAMP prepared by the method described above or a part thereof can be used. Further, the membrane fraction prepared from the DC-S TAMP-expressing recombinant cells, or the DC-S TAMP-expressing recombinant cells themselves, and the protein of the present invention chemically synthesized using a method well known to those skilled in the art. Partial peptides can also be used as antigens.
  • the antigen obtained in step (a) is mixed with an adjuvant such as Freund's complete or incomplete adjuvant or liposomal liposome to immunize experimental animals as an immunogen.
  • an adjuvant such as Freund's complete or incomplete adjuvant or liposomal liposome
  • an animal used for a known hybridoma production method can be used without any trouble.
  • a mouse, a rat, a goat, a sheep, a horse, a horse, and the like can be used.
  • mice or rats are preferably used as immunized animals.
  • mice and rats there are no particular restrictions on the strains of mice and rats used, and in the case of mice, for example, each strain A, AKR, BALB / c, BDP, BA, CE, C3H, 57BL, C57BR, C57L, DBA , FL, HTH, HT1, LP, NZB, NZW, RF, RIIK SJL, SWR, WB, 129, etc., and in the case of a rat, for example, Low, Lewis, Spraque, Daweley, ACI, BN, Fischer Etc. can be used.
  • mice and rats can be obtained from experimental animal breeding distributors such as CLEA Japan, Japan Charlsliver, SL The Jackson Laboratories Japan.
  • the BALB / c strain is particularly preferable as a mouse and the low strain as a rat in a rat. It is also preferable to use a mouse in which the biological mechanism for removing autoantibodies is reduced, that is, an autoimmune disease mouse, in consideration of homology between the antigen human and the mouse.
  • the age of these mice or rats at the time of immunization is preferably 5 to 12 weeks, and more preferably 6 to 8 weeks.
  • a preferred method in the present invention is specifically described as follows, for example. That is, first, a membrane protein fraction, which is an antigen, or cells expressing the antigen are administered intradermally or intraperitoneally to an animal. However, in order to enhance immunity efficiency, it is preferable to use both of them.
  • Intradermal administration is performed in the first half and intraperitoneal administration is performed only in the second half or the last time.
  • the antigen administration schedule varies depending on the type of animal to be immunized, individual differences, etc., but in general, the antigen administration frequency is preferably 3 to 6 times, and the administration interval is 2 to 6 weeks, and the administration frequency is 3 to 4 times, and the administration interval. More preferably, 2 to 4 weeks. Too many doses It is not preferable to waste the antigen easily, and if the administration interval is too wide, the cells become less active due to aging of the animal.
  • the dose of the antigen varies depending on the type of animal, individual differences, etc., but is generally 0.05 to 5 ml, preferably about 0.1 to 0.5 ml.
  • the booster immunization is performed 1 to 6 weeks, preferably 2 to 4 weeks, more preferably 2 to 3 weeks after the antigen administration as described above. If this booster is later than week 6, or earlier than week 1, the booster effect will be less.
  • the amount of antigen to be used for boosting varies depending on the type and size of the animal, but is generally 0.05 to 5 ml, preferably 0.1 to 0.5 ml, more preferably, for example, for mice. Is about 0.1-0.2 ml. Unnecessary large doses not only reduce the immune effect, but are not preferred for the immunized animals.
  • the antibody titer is measured, and the efficiency of the subsequent operation can be increased by using the animal having a sufficiently high antibody titer as a source of the antibody-producing cells.
  • the methods for measuring the antibody titer used here include various known techniques such as the RIA method, the ELISA method, the fluorescent antibody method, the passive hemagglutination method, and the detection sensitivity, speed, accuracy, and operation. From the viewpoint of the possibility of automation of RIA, the RIA method or the ELISA method is more preferable.
  • the measurement of the antibody titer in the present invention can be carried out, for example, by the following procedure according to the ELISA method.
  • the purified or partially purified antigen is adsorbed on a solid surface such as a 96-well plate for ELISA, and the solid surface on which the antigen is not adsorbed is exposed to a protein unrelated to anti-II, for example, Pseudoserum albumin (hereinafter referred to as “serum albumin”).
  • the sample After washing the surface, the sample is contacted with a serially diluted sample (for example, mouse serum) as a first antibody, and the monoclonal antibody in the sample is bound to the antigen. Further, an antibody against the mouse antibody labeled with an enzyme is added as the second antibody, and the antibody is bound to the mouse antibody.
  • a serially diluted sample for example, mouse serum
  • an antibody against the mouse antibody labeled with an enzyme is added as the second antibody, and the antibody is bound to the mouse antibody.
  • the substrate of the enzyme is added, and the change in absorbance due to color development based on the decomposition of the substrate is measured, thereby obtaining the antibody titer calculate. Isolation of antibody-producing cells from these spleen cells or lymphocytes can be performed by a known method.
  • myeloma Preparation of myeloma cells (hereinafter referred to as "myeloma")
  • Myeloma cells used for cell fusion are not particularly limited, and can be appropriately selected from known cell lines and used. However, considering the convenience of selecting hybridomas from fused cells, it is preferable to use HGPRT (Hypox anthine-guanine phosphor ibosyl transferase) -deficient ilfe, for which the selection procedure has been established. No.
  • HGPRT Hypox anthine-guanine phosphor ibosyl transferase
  • HGPRT-deficient strains can be obtained, for example, from the American Type Culture Collection (ATCC).
  • cell lines were prepared by adding a suitable medium, for example, 8-azaguanine medium [RPMI-164 medium, supplemented with glutamine, 2-mercaptoethanol, gentamicin, and fetal calf serum (FCS).
  • a suitable medium for example, 8-azaguanine medium [RPMI-164 medium, supplemented with glutamine, 2-mercaptoethanol, gentamicin, and fetal calf serum (FCS).
  • FCS fetal calf serum
  • IMDM Iscove's Modified Dulbecco's Medium
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • subculture 3 to 4 days before cell fusion in normal medium eg, ASF 104 medium containing 10% FCS (manufactured by Ajinomoto Co., Inc.)]. set aside 2 X 1 0 7 or more cell number day of fusion.
  • the fusion of the antibody-producing cells with the Mie cell is performed by a known method (Weir, DM, Handbook of Experimental Immuno 1 ogy Vo 1.I. II.III., BLackwe 11 Scientific Publications). , Oxford (1987), Kabat, EA and Mayer, MM, Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas Publisher Spigfield, Illinois (1964), etc.) can be appropriately carried out under conditions that do not extremely reduce the cell viability.
  • Such methods include, for example, a chemical method of mixing antibody-producing cells and myeloma cells in a high-concentration polymer solution such as polyethylene glycol, or a physical method utilizing electrical stimulation. Can be .. Among them, specific examples of the above chemical method are as follows.
  • polyethylene 'daricol when used as the high-concentration polymer solution, it can be dissolved in a polyethylene glycol solution having a molecular weight of 1500 to 6000, preferably 2000 to 4000, at a temperature of 30 to 40 ° (:, preferably, 35 to 40 ° C.).
  • the antibody producing cells and myeloma cells are mixed at a temperature of 338 for 1-10 minutes, preferably for 5-8 minutes.
  • the method for selecting the hybridoma obtained by the cell fusion is not particularly limited, but is usually a HAT (hypoxanthine / 7 minobuterin * thymidine) selection method [Kohler et al., Nature, 256, 495 (1975); a, Nature 266, 550 (1977)].
  • This method is effective for obtaining hybridomas using myeloma cells of an HGPRT-deficient strain that cannot survive aminobuterin. That is, by culturing unfused cells and hybridomas in a HAT medium, only hybridomas having resistance to aminobuterin can be selectively left and grown.
  • a methylcellulose method such as a methylcellulose method, a soft agarose method, and a limiting dilution method can be used as a method for closing a hybridoma [eg, Barbara, BM and Stanley, MS: Selected Methods in Cellular Immunology, WH Freeman and Company, San Francisco (1980)].
  • Examples of the cloning method include a limiting dilution method in which a single well of the plate is diluted so that one hybridoma is contained in the plate, a soft agar method in which the colony is collected by culturing in a soft agar medium, and a micromanifold method.
  • One method is to take out and culture one cell at a time, and one cell is sorted using a cell sorter.
  • the limiting dilution method is particularly preferred.
  • a rat fetal fibroblast cell line or a normal mouse spleen Inoculate a feeder of cells, thymocytes, and ascites cells.
  • the hybridomas are diluted in advance in the culture medium to 0.2 to 0.5 cells / m1 and the suspension of the diluted hybridomas is added to each well in a volume of 0.1 m1.
  • the hybridomas can be grown by replacing the medium with a new one at regular intervals (for example, every three days) for about two weeks while replacing the medium.
  • cloning by limiting dilution for example, is repeated 2 to 4 times, and those with a stable antibody titer are selected as anti-DC-STAMP monoclonal antibody-producing hybridoma strains.
  • hybridomas selected in this manner By culturing the hybridomas selected in this manner, monoclonal antibodies can be obtained efficiently.However, prior to culturing, hybridomas producing the desired monoclonal antibodies can be screened. desirable. A known method can be used for this screening.
  • the measurement of the antibody titer in the present invention can be carried out, for example, by the following procedure according to the ELISA method.
  • purified or partially purified DC-STAMP or cells expressing DC-STAMP is adsorbed on a solid surface such as a 96-well plate for ELISA.
  • a solid surface such as a 96-well plate for ELISA.
  • an irrelevant protein for example, serum albumin (hereinafter, referred to as “BSA”)
  • BSA serum albumin
  • an antibody against a mouse antibody labeled with an enzyme is added as a second antibody to bind to the mouse antibody.
  • a substrate of the enzyme is added, and a change in absorbance due to color development based on the decomposition of the substrate is measured. This calculates the antibody titer.
  • Such screening may be performed after the hybridoma is closed as described above, or may be performed before it.
  • the hybridoma obtained by the above method can be stored in a frozen state in liquid nitrogen or a freezer at 180 ° C or lower.
  • the hybridoma is cultured by changing the medium from HT medium to normal medium.
  • Large-scale culture can be performed by rotating culture using large culture bottles or spin culture. This is performed in a nutrient culture.
  • a monoclonal antibody specifically binding to the protein of the present invention can be obtained.
  • a hybridoma into the peritoneal cavity of a mouse of the same strain (for example, the above-mentioned BALB / c) or Nu / Nu mouse, and growing the hybridoma, the monoclonal antibody of the present invention can be obtained.
  • a large amount of ascites can be obtained.
  • the monoclonal antibody obtained by the above method can be purified, for example, by the method described in Weir, DM: Handbook of Experimental Immunology Vol. I, II, III, Black el Scientific Publications, Oxford (1978). That is, they include ammonium sulfate salting out method, gel filtration method, ion exchange chromatography method, affinity chromatography method and the like. Of these methods, the monoclonal antibody can be purified by repeating the ammonium sulfate precipitation method 3 to 4 times, preferably 3 to 6 times. However, in this method, the yield of purified monoclonal antibody is extremely low.
  • a highly purified monoclonal antibody can be obtained in a high yield.
  • the combination and sequence of the ammonium sulfate precipitation and other methods include (i) ammonium sulfate precipitation—ion exchange chromatography—gel filtration, and (ii) ammonium sulfate precipitation—ion exchange chromatography.
  • Examples of the method include the method of affinity chromatography and the method of (iii) ammonium sulfate precipitation / gel filtration—affinity chromatography. In order to obtain, the combination of the above (iii) is particularly preferred.
  • a commercially available monoclonal antibody purification kit for example, MAbT'rapGII kit; manufactured by Pharmacia
  • the thus obtained monoclonal antibody has high antigen specificity against DC-STAMP.
  • the isotype and subclass of the monoclonal antibody thus obtained can be determined as follows.
  • the identification method includes the Ouchterlony method, the ELISA method, or the RIA method.
  • the Octel method is simple but requires concentration if the concentration of monoclonal antibody is low.
  • the ELISA method or the RIA method is used, the culture supernatant is reacted with the antigen-adsorbed solid phase as it is, and antibodies corresponding to various immunoglobulin isotypes and subclasses are used as the secondary antibodies, thereby obtaining a monoclonal antibody.
  • a commercially available identification kit for example, mouse type kit; manufactured by Bio-Rad
  • a commercially available identification kit for example, mouse type kit; manufactured by Bio-Rad
  • Immunoglobulin G (hereinafter simply referred to as “IgG”) is a light polypeptide chain having a molecular weight of about 230,000 (hereinafter, referred to as “light chain”), and heavy polypeptide having a molecular weight of about 500,000. It consists of two peptide chains (hereinafter referred to as “heavy chains”). Both the heavy chain and the light chain have a repeating structure of a conserved amino acid sequence consisting of about 110 residues, and these are the basic units of the three-dimensional structure of IgG (hereinafter referred to as “domain”). ). The heavy and light chains are composed of four and two consecutive domains, respectively.
  • variable domain In both heavy and light chains, the amino-terminal domain has a greater variation in amino acid sequence between antibody molecules than the other domains, and this domain is referred to as a variable domain (V domain). ).
  • V domain variable domain
  • heavy and light chain V domains are complementary And form a variable region.
  • the remaining domains form a constant region as a whole.
  • the constant region has a sequence characteristic of each animal species.For example, since the constant region of mouse IgG is different from that of human IgG, mouse IgG Recognized as a foreign substance by the immune system, resulting in a human anti-mouse antibody (HAMA) response (Schloff et al., Cancer Res., (1985) 45, 879-85). ). Therefore, mouse antibodies cannot be administered repeatedly to humans. In order to administer such an antibody to humans, it is necessary to modify the antibody molecule so as not to cause a HAMA response while maintaining the specificity of the antibody.
  • HAMA human anti-mouse antibody
  • such a domain generally has a long cylindrical structure in which two layers of antiparallel ⁇ -sheets each consisting of three to five ⁇ -chains are overlapped.
  • variable region three loops are assembled in each of the heavy and light chain V domains to form an antigen binding site.
  • Each of these loops is a complementarity determining region
  • CDR complementarity determining region
  • each framework consists of a plurality of subgroups whose amino acid sequences have common characteristics. Was classified. Furthermore, it was found that there was a corresponding framework between human and mouse. From the study on the structural characteristics of IgG, the following method for producing a humanized antibody was devised.
  • a chimeric antibody was proposed in which the variable region of a mouse-derived antibody was joined to a human-derived constant region (see Proc. Nail. Acad. Sci. USA 81-6851-6855, (1984)). .
  • such chimeric antibodies still contain many non-human amino acid residues and can induce a HAM A response, especially when administered for long periods of time (Begent et al., Br. J. Cancer, (1990) 62, 487).
  • a non-human mammal-derived animal that may develop a HAMA response to humans
  • a method for further reducing the number of amino acid residues a method has been proposed in which only the CDR portion is incorporated into a human-derived antibody (see Nature, 321, 522-525, (1986)). Transplantation with CDR alone was not enough to maintain the activity.
  • an antibody derived from a non-human mammal having a CDR to be transplanted is defined as a “donor”, and a human antibody to which the CDR is transplanted is defined as an “acceptor”, and the present invention also complies with this definition. I do.
  • a point to consider when performing the CDR transplantation method is to preserve the structure of the CDR as much as possible and to maintain the activity of the immunoglobulin molecule. To achieve this goal:.
  • the amino acid is in the immediate vicinity of one of the CDRs; (c) It is expected that the amino acid has a side chain atom within about 3 A of the CDR in the three-dimensional immunoglobulin model and is capable of interacting with the antigen or with the CDR of the humanized antibody.
  • the DNA encoding the heavy or light chain of the anti-DC-STAMP monoclonal antibody of the present invention is prepared from mRNA prepared from the above-mentioned anti-DC-STAMP monoclonal antibody-producing hybridoma cells, and the mRNA is c-reversed with reverse transcriptase. After conversion to DNA, the DNA is obtained by isolating DNAs encoding the heavy or light chains of the antibody, respectively.
  • a guanidine-thiocyanate-hot-phenol method for the extraction of mRNA, a guanidine-thiocyanate-hot-phenol method, a guanidine 'thiocine-toguanidine' hydrochloric acid method, or the like may be employed, but the guanidine-thiocyanate-cesium chloride method is preferred.
  • a carrier for poly (A) + RNA purification such as oligo (dT) cellulose or oligo (dT) latex beads is prepared from the total RNA.
  • a method of directly purifying from a cell lysate using the carrier for the extraction of mRNA, a guanidine-thiocyanate-hot-phenol method, a guanidine 'thiocine-toguanidine' hydrochloric acid method, or the like may be employed, but the guanidine-thiocyanate-cesium chloride method is preferred.
  • the methods for preparing total RNA include alkaline sucrose dense gradient centrifugation (Dougherty, WG and Hiebert, E., Viology, (1980) 101, 466-474), guanidine thiosinate and phenol. Method, guanidine thiosine-trifluorocesium method, phenol-SDS method and the like can be adopted, but a method using guanidine thiocyanate and cesium chloride (Chirgwin, JM, et a, (1979) Biochemistry , (1979) 18, 5294-5299).
  • a single-stranded cDNA is synthesized by a reverse transcriptase reaction, and a double-stranded cDNA is converted from the single-stranded cDNA.
  • This method includes the SI nuclease method (Eistrati ad is, A., et al., Cell, (1976) 7, 279-288), the Gubler-Hoffman method (Gub 1 er, U. and Hoffman, BJ, Gene, (1983) 25, 263-269), and the Okayamaberg method (Okayama, H. and Berg, P., Mol. Cel 1. Biol., (1982) 2, 16-170).
  • PCR polymerase chain reaction
  • the double-stranded cDNA thus obtained was incorporated into a cloning vector,
  • the resulting recombinant vector is introduced into a microorganism such as Escherichia coli for transformation, and a transformant can be selected using tetracycline resistance or ampicillin resistance as an index.
  • the transformation of Escherichia coli was performed by the Hanahan method (Hanahan, D., J. Mol. Biol., (1983) 166, 557-580).
  • the method can be carried out by adding the recombinant DNA vector to cells.
  • a plasmid as a vector, it is necessary to have the above-mentioned drug resistance gene.
  • Cloning vectors other than plasmids, such as lambda phage can also be used.
  • sense strand and antisense strand oligonucleotide primers corresponding to a part of the amino acid sequence are synthesized, and these are combined to obtain a polymerase.
  • Perform a chain reaction (Saiki, RK, et al., Science, (1988) 239, 487-49) to amplify the DNA fragment that encodes the desired anti-DC-STAMP antibody heavy or light chain subunit .
  • cDNA synthesized by reverse transcriptase reaction from mRNA of a hybridoma producing an anti-DC-STAMP monoclonal antibody can be used.
  • the DNA fragment prepared in this manner can be directly incorporated into a plasmid vector using a commercially available kit or the like, or the fragment is labeled with 32 P, 35 S, or biotin, etc.
  • the target clone can also be selected by performing a colony hybridization or a plaque hybridization using the DNA. .
  • a method for examining the partial amino acid sequence of each of the subunits of the anti-DC-STAMP monoclonal antibody of the present invention includes electrophoresis and column chromatography. After isolating each subunit using a well-known method, the N-terminal amino acid sequence of each subunit is determined using an automated protein sequencer (eg, PPSQ-10 manufactured by Shimadzu Corporation). Is preferable.
  • an automated protein sequencer eg, PPSQ-10 manufactured by Shimadzu Corporation. Is preferable.
  • a method for collecting cDNA encoding each subunit of the anti-DC-STAMP monoclonal antibody protein can be obtained by a known method (Mani at is, T (1982) in Molecular Cloning A Laboratory Manual "Cold Spring Harbor Laboratory, NY.” For example, a fraction corresponding to vector DNA was separated from cells, and the plasmid DNA was isolated from the cells. This can be done by cutting out the DNA region encoding the target subunit.
  • (3-2) Screening method using synthetic oligonucleotide probe When all or part of the amino acid sequence of the target protein has been elucidated.
  • An oligonucleotide corresponding to the amino acid sequence is synthesized (in this case, a plurality of nucleotide sequences in which a nucleotide sequence deduced with reference to the frequency of use of a code or a combination of possible nucleotide sequences is synthesized). Any of the nucleotide sequences can be used, and in the latter case, the type can be reduced by including inosine, and this can be used as a probe (labeled with 32 P, 35 S, or biotin, etc.) to obtain a transformant.
  • the DNA is hybridized with a nitrocellulose filter denatured and fixed, and the resulting positive strain is selected.
  • the determination of the sequence of the DNA obtained in this manner can be performed, for example, by the method of modification of Maxamuirgilva. (Maxam, AM and Gilbert, 'ff., Methods in Enzymolgy, (1980) 65, 499-576). It can be carried out by dideoxynucleotide chain termination method (Messing, J. and Vieira, J., Gene (1982) 19, 269-276).
  • nucleotide sequences of the DNA of the present invention thus determined, and the N-terminal amino acid sequences of the heavy and light chains From the sequence data, the entire amino acid sequence of the heavy and light chains of the monoclonal antibody of the present invention can be determined.
  • Each of the heavy and light chains of immoglopurin consists of a variable region and a constant region, and the variable region is further described as “CDR” below the complementarity-determining region; Consists of adjacent framework regions (4 each for heavy and light chains).
  • the amino acid sequence of the constant region is common between antibodies having the same immunoglobulin subclass regardless of the type of antigen.
  • the amino acid sequences of the variable regions especially CDRs, are unique to each antibody, studies comparing the amino acid sequence data of many antibodies show that the CDR positions and the length of the framework sequences are the same. It is known that antibody subunits belonging to the subgroup are almost similar (Kabat, EA, et al., In "Sequence of Proteins of Immunological Interest Vol. II": US Department of Health and Human Services). , (1991)).
  • the CDR, framework region and constant region in each amino acid sequence can be determined.
  • the chain length of the framework region of FRH ie, the N-terminal side of the heavy chain
  • the framework region has a minimum of 18 amino acids.
  • the chain length of the N-terminal framework region of the heavy chain is set to be 18 amino acids or more and 30 amino acids or less, as long as the function as an anti-DC-STAMP antibody is not impaired. Preferably it is 30 amino acids.
  • the peptide having the same amino acid sequence as that of the light chain or heavy chain CDR determined as described above, or a peptide having a continuous partial amino acid sequence therein, is subjected to an artificial modification operation to obtain the CDR.
  • an artificial modification operation By approaching the three-dimensional structure formed in the anti-DC-STAMP antibody molecule, it is possible to impart binding activity to DC-STAMP alone [for example, US Pat. No. 5,331,573] Reference].
  • peptides having the same amino acid sequence as the CDR, or a continuous partial amino acid sequence therein, so modified are also encompassed in the molecules of the present invention.
  • the cassette mutation method In order to produce variants in which any one or more amino acids in the amino acid sequence have been deleted, the cassette mutation method (Toshimitsu Kishimoto, "New Chemistry Laboratory Course 2 "See 242-251).
  • Such various types of DNA can be prepared by a conventional method such as the phosphate-triester method (Hunkapiller, M., et al., Nature (1984) 310, 105-111).
  • the codon for the desired amino acid is known per se, and its selection may be arbitrary.
  • the codon for the desired amino acid can be determined according to a conventional method in consideration of the codon usage of the host used.
  • Partial modification of these nucleotide sequence codons can be performed by a site-directed mutagenesis method using a primer consisting of a synthetic oligonucleotide that encodes the desired modification (site specific Muscle Genesis) (Mark, DF, et al., Proc. Nat 1. Acad. Sci. USA (1984) 81, 5662-5666).
  • Whether or not a certain DNA hybridizes with DNA encoding the heavy chain or light chain of the anti-DC-STAMP monoclonal antibody of the present invention can be determined, for example, by subjecting the DNA to a random frying method (Feinberg, AP and Vogelstein, B., Anal.iochem., (1983) 132, 6-13) and the nick translation method Maniatis, T., et al., In "Molecular Cloning A laboratory Manual” Cold Spring Harbor Laboratory, NY., ( 1982)) and the like, using a probe DNA labeled with [ ⁇ - 32 P] d CTP or the like, and conducting an experiment as described below.
  • a random frying method Feinberg, AP and Vogelstein, B., Anal.iochem., (1983) 132, 6-13
  • the nick translation method Maniatis, T., et al., In "Molecular Cloning A laboratory Manual” Cold Spring Harbor Laboratory, NY., ( 1982)
  • the DNA to be examined is adsorbed on, for example, a nitrocellulose membrane or a nitrocellulose membrane, and if necessary, treated with alkali denaturation or the like, and then solidified by heating or ultraviolet rays.
  • This membrane is treated with 6 XS SC (1 XS SC is 0.15 M sodium chloride, 0.015 M trisodium citrate solution), 5% denhate solution, 0.1% sodium dodecyl sulfate (SDS ) immersed in Purehaipuri Daize one to down solution containing, 5 5 ° from the incubated over 4 hours with C, and the probe previously prepared in a similar pre hybrida I peptidase one to emissions solution final specific activity 1 XI 0 6 Add to c pmZml and incubate at 60 ° C overnight. After that, the procedure of washing the membrane with 6 XSSC at room temperature for 5 minutes is repeated several times, and further washing with 2 XSSC for 20 minutes, and then performing autoradiography.
  • the DNA encoding the heavy or light chain of the humanized anti-DC-STAMP antibody of the present invention can be isolated from the DNA (Maniatis, T., et al., in "Molecular Cloning A laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, NY., (1982)).
  • each DNA obtained as described above into an expression vector, it is possible to introduce them into prokaryotic or eukaryotic host cells, and to express each gene in those host cells. is there.
  • the expression can be performed by the same method as described in the section “(1) Preparation of antigen” in the section “6. Production of anti-DC-STAMP antibody” above. '
  • the fraction containing the anti-DC-STAMP antibody protein which is produced intracellularly or extracellularly in the transformant, can be obtained by various known protein separation procedures utilizing the physical properties, chemical properties, etc. of the protein. It can be separated and purified. Examples of such a method include, for example, treatment with a normal protein precipitant, ultrafiltration, molecular sieve chromatography (gel filtration), adsorption chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, Various types of chromatography, such as high performance liquid chromatography (HPLC), dialysis methods, and combinations thereof can be used.
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • the amino acid in the variable region was selected so that the entire CDR sequence and a part of the amino acid residues of the FR sequence were transplanted into the human antibody. You need to design the array. This design follows the following method.
  • the selection guidelines for the subgroup of ceptors include (a) the natural combination of the heavy and light chains of a known human antibody having a natural amino acid sequence. Use it as it is,
  • the identity of the amino acid in the FR portion between the donor and the receptor can be at least 70% or more.
  • the number of amino acid residues to be transplanted from the donor can be reduced, and the induction of the HAMA response can be reduced.
  • the operation of predicting the tertiary structure from the primary sequence of an antibody molecule (hereinafter, this operation is referred to as “molecular modeling”) has limited prediction accuracy, and rarely appears in the subgroup to which the donor belongs.
  • the role of amino acid residues cannot be fully specified. According to the method of Queen et al., It is generally difficult to determine which amino acid residue, donor or receptor, should be selected at such a position. According to the selection method (c), the chance of making such a judgment can be significantly reduced.
  • the present inventors have provided a novel method for identifying amino acids from the donor FR that are important for maintaining the structure and function of the donor CDR.
  • the method of conversion is further improved.
  • the method of selecting the amino acid residues to be transplanted from Dna's FR is as described below.
  • the amino acid sequences of the donor and the acceptor are aligned, and the amino acid residues are different at the corresponding positions of the FRs, it is necessary to determine which residue to select. It is necessary to make a selection so as not to impair the three-dimensional structure of CDR from one source.
  • the amino acids in the human FR region of the receptor are rare at that position and the corresponding amino acids of the donor are common at said position of the receptor;
  • the amino acid is within about 3 A of the CDR in the three-dimensional immunoglobulin model. It is expected that it will have side chain atoms and be able to interact with the antigen or with the CDRs of the humanized antibody.
  • the residue shown in 2) often exhibits the property of 3), and therefore, in the present invention, the requirement of 2) is deleted, and two new requirements are separately provided. That is, in the present invention, for amino acid residues on the donor FR to be transplanted with the CDR: a) the amino acid in the FR of the acceptor is rare at that position and the corresponding amino acid of the donor is at that position; Normal or
  • the amino acid residue is transplanted from the donor FR.
  • amino acids that are found at a frequency of 90% or more at the relevant position for antibodies of the same subclass are ⁇ normal, '' and amino acids that are found at a frequency of less than 10% are ⁇ rare.
  • the distance between two atoms is 0.5 A to the sum of each Van der Waals radius.
  • the distance between polar atoms such as amide nitrogen and carbonyl oxygen in the main chain and side chain is shorter than the average hydrogen bond distance of 2.9 A plus 0.5 A, it is considered that hydrogen bonds exist between them.
  • the distance between atoms with opposite charges was shorter than 2.85 A plus 0.5 A, it was assumed that an ion pair was formed between them.
  • amino acid residues at these positions will be in contact with the amino acid residues of CDR in two-thirds of the known antibody variable regions.
  • b) of "the amino acid is expected to interact with the antigen or CDR loop to be transplanted in the three-dimensional structural model of the amino acid in the three-dimensional structural model” means the following requirements. I do.
  • the position of FR predicted to have a possibility of contact between FR and CDR coincides with one of the positions where the contact between FR and CDR is frequently detected experimentally by X-ray crystallography. In such cases, transplantation of donor amino acid residues is preferred.
  • the position constitutes the contact surface between the heavy chain and the light chain means the following requirements. From the results of X-ray crystallography of the variable regions of various antibodies, it was found that in the light chain, the amino acid residues at positions 36, 38, 43, 44, 46, 49, 87, 98, heavy In the chain, amino acid residues at positions 37, 39, 45, 47, 91, 103 and 104 are frequently found to make heavy chain-light chain contacts. ing. In molecular modeling, the possibility of heavy chain-light chain contact is foreseen, and if that position matches any of the positions described above, priority is given to donating one amino acid residue. Otherwise, this requirement d) is not considered.
  • DNA encoding the variable regions of the heavy and light chains of the humanized anti-DC-STAMP antibody of the present invention can be produced by the method described below.
  • a partial nucleotide sequence of the DNA of 60 to 70 nucleotides A plurality of polynucleotide fragments are chemically synthesized such that they are alternately arranged on the sense side and the antisense side, and then each polynucleotide fragment is bound, and then combined with DNA ligase.
  • a DNA having a DNA encoding the variable regions of the heavy and light chains of the humanized anti-DC-STAMP antibody can be obtained.
  • DNA encoding the entire amino acid sequence of the variable region of the receptor is separated from the human lymphocyte, and nucleotide substitution is performed on the CDR coding region by a method well known to those skilled in the art. Introduces a restriction enzyme cleavage sequence.
  • a nucleotide sequence encoding the CDR of the donor is synthesized and linked by DNA ligase to form the heavy chain and light chain of the desired humanized anti-DC-STAMP antibody.
  • DNA encoding the variable region of the chain can be obtained.
  • a desired humanized anti-DC is preferably prepared according to the following method, which is described below. (See Holton et al., Gene, 77, 61-68, (1989)). -It is possible to obtain DNA encoding the variable regions of the heavy and light chains of the STAMP antibody.
  • a sense primer of 20 to 40 nucleotides that anneals to the 5 ′ side of (A) (hereinafter, this primer is referred to as (C)) and 20 to 40 nucleotides that anneals to the 3 ′ side of (B)
  • the antisense primer (hereinafter, this primer is referred to as (D)) is chemically synthesized.
  • a chimeric sense primer (hereinafter, this primer is referred to as (E), in which 2.0 to 30 nucleotides on the 3 'side of (A) and 20 to 30 nucleotides on the 5' side of (B) are linked. ) And an antisense primer complementary thereto (hereinafter, this primer is referred to as (F)).
  • E a chimeric sense primer
  • F an antisense primer complementary thereto
  • the DNA encoding the CDR regions of the heavy and light chains of the anti-human DC-STAMP mouse monoclonal antibody and the DNA encoding the FR region of human immunoglobulin IgG can be carried out using DNA encoding the secretion signal of human immunoglobulin IgG as (A) and (B) depending on the case and bi-case, respectively.
  • the codon for the desired amino acid is known per se, and its selection may be arbitrary.
  • the codon can be determined according to a conventional method in consideration of the codon usage of the host to be used. Partial modification of these nucleotide sequence codons can be performed by a conventional method using site specific mutagenesis (Mark, DF) using a primer consisting of a synthetic oligonucleotide encoding the desired modification. Natl. Acad. Sci. USA, (1984) 81, 5662-5666). Therefore, when each primer is chemically synthesized, the variable regions of the desired heavy and light chains of the anti-DC-STAMP antibody are encoded by designing each primer in advance to introduce a point mutation. DNA can be obtained.
  • each of the thus obtained DNAs of the present invention into expression vectors, prokaryotic or eukaryotic host cells can be transformed. Furthermore, by introducing an appropriate promoter and a sequence related to expression into these vectors, each gene can be expressed in each host cell. By the above method, a recombinant anti-DC-STAMP antibody can be easily produced with high yield and high purity.
  • a complete human antibody means a human antibody having only the gene sequence of an antibody derived from human chromosome.
  • the anti-DC-STAMP complete human antibody was obtained by a method using a human antibody-producing mouse having a human chromosome fragment containing the genes for the H and L chains of the human antibody (Tomizuka, K. et al., Nature Genetics, (1977) 16, 133-143; Kuroi a, Y. et.al., Nuc. Acids Res., (1998) 26, 3447-3448; Yoshida, H. et.al., Animal Cell Technology: Basic and Applied Aspects, (1999) 10, 69-73 (Ki tagawa, Y., Matuda, T.
  • an antibody that neutralizes the biological activity of DC-STAMP can be obtained. Wear. These antibodies, which neutralize the biological activity of DC-STAMP, inhibit the biological activity of DC-STAMP in vivo, namely, osteoclast differentiation and Z or f maturation. It can be used as a therapeutic agent for bone metabolism disorders caused by abnormal bone cell differentiation.
  • Neutralization of DC-STAMP biological activity by an anti-DC-STAMP antibody in vitro is measured, for example, by inhibiting the differentiation of cells into osteoclasts in cells overexpressing DC-STAMP.
  • DC-STAMP for example, mouse monocyte-derived cell lines overexpressing DC-STAMP, RAW264.7 cells, RAW264 cells, or RAW-D cells
  • anti-DC-STAMP antibodies are added to the culture system at various concentrations, and the inhibitory activity of osteoclast differentiation by RANKL and TNF- ⁇ stimulation can be measured.
  • anti-DC-STAMP antibodies can be added at various concentrations to primary cultured cells derived from bone marrow to measure the inhibitory activity of osteoclast differentiation by RANKL and TNF- ⁇ stimulation.
  • the thus obtained antibody that neutralizes the biological activity of DC-STAMP can be used as a medicament in the treatment of diseases caused by abnormal bone metabolism such as osteoporosis, rheumatoid arthritis and cancerous hypercalcemia. It is useful as a target pharmaceutical composition or as an antibody for immunological diagnosis of such a disease.
  • the anti-DC-STAMP antibody can be administered alone for the treatment of bone metabolism disorder, or together with a therapeutic agent for at least one bone-related disease.
  • the anti-DC-STAMP antibody can be administered together with a therapeutically effective drug * for treating bone metabolism disorders.
  • Bisphosphonates and active vitamins can be administered together with anti-DC-STAMP antibodies! ) 3.
  • it is possible to administer two, three or more types of drugs, and these drugs may be of the same formulation.
  • the drug and the anti-DC-STAMP antibody can be supplied together by encapsulating them in the same preparation. Drugs can also be supplied together by encapsulation in a therapeutic kit, or the drug and anti-DC-STAMP antibody are supplied separately. You can also.
  • the gene for the proteinaceous bone disease therapeutic agent and the gene for the anti-DC-STAMP antibody can be introduced simultaneously or separately downstream of the same promoter region, separately or separately. It can be introduced in the same vector.
  • MC Garnet “Targeted drug conjugates: principles and progressj, Advanced Drug Delivery Reviews, (2001) 53, 171-216
  • the targeted drug conjugates described can be prepared for this purpose, in addition to antibody molecules, any antibody fragment, as long as osteoclast recognition is not completely lost, can be used,
  • fragments such as Fab, F (ab ') 2, and Fv can be mentioned as examples, and in the present invention, similarly, antibodies and the fragments can be used.
  • the binding mode of antibody fragments and therapeutic agents for bone diseases is described in MC Garnet, “Targeted drug conjugates: principles and progress”, Advanced Drug Delivery Reviews, (2001) 53, 171-216, GT Hermaiison, “Bioconjugate Techniques j Academic Press” , California (1996), Putnam and J. Kopecek, "Polymer Conjugates with Anticancer Activity", Advances in Polymer Science (1995) 122, 55-123, and the like. That is, the anti-DC-STAMP antibody and the therapeutic agent for bone disease are chemically bonded directly or via a spacer such as an oligopeptide, or are bonded via an appropriate drug carrier. Style. Examples of drug carriers include ribosomes and water-soluble polymers.
  • the mode in which these drug carriers are mediated is a mode in which the antibody and the therapeutic agent for bone disease are included in ribosomes, and the mode in which the ribosome and the antibody are bound to each other.
  • the binding of the antibody (or the fragment) to a drug carrier such as a bone disease therapeutic agent, ribosome, or a water-soluble polymer can be carried out according to GT Hermanson's Bioconjugate Techniquesj Academic Press, California (1996), Putnam and J. Kopecek, Polymer Conjugates with Anticancer Activityj. Advances in Polymer Science (1995) 122, 55-123. It can be performed by a known method. Inclusion of the therapeutic agent for bone disease in the liposome
  • the complex of the antibody (or the fragment) and the therapeutic agent for a proteinaceous bone disease (or the fragment) can be prepared by a method known to those skilled in the art, in addition to the above-mentioned method, in addition to the above-mentioned method. can do.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising a therapeutically effective amount of an anti-DC-STAMP antibody and a pharmaceutically acceptable diluent, carrier, solubilizer, emulsifier, preservative, and Z or adjuvant.
  • the present invention relates to a therapeutically effective amount of an anti-DC-STAMP antibody, a therapeutically effective amount of at least one therapeutic agent for bone disease, and a pharmaceutically acceptable diluent, carrier, solubilizer, emulsifier, and preservative.
  • a pharmaceutical composition comprising Z and an adjuvant.
  • Bisphosphonates and active vitamins are used as therapeutic agents for bone diseases! ) 3, Cal phosphatonin and derivative thereof, E be sampled radio, reading one Le etc.
  • SERMs selective estrogen receptor modulators
  • Ipuri flavone Ipuri flavone
  • vitamin K 2 Menatetrenone
  • calcium manufactured agents PTH (parathyroid Hormone ) Preparations, non-steroidal anti-inflammatory drugs, anti-TNFa antibody, anti-PTHrP (parathyroid hormine-related protein) antibody, IL-1 receptor, anti-RANKL antibody, OCIF (osteoclastogenesis inhibi tory factor), etc.
  • PTH parathyroid Hormone
  • non-steroidal anti-inflammatory drugs anti-TNFa antibody
  • anti-PTHrP parathyroid hormine-related protein
  • IL-1 receptor anti-RANKL antibody
  • OCIF osteoclastogenesis inhibi tory factor
  • the substance used in the formulation acceptable in the pharmaceutical composition of the present invention is preferably non-toxic to the person to whom the pharmaceutical composition is administered, preferably at the dosage and administration concentration.
  • the pharmaceutical composition of the present invention changes or maintains ⁇ , osmotic pressure, viscosity, transparency, color, isotonicity, color, sterility, stability, dissolution rate, sustained release rate, absorption rate, and permeability. It can contain pharmaceutical substances for storage and maintenance.
  • Pharmaceutical substances include, but are not limited to, amino acids such as glycine, alanine, glutamine, asparagine, arginine or lysine, antibacterial agents, ascorbic acid, sodium sulfate or Antiacids such as sodium bisulfite Reagents, phosphates, citrate, borate buffer, bicarbonate, buffers such as Tris-Hcl solution, fillers such as mannitol and glycine, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), etc.
  • amino acids such as glycine, alanine, glutamine, asparagine, arginine or lysine
  • antibacterial agents such ascorbic acid, sodium sulfate or Antiacids such as sodium bisulfite Reagents, phosphates, citrate, borate buffer, bicarbonate, buffers such as Tris-Hcl solution
  • fillers such as mannitol and glycine, ethylenediaminetetraace
  • Chelating agents caffeine, polyvinylpyrrolidine, ⁇ -cyclodextrin / hydroxypropyl-1-i3—complexing agents such as cyclodextrin, bulking agents such as glucose, mannose or dextrin, monosaccharides, disaccharides Other carbohydrates such as, coloring agents, flavoring agents, diluents, emulsifiers and hydrophilic polymers such as polyvinylpyrrolidine, low molecular weight polypeptides, salt-forming counterions, benzalkonium chloride, benzoic acid, salicylic acid, thimerosal, etc.
  • Preservatives glycerin, propylene glycol or polyethylene
  • Solvents such as 'Dali' alcohol, alcohols such as mannitol or sorbitol, suspending agents, sorbitan esters, polysorbitates such as polysorbitol 20 and polysorbitol 80, triton surfactants such as riton), tromethamine, lecithin or cholesterol
  • stabilizing and enhancing agents such as sorbitol-sorbitol; sodium chloride; Strong agents, transport agents, diluents, excipients, and Z or pharmacological auxiliaries.
  • the amount of the substance for these preparations is preferably 0.1 to 100 times, particularly 0.1 to 10 times, the weight of the anti-DC-STAMP antibody.
  • the composition of the composition can be appropriately determined by those skilled in the art according to the disease to be applied, the administration route, and the like.
  • Excipients and carriers in pharmaceutical compositions may be liquid or solid. Suitable excipients and carriers may be water for injection, saline, artificial cerebrospinal fluid, or other substances commonly used for parenteral administration. Neutral saline or saline containing serum albumin can also be used for the carrier. Pharmaceutical compositions can also include Tris buffer pH 7.0-8.5, acetate buffer pH 4.0-5.5, and sorbitol and other compounds. Examples of the pharmaceutical composition of the present invention include a pharmaceutical composition containing an anti-DC-STAMP antibody, and a pharmaceutical composition containing an anti-DC-STAMP antibody and at least one therapeutic agent for bone disease.
  • the pharmaceutical composition is prepared as an appropriate drug with the required purity in the selected composition, as a lyophilized product or as a liquid.
  • a pharmaceutical composition comprising an anti-DC-STAMP antibody; and an anti-DC-STAMP antibody and at least one anti-bone metabolic disorder.
  • Pharmaceutical compositions containing conventional therapeutic agents can also be formulated as lyophilizates using suitable excipients such as sucrose.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be prepared for parenteral administration or can be prepared for oral gastrointestinal absorption.
  • the composition and concentration of the preparation can be determined by the administration method, and the affinity of the anti-DC-STAMP antibody for DC-STAMP contained in the pharmaceutical composition of the present invention, that is, the dissociation constant for DC-STAMP, The higher the affinity (lower the Kd value) with respect to the (Kd value), the smaller the dose to humans and the more effective the drug.
  • the dosage for humans can also be determined.
  • the human anti-DC-STAMP antibody is administered to human, the dose is about 0.1 to 100 mg / kg :! One dose may be given between ⁇ 30.
  • Examples of the form of the pharmaceutical composition of the present invention include injections containing iv drops, suppositories, nasal preparations, sublingual preparations, transdermal absorbents and the like.
  • Another embodiment of the present invention includes a drug design technique based on the three-dimensional structure of the protein for the purpose of obtaining a substance that suppresses the activity of DC-STAMP.
  • a drug design technique is known as a rational drug design method, and is used for searching for a compound that efficiently inhibits or activates functions such as enzyme activity and binding to ligands, cofactors, or DNA. Have been.
  • An example of this is the well-known inhibitor of protease, an already marketed anti-HIV agent.
  • generally well-known techniques such as X-ray crystallography and nuclear magnetic resonance can be used.
  • C ADD computer-drug design
  • the polypeptide to which the DC-STAMP of the present invention associates That is, it relates to the partner protein of DC-STAMP. That is, the present invention relates to a method for screening a partner protein that regulates the activity of DC-STAMP.
  • One embodiment of this screening method includes a step of bringing a test protein sample into contact with DC-STAMP and selecting a protein that binds to DC-STAMP.
  • a method for example, there is a method in which a purified DC-STAMP is used for affinity purification of a protein bound thereto.
  • An example of a specific method is as follows. A sequence comprising six histidines fused to DC-STAMP as an affinity tag is produced, and this is extracted from the cell extract (nickel-agaga The column was charged and the fraction that passed through the column was incubated at 4 ° C for 12 hours, and then the mixture was separately added with a nickel-agarose carrier and incubated at 4 ° C for 1 hour. Beat it.
  • a fusion protein of DC-STAMP and daltathione S-transferase is prepared, and after binding to a microplate covered with an anti-glutathiothion S-transferase antibody, The biotinylated partner protein is brought into contact with the fusion protein, and the binding to the fusion protein is determined by streptavidinated alkaline phosphatase. Detect with ze.
  • a test substance is also added, and a substance that promotes or inhibits the binding between the fusion protein and the partner protein is selected.
  • a substance that directly acts on the fusion protein or a substance that directly acts on the partner protein is obtained.
  • the above-mentioned assay is similarly performed in the presence of a cell extract containing the factor, for example. .
  • a substance that acts on the factor may be selected.
  • the abnormal bone metabolism is performed according to the test method using the expression vector for the DC-STAMP gene described above.
  • a therapeutic agent for example, a candidate substance useful as a therapeutic agent for osteoporosis can be screened.
  • a polynucleotide having a nucleotide sequence encoding such a suppressor can be used to inhibit bone metabolism. It can be used for gene therapy.
  • Such a polynucleotide is analyzed, for example, by analyzing the amino acid sequence of the identified inhibitor, synthesizing an oligonucleotide probe consisting of a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence, and screening a cDNA library or genomic library. Can be obtained.
  • the peptide having the inhibitory activity on the function of DC-STAMP is derived from a randomly synthesized human peptide library, DNA consisting of a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the peptide is chemically synthesized. Combine.
  • the gene encoding the inhibitor thus obtained is inserted into, for example, a viral vector, and the virus (detoxified) having the recombinant viral vector is transmitted to a patient. Let it.
  • Anti-osteolytic factor is produced in the patient's body and has the function of inhibiting osteoclast differentiation, which makes it possible to treat abnormal bone metabolism.
  • Methods for introducing a gene therapy agent into cells include a gene transfer method using a viral vector or a non-viral gene transfer method (Nikkei Science, April 1994, pp. 20-45). , Experimental Medicine Special Edition, 1 2 (15) (1994), Experimental Medicine Supplement Basic techniques of treatment ”, Youtosha (1996)) can be applied.
  • Methods for gene transfer using a viral vector include, for example, DNA virus or RNA virus such as retrovirus, adenovirus, adeno-associated virus, herpes virus, vaccinia virus, box virus, polio virus, simbis virus, DC- A method of incorporating and introducing a DNA encoding a STAMP inhibitor or a mutant thereof is exemplified.
  • Non-viral gene transfer methods include direct injection of the expression plasmid into muscle (DNA vaccine method), ribosome method, ribofectin method, microinjection method, calcium phosphate method, and electroporation method.
  • the DNA vaccine method and the ribosome method are particularly preferred.
  • an in vivo method for directly introducing DNA into the body or a method of extracting certain cells from a human and introducing DNA outside the body to the cells There is an exvivo method for returning the body to the body (Nikkei Science, April 1994, pp. 20-45, Monthly Pharmaceutical Affairs, 36 (1), 23-48 (1994), Experimental Medicine, 12 (15) ( 1994)).
  • the gene therapy agent when administered by the in vivo method, it is administered by an appropriate administration route such as intravenous, arterial, subcutaneous, intradermal, intramuscular, etc., depending on the disease, symptoms, and the like.
  • the gene therapy agent When administered by the in vivo method, the gene therapy agent is generally used as an injection or the like, but if necessary, a conventional carrier may be added.
  • ribosome preparations such as a suspension, a freezing agent, and a centrifugal concentrated frozen agent can be used.
  • a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 of the sequence listing or a nucleotide sequence complementary to a partial sequence of the sequence can be used for so-called antisense therapy.
  • the antisense molecule is a DNA complementary to a part of the nucleotide sequence selected from the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 1, 3 and 5 in the sequence listing, usually consisting of 15 to 30 mers, or a phosphorothioate thereof. It is used as a stable DNA derivative such as methylphosphonate or morpholino derivative, or a stable RNA derivative such as 2'- ⁇ -alkyl RNA.
  • Such antisense molecules can be introduced into cells by methods well known in the art of the present invention, such as by microinjection, ribosome encapsulation, or expression using a vector having an antisense sequence. .
  • Such antisense therapy is useful for treating a disease caused by excessively increasing the activity of the protein encoded by the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. It is also possible to mention a method using double-stranded short RNA (siRNA) (“Genes and Developments”), 2001 March 15th, Vol. 15, No. 2, p. 188—200).
  • siRNA double-stranded short RNA
  • a composition useful as a medicine containing the antisense oligonucleotide and / or the siRNA can be produced by a known method such as mixing a pharmaceutically acceptable carrier.
  • pharmaceutical carriers containing antisense oligonucleotides and methods of manufacture are described in Applied Antisense Oligonucleotide Technology (1998 Wiley-Liss, Inc.).
  • Formulations containing antisense oligonucleotides and / or siRNAs may be mixed with excipients, diluents, etc., per se or as appropriate pharmacologically acceptable, and tablets, capsules, granules, powders, syrups, etc. Can be administered orally, or parenterally by injection, suppository, patch, or external preparation.
  • These preparations may contain excipients (eg, lactose, sucrose, glucose, saccharide derivatives such as mannitol, sorbitol; corn starch, potato starch, starch derivatives such as ⁇ -starch, dextrin; crystalline cellulose).
  • excipients eg, lactose, sucrose, glucose, saccharide derivatives such as mannitol, sorbitol; corn starch, potato starch, starch derivatives such as ⁇ -starch, dextrin; crystalline cellulose.
  • Organic derivatives such as gum arabic; dextran; pullulan; and silicate derivatives such as light anhydrous silicic acid, synthetic aluminum silicate, calcium silicate, and magnesium aluminate metasilicate; calcium hydrogen phosphate Phosphates; carbonates such as calcium carbonate; calcium sulfates; inorganic excipients such as sulfates; lubricants (eg, stearate, calcium stearate) Metal stearate such as magnesium stearate; ; Colloidal Doshirika; beeswax, gay ⁇ Such as waxes; boric acid; adipic acid; sulfates such as sodium sulfate; glycol; fumaric acid; sodium benzoate; DL leucine; lauryl sulfates such as sodium lauryl sulfate and magnesium lauryl sulfate; Silicic acids such as silicic acid hydrate; and the above-mentioned starch derivatives.
  • Binders for example, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, polypinylpyrrolidone, macrogol, and compounds similar to the above-mentioned excipients
  • disintegrants for example, cellulose derivatives such as low-substituted hydroxypropylcellulose, carboxymethylcellulose, carboxymethylcellulose calcium, and internally crosslinked sodium carboxymethylcellulose; such as carboxymethylstarch, sodium carboxymethylstarch, and crosslinked polyvinylpyrrolidone And chemically modified starch and celluloses
  • emulsifiers eg, colloidal clays such as bentonite and big gum; metal hydroxides such as magnesium hydroxide and aluminum hydroxide
  • Anionic surfactants such as sodium lauryl sulfate and calcium stearate; cationic surfactants such as benzalkonium chloride; and polyoxetylene alkyl ether, polyoxyethylene sorbin fatty acid ester, and sucrose Examples thereof include nonionic sur
  • the colloid dispersion system is expected to have the effect of increasing the stability of the compound in vivo and the effect of efficiently transporting the compound to specific organs, tissues or cells.
  • the colloid dispersion system is not limited as long as it is commonly used, but is not limited to polymer complexes, nanocapsules, microspheres, beads, and lipids including oil-in-water emulsifiers, micelles, mixed micelles, and ribosomes. And preferably dispersing the compound efficiently to a specific organ, tissue or cell. Multiple ribosomes with transport effect, vesicles of artificial membrane (Mannino et a 1., Biotechniques, (1988) 6, 682; Blume and Cevc, Biochem. Et Biophys. Acta, (1990) 1029, 91 Lappalainen et al., Antiviral Res., (1994) 23, 119; Chonn and Cul 1 is, Current Op. Biotech., (1995) 6, 698).
  • Monomembrane ribosomes can encapsulate a significant proportion of the aqueous buffer containing macromolecules, and the compound is encapsulated in this aqueous inner membrane, Is transported to brain cells in a more active form (Fraly et al., Trends Biochem. Sci., (1981) 6, 77).
  • the composition of the ribosome is usually a complex of a lipid, especially a phospholipid, especially a phospholipid with a high phase transition temperature, with one or more steroids, especially cholesterol.
  • lipids useful for liposome production include phosphatidyl compounds such as phosphatidylglycerol, phosphatidylcholine, phosphatidylserine, sphingolipid, phosphatidyletanoylamine, cerebroside and gangliosides. Particularly useful is diacylphosphatidylglycerol, where the lipid moiety contains 14-18 carbon atoms, especially 16-18 carbon atoms, and is saturated (14-18 Lacks a double bond within the carbon chain).
  • Representative phospholipids include phosphatidyl choline, dipalmitoyl phosphatidyl choline and distearoyl phosphatidyl choline.
  • the targeting of colloidal dispersions can be either passive or active. Passive targeting is achieved by taking advantage of the liposome's natural tendency to distribute to cells in the retina of organs containing sinusoidal capillaries.
  • active targeting can be achieved, for example, by using the protein coat of the virus (Morishita et al., Proc. Nat 1. Acad. Sci. USA, (1993) 90, 8474), the monoclonal antibody (or its appropriate binding moiety).
  • Binding specific ligands such as sugars, glycolipids or proteins (or appropriate oligopeptide fragments thereof) to ribosomes, or achieving distribution to organs and cell types other than the naturally occurring localization sites For this purpose, a technique for modifying the ribosome by changing the composition of the ribosome can be used.
  • the surface of the targeted colloid dispersion can be modified in various ways. In ribosome-targeted delivery systems, liposomal lipids are used to maintain the target ligand in tight association with the lipid bilayer. Lipid groups can be incorporated into the bilayer. Various linking groups can be used to link the lipid chain to the targeting ligand.
  • Target ligands that bind to specific cell surface molecules that are predominantly found on cells where delivery of the oligonucleotides of the invention are desired include, for example, (1) predominantly expressed by cells where delivery is desired Specific for a hormone, a growth factor or its appropriate oligopeptide fragment, or (.2) specifically to an antigenic epitope found predominantly on target cells
  • the binding can be a polyclonal or monoclonal antibody, or a suitable fragment thereof (eg, Fab; F (ab ') 2).
  • the two or more bioactive agents can also be conjugated and administered within a single ribosome. Agents that increase the intracellular stability and / or targeting of the contents can also be added to the colloid dispersion.
  • the dosage varies depending on symptoms, age, etc., but in the case of oral administration, the lower limit is 1 mg (preferably 30 mg) and the upper limit is 200 mg (preferably 150 mg) per dose. nig), in the case of injection, a lower limit of 0.1 mg (preferably 5 mg) per dose and an upper limit of 1000 mg (preferably 500 mg) subcutaneously, intramuscularly or It can be administered by intravenous injection. 'Hereinafter, the present invention will be described in detail and specifically with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples. In the following examples, unless otherwise specified, each operation relating to gene manipulation is referred to as “Molecular Cloning” (from Sambrook, J., Fritsch, EF and Maniatis, ⁇ ⁇ , Cold Spring Harbor Laboratory Press). (Published in 1989), or when a commercially available reagent or kit was used, it was used according to the instructions for the commercial product. ⁇
  • RAW264.7 Stimulation of mouse monocyte-derived cell line RAW264.7 with soluble RANKL strongly induces osteoclast differentiation genes such as tartrate-resistant acid phosphatase (hereinafter referred to as “TRAP”) and cathepsin K (Hsu et a, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1999) 96, 3540-3545). Therefore, it is thought that RAW264.7 cells can be induced to differentiate into osteoclasts by stimulating with RANKL. Therefore, we attempted to obtain subclonal cells from RAW264 cells, the parent strain of RAW264.7 cells, that are more sensitive to RANKL and TNF- ⁇ , that is, easily differentiated into osteoclasts by these stimuli.
  • RAW264 cells can be purchased from the European Collection of Cell Culture (Catalog No. 85062803). RAW264 cells were 'limitedly diluted' in an a-MEM medium containing 10 ⁇ l of fetal serum according to a conventional method, and seeded at 100 ⁇ 1 in a 96-well plate. After culturing for 10 to 14 days, the formed colonies were collected.
  • TRAP staining was performed using Leukocyte Acid Phosphatase kit (manufactured by Shimadama) according to the attached protocol to confirm the presence or absence of TRAP-positive multinucleated osteoclasts. This series of limiting dilution culture procedures was repeated twice for each colony.
  • RAW-D cells and RAW-N cells are stimulated with substances that induce osteoclasts, such as RANKL and TNF- ⁇
  • substances that induce osteoclasts such as RANKL and TNF- ⁇
  • RAW-D, RAW-N and RAW264 were prepared to 4.5 x 10 4 cells / ml in a-MEM medium containing 10% fetal calf serum, and then 150 ⁇ l / well in a 96-well plate.
  • TNF- ⁇ (manufactured by Pebrotech) was added to a final concentration of 1 ng / ml, and human RAML (manufactured by Protec) was added to a final concentration of 10, 20, 40, and 80 ng / ml, respectively.
  • TRAP staining was performed using a Leukocyte Acid Phosphatase kit (manufactured by Sigma) according to the attached protocol, and the number of formed TRAP-positive polynuclear osteoclasts was counted.
  • RAW-D TRAP-positive multinucleated osteoclasts were formed in a concentration-dependent manner of added RANKL (Fig. 0.
  • RAW-N and RAW264 the parent cell line, No positive osteoclast formation was observed.
  • RNA sample buffer (1XM0PS buffer (1X MOPS buffer is 20 mM
  • MOPS containing 8 mM sodium acetate and 1 mM EDTA), 503 ⁇ 4 formamide, 18 g / nil bromophenol, 5. 5. formaldehyde, 5% glycerol) to adjust 0.5 g / ⁇ 1 and 65 65 C, Incubate for 15 minutes, then chilled on ice for 5 minutes. 20/1 of this sample solution was injected into one well of agarose gel for electrophoresis containing formaldehyde (1 XM0PS buffer, 1.2% agarose (Sigma), 6-formaldehyde) and electrophoresed. The electrophoresis was performed by applying a current at 100 V for about 3 hours in a submarine electrophoresis layer containing a 1XM0PS buffer.
  • RNA in the agarose gel was subjected to a nylon membrane according to the cabillari transfer method (Maniat is, T. et al., In 'Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY, (1982)). (High Pond N10, manufactured by Amersham-Pharmacia) to transfer (20XSSC was used as the transfer solution).
  • the membrane was washed with 2 ⁇ SSC for 5 minutes, air-dried, and irradiated with ultraviolet rays (300 mJ / cm 2 ) using a cross-link ultraviolet irradiation apparatus (Stratanal inker 2400, manufactured by Stratagene) to fix the RNA.
  • the nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 457 to 1208 of mouse DC-STAMPAT7 cDNA (SEQ ID NO: 5, GenBank accession number: AB109561) is inserted into the TA cloning site of pGEM-T Easy vector (Promega).
  • the inserted plasmid DNA was converted into linear MA by Ncol (Takara Shuzo) digestion using the Ncol site present near the TA cloning site.
  • An antisense RNA probe labeled with DIG digoxigenin
  • DIG digoxigenin
  • SP6 RNA polymerase Rosetta Diagnostics
  • RNA probe corresponds to nucleotide sequence of nucleotide numbers 457 to 1078 and 1247 to 1376 of SEQ ID NO: 3 (mouse DC-STAMP cDNA) in the sequence listing, so that both DC-STAMP and DC-STAMP ⁇ 7 mRNA Can be detected.
  • the membrane prepared in b) into a 6 ml hybridization solution (DIG Easy Hyb Granules dissolved in double-distilled water according to the attached protocol: Roche's Diagnostics). After incubation at 65 ° C for 15 minutes (prehybridization), the cells were incubated at 65 ° C for 16 hours in 6 ml of a hybridization solution containing a DIG-labeled RNA probe. Then, the membrane was washed once in a solution containing 2XSS (:, 0.13 ⁇ 4 SDS) at room temperature for 5 minutes, and then twice in a solution containing 0.5XSSC, 0.13 ⁇ 4 SDS at 65 ° C for 30 minutes.
  • 2XSS 0.13 ⁇ 4 SDS
  • the membrane is treated with a blocking solution (blocking reagent dissolved in maleic acid buffer according to the attached protocol: manufactured by Roche Diagnostics Inc.) for 30 minutes, and then treated with an argariphosphatase-labeled antibody.
  • a blocking solution blocking reagent dissolved in maleic acid buffer according to the attached protocol: manufactured by Roche Diagnostics Inc.
  • mouse DC-STAMP was hardly expressed when RANKL and TNF- ⁇ were not added, but expression of mouse DC-STAMP was significantly increased when RANKL and TNF- ⁇ were added. (Fig. 2). The expression level of mouse DC-STAMP did not increase when MIP-l Q! Was further added.
  • RAW-murine DC-STAMP mRNA expression in D RAW-D also had prepared 7 ⁇ 10 4 cells / ml in alpha-MEM medium containing 10% ⁇ shea calf serum 500 ⁇ 1 / well in 24-well plate, human RANKL (manufactured by Pebrotech) at a final concentration of 20 ng / ml, human TNF- ⁇ (manufactured by Pebrotech) at a final concentration of 2 ng / ml, and mouse MIP-1 ( ⁇ Protech) was added to a final concentration of 1 ng / ml, and the cells were cultured for 0, 4, 8, 16, 32, 48, and 72 hours.
  • human RANKL manufactured by Pebrotech
  • human TNF- ⁇ manufactured by Pebrotech
  • mouse MIP-1 ⁇ Protech
  • 1 g of total RNA and 1 ⁇ l oligo (dT) 18 primer (0.5 g / 1) were adjusted to 111 with H 20 , heated at 70 ° C. for 10 minutes, and then kept at 4 ° C.
  • the single-stranded cDNA thus prepared was amplified using the following combinations of primers.
  • PCR was carried out under the following conditions using a thermal cycler (GeneAmp: PCR System 9700, manufactured by PerkinElmer Japan Applied Biosystems Division). In the reaction, Platinum Taq DNA polymerase (manufactured by Invitrogen) was used.
  • DC-STAMP gene started to increase 8 hours after the addition of RAML, TNF- ⁇ and ⁇ -1, and the expression level continued until 72 hours (Fig. 3).
  • upregulation of the expression of cathepsin ⁇ and TRAP genes, which are known as osteoclast marker molecules was confirmed 16 hours later.
  • the upper numbers show the elapsed time after the addition of RANKL, TNF-H and MIP-1 ⁇ , and the right side shows the number of each gene.
  • the size of the product amplified by the PCR reaction is shown in base pairs.
  • TRIZol reagent manufactured by Invitrogen
  • RNA LA PCR kit (AMY) Ver 1.1 (Yukara Biochemicals).
  • 2 1 25 mM MgCl 1 1 10X RNA PCR Buffer, 1 n 1 dNTP Mix (10 mM each), 0.25 / ⁇ 1 RNase Inhibit or (40 U / 1), 0.5 ⁇ 1 reverse transcriptase (5 U / ⁇ 1 ), 0.5 ⁇ 1 01 igo dT -Adaptor primer (2.5 pmol / t 1), to prepare a reaction solution 1 g total RNA Karoe, as 10 1 in RNase Free dH 2 0.
  • the reaction solution was heated at 50 ° C. for 25 minutes, heated at 99 ° C. for 5 minutes, and kept at 4 ° C.
  • This single-stranded cDNA was amplified with the combination of primers described in Example 2.
  • RT-PCR was performed using a thermal cycler (GeneAmp PCR System 9700) under the following conditions.
  • a reaction solution 5i1 containing cDNA add 1,5 1 25 mM MgCl 2 ⁇ 1 10 XLA PCR Buffer II (Mg n free), 0.125 n 1 Takara LA Taq (5 U / ⁇ 1), primer set (1 ⁇ each final concentration), and adjusted to 251 with double-distilled water to prepare a reaction solution.
  • a temperature cycle of 94 ° C for 30 seconds, 60 ° C for 30 seconds, and 30 ° C for 30 seconds was repeated 25 times, and the temperature was kept at 4 for 4 times.
  • the reaction solution 9 ⁇ l was electrophoresed on a 2.0% agarose gel.
  • the DC-STAMP gene was only slightly expressed on day 1 after addition of the active vitamin]) 3 , but was prominent on day 3 when mononuclear osteoclast precursor cells were formed. And on day 5 and 6 when multinucleation flourishes actively (Fig. 4).
  • amino acids 330 to 343 are located between the sixth and seventh transmembrane domains. Based on the peptide consisting of the amino acid sequence, we attempted to produce a partial peptide of mouse DC-STAMP protein. Partial peptide with one cysteine residue added to the N-terminus of the above sequence:
  • the tibia was excised from 1-day-old DDY mice, and 'soft tissues were removed.
  • the tibia was minced in an ⁇ -MEM medium containing 15% fetal fetus serum using dissecting scissors. Thereafter, cells were loosened and suspended by slightly vigorous pipetting, and seeded on a chamber slide (Narge Nunc International). After culturing for 1 hour, the multinucleated cells adhered to the slide were used as osteoclasts.
  • the osteoclasts obtained in a) were subjected to a fixation reaction with 4% paraformaldehyde solution at room temperature for 20 minutes, washed 4 times with a phosphate buffer (PH7.4), and washed with 3% A blocking reaction was performed for 30 minutes at room temperature with a phosphate buffer (PH7.4) containing goat serum. After removing the blocking solution, a phosphate buffer (containing 1% ⁇ serum) containing 10 g / ml of the egret anti-mouse DC-STAMP polyclonal antibody prepared in Example 4 was added. The reaction was performed for 30 minutes at the temperature.
  • a non-immunized egret IgG antibody (manufactured by Dako Japan) was prepared as a negative control, and the same operation was performed. After washing 4 times with a phosphate buffer containing 1% ⁇ serum, the cells are allowed to react with the cells for 30 minutes at room temperature using a biotinylated goat anti-Peagle IgG antibody (manufactured by Vector I-Lapora Trees) as a secondary antibody.
  • a color reaction was performed by using an ABC-AP kit (Vector's manufactured by Lapora Trees) according to the attached protocol.
  • osteoclasts were not stained at all.
  • One-day-old DDY mice were anesthetized with ether, and a phosphate buffer (pH 7.4) containing 4% paraformaldehyde was injected from the left ventricle and fixed by perfusion.
  • the mandible was excised, immersed in a phosphate buffer (pH 7.4) containing 4% paraformaldehyde as described above, and further exposed at 4
  • the mixture was fixed for 12 hours, washed three times with a phosphate buffer, and further washed with a phosphate buffer for 4 hours. After that, demineralization was performed for 4 weeks with 10% EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) for 4 weeks.
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • the cells were embedded with OCT compound (Sakura Finetech), immersed in dry ice-containing isopentane, and frozen.
  • OCT compound Sakura Finetech
  • the embedding block thus prepared was sliced at 10 / iin using a cryomicrotome (manufactured by Leica) to prepare a mandibular tissue section.
  • the endogenous peroxidase activity was eliminated by reacting with methanol containing 0.3% hydrogen peroxide at room temperature for 30 minutes. After washing three times with phosphate buffer (room temperature, 5 minutes each), blocking was performed by reacting with phosphate buffer containing 10% donkey serum at room temperature for 30 minutes. The blocking solution was removed, and a phosphate buffer (containing 2% donkey serum) containing 10 ig / ml of the perforated anti-mouse DC-STAMP polyclonal prepared in Example 4 was added. The mixture was allowed to react at 4 ° C.
  • a non-immunized egret IgG antibody (manufactured by Dako Japan) was prepared as a negative control, and the same operation was performed. After washing three times with phosphate buffer (room temperature ⁇ 5 min each): Diluted 200-fold diluted biotinylated donkey anti-Egret IgG antibody (manufactured by Jackson, Imno Research, Rapora Trees) with phosphate buffer. After reacting for 1 hour at room temperature and washing 3 times with phosphate buffer (room temperature for 5 minutes each), the peroxidase-labeled streptavidin complex (manufactured by Dako Japan) is distilled water.
  • the reaction was carried out at room temperature for 30 minutes with a 300-fold dilution. After washing three times with a phosphate buffer (at room temperature for 5 minutes each), a color reaction was performed using a DAB substrate kit (manufactured by Vector Laboratories) according to the attached protocol.
  • a DAB substrate kit manufactured by Vector Laboratories
  • Each mouse DC-STAMP siRNA with two bases (UU) added to the 3 'end of each of the sense strand and antisense strand is a Si1encers iRNA constru ti on kit (Ambion) ) was prepared by transcription according to the attached protocol.
  • the template oligo MA sets required for siRNA preparation are as follows.
  • siRNAs for the 5 'end of the third exon (corresponding to the 7th transmembrane region in the amino acid sequence deduced from the human DC-STAMP cDNA sequence) and siRNAs containing mutations were prepared as follows. A combination of template oligo DNAs was used.
  • siRNA # 135 template
  • nucleotides 12 and a are nucleotides a and g, respectively. It has been mutated to c.).
  • siRNAs and mutant siRNAs for the mouse DC-STAMP specific cDNA sequence located 3 'to the above siRNA (# 135) in the third exon. Using.
  • human RANKL manufactured by Bae flop port Tech
  • human TNF-alpha manufactured by PeproTech Inc.
  • 20% 100 ⁇ l of human MEM medium containing fetal serum was added.
  • TRAP staining was performed using a Leukocyte Acid Phosphatase kit (manufactured by Sigma) according to the attached protocol, and the number of formed TRAP-positive polynuclear osteoclasts was counted.
  • RAW-D was prepared at a concentration of 7 x 10 4 cells / ml in ⁇ -MEM medium containing 1 ( ⁇ fetal serum and spread in a 24-well plate at 500 1 / well, and human RANKL ( ⁇ Protech) was added. A final concentration of 20 ng / ml, human TNF- ⁇ (manufactured by Pebrotech) was added to a final concentration of 2 ng / ml, and mouse MIP-1a (manufactured by Pebrotech) was added to a final concentration of 1 ng / ml. Cultured for 3 days.
  • An oligonucleotide having the sequence was synthesized according to a conventional method.
  • This primer PCR was performed under the following conditions using a thermal cycler (Gene Amp PCR System 9700). Primer (final concentration 1.0 ⁇ ⁇ each), 5 1 10 X Pyrobest PCR buffer 1 (Takara Shuzo), 4 ⁇ 1 2.5mM dNTPs, prepared with 1 ⁇ .1 cDNA (b), 50 1 with double distilled water And Furthermore, 0.5 ⁇ 1 of 5U / 1 Pyrobest DNA polymerase (Takara Shuzo) was added to prepare a reaction solution.
  • This reaction solution was first heated at 94 ° C for 2 minutes, and then repeated 30 times at 94 ° C for 0.5 minutes, 60 at 0.5 minutes, and 72 at 5 minutes 30 times, and then heated at 7 C for 10 minutes. The temperature was kept at 4 ° C.
  • the entire amount of the PCR reaction solution obtained in c) was purified using QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen) according to the attached protocol.
  • the obtained fragment was digested with the restriction enzymes Sail and NoU, and then digested with pCI-neo (Promega) and DNA Ligation Kit Ver.1 (Takara Shuzo) similarly digested with Sail and Notl.
  • the cells were transformed and transformed into E. coli XL Blue MRF '(Stratagene). From the Escherichia coli colony thus obtained, transformed Escherichia coli carrying the plasmid pCI-neo-mouse DC-STAMP was isolated.
  • the entire nucleotide sequence of the 0RF cDNA inserted into the obtained plasmid was analyzed using MA Sequencer (ABI Prism 310 DNA Sequencer manufactured by Applied Biosystems Division, PerkinElmer Japan, Inc.). As a result, the sequence was found to be the sequence shown in SEQ ID NO: 26 in the sequence listing.
  • This nucleotide sequence is identical to the 0RF coding region of the sequence registered as “mouse DC-STAMP” (registration number: AB109560) in the NCBI GeneBank database, and is identical to the amino acid encoded by the nucleotide sequence.
  • the acid sequence (SEQ ID NO: 27 in the sequence listing) matched 100 times with the amino acid sequence of mouse DC-STAMP.
  • the above-described expression plasmid was transfected into RAW-D (transient 'transfection) by the DEAE-dextran method.
  • RAW-D (3.0 ⁇ 10 6 ), which was washed twice with serum-free a-MEM (10 ml) (200 ⁇ g, centrifuged for 5 minutes), was suspended in the above transfusion solution (1 ml). After incubation for 30 minutes at C0 2 in Kyubeta in one (37 ° C), Fei without serum - once washed with MEM (10ml) (200 Xg, centrifuged for 5 minutes) after, a further 5% ⁇ shea calf serum The plate was washed once with a-MEM (10 ml).
  • TRAP staining was performed using Leukocyte Acid Phosphatase kit (manufactured by Sigma) according to the attached protocol. The number of formed TRAP-positive polynuclear osteoclasts was measured, and as a result, in the absence of RANKL and TNF- ⁇ , TRAP-positive polynuclear osteoclasts were not induced at all even when mouse DC-STAMP protein was forcibly expressed.
  • RAW-D was adjusted to 4.5 ⁇ 10 4 cells / ml in human MEM medium containing 10% fetal calf serum.
  • DC-STAMP and DC-STAMPA T7 inhibited the formation of TRAP-positive multinucleated osteoclasts of RAW-D by antibodies that would specifically bind to DC-STAMP and DC-STAMP ⁇ 7. However, it was suggested that it is deeply involved in osteoclast differentiation. '
  • Example 4 To this cell culture supernatant was added the egret anti-mouse DC-STAMP polyclonal monoclonal antibody prepared in Example 4 to a final concentration of 0, 5, 10, 20 g / ml, and after culturing for 6 days, Leukocyte TRAP staining was performed using an Acid Phosphatase kit (manufactured by Sigma) according to the attached protocol, and the number of formed TRAP-positive polynuclear osteoclasts was counted. As a result, the formation of TRAP-positive polynuclear osteoclasts was suppressed in a dose-dependent manner with the added anti-mouse DC-STAMP polyclonal antibody (FIG. 8).
  • a 14-day-old ICR mouse male or female was euthanized by cervical dislocation under ether anesthesia, and the femur and tibia were removed. After removing the soft tissue, the bones were minced with scissors in a 60 mm diameter dish containing 1 ml of DMEM medium containing 10% fetal serum. The mixture was transferred to a 15 ml centrifuge tube, 10 ml of DMEM medium containing 10% fetal calf serum was added, and the mixture was stirred for 30 seconds with a Portex mixer (EMS equipment), and then allowed to stand for 2 minutes.
  • EMS equipment Portex mixer
  • ivory slices (150-200 m in thickness, 6 mm in diameter) prepared in DMEM medium containing 10% fetal calf serum to 1 ⁇ 10 7 cells / ml were prepared.
  • chemical industry in manufacturing 96-well plates in 100 1 / well seeded lined, C0 2 incubator base - was incubated for 4 hours in a coater. Then was replaced with DMEM medium 200 1 containing 10% ⁇ shea calf serum, active peak evening Min D 3 (Sigma) was added to a final concentration of 1X10- 8 M (non-addition group was also prepared) .
  • Example 4 To this cell culture supernatant was added the egret anti-mouse DC-STAMP polyclonal antibody prepared in Example 4 to a final concentration of 0, 2, 6, or 20 g / ml, and the cells were cultured for 4 days. After completion of the culture, the culture supernatant was removed from the plate containing the ivory, and distilled water was added to wash the plate once, and distilled water was newly added. Cells attached to the ivory section were peeled off using a poly tsushinda brush (manufactured by Tagaya Seisakusho) connected to Hand Mo (Yuichi, manufactured by Tokyo Nakai Co., Ltd.).
  • Giant cell tumor is a bone tumor in which a large number of histologically osteoclast-shaped multinucleated giant cells appear, characterized by osteolytic bone destruction as clinical findings
  • RANK Affymetrix Genechip HG-U133 probe 207037—at: manufactured by Affymetrix
  • RANKL Affymetrix Genechip HG-U133 probe 210643—t: affyme
  • Catixin K Affymetrix Genechip HG-U133 probe 202450—s—at: Affymetrix
  • TRAP Affymetrix Genechip HG-U133 probe 204638—
  • the expression level was compared in 9 normal bone tissues, 14 GCT tissues, and 10 non-GCT bone tumor tissues. Compared with normal tissues, it was found that the transcription of RANK and RANKL was specifically enhanced in GCT tissues. It became clear (Fig. 10A). On the other hand, in bone tumor tissues other than GCT where bone resorption is not considered to be necessarily enhanced, the transcription of RANK and RANKL was significantly lower than that of GCT, and the expression level was equivalent to that of normal tissues. GCT suggested that the environment promoted osteoclast formation and activation. In addition, when the expression levels of cathepsin K and TRAP were compared, the transcription was significantly higher in GCT (FIG.
  • HPBMCs human peripheral blood mononuclear cells
  • RANKL RANKL
  • dexamethasone TRAP-positive multinucleated osteoclasts are formed (Mat suzaki et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., (1998) 246, 199-204).
  • HPBMC purchased from Yukkara Bio Inc.
  • Oral antibodies were added to a final concentration of 0, 2, and 6 IX g / ml After 4 days, 7 days, and 11 days of culture, the medium was replaced and samples were added, and 13 days after culture, Leukocyte Acid Phosphatase kit (Sigma) And TRAP staining was performed according to the attached protocol. As a result, a large number of osteoclasts were formed by RANKL stimulation, but the formation of TRAP-positive multinucleated osteoclasts was suppressed in a dose-dependent manner using anti-mouse DC-STAMP polyclonal monoclonal antibody. (Fig. 1) As shown above, the anti-mouse DC-STAMP antibody suppressed the formation of TRAP-positive polynuclear osteoclasts from HPBMC. It was strongly suggested that it is also involved in osteocyte differentiation. Industrial potential
  • a preventive and / or therapeutic agent for abnormal bone metabolism having a mechanism of action of inhibiting osteoclast activity can be obtained.
  • SEQ ID NO: 15 Description of an artificial sequence :: Mouse DC- • Synthetic partial peptide of STAMP
  • SEQ ID NO: 16 Description of an artificial sequence :: Mouse II-Type I DNA of STAMP
  • SEQ ID NO: 18 Description of artificial sequence:: mouse DC- ⁇ STAMP type III DNA 3
  • SEQ ID NO: 24 Description of an artificial sequence ::: Mouse DC-• STAMP forward PCR primer
  • SEQ ID NO: 25 Description of an artificial sequence:: Mouse DC-• STAMP reverse PCR primer

Abstract

本発明は、破骨細胞で強く発現する遺伝子を用いた骨代謝異常の検出方法､骨代謝異常治療及び／または予防効果を有する化合物のスクリーニング法、及び骨代謝異常治療及び／または予防用医薬組成物に関する。すなわち、本発明は、ヒトDC-STAMP遺伝子の発現を指標とした骨代謝異常の検出方法、及びヒトDC-STAMPを特異的に認識し、破骨細胞の形成を抑制する活性を有する抗体を含む医薬組成物の提供等。

Description

明 細 書
. 破骨細胞関連タンパク質を標的とした抗体 技術分野
本発明は、 骨代謝異常症の治療及び/又は予防剤として有用な物質、 骨代謝 異常症の治療及びノ又は予防剤として有用な物質のスクリ一二ング方法、 骨代 謝異常症の検査方法並びに骨代謝異常症の治療又は予防方法に関する。 背景技術
骨は、 自らの形態変化や血中カルシウム濃度の維持のため、 常に形成と吸収を 繰り返し再構築を行う動的な器官として知られている。 正常な骨では骨芽細胞 による骨形成と破骨細胞による骨吸収とは平衡関係にあり、 骨量は一定に保た れている。 一方、 骨形成と骨吸収との平衡関係が崩れると、 骨粗鬆症などの骨 代謝異常になる (Endocrinological Review 13， 66-80， 1992， Principles of Bone Biology p87-102, 1996, Academic Press , New York)。
骨代謝を調節する因子としては、 全身性のホルモンや局所性のサイ 卜力イン が数多く報告されており、 それら.因子の共同作用により骨の形成と維持が営ま れてレ る（Endocrinological Review 13, 66-80, 1992, Endocrinological Review 17, 308-332, 1996)。 加齢による骨組織の変化としては、 骨粗鬆症の発症が広 く知られているが、 その発症機構は性ホルモンの分泌低下やそのレセプ夕一異 常、 老化遣伝子の発現、 破骨細胞や骨芽細胞の分化あるいは機能不全など多岐 にわたつており、 加齢による生理現象として理解するのは困難である。 骨粗鬆 症はエス トロゲンの分泌低下による閉経後骨粗鬆症と加齢による老人性骨粗鬆 症に大別されているが、 その発症機構の解明と治療薬開発の為には、 骨吸収と 骨形成の調節機構についての基礎的研究の進展が必須である。
破骨細胞は、 造血幹細胞に由来する多核の細胞であり、 骨との接着面に塩素 イオンと水素イオンを放出することによって、 細胞と骨接着面の間隙を酸性化 する （American Journal of Physiology 260, C1315-C1324, 1991 )。 この結果、 リ ン酸カルシウムの分解と酸性プロテアーゼの活性化が引き起こされ、 骨吸収 が進行する。
破骨細胞の前駆細胞は骨表面の骨芽細胞/ス トローマ細胞の細胞膜上に発現 す ¾ RANKL (Receptor activator of NF-κ B 1 igand) の刺激を受けて、 破骨細 胞へ分化することが明らかとなつてきた （Procedings of the National Academy of Science of the Uited States of America 95, 3597-3602, 1998, Cell 93, 165-176， 1998)。 RANKLは骨芽細胞/ス トロ一マ細胞が産生する膜結合因子であ り、 その発現は骨吸収因子により調節されること、 および、 RANKL は破骨細胞 前駆細胞から多核破骨細胞への分化を誘導することなどが明らかにされた
(Procedings of the National Academy of Science of the Uited States of America 95, 3597-3602, 1998, Journal of Bone and Mineral Research 23, S222, 1998)。 さらに、 RANKLをノ ックアウ トしたマウスが、 典型的な大理石病を発症 することが見出され、 MNKLが生理的な破骨細胞分化誘導因子であることが証 明された (Nature '397, 315-323, 1999)。
骨に関わる疾患の治療や治療期間の短縮を図る医薬品として、 ビスホスホネ ー ト、 活性型ビタミン！ )3、 カルシトニンおよびその誘導体、 ェス トラジオ一ル 等のホルモン製剤、 SERMs (Selective estrogen receptor modulators) , ィプ リフラボン、 ビタミ ン K2 (メナテトレノン） 及びカルシウム製剤等が使用され ている。 しかし、 これらの薬剤は、 治療結果において必ずしも満足できるもの ではなく、 より治療効果の高い薬剤の開発が望まれていた。
樹状細胞 （dendritic cell、 '以下、 「D (：」 という。） は、 免疫系の専門的な抗 原提示細胞で、 身体全体に散在している。 樹状細胞特異的細胞膜貫通タンパク 質 （dendritic cell - specific transmembrane protein, 以下、 「DC - STAMPj と いう。） は、 樹状細胞の細胞膜を貫通する夕ンパク質として単球由来 DCの cDNA ライブラリ一よりクロ一ニングされたタンパク質である （European Journal of Immunology 30, 3585-3590, 2000)。 DC- STAMP の cDNAについてはこれまでにヒ 卜で 1種類報告されており （GenBank ァクセシヨ ン番号 ： NM_030788)、 マウス では、 第 3ェクソンを含む長い配列 （GenBank ァクセシヨ ン番号 ： AB109560) と、 第 3ェクソンが短いスプライスパリアン ト （GenBank ァクセショ ン番号 ： AB109561 ) の 2 種類が報告されている。 ヒ ト由来の DC-STAMP とマウス由来の DC - STAMP との間でのアミノ酸配列の相同性は、 約 74%である。 アミノ酸配列の 疎水性解析の結果から DC- STAMPは 7つの膜貫通ドメインを持つと推定されてい る。 なお、 マウスにおける第 3ェクソンが短いスプライスバリアン卜は、 第 7 番目の膜貫通ドメインを欠失していると考えられ、以下 DC- STAMP ΔΤ7と表記す る。
DC-STAMP については、 単核貪食細胞を IL-4 により不活化するとその発現が 上昇し、 デキサメタゾンで不活化すると逆に発現が減少するとの報告があるが (Immunogenetics 53, 105-113, 2001)、 DC-STAMP と破骨細胞の分化との関連 は明らかになつていなかった。 発明の開示
本発明の目的は、 骨粗鬆症、 関節リウマチ、 癌細胞の骨転移等に見られる、 骨破壊等の種々の骨代謝異常の際に特異的に発現する遺伝子、 破骨細胞の活動 を阻害する物質、骨代謝異常の予防または治療剤を試験するための新規な方法、 および破骨細胞の活動を阻害する物質、 骨代謝異常の予防剤および Zまたは治 療剤を提供することにある。
本発明者らは、 骨代謝異常症の治療及び/又は予防効果を有する物質を探索 する目的で、破骨細胞の分化、成熟及び活性化の機能の解明を目指したところ、 DC-STAMP が破骨細胞の分化、 成熟及び活性化に関与していることを見出し、 DC- STAMPの発現を抑制すると、 破骨細胞の分化が抑制されることを見出し、 本 発明を完成させた。
すなわち、 本発明は、
( 1 ) DC- STAMP と特異的に結合し、 破骨細胞の形成を抑制する抗体、
( 2 ) 配列表の配列番号 2に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、 配列番 号 4に示されるアミ ノ酸配列からなる蛋白質及び配列表の配列番号 6に示され るアミノ酸配列からなる蛋白質からなる群から選択される少なく とも一つの蛋 白質と特異的に結合し、 破骨細胞の形成を抑制する抗体、
( 3 ) モノクローナル抗体であることを特徴とする、 （ 1 ) 又は （ 2 ) に記載 の抗体、
(4) ヒ ト化されていることを特徴とする、 （ 1 ) 乃至 （ 3 ) のいずれか 1 項に記載の抗体、 ' ( 5 ) 完全ヒ ト抗体であることを特徴とする、 （ 1 ) 乃至 （4) のいずれか 1 項に記載の抗体、
( 6) I g G抗体であることを特徴とする、 （ 1 ) '乃至 （ 5 ) のいずれか一つ に記載の抗体、
(7 ) 下記の工程 1 ) 乃至 4) を含む、 骨代謝異常の検出方法 ：
1 ) 被験者より採取した検体より、 全 R N A画分を抽出する工程 ；
2) 正常人より採取した検体より、 全 R N A画分を抽出する工程 ；
3) 上記工程 1 ) 由来の全 R N A画分と上記工程 2 ) 由来の全 RNA画分にお ける、 下記の a)または!)）のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドの発現量を 測定する工程 ；
a)配列表の配列番号 1、 3及び 5の少なく ともいずれか一つに示されるヌクレ ォチド配列からなるポリヌクレオチド、
b)上記 a)に記載のポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列からなるポリ ヌクレオチドとス トリ ンジェントな条件下でハイブリダィズするポリヌクレオ チド ；
4) 上記工程 1 ) 由来の全 R N A画分と上記工程 2 ) 由来の全 RNA画分との 間 Ϊこおける上記工程 3 ) によって測定されたポリヌクレオチドの発現量の差を 解析し、 上記工程 1 ) に記載の被験者の骨代謝異常を検出する工程、
( 8 ) 下記の工程 1 ) 乃至 3) を含む、 骨代謝異常の検出方法 ： .
1 ) 被験者より採取した検体における、 配列表の配列番号 2、 4及び 6の少なく ともいずれか一つに示されるアミノ酸配列からなる蛋白質の発現量を測定する 工程；
2) 正常人から採取した検体における、 上記工程 1 ) に記載の少なく ともいずれ か一つの蛋白質の発現量を測定する工程 ； '
3) 上記工程 1 ) で検出された蛋白質の発現量と上記工程 2 ) で測定された該蛋 白質の発現量の差を解析し、 被験者の骨代謝異常を検出する工程、
( 9 ) 骨代謝異常が骨粗鬆症、 関節リゥマチ及び 又は癌性高カルシウム血症 であることを特徴とする、 （ 7 ) 又は （ 8 ) に記載の方法、
( 1 0 ) 骨代謝異常が骨粗鬆症であることを特徴とする、 （ 7 )·又は （ 8 ) に 記載の方法、 ( 1 1 ) 骨代謝異常が関節リウマチであることを特徴とする、 （7 ) 又は （8 ) に記載の方法、
( 1.2 ) ' 骨代謝異常が癌性高カルシウム血症であることを特徴とする、 （ 7 ) 又は （ 8 ) に記載の方法、
( 1 3) ポリヌクレオチドの発現量を測定する方法が、 ノーザンプロッ ト法 、 ドッ トブロッ ト法、 スロッ トプロッ ト法、 R T— P C R、 リポヌクレアーゼ 保護アツセィまたはランオン ' アツセィであることを特徴とする、 （ 7 )、 （ 9) 乃至 （ 1 2 ) のいずれか一つに記載の方法、
( 1 4) ポリヌクレオチドの発現量を測定する方法が検体由来の相補的 D N A群または該 D N A群の各 D N Aの部分配列からなる D N Aで作製された遺伝 子チップまたはアレイを用いることを特徴とする、 （ 7 )、 （ 9 ) 乃至 （ 1 2 ) の いずれか一つに記載の方法、
( 1 5 ) 蛋白質の発現量の測定方法が、 該蛋白質に特異的に結合する抗体また はリガンドを用いることを特徴とする、 （ 8 ) 乃至 （ 1 2 ) のいずれか一つに記 載の方法、
( 1 6) 蛋白質の発現量の測定方法が、 ウェス夕.ンブロッ ト法、 ドッ トブロッ ト法、 スロッ トブロッ ト法または固相酵素免疫定量法 （E L I S A法） であるこ とを特徴とする、 （ 8 ) 乃至 （ 1 2 ) のいずれか一つに記載の方法、
( 1 7) 下記の 1 ) 乃至 3 ) からなる群から選択される少なく とも一つ以上を 含む骨代謝異常の検出用キッ ト ：
1 ) 配列表の配列番号 1、 3及び 5の少なく ともいずれか一つに示されるヌク レオチド配列からなるポリヌクレオチドを特異的に増幅するための 1 5乃至 3 0塩基長の連続したオリゴヌクレオチドプライマ一 ；
2 ) 配列表の配列番号 1、 3及び 5の少なく ともいずれか一つに示されるヌク レオチド配列からなるポリヌクレオチドにス トリ ンジェントな条件下でハイブ リダィズし、 該ポリヌクレオチドを検出するための 1 5ヌクレオチド以上の連 続したポリヌクレオチドプローブ ；
3 ) 配列表の配列番号 1、 3及び 5の少なく ともいずれか一つに示されるヌク レオチド.配列からなるポリヌク レオチドが固定された固相化試料、
( 1 8 ) 下記の 1 ) 及び 2 ) を含む骨代謝異常の検出用キッ ト ： 1 ) 配列表の配列番号 2、 4及び 6の少なく ともいずれか一つに示されるアミ ノ酸配列からなる蛋白質に特異的に結合し、 該蛋白質を検出するための抗体 ；
2) .上記 1 ) に記載の抗体に結合し得る二次抗体、
( 1 9) 骨代謝異常が骨粗鬆症、 関節リウマチ又は癌性髙カルシウム血症で あることを特徴とする、 （ 1 7) 又は （ 1 8 ) に記載のキッ ト、
(2 0) 骨代謝異常が骨粗鬆症であることを特徴とする、 （ 1 7)又は （ 1 8 ) に記載のキッ ト、
(2 1 ) 骨代謝異常が関節リウマチであることを特徴とする、（ 1 7)又は（'1 8 ) に記載のキッ ト、
( 2 2 ) 骨代謝異常が癌性高カルシウム血症であることを特徴とする、（ 1 7 ) 又は （ 1 8 ) に記載のキッ ト、
(2 3) ( 1 ) 乃至 （ 6 ) に記載の抗体の少なく ともいずれか一つを含有す ることを特徴とする、 骨代謝異常の治療用医薬組成物、
(2 4) ( 1 ) 乃至 （ 6 ) に記載の抗体の少なく ともいずれか一つ、 並びに、 ビスホスホネート、 活性型ビタミン D3、 カルシトニンおよびその誘導体、 エス ト ラ ジオ一ル等のホルモ ン製剤、 SERMs ( select ive estrogen receptor modulators), ィプリ フラボン、 ビタミン K2 (メナテトレノン）、 カルシウム製 剤、 PTH (parathyroid hormone)製剤、 非ステロイ ド性抗炎症剤、 抗 TNFa抗体、 抗 PTHrP (parathyroid hormone - related protein)抗体、 IL-1 レセプタ一アンタ ゴニス ト、 抗 RANKL抗体及び OCIF(osteoclastogenesis inhibitory factor)か らなる群から選択される少なく ともいずれか一つを含有することを特徴とする、 骨代謝異常の治療用医薬組成物、
( 2 5 ) 配列表の配列番号 1、 3及び 5に示されるヌクレオチド配列のいずれ か一つまたは該配列の部分配列に相補的なヌク レオチ ド配列を有するオリ ゴヌ クレオチドを含む骨代謝異常の治療用医薬組成物、
(2 6) 骨代謝異常が骨粗鬆症、 関節リウマチ又は癌性高カルシウム血症で あることを特徴とする、 （2 3) 乃至 （2 5 ) のいずれか一つに記載の医薬組成 物、
(2 7) 骨代謝異常が骨粗鬆症であることを特徴とする、 （ 2 3 ) 乃至 （ 2 5 ) のいずれか一つに記載の医薬組成物、 (2 8) 骨代謝異常が関節リ ゥマチであることを特徴とする、（ 2 3)乃至（2 5 ) のいずれか一つに記載の医薬組成物、
( 2.9 ) 骨代謝異常が癌性高カルシウム血症であることを特徴とする、（ 2 3) 乃至 （2 5 ) のいずれか一つに記載の医薬組成物、
( 3 0 ) 下記の工程 1 ) 乃至 4) を含むことからなる、 骨代謝異常に対する 治療効果及び Zまたは予防効果を有する物質のスクリ一二ング方法 ：
1 ) 被験物質を添加した培地で培養した哺乳動物由来培養細胞より、 全 RNA 画分を抽出する工程 ；
2 ) 被験物質を添加しないで培養した哺乳動物由来培養細胞より、 全 RNA画 分を抽出する工程 ：
3) 上記工程 1 ) 由来の全 RN A画分と上記工程 2 ) 由来の全 RNA画分にお ける、 下記いずれか一つに記載のポリヌクレオチドまたはその部分ポリヌクレ ォチドの発現量を測定する工程 ；
配列表の配列番号 1に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、 配列番号 3に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番 号 5に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドからなる群から選 択される少なく ともいずれか一つのポリヌクレオチド、
4 ) 上記工程 1 ) 由来の全 R N A画分と上記工程 2 ) 由来の全 RNA画分との 間における上記工程 3) によって測定されたポリヌクレオチドの発現量の差を 解析し、 被 物質の、 骨代謝異常に対する治療効果及び Zまたは予防効果を判 定する工程、
( 3 1 ) 下記の工程 1 ) 乃至 4) を含むことからなる、 骨代謝異常の治療効 果及び/ /または予防効果を有する物質のスク リーニング方法 ：
1 ) 被験物質を投与した哺乳動物個体より採取した検体より、 全 RNA画分を 抽出する工程 ；
2) 被験物質を投与しなかった哺乳動物個体より採取した検体より、 全 RNA 画分を抽出する工程 ；
3 ) 上記工程 1 ) 由来の全 R N A画分と上記工程 2 ) 由来の全： NA画分にお ける、 下記のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドまたはその部分ポリヌク レオチドの発現量を測定する工程 ； 配列表の配列番号 1 に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、 配列番号 3 に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番 号 5.に示されるヌクレオチド配列からなる'ポリヌクレオチドからなる群から選 択される少なく ともいずれか一つのポリヌクレオチド、
4 ) 上記工程 1 )由来の全 R N A画分と上記工程 2 ) 由来の全 R N A画分との間 における上記工程 3 ) よって測定されたポリヌクレオチドの発現量の差を解析 し、 被験物質の骨代謝異常に対する治療効果及び/または予防効果を判定する 工程、
( 3 2 ) 下記の工程 1 ) 乃至 3 ) を含むことからなる、 骨代謝異常の治療効 果及び/ /または予防効果を有する物質のスクリーニング方法 ：
1 ) 被験,物質を添加した培地で培養した哺乳動物由来培養細胞における、 下記 のいずれか一つに記載の蛋白質またはその部分ポリペプチドの発現量を測定す る工程 ；
配列表の配列番号 2 に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、 配列番号 4に示 されるアミノ酸配列からなる蛋白質及び配列番号 6 に示されるアミノ酸配列か らなる蛋白質からなる群から選択される少なく ともいずれか一つの蛋白質、
2 ) 被験物質を添加しない培地で培養した哺乳動物由来培養細胞における、 上 記工程 1 ) のいずれか一つに記載の蛋白質の発現量を該蛋白質に特異的に結合 する抗体またはリガンドを用いて検出する工程 ；
3 ) 上記工程 1 ) で検出された蛋白質の発現量と、 上記工程 2 ) で検出された 該蛋白質の発現量の差を解析し、 被験物質の骨代謝異常に対する治療効果及び /または予防効果を判定する工程、
( 3 3 ) 下記の工程 1 ) 乃至 3 ) を含むことからなる、 骨代謝異常の治療効 果及び または予防効果を有する物質のスク リーニング方法 ：
1 ) 被験物質を投与された哺乳動物個体より採取した検体における、 下記のい ずれか一つに記載の蛋白質またはその部分ポリベプチドの発現量を測定するェ 程 ；
配列表の配列番号 2 に示されるァミノ酸配列からなる蛋白質、 配列番号 4に示 されるアミノ酸配列からなる蛋白質及び配列番号 6に示されるアミノ酸配列か らなる蛋白質からなる群から選択される少なく ともいずれか一つの蛋白質、 2 ) 被験物質を投与されなかった哺乳動物個体より採取した検体における、 上 記工程 1 ) のいずれか一つに記載の蛋白質またはその部分ポリペプチドの発現 量を測定する工程 ； ■
3 ) 上記工程 1 ) で検出されだ蛋白質の発現量と、 上記工程 2 ) で検出された 該蛋白質の発現量の差を解析し、 被験物質の骨代謝異常に対する治療効果及び Zまたは予防効果を判定する工程、
( 3 4 ) ポリヌクレオチドの発現量を測定する方法が、ノーザンプロッ ト法、 ドッ トプロッ ト法、 スロッ トプロッ ト法、 R T— P C R、 リポヌク レア一ゼ保 護アツセィまたはランオン ·アツセィであることを特徴とする、（ 3 0 )又は（ 3 1 ) に記載の方法、
( 3 5 ) ポリヌクレオチドの発現量を測定する方法が動物組織または動物細 胞由来の相補的 D N A群または該 D N A群の各 D N Aの部分配列からなる D N Aで作製された遺伝子チップまたはアレイを用いることを特徴とする （ 3 0 ) 又は （ 3 1 ) に記載の方法、
( 3 6 ) 蛋白質の発現量の測定方法が、 該蛋白質に特異的に結合する抗体ま たはリガンドを用いることを特徴とする、 （ 3 2 ) .又は （ 3 3 ) に記載の方法、 からなる。 図面の簡単な説明
図 1 は、 RANKL刺激による各 RAW264サブクローン細胞の破骨細胞への分化を 示したグラフである。
図 2は、 RAW- D細胞の破骨細胞への分化に伴う DC- STAMPの m- RNAの発現を示 した図である。
図 3は、 RANKL、TNF αおよび ΜΙΡ- 1 aで刺激した RAW- D細胞における DC - STAMP の m- RNAの発現を示した図である。
図 4は、 活性型ビタミン D3 で刺激した初代骨髄細胞における DC- STAMP の m-RNAの発現を示した図である。
図 5は、 DC- STAMPの siRNAによる、 RAW- D細胞から破骨細胞への分化の抑制 を示したグラフである。
図 6は、 DC- STAMP蛋白質の強制発現による、 RAW- D細胞からの破骨細胞形成 促進を示したグラフである。 .
図 7は、 抗 DC-STAMP抗体による、 RAW-D細胞からの破骨細胞形成阻害を示し たグラフである。
図 8は、 抗 DC- STAMP抗体による、 マウス骨髄細胞からの破骨細胞形成阻害を 示したグラフである。
図 9は、 抗 DC - STAMP抗体による、 吸収窩形成の抑制を示したグラフである。 図 1 0は、 巨細胞腫におけるヒ ト RANK、 RANKL、 カテブシン Kおよび TRAP遺 伝子の発現プロファイルを示したグラフである。
図 1 1 は、巨細胞腫におけるヒ ト DC-STAMP遺伝子の発現プロフアイルを示し たグラフである。
図 1 2 は、 抗 DC- STAMP抗体による、 ヒ ト末梢血単核球からの破骨細胞形成阻 害を示したグラフである。 発明を実施するための最良の形態
本発明において、 「ス トリ ンジェン トな条件下でハイプリダイズする」 とは、 市販のハイブリダィゼ一シヨ ン溶液 ExpressHyb Hybridization Solution (ク ロンテック社製） 中、 6 8 °Cでハイブリダィズすること、 または、 DNAを固 定したフィルタ一を用いて 0. 7 — 1 . 0 Mの N a C 1 存在下 6 8 °Cでハイブ リダィゼーシヨ ンを行った後、 0. 1 — 2倍濃度の S S C溶液 （ 1倍濃度 S S Cとは 1 5 0 mM N a C l 、 1 5 mM クェン酸ナトリウムからなる） を用 い.、 6 8 °Cで洗浄することにより同定することができる条件またはそれと同等 の条件でハイプリダイズすることをいう。
1 . DC-STAMP
本発明者らによって、 DC-STAMPは巨細胞腫において特異的に発現しているこ とが見出された。 また、 本発明者らによって DC-STAMPは単球由来細胞株が破骨 細胞に分化する際に発現量が増加するこ'とも見出された。
本発明で用いる DC- STAMPは、 ヒ ト、 あるいは非ヒ ト哺乳動物 （例えば、 モル モッ ト、 ラッ ト、 マウス、 ニヮ ト リ、 ゥサギ、 ブ夕、 ヒッジ、 ゥシ、 サルなど） の単球細胞、 樹上細胞あるいは骨髄細胞から直接精製して使用するか、 あるい は上記の細胞の細胞膜画分を調製して使用することができ、 また、 DC-STAMP を i n v i t r oにて合成する、 あるいは遺伝子操作により宿主細胞に産生さ せる.ことによって得ることができる。 遺伝子操作では、 具体的には、 DC- STAMP を発現可能なベクタ一に組み込んだ後、 転写と翻訳に必要な酵素、 基質及びェ ネルギー物質を含む溶液中で合成する、 あるいは他の原核生物、 または真核生 物の宿主細胞を形質転換させることによって DC- STAMP を発現させることによ り、 該蛋白質を得ることが出来る。
ヒ ト DC-STAMPの cDNAのヌクレオチド配列は、 GenBank にァクセッショ ン番 号 ： NM— 030788 で登録されており、 配列表の配列番号 1 にも示されており、 そ のアミノ酸配列は配列表の配列番号 2 に示されている。マウス DC- STAMPの cDNA のヌクレオチド配列は、 第 3ェクソンを含む長い配列が GenBankにァクセッシ ヨ ン番号： AB 109560で登録されており、配列表の配列番号 3'にも示されており、 そのアミノ酸配列は配列表の配列番号 4に示されている。マウス DC-STAMPの第 3ェクソンが短いスプライスバリアントの cDNAのヌクレオチド配列は GenBank にァクセッショ ン番号： AB1 09561 で登録されており、 配列表の配列番号 5 にも 示されてお り、 そのアミ ノ酸配列は配列表の配列番号 6 に示されている。 DC-STAMPの cDNAは例えば、 DC-STAMP を発現している cDNAライブラリ一を錡型 として、 DC-STAMPの c D N Aを特異的に増幅するプライマーを用いてポリ.メラ —ゼ連鎖反応（以下「 P C R」という）（S a i k i , R. K.， e t a l . , Sc i ence, (1 988) 239 , 487- 49)を行なう、 いわゆる P C R法により取得することができる。
なお、 配列表の配列番号 1 、 3及び 5から選択される少なく ともいずれか一 つに示されるヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌク レオチドとス トリ ンジェントな条件でハイブリダィズし、 かつ、 DC-STAMP と同 等の生物活性を有する蛋白質をコー ドするポリヌク レオチドも DC-STAMP の cDNA に含まれる。 さらに、 ヒ ト若しくはマウス DC-STAM遺伝子座から転写され るスプライシングパリアント又はこれにス トリ ンジェントな条件でハイプリダ ィズするポリヌクレオチドであって、 かつ、 DC- STAMP と同等の生物活性を有す る蛋白質をコードするポリヌクレオチドも DC-STAMPの cDNAに含まれる。
また、 配列表の配列番号 2、 4及び 6から選択される少なく ともいずれか一 つに示されるアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、 付加されたアミノ酸配列からなり、 DC- STAMP と同等の生物活性を有する蛋白質 も DC- STAMP に含まれる。 さらに、 ヒ ト若しくは DC- STAMP遺伝子座から転写さ れる.スプライシングバリアン トにコードされるアミノ酸配列又は該アミノ酸配 列において、 1若しくは数個のアミ ノ酸が置換、 欠失、 付加されたアミノ酸配 列からなり、 かつ、 DC- STAMP と同等の生物活性を有する蛋白質も DC- STAMP に 含まれる。
2. 骨代謝異常の検出
DC- STAMP遺伝子は、 ヒ ト各種骨組織検体群における遺伝子の発現量の解析を すると、 破骨型の多核巨細胞が多数出現する骨腫瘍であり、 臨床的所見として 骨溶解性の骨破壊を特徴とする （Bullough et al. , Atlas of Orthopedic Pathology 2nd edition, ppl 7.6-17.8, Lippincot t Williams & Wilkins . Publishers (1992)) 巨細胞腫 （Giant cell tumor; GCT) において有意に発現 量が増加していることが見出される。
また、 DC-STAMP は単球由来細胞株が破骨細胞に分化する際に発現量が増加す ることも見出された。
したがって、 DC- STAMPは GCTのような骨吸収が宂進するヒ 卜の病態において 関与していると考えられる。 すなわち、 DC- STAMPの各細胞、 及び/又は各組織 における発現量を測定することで DC- STAMP の過剰発現に起因して発生すると 考えられる骨代謝異常疾患の状態を判定することができる。 なお、 本明細書に おける骨代謝異常疾患とは、 骨粗鬆症 （閉経後骨粗鬆症、 老人性骨粗鬆症、 ス テロイ ドゃ免疫抑制剤使用による続発性骨粗鬆症、 関節リ ゥマチに伴う骨粗鬆 症）、 関節リ ウマチの骨破壊、 癌性高カルシウム血症、 多発性骨髄腫や癌の骨転 移に伴う骨破壊、 歯根膜炎による歯の喪失、 人工関節周囲の骨融解、 慢性骨髄 炎における骨破壊、 骨ページエツ ト病、 腎性骨異栄養症、 骨形成不全症などを 含むがこれらに限定されない。
なお、 本発明に DC- STAMPの発現量を調べる対象となる 「検体」 とは、 被験者 や臨床検体等から得られた、 血液、 骨髄、 骨、 体液、 前立腺、 精巣、 陰茎、 膀 胱、 腎臓、 口腔、 咽頭、 口唇、 舌、 歯肉、 鼻咽頭、 食道、 胃、 小腸、 大腸、 結 腸、 肝臓、 胆囊、 滕臓、 鼻、 肺、 軟部組織、 皮膚、 乳房、 子宮、 卵巣、 脳、 甲 状腺、 リ ンパ節、筋肉、脂肪組織等の組織または排泄物等の試料を意味するが、 本発明においては血液又は骨髄がより好ましい。
( 1 ) DC- STAMP遺伝子の発現量を利用した骨代謝異常の検出方法 .
DC- STAMP遺伝子の発現量を利用した骨代謝異常の検出方法は、 具体的には、 以下の工程 1 ) 乃至 4) を含む方法である。
1 ) 被験者より採取した検体より、 全 R N A画分を抽出.する工程 ；
2 ) 正常人より採取した検体より、 全 RN A画分を抽出する工程 ；
3) 上記工程 1 ) に記載の全 R N A画分と上記工程 2 ) に記載の全 RNA画分に おける DC-STAMP遣伝子の発現量を測定する工程 ；
4) 上記工程 1 ) 由来の全 RN A画分と上記工程 2) 由来の全 RNA画分との間 における上記工程 3 )によって測定された遺伝子の発現量の差を解析し、 上記ェ 程 1 ) に記載の被験者の骨代謝異常を検出する工程。
以下、 各工程を具体的に説明する。
a) 工程 1 ) 被験者より採取した検体より、 全 R A画分を抽出する工程 ； 検体から全 RN A画分を抽出するに際しては、 適切な実験の倫理基準に適し た方法で入手したヒ ト由来組織を RN A抽出用の溶媒 （例えばフエノール等、 リポヌクレア一ゼを不活性化する作用を有する成分を含むもの） で直接溶解す るか又は、 該組織の細胞を破壊しないように、 スクレーパーで慎重に搔きとる か、 もしくはトリプシン等の蛋白質分解酵素を用いて穏やかに組織から細胞を 抽出するなどの方法により、 細胞を回収した後、 速やかに R N A抽出工程に移 行する。
R N Aの抽出方法としては、 チォシアン酸グァニジン · 塩化セシウム超遠心 法、 チォシアン酸グァニジン · ホッ トフエノール法、 グァニジン塩酸法、 酸性 チオシァン酸グァニジン · フエノール ' クロ口ホルム法 （Chomczynski，P. an d Sacchi.N. , Anal . Bi ochem. (1987), 162, 156-159) などを採用しうるが、 酸 性チオシアン酸グァニジン · フエノール · クロ口ホルム法が好適である。 また 、 市販の RNA抽出用試薬 （例えば、 I S O GEN (二ツボンジーン （株） 製 ) 、 丁尺 1 2〇 試薬 （ギブコ ' ビーアールエル社製） ） 等を試薬に添付のプ ロ トコールに従って用いることもできる。
得られた全 RNA画分は、 必要に応じてさらに mRNAのみに精製して用い るのが好ましい。 精製方法は特に限定されないが、 例えばピオチン化したオリ ゴ （d T) プローブに mRN Aを吸着させ、 さらにス トレプトアビジンを固定 化した常磁性粒子に、 ピオチン ス トレプトァビジン間の結合を利用して mR N Aを捕捉し洗浄操作の後、 mRN Aを溶出することにより、 mRNAを精製 することができる。 また、 オリゴ （d T) セルロースカラムに mRNAを吸着 させて、 次にこれを溶出して精製する方法も採用し得る。 ただし、 本発明の方 法のためには、 これら mR N Aの精製工程は必須ではなく、 検出対象のポリヌ クレオチドの発現の検出が可能である限りにおいて、 全 RN A画分をその後の 工程に用いることもできる。
b) 工程 2 ) 正常人より採取した検体より、 全 RN A画分を抽出する工程 ： 本発明において、 正常人とは、 骨代謝異常を有さない人を意味する。 正常人で あるか否かは、 DC - STAMPの濃度を測定し、 あらかじめ正常人の値として決めら れている数値範囲に入るか否かで判定することもできるし、 DC-STAMPの発現量 と、 正常人の骨代謝異常の形成度の相関をあらかじめ調べておく ことによって 、 被験者から採取した検体における DC- STAMPの発現量を測定することによって 被験者が、 正常人であるか否かを判定することもできる。 正常人よりの全 RN A画分の調製は、 上記工程 1 ) と同様に行う ことができる。
c) 工程 3 ) 上記工程 1 ) に記載の全 R N A画分と上記工程 2 ) に記載の全 RNA画分における DC- STAMP遺伝子の発現量を測定する工程 ：
ここで、 DC- STAMP遺伝子の発現量は配列表の配列番号 1に示されるヌクレオ チド配列を含むことからなるポリヌクレオチドまたは、 配列表の配列番号 1に 示されるヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオ チドとス トリ ンジェントな条件下でハイプリダイズするポリヌクレオチドの発 現量で示される。
D C - S T A M P遺伝子の発現量の測定方法として、 固相化試料を用いた測定方法と 、 その他のいくつ-かの測定方法について説明する。
( a) 固相化試料を用いた測定方法
( i ) 固相化試料
固相化試料としては、 例えば以下のものが挙げられる。
(ィ） 遺伝子チップ ：
つ—夕ベース上の E S T (. e x p r e s s e d s e q u e n c e t a g ) 配列又は mR N A配列をもとに合成したアンチセンスオリゴヌクレオチドが 固相化された遺伝子チップを用いることができる。 このような遺伝子チップと してはァフィ メ トリ ックス （A f f yme t r i x) 社製の遺伝子チップ（Lip shutz, R. J. et al. , Nature Genet. (1999) 21， suppl iment, 20- 24)を用いるこ とができるが、 これに限定されず、 公知の方法に基づき作製してもよい。 ヒ ト 細胞由来の mR N Aを解析する場合には、 ヒ ト由来のものが好ましく、 例えば 、 ァフィ メ トリ ックス社製ヒ ト U 9 5セッ ト又は U 1 3 3セッ トを用いること ができる。 しかしながら、 それらに限定されず、 例えば近縁種の動物由来のも のも使用可能である。
(口） ヒ ト、 全 RN Aあるいは特定の組織から得た全 RN Aより作製された c D N A又は R T— P C R産物が固相化された、 アレイ又はメンブレンフィル 夕一 ：
上記 c DNA又は RT— P C R産物は、 ヒ トの E S Tデータベース等の配列 情報を基に作製されたプライマーで逆転写酵素反応や P C Rを実施することに よりクローン化されたものである。 この c DNAや RT— P C R産物は、 あら かじめ骨代謝異常を有するヒ トと骨代謝異常を有きないヒ 卜の間で発現量の異 なる全 RNAを、 サブトラクシヨ ン法 （Diatchenki, L, et al, Proc. Natl. Aca d. Sci. USA, (1996) 93, 6025-6030) 、 ディ ファレンシャルディスプレイ法 （Lia ng, P. , et alNucleic Acids Res. , (1992) 23, 3685-3690) などを利用して選択 されたものであって'もよい。 また、 アレイやフィルタ一は市販のもの （例えば 、 インテリ ジーン ： 夕カラバイオ社製等） を使用してもよいし、 上記 c DNA や RT— P C R産物を市販のスポッターで （例えば、 GMS 4 1 7アレイヤー ： タカラバイオ社製等） を用いて固相化することにより作製してもよい。
(ii) プローブの作製と解析
標識プローブは、 特定の mRNAクロ一ンではなく、 発現している全ての m RNAを標識したものを用いる。 プローブ作製のための出発材料としては精製 していない mRNAを用いてもよいが、 前述の方法で精製したポリ （A) +R NAを用いることが望ましい。 以下に、 各種固相化試料を用いた場合の、 標識 プローブの調製方法と検出、 解析方法について説明する。
(ィ） ァフィ メ トリ ックス社製遺伝子チップ ： ァフィ メ トリ クス社製遺伝子チップに添付されたプロ トコ一ル （ァフィ メ ト リ ックス社発現解析技術マニュアル） に従ってピオチン標識した c RN Aプロ —ブを作製する。 次いでァフィ メ ト リ ックス社製遺伝子チップに添付のプロ ト コール （発現解析技術マニュアル） に従って、 ァフィ メ トリ ックス社製の解析 装置 （G e n e C h i p F l u i d i c s S t a t i o n 4 0 0) を用 いてハイブリダィゼ一シヨ ン及び解析を行い、 アビジンによる発光を検出、 解 析を行う。 ' (口） アレイ ：
逆転写酵素反応でポリ （A) + R N Aから c D N Aを作製する際に、 c DN Aの検出ができるように c DNAを標識しておく ことが必要であり、 蛍光色素 で標識する場合には、 蛍光色素 （例えば C y 3、 C y 5など） で標識された d —UT Pなどを加えておく ことにより c DN Aを蛍光標識する。 このとき、 被 験者より採取した検体由来のポリ （A) + R N Aと正常人より採取した検体由 来のポリ （A) +RNAをそれぞれ異なる色素で標識しておけば、 後の八イブ リダイゼ―ショ ン時には両者を混合して用いることができる。 アレイ として例 えば、 タカラバイオ （株） 社の市販アレイを用い^)場合、 同社のプロ トコール に従いハイブリダィゼ一ショ 及び洗浄を行って、 蛍光シグナル検出機 （例え ば GMS 4 1 8アレイスキャナ一 （夕カラバイオ （株） 社製） 等） で蛍光シグ ナルを検出後、 解析を行う。 ただし、 使用するアレイとしては市販のものに限 定されず、 自家製のもの、 特別に作製したものでもよい。
(ハ） メンブレンフィルタ一 ：
逆転写酵素でポリ （A) +RN Aから c DN Aを作製する際に、 放射性同位元 素 （例えば、 d— C T P等を加えることにより標識プローブを調製し、 常法に よりハイブリダィゼ一シヨ ンを行い、 例えば、 市販のフィル夕一製マイクロア レ一である、 ア トラスシステム （クロンテック社製） を用いてハイブリダィゼ ーショ ン及び洗浄を行った後、 解析装置 （例えば、 ア トラスイメージ ： クロン テック社製等） を用いて検出、 解析を行う。
前記 （ィ） 乃至 （八） のいずれに記載の方法も、 同一ロッ トの'固相化試料に ヒ ト各組織由来のプロ一プをハイブリダィズさせる。 このとき、 使用するプロ —ブ以外のハイプリダイゼーショ ンの条件は同じとする。 蛍光標識プローブを 用いる場合には、 それぞれのプローブを異なる蛍光色素で標識しておけば一つ の固相化試料に両プローブの混合物を一度に八ィブリダィズさせて蛍光強度を 読み取ることができる（Brown、 P.O. et al. Nature Genet. , (1999) 21 , supplement, 33— 37)。
(b) その他の測定方法
上記以外の測定方法としてサブトラクシヨ ンクロ一ニング法 （実験医学別 冊 新 遺伝子工学ハンドブック、 羊土社刊（1996) p.32- 35参照） 、 ディ ファ レンシャルディスプレイ法 （基礎生化学実験法 4 核酸 ·遺伝子実験 II·応用 編、 東京化学同人（2001), P125-128) 、 レポ一ター遺伝子を用いた方法 （クロ ラムフエニコールァセチルトランスフェラ一ゼ （例えば、 p CAT 3— B a s i cベクター ： プロメガ社製を使用。 ） や ；3—ガラク トシダーゼ （例えば、 p i3 g a l — B a s i c : プロメガ社製を使用。 ） 、 分泌型アル力リホスファタ ーゼ （例えば、 p S E A P 2— B a s i c ： クロンテック社製を使用。 ；） 、 綠 色^:光蛋白質 (g r e e n— f l u o r e s c e n t p r o t e i n) (例え ば、 p E G F P— 1 ： クロンテツク社製を使用。 ） ） があるがこれらに限定さ れない。
d) 工程 4) 上記工程 1 ) 由来の全 RN A画分と上記工程 2 ) 由来の全 RN A画分との間における上記工程 3 )によつて測定された遺伝子の発現量の差を 解析し、 上記工程 1 ) に記載の被験者の骨代謝異常を検出する工程。
正常人由来の検体と被験者由来の検体との間で DC- STAMPの発現量の差を解析 し、 DC- STAMPの発現量が有意に増加している検体では骨代謝異常が存在する可 能性が高いと判定することができ、骨代謝異常を検出することができる。発現量 が有意に増加しているとは、 例えば、 ァフィ メ トリ ックス社の遺伝子チップを 用いて、 ァフィ メ トリ ックス社の m i c r o a r r a y S u i t e V e r . 3. 0を用いて解析した場合、 DC-STAMP遺伝子の A v e r a g e d i f f e r e n c e値が正常人由来の検体に比べて有意に増加している場合をいう。 また、 DC-STAMP遺伝子の濃度を測定し、 あらかじめ正常人の値として決めら れている数値範囲に入るか否かを解析し正常人の値として決められている範囲 を超えている場合には骨代謝異常を有すると判定することで骨代謝異常を検出 することもできるし、 DC-STAMP遣伝子の発現量と、 正常人の骨代謝異常の形 成度の相関をあらかじめ調べておく ことによって、 被験者から採取した検体に おける DC-STAMP 遺伝子の発現量を測定することによって被験者が、 正常人 で るか否かを判定することもできる。
( 2 ) DC- STAMPの発現量 （蛋白質の発現量） を利用した骨代謝異常の検出 方法
DC - STAMPの発現量を利用した骨代謝異常の検出方法は、 具体的には、 以下の 工程 1 ) 乃至 3 ) を含む方法である。
1 ) 被験者より採取した検体における、 DC- STAMPの発現量を測定する工程 ：
2 ) 正常人より採取した検体における、 上記 1 ) に記載の蛋白質の発現量を測定 する工程 ： '
3 ) 上記工程 1 ) で測定された蛋白質の発現量と上記工程 2 ) で測定された該蛋 白質の発現量の差を解析し、 被験者の骨代謝異常を検出する工程。
以下、 各工程を具体的に説明する。
1 ) 工程 1 ) 被験者より採取した検体における、 DC- STAMPの発現量を測定 する工程 ：
( a ) 検体より蛋白質測定用試料の調製
検体は、 必要に応じて高速遠心を行う ことにより、 不溶性の物質を除去した 後、 以下のように E L I S A Z R I A用試料やウェス夕ンブロッ ト用試料とし て調製する。
E L I S A / R I A用試料としては、 例えば回収した、 血液または骨髄組織 の抽出液をそのまま使用するか、 緩衝液で適宜希釈したものを用いる。 ウェス タンプロッ ト用 （電気泳動用） 試料は、 例えば、 血液または骨髄組織の抽出液 をそのまま使用するか、 緩衝液で適宜希釈して、 S D S —ポリアクリルアミ ド 電気泳動用の 2 —メルカ トルエタノールを含むサンプル緩衝液 （シグマ （ S i g m a ) 社製等） と混合する。 ドッ ト スロッ トプロッ トの場合は、 例えば回 収した血液または骨髄組織の抽出液そのもの、 または緩衝液で適宜希釈したも のを、 ブロッテイ ング装置を使用するなどして、 直接メンプレンへ吸着させる
( b ) 試料の固相化
上記のようにして得られた試料中の蛋白質を特異的に検出するためには、 試 料を免疫沈降法、 リガン ドの結合を利用した方法等によって、 沈殿させ、 固相 化せずに検出することもできるし、 そのまま検出する該試料を固相化すること もできる。 蛋白質を固相化する場合において、 ウェスタンプロッ ト法、 ドッ ト ブロッ ト法またはスロッ トブロッ ト法に用いられるメンブレンとしては、 ニト ロセルロースメンブレン （例えば、 バイオラッ ド社製等） 、 ナイロンメンブレ ン （例えば、 ハイポンド— E C L (アマシャム · フアルマシア社製) 等） 、 コ ッ トンメンプレン （例えば、 プロッ トァブソーベントフィルタ一 （バイオラッ ド社製） 等） またはポリ ビニリデン · ジフルオリ ド （ P V D F ) メンブレン （ 例えば、 バイオラッ ド社製等） 等が挙げられる。
E L I S A法/ R I A法で蛋白質の檢出 · 定量を行うためには、 専用の 9 6 穴プレート （例えば、 ィムノプレート · マキシソープ （ヌンク社製） 等） に試 料またはその希釈液 （例えば 0. 0 5 % アジ化ナトリ ウムを含むリ ン酸緩衝 生理食塩水 （以下 「P B S」 という） で希釈したもの） を入れて 4 °C乃至室温 で一晩、 または 3 7 °Cで 1乃至 3時間静置することにより、 ゥエル内底面に蛋 白質を吸着させて固相化する。
DC-STAMPに対する抗体は、 常法を用いて （例え 、 新生化学実験講座 1、 蛋 白質 1、 P.389- 397、 1992参照。 ） 、 DC-STAMPまたは DC- STAMPのアミノ酸配列か ら選択される任意のポリぺプチドを動物に免疫し、 生体内に産生される抗体を 採取、 精製することによって得ることができる。 また、 公知の方法 （例えば、 K ohler and Milstein, Nature, (1975) 256, 495 - 497、 Kennet, R. ed. , Monocl onal Antibody, (1980) 365-367, Prenum Press, N. Y. ) に従って、 DC-STAMP に対する抗体を産生する抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることに よりハイプリ ドーマを樹立し、 モノクローナル抗体を得ることもできる。
なお、 抗原となる DC- STAMPは DC- STAMP遺伝子を遺伝子操作により宿主細胞に 産生させることによって得ることができる。具体的には、 DC- STAMP遺伝子を発現 可能なベクタ一を作製し、 これを宿主細胞に導入して該遺伝子を発現させ、 発 現した DC- STAMPを精製すればよい。あるいは、 DC-STAMPを発現させた宿主細胞そ のもの若しくは膜断片を抗原として用いてもよい。
( c ) DC- STAMPの発現量の測定
DC - STAMPの発現量は、 配列表の配列番号 2 に示されるアミノ酸配列からなる 蛋白質の発現量で示される。
発現量の測定は、上記抗 DC- S TAMP抗体を用いてウェス夕ンブロッ ト法ゃドッ ト ノスロッ トプロッ ト法等公知の方法を用いて測定することができる。
2 ) 工程 2 ) 正常人より採取した検体における、 上記 1 ) に記載の蛋白質の 発現量を測定する工程 ：
正常人より採取した検体における DC- S TAMPの発現量の測定は上記工程 1 )と同 様の方法で行う ことができる。
3 ) 工程 3 ) 上記工程 1 ) で測定された蛋白質の発現量と上記工程 2 ) で測 定された該蛋白質の発現量の差を解析し、 被験者の骨代謝異常を検出する工程。 正常人由来の検体と被験者由来の検体との間で DC- STAMPの発現量の差を解析 し、 DC- S TAMPの発現量が有意に増加している検体では骨代謝異常が存在する可 能性が高いと判定することができ、 骨代謝異常を検出することができる。
また、 D C -STAMPの濃度を測定し、 あらかじめ正常人の値として決められて いる数値範囲に入るか否かを解析し正常人の値として決められている範囲を超 えている場合には骨代謝異常を有すると判定することで骨代謝異常を検出する こともできるし、 D C - STAMPの発現量と、 正常人の骨代謝の相関をあらかじめ 調べておく ことによって、 被験者から採取した検体 おける D C - STAMP の発 現量を測定することによって被験者が、 正常人であるか否かを判定することも できる。
3 . DC-S TAMP遺伝子及び DC- STAMPの検定
DC - S TAMP遺伝子及び DC-STAMPは巨細胞腫において特異的に発現し、 また単球 由来細胞株が破骨細胞に分化する際に発現量が増加する。
( 1 ) DC- S TAMPの過剰発現を利用した DC- STAMP遺伝子及び DC-STAMPの機能解 析
DC- S TAMPの機能を調べる方法としては、 まず、 DC- S TAMPを発現している細胞 由来の c D N Aライブラリ一から、 コロニーハイブリダィゼ一シヨ ン法等、 公 知の方法に従い、 完全長 c D N Aを取得する。 この完全長 c D N Aをヒ ト由来 細胞又は非ヒ ト哺乳動物由来細胞 （例えば、 モルモッ ト、 ラッ ト、 マウス、 二 ヮ トリ、 ゥサギ、 ブタ、 ヒッジ、 ゥシ、 サル由来細胞など） に導入して高発現 させ、 細胞に影響が生じるか否かを検討する。 c D N Aを動物個体内で発現させるためには、 得られた完全長 c DNAをゥ ィルスべクタ一に組み込み、 動物に投与する方法が挙げられる。 ウィルスべク ターによる遺伝子導入方法としては例えば、 レトロウイルス、 アデノウイルス 、 アデノ関連ウィルス、 ヘルぺスウィルス、 ワクシニアウィルス、 ボックスゥ ィルス、 ポリオウイルス等の DNAウィルス、 又は RNAウィルスに c DNA を組み込んで導入する方法が挙げられる。 なかでも、 レトロウイルス、 アデノ ウィルス、 アデノ関連ウィルス、 ワクシニアウィルスを用いた方法が好ましい 非ウィルス性の遺伝子導入方法としては、 発現プラスミ ドを直接筋肉内に投 与する方法 （DNAワクチン法） 、 リポソ一ム法、 リポフエクシヨ ン法、 マイ クロインジェクショ ン法、 リ ン酸カルシウム法、 エレク トロボレ一シヨ ン法等 が挙げられ、 なかでも、 DN Aワクチン法、 リボソーム法が好ましい。
また、 培養細胞に対して、 完全長 c DN Aをヒ ト由来細胞、 非ヒ ト哺乳動物 由来細胞 （例えば、 モルモッ ト、 ラッ ト、 マウス、 ニヮ トリ、 ゥサギ、 ブタ、 ヒッジ、. ゥシ、 サル由来細胞など） の単球由来細胞、 リ ンパ節由来細胞、 筋肉 細胞、 肝細胞、 脂肪細胞、 あるいは皮膚細胞等へ導入し、 高発現させ、 各標的 細胞の有する機能、 具体的には、 破骨細胞の分化や成熟等の骨代謝に関係する 機能、 あるいは細胞の形態にどの様な影響が現れるかを検討することができる 完全長 c DN Aを動物又は細胞に導入するにあたっては、 適当なプロモータ 一及び形質発現に関わる配列を含むベクタ一に該 c DNAを組み込み、 該べク ターで宿主細胞を形質転換させる。 脊椎動物細胞の発現プロモー夕一としては 、 通常発現しょう とする遺伝子の上流に位置するプロモーター、 RNAのスプ ライス部位、 ポリアデニル化部位、 及び転写終結配列等を有するものを使用で き、 さらにこれは必要により複製起点を有してもよい。 該発現べクタ一の例と しては、 S V4 0の初期プロモ一夕一を有する p S V 2 d h f r (Subramani, S. et al. , Mol. Cell. Biol., (1981) 1, 854-864) 、 CMVの初期プロモ一夕一 を有する、 p C I — n e o (プロメガ （P r om e g a) 社製） 、 レトロウイ ルスべクタ一 p L N C X、 p L N S X、 p L X I N、 p S I R (クロンテック (C I o n t e c h) 社製） 、 コスミ ドベクター p Ax Cw (夕カラバイオ社 製） 等が挙げられるが、 これに限定されない。 該発現ベクターは、 ジェチルァ ミノェチル （D E A E) —デキス トラン法 （LuthDian，H. and Magnusson，G.， Nu cleic Acids Res. , (1983) 11, 1295- 1308) 、 リ ン酸カルシウム— D N A共沈殿 法（Graham, F. L. and van der Eb, A. J. , Virology, (1973) 52, 456-457) , 及び 電気パルス穿孔法（Neumann, E.et al.， EMBO 】.，（1982) 1, 84卜 845)などによ りマウス単球由来細胞 RAW264.7 (ATCC Cat. No. TIB- 71) 、 RAW264細胞（ECACC Cat. No. 85062803)、 RAW- D細胞 （Watanabe et al. , J. Endocrinol. , (2004) 180， 193-201 ) 、 サルの細胞である C O S細胞（Gluzman, Y. , Cell, (1981) 23 ， 175-182, ATCC： C R L— l 6 5 0 )やチャイニーズ ' ハムスター卵巣細胞 （ C HO細胞、 AT C C : C C L— 6 1 ) のジヒ ド口葉酸還元酵素欠損株 （Urla ub,G. and Chasin, L.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1980) 77, 4126 - 422 0) 、 ヒ ト胎児腎臓由来 2 9 3.細胞 （AT C C ： C. R L— 1 5 7 3 ) 等に取り込 ませることができるが、 これらに限定されない。 かくして所望の形質転換体を 得ることができる。
また、 遺伝子操作により、 正常動物において、 目的とする遺伝子が高発現す るように トランスジエニック動物を作製し、 細胞の形態にどの様な影響が現れ るかを検討することも可能である。
( 2 ) DC-STAMPの発現量を抑制することによる DC-STAMPの機能解析
DC-STAMPの発現量を抑制することによって破骨細胞の分化や破骨細胞の成熟 、 細胞の形態にどの様な影響が現れるかを調べることによっても DC- STAMPの機 能を解析することができる。
DC-STAMPの発現を抑制する物質としては DC- STAMP遺伝子に対するアンチセン ス核酸、 siRNA等を挙げることができる。 DC-STAMPの機能を阻害する物質として は DC-STAMPに特異的に結合する抗体を挙げることができる。
DC-STAMP の発現を抑制するか、 あるいは DC- STAMP の機能を阻害したときに 各標的細胞の有する機能、 具体的には、 破骨細胞の分化や成熟等の骨代謝に関 係する機能、 あるいは細胞の形態にどの様な影響が現れるかを検討することが できる。 また、 骨代謝異常を有する動物又は骨代謝異常を有さない動物におい て、 DC- STAMP S伝子を破壊したノックァゥ ト動物を作製し細胞や組織の状態を 判定することができる。 4 . DC-STAMP遺伝子及び/又は DC- STAMP検出用キッ ト
DC - STAMP遺伝子及び Z又は DC - STAMPは、 以下の 1 ) 乃至 5 ) からなる群から 選択される少なく とも一つ以上を含むキッ トを用いて検出することができる。
1 ) 配列表の配列番号 1 に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチ ド、 配列番号 3に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配 列番号 5 に示されるヌク レオチド配列からからなるポリヌクレオチドから選択 される少なく ともいずれか一つのポリヌクレオチドを特異的に増幅するための 1 5乃至 3 0塩基長の連続したオリゴヌクレオチドプライマ一 ；
2 ) 配列表の配列番号 1 に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチ ド、 配列番号 3に示されるヌク レオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配 列番号 5 に示されるヌクレオチド配列からからなるポリヌクレオチドから選択 される少なく ともいずれか一つのポリヌクレオチドにス トリ ンジェントな条件 下でハイブリダィズし、 該ポリヌクレオチドを検出するための 1 5ヌク レオチ ド以上の連続したポリヌクレオチドプローブ ； .
3 ) 配列表の配列番号 1 に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチ ド、 配列番号 3 に示されるヌクレオチド配列から るポリヌクレオチド及び配 列番号 5に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドから選択され る少なく ともいずれか一つのポリヌクレオチドが固定された固相化試料 ；
4 ) 配列表の配列番号 2 に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、 配列番号 4 に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質及び配列番号 6 に示されるアミノ酸配 列からなる蛋白質から選択される少なく ともいずれか一つの蛋白質に特異的に 結合し、 該蛋白質を検出するため.の抗体 ；
5 ) 上記 4 ) に記載の坊体に結合し得る二次抗体。
'前記 1 ) 記載のプライマーは、 DC-STAMP遺伝子のヌク レオチド配列 （配列表 の配列番号 1、 3及び 又は 5 に示されるヌクレオチド配列） に基づき市販の プライマ一設計ソフ ト （たとえば、 W i s c on s i n GCG package Ve r s i on 1 0. 2 ) を 用いる等、 常法により容易に設計し、 増幅することができる。 また、 前記 2 ) に記載のプロ一ブは、 DC- STAMPに特異的にハイブリダィズするポリヌクレオチ ドであって、 1 0 0乃至 1 5 0 0塩基長、 好ましくは 3 0 0乃至 6 0 0塩基長 である。 これらのプライマーやプロ一ブは、 適当な標識により ラベル （例えば 、 酵素標識、 放射性標識、 蛍光標識等） されていてもよく、 また、 リ ンカ一を 付加していてもよい。
上記 3 ) に記載の固相化試料は、 上記 2 ) に記載のプローブをガラス板、 ナ イロンメンプレン等の固相に固定することにより作製される。 このような固相 化試料の作成方法については、 既に 「 2. 骨代謝異常の検出」 の項の 「（ 1 ) D C - STAMP遺伝子の発現量を利用した骨代謝異常の検出方法」の項で説明した通り であり、 例えば、 遺伝子チップ、 c D NAアレイ、 オリ ゴアレイ、 メンブレン フィルタ一等を挙げることができる。
本発明のキッ トには、 更に耐熱性 D N Aポリメラ一ゼ、 d N T P ( d AT P、 d C T P、 d G T P、 d TT Pの混合物） 及び緩衝液を含めることもできる。 耐熱性 D N Aポリメラ一ゼとしては T a q D NAポリ メラ一ゼ、 L A T a q D NA p o 1 y m e r a s e (宝酒造社製）、 T t h D NAポリメラ一 ゼ、 P f u D N Aポリメラ一ゼなどが例示できる。 緩衝液は使用する D N A ポリメラ一ゼに応じて選ばれ、 必要に応じて M g 2 +などが添加されている。 前記、 4 ) 及び 5 ) に記載の抗体は上記 「 2. 骨代謝異常の検出」 の項の 「 ( 2 ) DC-STAMPの発現量 （蛋白質の発現量） を利用した骨代謝異常の検出方 法」 の項や 「 6. 抗 DC- STAMP抗体の製造」 の項に記載した方法により作製する ことができる。 該抗体は、 適当な標識によりラベル （例えば、 酵素標識、 放射 性標識、 蛍光標識等） されていてもよい。
本発明のキッ トは DC- STAMP遺伝子及びノ又は DC- STAMPの検出に用いることが でき、 骨代謝異常の有無の判定や、 骨代謝異常の病態の進行を抑制する物質の スクリーニングにも用いることができる。
5. 破骨細胞への分化抑制物質のスクリ一ニング方法
本発明の一つの態様として、 DC-STAMP遺伝子及び/または、 DC-STAMPの発現 量を測定することによる、 被骨細胞への分化抑制物質のスクリーニング方法を 挙げることができる。
本発明の一つの態様として、 DC- STAMPの破骨細胞分化促進活性を阻害する物 質を同定することによって、 骨代謝異常症の治療効果及びノまたは予防効果を 有する物質をスクリ一ニングする方法を挙げることができる。
なお、 「被験物質」 とは、 本発明のスクリーニング方法で破骨細胞への分化抑 制活性を調べる対象となる物質をいう。 被験物質としては、 化合物、 微生物の 代謝産物、 植物や動物組織の抽出物、 それらの誘導体またはそれらの混合物等 が挙げられる。 また、 DC- STAMPの発現量を低下するよう'に設計された核酸また はその誘導体 （アンチセンスオリゴヌクレオチド、 リボザィム、 d s RNA、 s i RNA等を含む） を、 被験物質として使用することも可能である。 被験物 質の投与量や濃度は適宜設定するか、 または例えば希釈系列を作成するなどし て複数種の投与量を設定してもよく、 固体、 液体等適当な状態で投与すること ができ、 適当なバッファーに溶解するか、 あるいは安定化剤等を加えてもよい 。 培養細胞を用いるスクリーニング方法の場合には、 培地に添加して培養する ことができる。 培地に添加する場合には培養開始時から添加してもよいし、 培 養途中で添加しても良く、 また、 添加の回数も 1回に限らない。 被験物質存在 下で培養する期間も適宜設定してよいが、 好ましくは 3 0分乃至 2週間であり 、 より好ましくは、 3 0分乃至 4 8時間である。 哺乳動物個体に被験物質を投 与する場合は、 被験物質の物性等により経口投与、 静脈注射、 腹腔内注射、 経 皮投与、 皮下注射等の投与形態を使い分ける。 なお被験物質の投与から、 検体 を得るまでの時間は適当に選択することができる。.
本発明のスクリ一ニング方法において用いられる培養細胞は、 DC-STAMPを発 現する哺乳動物細胞である限り において、 正常な細胞でも、 癌細胞等の異常な 増殖を示す細胞でもよく、 例えば、 マウス単球由来細胞 RAW264.7 (ATCC Cat. No TIB-71) 、 RAW264細胞（ECACC Cat. No. 85062803)、 RAW-D細胞 （Watanabe et al. , J. Endocrinol. , (2004) 180, 193-201 ) 、 マウス骨髄由来初代培養細 胞等を挙げることができるがこれらに限定されない。培養細胞の哺乳動物種と しては、 ヒ ト、 マウスまたはその他の哺乳動物 （モルモッ ト、 ラッ ト、 ニヮ ト リ、 ゥサギ、 ブ夕、 ヒッジ、 ゥシ、 サルなど） が好ましいが、 これらに限定さ れない。 なお、 培養細胞としては DC-STAMPを過剰発現している哺乳動物細胞を 用いるのがより好ましく、 例えば DC- STAMP遺伝子をそのプロモー夕一領域とと もに導入し、 DC- STAMPを過剰発現する RAW264.7細胞、 RAW264細胞、 RAW- D細胞な どを挙げることができる。
本発明のスク リーニング方法には、 培養細胞を用いず、 哺乳動物個体に被験 物質を投与して、 その後該動物個体から摘出されたその臓器または組織細胞に おける DC- STAMP遺伝子の発現を検出する方法も含まれる。 遺伝子発現の検出対 象となる臓器または組織は、 DC- STAMPを発現するものであればよいが.、 好まし くは骨代謝異常が発生している組織であり、より好ましくは骨髄である。哺乳動 物種としては非ヒ ト哺乳動物を用いることができ、 マウス、 ラッ トまたはハム スターが好ましく、 マウスまたはラッ トがより好ましい。 なお、 骨代謝異常を 呈する動物モデルとして、 卵巣摘除動物、 精巣摘除動物、 腫瘍細胞を皮下、 皮 内、 左心室、 骨髄、 静脈あるいは腹腔等に移植した担癌動物、 坐骨神経切除動 物、 アジュバン ト関節炎モデル動物、 コラーゲン誘発性関節炎モデル動物、 グ ルココルチコイ ド誘発性骨粗鬆症モデル動物、 老化促進マウス （SAMP6マウス、 Matsushita et al. , Am. J. Pathol. 125, 276-283 (1986)) 、 甲状腺 ·副甲状 腺摘除動物、 副甲状腺ホルモン関連ペプチド （PTHrP) 持続注入動物、 破骨細胞 形成抑制因子 （0CIF) ノ ックアウ トマウス （Mizuno et al. , Biochem. Biophy s. Res. Commun. , (1998) 247, 610-615) などを用いることができる。 更に、 歯 周病による歯の喪失モデル動物や、 DC-STAMPを過剰発現させた動物を用いるこ ともできる。さらにスク リ一二ングで選択された被検物質を上記の動物モデル に投与し、 骨組織における破骨細胞の数、 骨密度、， 骨強度あるいは血中 Ca濃度 等、 骨代謝異常により変動するパラメ一夕一を測定することによって、 該被検 物質の骨代謝異常に対する治療効果及び/または予防効果を評価することがで きる。
本発明の方法において用いられる培養細胞は、被験物質を添加しない場合に R ANKL及ぴ TNF-a;を添加すると DC- STAMPを発現可能な条件であれば、 いかなる条 件で培養してもよい。 例えば、 該培養細胞について公知の培養条件が知られて おり、 該条件下において該細胞が DC- STAMPを.発現する場合は、 該条件で培養し てもよい。 また、 哺乳動物個体から摘出した臓器または組織における DC- STAMP の発現を検出する場合における、 該動物の飼育条件も、 被験物質を添加しない 場合に DC- STAMPを発現可能な条件であればよい。
なお、 被験物質の、 DC-STAMPの発現に対する影響を調べるためには、 DC- STA MP遺伝子の発現量を測定する方法と、 DC- STAMP遺伝子の翻訳産物である、 DC-S TAMPの発現量を測定する方法がある。 DC- STAMP遺伝子、 及び または、 DC- STA MPの発現を抑える被験物質は骨代謝異常、 好適には骨粗鬆症、 関節リ ウマチ及 び 又は癌性高カルシウム血症に対する治療効果及び/または予防効果を有す る物質であると考えられる。
培養細胞からの、全 R N Aの抽出、 DC- STAMP遺伝子の発現量の測定、 DC-STAMP の発現量の測定については、 上記 「 2. 骨代謝異常の検出」 の項に記載した方 法に従って行う ことができる。なお、哺乳動物由来培養細胞を用いる場合には、 必要に応じて培地には被験物質と共に RANKL ¾び TNF-Q!を適当量添加し、 被験 物質を添加しないコン トロールにおいても RANKL及び TNF-αを適当量添加する。
( 1 ) DC-STAMP遺伝子を用いる方法
本発明のスクリ一ニング方法としては例えば、 哺乳動物由来培養細胞を用い る方法、'及び哺乳動物個体を用いる方法についてそれぞれ以下のようになる。
(a) 哺乳動物由来培養細胞を用いる方法
( i ) 以下の工程ィ） 乃至ハ） を含む ：
ィ） 被験物質を添加した培地で培養した哺乳動物由来培養細胞より、 全 RN Aを 抽出する工程 ；
口） ィ） 由来の全 RN Aと被験物質を添加しないで培養した哺乳動物培養細胞由 来全 RNAの間における、 DC- STAMP遺伝子の発？ ί量の差を検出する工程 ； ' 八） 口）に記載の遺伝子の発現量の差を解析し、 被験物質の、 骨代謝異常に対す る治療、 及びノまたは予防効果を判定する工程。
( i i) 以下の工程ィ） 乃至二） 'を含む。
ィ） 被験物質を添加した培地で培養した哺乳動物由来培養細胞より、 全 R N Aを 抽出する工程 ；
口） 被験物質を添加しない培地で培養した哺乳動物由来培養細胞より、 全 R NA を抽出する工程 ；
ハ） 上記ィ） 由来の全 RNAと口） 由来の全 R NAにおける、 DC- STAMP遺伝子の 発現量を測定する工程 ；
二） 上記ィ） 由来の全 RNAと口） 由来の全 RNAとの間における上記八） によ つて測定された遺伝子の発現量の差を解析し、 被験物質の、 骨代謝異常に対する 治療、 及び/または予防効果を判定する工程。
(b)哺乳動物個体を用いる方法
( i ) 以下の工程ィ） 乃至八） を含む。 ィ） 被験物質を投与した哺乳動物個体より採取した検体より、 全 R N Aを抽出す る工程 ；
口） ィ） 由来の全 R N Aと被験物質を投与しなかった動物個体より採取した検体 より得た全 R N Aの間における、 DC- STAMP遺伝子の発現量の差を検出する工程 ； ハ） 上記口）.に記載の遺伝子の発現量の差を解析し、 被験物質の骨代謝異常に対 する治療、 及び/または予防効果を判定する工程。
( i i ) 以下の工程ィ） 乃至二） を含む。 · ィ） 被験物質を投与した哺乳動物個体より採取した検体より、 全 R N Aを抽出す る工程 ；
口） 被験物質を投与しなかった哺乳動物個体より採取した検体より、 全 R N Aを 抽出する工程 ； '
ハ） 上記工程ィ） 由来の全 R N Aと上記工程口） 由来の全 R N Aにおける、 DC- STAMP遺伝子の発現量を測定する工程 ；
二） ハ） に記載の遺伝子の発現量の差を解析し、 被験物質の骨代謝異常に対する 治療及び または予防効果を判定する工程。
( 2 ) DC-STAMPを用いる方法
DC-STAMPの発現量を測定することを利用したスク リーニング方法については 哺乳動物培養細胞を用いた方法と動物個体を用いた方法についてそれぞれ以下 の工程を含む。
(a) 哺乳動物由来培養細胞を用いる方法
( i ) 以下の工程ィ,） 及び口） を含む ：
ィ） 被験物質を添加した培地で培養した哺乳動物由来培養細胞における、 DC- ST AMPの発現量を測定する工程 ；
口） ィ） で測定された蛋白質の発現量と、 被験物質を添加しない培地で培養した 哺乳動物由来培養細胞における該蛋白質の発現量の差を解析し、被験物質の骨代 謝異常に対する治療効果及び/または予防効果を判定する工程。
( i i ) 以下の工程ィ） 乃至ハ） を含む：
ィ） 被験物質を添加した培地で培養した哺乳動物由来培養細胞における、 DC - ST AMPの蛋白質の発現量を測定する工程 ；
口） 被験物質を添加しない培地で培養した哺乳動物由来培養細胞における、 上記 ィ） に記載の蛋白質の発現量を測定する工程 ；
ハ） 上記ィ） で測定された蛋白質の発現量と、 上記口） で測定された該.蛋白質の 発現量の差を検出し、被験物質の骨代謝異常に対する治療効果及び Zまたは予防 効果を判定する工程。
( i i i ) 以下の工程ィ） 乃至ハ） を含む ：
ィ）被験物質を添加した培地で培養した哺乳動物由来培養細胞から得た全蛋白質 を固相化する工程 ；
口） 上記固相化蛋白質における、 DC- STAMPの蛋白質の発現量を測定する工程 ； ハ） 上記口） で検出された DC-STAMPの発現量と、 被験物質を添加しない培地で培 養した哺乳動物由来培養細胞から得た全蛋白質における該蛋白質の発現量の差 を解析し、被験物質の骨代謝異常に対する治療効果及びノまたは予防効果を判定 する工程。
( i v)以下の工程ィ）乃至ホ） を含む ：
ィ）被験物質を添加した培地で培養した哺乳動物由来培養細胞から得た全蛋白質 を固相化する工程 ；
口）被験物質を添加しない培地で培養した哺乳動物由来培養細胞から得た全蛋白 質を固相化する工程 ；
ハ） 上記工程ィ） に記載の固相化蛋白質における DC-STAMPの蛋白質の発現量を該 蛋白質に特異的に結合する抗体またはリガンドを用いて測定する工程 ； 二） 上記工程口） に記載の固相化蛋白質における DC^STAMPの発現量を該蛋白質に 特異的に結合する抗体またはリガンドを用いて測定する工程 ；
ホ） 上記工程八） で測定された蛋白質の発現量と、 上記工程二） で測定された蛋 白質の発現量の差を解析し、 被験物質の、 骨代謝異常に対する治療効果及びノま たは予防効果を判定する工程。
(b) 哺乳動物個体を用いる方法
( i ) 以下の工程ィ） 及び口） を含む ：
ィ） 被験物質を投与された哺乳動物個体より採取した検体における、 DC- STAMP の蛋白質の発現量を測定する工程 ；
口） 上記工程ィ） で測定された DC- STAMPの発現量と、 被験物質を投与されなかつ た哺乳動物個体から採取した橡体における該蛋白質の発現量の差を解析し、被験 物質の骨代謝異常に対する治療効果及びノまたは予防効果を判定する工程。
( i i ) 以下の工程ィ） 乃至ハ） を含む：
ィ） 被験物質を投与された哺乳動物個体より採取した検体における、 DC-STAMP の蛋白質の発現量を該蛋白質に特異的に結合する抗体またはリガンドを用いて 測定する工程 ；
口）被験物質を投与されなかった哺乳動物個体より採取した検体における、 該蛋 白質の発現量を測定する工程 ；
ハ） ィ） で測定された DC- STAMPの蛋白質の発現量と、 口） で測定された該蛋白質 の発現量の差を解析し、被験物質の骨代謝異常に対する治療効果及び Zまたは予 防効果を判定する工程。
( i i i )以下の工程ィ） 乃至ハ） を含む ：
ィ） 被験物質を投与された哺乳動物個体より採取した検体中の全蛋白質を固相 化する工程 ； '
口） 上記固相化蛋白質における、 DC-STAMPの蛋白質の発現量を測定する工程 ； ハ） 上記口） で検出された DC- STAMPの蛋白質の発現量と、 被験物質を投与され なかった哺乳動物個体より採取した検体中における該蛋白質の発現量の差を解 祈し、 被験物質の骨代謝異常に対する治療及び/または予防効果を判定するェ 禾王
( i v)以下の工程ィ） 乃至ホ） を含む ：
ィ） 被験物質を投与された哺乳動物個体より採取した検体中の全蛋白質を固相 化する工程 ；
口）.被験物質を投与されなかった哺乳動物個体より採取した検体中の全蛋白質 を固相化する工程 ；
八） 上記工程ィ） に記載の固相化蛋白質における、 DC- STAMPの蛋白質の発現量 を該蛋白質に特異的に結合する抗体またはリガンドを用いて検出する工程 ； 二） 上記口） に記載の固相化蛋白質における、 DC- STAMPの蛋白質の発現量を該 蛋白質に特異的に結合する抗体またはリガクドを用いて検出する工程 ； ホ） 上記ハ） で検出された蛋白質の発現量と、 上記二） で検出された該蛋白質 の発現量の差を解析し、 被験物質の骨代謝異常に対する治療効果及び または 予防効果を判定する工程。 ( 3) その他の方法
DC-STAMP を過剰発現させた哺乳動物個体に被験物質を投与した場合と投与 しなかった場合について、 経時的に骨代謝異常の発生率、 骨代謝異常の程度、 及び/または生存率等を測定する。被験物質を投与じた哺乳動物で骨代謝異常 の発生率が有意に低下している、 骨代謝異常の程度が有意に小さい、 及び Zま たは、 生存率が約 1 0 %以上、 好ましくは約 3 0 %以上、 より好ましくは、 約 5 0 %以上上昇した場合に、 被験物質は骨代謝異常に対する治療及び または 予防効果を有する化合物として選択することができる。
6. 抗 DC- STAMP抗体の製造
( 1 ) 抗原の調製
抗 DC- STAMP抗体を作製するための抗原としては、 DC- STAMPまたはその少なく とも 6個の連続した部分アミノ酸配列からなるポリぺプチド、 あるいはこれら に任意のアミノ酸配列や担体が付加された誘導体を挙げることができる。
DC- STAMPは、 血球細胞又は骨髄細胞から直接精製して使用するか、 あるいは これらの細胞の細胞膜画分を調製して使用することができ、 また、 DC- STAMPを i n v i t r oにて合成する、 あるいは遺伝子操作により宿主細胞に産生さ せることによって得ることができる。
原核細胞の宿主としては、 例えば、 大腸齒 (Escherichia coli) や枯草菌 （B acillus subtil is) などが挙げられる。 目的の遺伝子をこれらの宿主細胞内で 形質転換させるには、 宿主と適合し得る種由来のレブリ コンすなわち複製起点 と、 調節配列を含んでいるプラスミ ドベクタ一で宿主細胞を形質転換させる。 また、 ベクタ一としては、 形質転換細胞に表現形質 （表現型） の選択性を付与 することができる配列を有するものが好ましい。
例えば、 大腸菌としては K 1 2株などがよく用いられ、 ベクタ一としては、 一般に P B R 3 2 2や p UC系のプラスミ ドが用いられるが、 これらに限定さ れず、 公知の各種菌株、 及びベクターがいずれも使用できる。
プロモーターとしては、 大腸菌においては、 トリ ブトファン （trp) プロモ一 ター、 ラク ト一ス （lac) プロモー夕一、 トリプトファン · ラク トース （tac) プロモータ—、 リポプロテイン （lpp) プロモータ一、 ポリペプチド鎖伸張因子
Tu (tufB) プロ.モ一ター等が挙げられ、 どのプロモーターも目的のポリべプチ ドの産生に使用することができる。
枯草菌としては、 例えば 2 0 7 — 2 5株が好ましく、 ベクタ一としては p T U B 2 2 8 (Ohmura, K. et al. (1984) J. Biochem. 95， 87-93) などが用い られるが、 これに限定されるものではない。 枯草菌の α—アミラーゼのシグナ ルぺプチド配列をコ一ドする D Ν Α配列を連結する'ことにより、 菌体外での分 泌発現も可能となる。
真核細胞の宿主細胞には、 脊椎動物、 昆虫、 酵母などの細胞が含まれ、 脊椎 動物細胞としては、 例えば、 マウス単球由来細胞 RAW264.7 (ATCC Cat. No TIB -71) 、 RAW264細胞（ECACC Cat. No. 85062803)、， RAW- D細胞 (Watanabe et al. , J. Endocrinol. , (2004) 180, 193-201 ) 、 サルの細胞である C O S細胞 （G luzman, Y.， Cell, (1981) 23, 175-182、 AT C C C R L— 1 6 5 0 ) 、 マウ ス繊維芽細胞 N I H 3 T 3 (A T C C N o . C R L— 1 6 5 8 ) やチヤィニ ーズ · ハムスター卵巣細胞 （C HO細胞、 AT C C C C L— 6 1 ) のジヒ ド 口葉酸還元酵素欠損株 （Urlaub, G. and Chasin, L. A.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1980) 77, 4126-4220) 等がよく用いられているが、 これらに限定さ れない。
脊椎動物細胞の発現プロモータ一としては、 通常発現しょうとする遺伝子の 上流に位置するプロモーター、 R NAのスプライス部位、 ポリアデニル化部位 、 及び転写終結配列等を有するものを使用でき、 さらにこれは必要により複製 起点を有してもよい。 該発現べクタ一の例としては、 サイ トメガロウィルス初 期プロモータ一を有する p C D N A 3. 1 (イ ンピトロジェン社製） 、 S V 4 0の初期プロモーターを有する p S V 2 d h f r (Subramani, S. et al. , Mo 1. Cell. Biol. , (1981) 1, 854-864) 等が挙げられるが、 これに限定されない 宿主細胞として、 C O S細胞あるいは N I H 3 T 3細胞を用いる場合を例に 挙げると、 発現べクタ一としては、 S V 4 0複製起点を有し、 C O S細胞ある いは N I H 3 T 3細胞において自立増殖が可能であり、 さらに、 転写プロモー 夕一、 転写終結シグナル、 及び R NAスプライス部位を備えたものを用いるこ とができる。 該発現べクタ一は、 D E AE—デキス トラン法 （Luthman, H. an d Magnusson, G. , Nucleic Acids Res. , (1983) 11， 1295-1308) 、 リ ン酸カル シゥム一 D N A共沈殿法（Graham, F. L. and van der Eb, A. J. , Virology, (1973) 52, 456-457) 、 及ぴ電気パルス穿孔法 （Neumann, E. et al. , EMBO J. , (1982) 1, 841-845) などにより C O S細胞、 あるいは N I H 3 T 3細胞に取 り込ませることができ、 かく して所望の形質転換細胞を得ることができる。 ま た、 宿主細胞として C HO細胞を用いる場合には、 発現ベクターと共に、 抗生 物質 G 4 1 8耐性マ一力一として機能する n e o遺伝子を発現し得るベクタ一 、 例ぇば 尺 3 ¥ 11 6 0 (Sambrook, J. et al. (1989) ： "Molecular Cloni ng A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, NY) や p S V 2 n e o (Southern, P. J. and Berg, P. , J. Mol.' Appl. Genet. , (1982)1， 3 27-341 ) などをコ ' トランスフエク トし、 G 4 1 8耐性のコロニーを選択する ことにより、 目的のポリペプチドを安定に産生する形質転換細胞を得ることが できる。
上記のようにして得られる形質転換体は、 常法に従い培養することができ、 該培養により細胞内、 細胞膜上または細胞外に目的のポリぺプチドが産生され る。 該培養に用いられる培地としては、 採用した宿主細胞に応じて慣用される 各種のものを適宜選択でき、 例えば、 上記 C O S糊胞であれば、 R PM I 1 6 4 0培地やダルベッコ変法イーグル培地 （以下 「DMEM」 という） などの培 地に、 必要に応じゥシ胎児血清などの血清成分を添加したものを使用できる。 上記培養により、 形質転換体の細胞内、 細胞膜上または細胞外に産生される 組換え蛋白質は、 該蛋白質の物理的性質や化学的性質などを利用した各種の公 知の分離操作法により分離 ■ 精製することができる。 該方法としては、 具体的 には例えば、 通常の蛋白質沈殿剤による処理、 限外濾過、 分子ふるいクロマト グラフィー （ゲル濾過） 、 吸着クロマトグラフィー、 イオン交換クロマトダラ フィ一、 ァフィ二ティ一クロマトグラフィー、 高速液体クロマ トグラフィー （ HP L C) などの各種液体クロマトグラフィー、 透析法、 これらの組み合わせ などを例示できる。 また、 発現させる組換え蛋白質に 6残基からなるヒスチジ ンを槃げることにより、 ニッケルァフィ二ティーカラムで効率的に精製するこ とができる。 上記方法を組み合わせることにより容易に高収率、 高純度で目的 とするポリペプチドを大量に製造できる。 また、 上記の蛋白質が細胞膜上に產 生される場合は、 細胞膜画分を調製することによって、 分離、 粗精製すること ができる。
( 2 ) 抗 D C -STAMPモノクローナル抗体の製造
DC- S TAMP と特異的に結合する抗体の例とし.て、 DC- STAMP と特異的に結合する モノクローナル坊体を挙げることができるが、 その取得方法は、 以下に記載す る通りである。
モノクローナル抗体の製造にあたっては、 一般に下記のような作業工程が必 要である。 すなわち、
( a ) 抗原として使用する生体高分子の精製、
( b ) 抗原を動物に注射することにより免疫した後、 血液を採取しその抗体価 を検定して脾臓摘出の時期を決定してから、 抗体産生細胞を調製する工程、
( c ) 骨髄腫細胞 （以下 「ミエ口一マ」 という） の調製、
( d ) 抗体産生細胞とミエ b—マとの細胞融合、
( e ) 目的とする抗体を産生するハイプリ ドーマ群の選別、
( f ) 単一細胞クローンへの分割 （クロ一ニング） 、
( g ) 場合によっては、 モノクローナル抗体を大量に製造するためのハイプリ ドーマの培養、 またはハイプリ ドーマを移植した動物の飼育、
( h ) このようにして製造されたモノクローナル抗体の生理活性、 及びその結 合特異性の検討、 あるいは標識試薬としての特性の検定、 等である。
以下、 モノクローナル抗体の作製法を上記工程に沿って詳述するが、 該抗体 の作製法はこれに制限されず、 例えば脾細胞以外の抗体産生細胞及びミエ口一 マを使用することもできる。
( a ) 坊原の精製
抗原としては、前記したような方法で調製した DC- STAMPまたはその一部を使 用することができる。 また、 DC- S TAMP発現組換え体細胞より調製した膜画分、 または DC- S TAMP発現組換え体細胞自身、さらに、当業者に周知の方法を用いて、 化学合成した本発明の蛋白質の部分ペプチドを抗原として使用することもでき る。
( b ) 抗体産生細胞の調製
工程（ a )で得られた抗原と、 フロインドの完全または不完全アジュパント、 または力リ ミ ヨ ゥパンのような助剤とを混合し、 免疫原として実験動物に免疫 する。 実験動物は公知のハイプリ ドーマ作製法に用いられる動物を支障なく使 用することができる。 具体的には、 たとえばマウス、 ラッ ト、 ャギ、 ヒッジ、 ゥシ、 ゥマ等を使用することができる。 ただし、 摘出した抗体産生細胞と融合 させるミエローマ細胞の入手容易性等の観点から、 マウスまたはラッ トを被免 疫動物とするのが好ましい。 また、 実際に使用するマウスおよびラッ トの系統 は特に制限はなく、マウスの場合には、たとえば各系統 A、AKR 、BALB/c、BDP 、 BA、 CE、 C3H 、 57BL、 C57BR 、 C57L、 DBA 、 FL、 HTH 、 HT1 、 LP、 NZB 、 NZW 、 RF、 R IIK SJL 、 SWR 、 WB、 129 等が、 またラッ トの場合には、 たとえば、 Low 、 Lewis 、 Spraque 、 Daweley 、 ACI 、 BN、 Fischer 等を用いることができる。 これらのマウス及びラッ トは例えば日本クレア、 日本チヤ一ルスリバ一、 日本 SL The Jackson Laboratories 等実験動物飼育販売業者より入手することが できる。このうち、.後述のミエ口一マ細胞との融合適合性を勘案すれば、 マウス では BALB/c 系統が、 ラッ トでは low 系統が被免疫動物として特に好ましい。 また、 抗原のヒ 卜とマウスでの相同性を考慮し、 自己抗体を除去する生体機構 を低下させたマウス、 すなわち自己免疫疾患マウスを用いることも好ましい。 なお、これらマウスまたはラッ 卜の免疫時の週齢は、好ましくは 5〜 1 2週齢、 さらに好ましくは 6 ~ 8週齢である。
DC-STAMP またはこの組換え体によって動物を免疫するには、 例えば、 We i r , D. M. , Handbook of Experimental Immunology Vol.1. II. III., Bl ack e 11 Scientific Publications, Oxford (1987) 、 Rabat, E. A. and Mayer, M. M. , Experimental Immunochem i s t ry, Charles C Thomas Publisher Spigf ield, Illinois (1964) 等に詳しく記載されている公知の方法を用いるこ とができる。 これらの免疫法のうち、 この発明において好適な方法を具体的に 示せば、 たとえば以下のとおりである。 すなわち、 まず、 抗原である膜蛋白画 分、 もしくは抗原を発現させた細胞を動物の皮内または腹腔内に投与する。 た だし、 免疫効率を高めるためには両者の併用が好ましく、 前半は皮内投与を行 い、 後半または最終回のみ腹腔内投与を行う と、 特に免疫効率を高めることが できる。 抗原の投与スケジュールは、 被免疫動物の種類、 個体差等により異な るが、 一般には、 抗原投与回数 3〜 6回、 投与間隔 2〜 6週間が好ましく、 投 与回数 3 ~ 4回、 投与間隔 2〜 4週間がさらに好ましい。 投与回数を過度に増 やすと抗原を浪費し、 また投与間隔を広げすぎると動物の老化による細胞の低 活性化を招くために好ましくない。 また、 抗原の投与量は、 動物の種類、 個体 差等により異なるが、 一般には、 0·05~5 ml, 好ましくは 0.1〜0.5ml 程度と する。 追加免疫は、 以上の通りの抗原投与の 1〜 6週間後、 好ましくは 2 ~4 週間後、 さ らに好ましくは 2〜 3週間後に行う。 この追加免疫の時期が 6週間 目より遅いか、 あるいは 1週間目より早すぎると追加免疫の効果が少ない。 な お、追加免疫を行う際の抗原投与量は、動物の種類、大きさ等により異なるが、 一般に、 例えばマウスの場合には、 0.05〜5 ml、 好ましくは 0.1〜0.5 ml、 さ らに好ましくは 0.1〜0.2 ml程度とする。 不必要の大量投与は免疫効果を低下 させるだけでなく、 被免疫動物にとっても好ましい'ものではない。 ' 上記追加免疫から 1〜 1 0 日後、 好ましくは 2〜 5 日後、 さらに好ましくは 2〜 3日後に被免疫動物から抗体産生細胞を含む脾臓細胞またはリ ンパ球を無 菌的に取り出す。 なお、 その際に抗体価を測定し、 抗体価が十分高くなつた動 物を抗体産生細胞の供給源として用いれば、 以後の操作の効率を高めることが できる。
ここで用いられる抗体価の測定法としては、 R I A法、 E L I.S A法、 蛍光 抗体法、 受身血球凝集反応法など種々の公知技術があげられるが、 検出感度、 迅速性、 正確性、 及び操作の自動化の可能性などの観点から、 R I A法または E L I S A法がより好適である。
本発明における抗体価の測定は、 例えば E L I S A法によれば、 以下に記載 するような手順により行うことができる。 まず、 精製または部分精製した抗原 を E L I S A用 9 6穴プレート等の固相表面に吸着させ、 さらに抗原が吸着し ていない固相表面を抗 IIと無関係な蛋白質、 例えばゥシ血清アルブミン （以下
「B S A」 という） により覆い、 該表面を洗浄後、 第一抗体として段階希釈し た試料 （例えばマウス血清） に接触させ、 上記抗原に試料中のモノクローナル 抗体を結合させる。 さらに第二抗体として酵素標識されたマウス抗体に対する 抗体を加えてマウス抗体に結合させ、 洗浄後該酵素の基質を加え、 基質分解に 基づく発色による吸光度の変化等を測定することにより、 抗体価を算出する。 これらの脾臓細胞またはリ ンパ球からの抗体産生細胞の分離は、 公知の方法
( 例 え ば 、 KoMer et aし， Nature, (1975) 256, 495； Kohler et. al. , Eur. J. Immnol. , (1977)6, 511, ； Mi lstein et al. , Nature, (1977) 266, 550; Walsh, Nature, (1977) 266, 495) に従って行う ことができる。 例えば、 脾臓細 胞の場合には、 細胞を細切してステンレスメ シュで濾過した後、 イーグル最 小必須培地 （ME M) に浮遊させて抗体産生細胞を分離する一般的方法を採用 することができる。
( c ) 骨髄腫細胞 （以下、 「ミエローマ」 という） の調製
細胞融合に用いるミエローマ細胞には特段の制限はなく、 公知の細胞株から 適宜に選択して用いることができる。 ただし、 融合細胞からハイプリ ドーマを 選択する際の利便性を考慮して、 その選択手続が確立している H G P R T (Hy p ox an th ine-guanine phosphor i bosyl transferase)欠 ilfe 用 るのが好ま し い 。 す な わ ち 、 マ ウ ス 由 来 の X63- Ag8(X63) 、 NSl-Ag4/l (NS1) 、 P3X63-Ag8.Ul (P3U1) 、 X63-Ag8.653 (X63.653) 、 SP2/0-Agl (SP2/0) 、 MPC11-45.6TG1.7(45.6TG) , F0 、 S149/5XX0 , BU.1 等 、 ラ ッ ト 由 来 の 210.RSY3.Ag.1.2.3(Y3) 等 、 ヒ ト 由 来 の U266AR(SKO-007) 、 GM1500 · GTG-A12 (GM1500), UC729- 6、 L I CR-LOW-HMy 2 (HMy2) , 8226AR/NIP4-1 (NP41)等で ある。 これらの H G P R T欠損株は例えば、 American Type Culture Collection (ATCC)等から入手することができる。
これらの細胞株は、 適当な培地、 例えば 8 —ァザグァニン培地 [R P M I — 1 6 4 0培地にグルタミ ン、 2 —メルカプトエタノール、 ゲンタマイシン、 及 びゥシ胎児血清 （以下 「F C S」 という） を加えた培地に 8 —ァザグァニンを 加えた培地] 、 イスコフ改変ダルベッコ培地 （Iscove' s Modified Dulbecco' s Medium ； 以下 「 I MD M」 という）、 またはダルベッコ改変イーグル培地 (Dulbecco' s Modi fied Eagle Medium； 以下 「DMEM」 という） で継代培養 するが、 細胞融合の 3乃至 4 日前に正常培地 [例えば、 1 0 % F C Sを含む A S F 1 0 4培地 （味の素 （株） 社製）] で継代培養し、 融合当日に 2 X 1 07 以上の細胞数を確保しておく。
( d ) 細胞融合
抗 体 産 生 細 胞 と ミ エ 口 一 マ 細 胞 と の 融 合 は 、 公 知 の 方 法 (Weir, D.M.,Handbookof Experimental Immuno 1 ogy Vo 1. I . II. III. , Bl ackwe 11 Scientific Publications, Oxford (1987) 、 Kabat, E. A. and Mayer, M. M. , Experimental Immunochemi s t ry, Charles C Thomas Publisher Spigfield, Illinois (1964) 等） に従い、 細胞の生存率を極度に低下.させない 程度の条件下で適宜実施することができる。 そのような方法は、 例えば、 ポリ エチレン · グリ コール等の高濃度ポリマ一溶液中で抗体産生細胞とミエローマ 細胞とを混合する化学的方法、 電気的刺激を利用する物理的方法等を用いるこ とができる.。このうち、上記化学的方法の具体例を示せば以下のとおりである。 すなわち、 高濃度ポリマー溶液としてポリエチレン ' ダリコールを用いる場合 には、 分子量 1500〜6000、 好ましくは 2000〜4000 のポリェチレン · グリ コ一 ル溶液中で、 3 0〜 4 0 ° (：、 好ましくは 3 5〜 3 8での温度で抗体産生細胞と ミエローマ細胞とを 1〜 1 0分間、 好ましくは 5 ~ 8分間混合する。
( e ) ハイプリ ドーマ群の選択
上記細胞融合により得られるハイプリ ドーマの選択方法は特に制限はないが、 通常 HAT (ヒポキサンチン · 7ミノブテリ ン * チミジン） 選択法 〔Kohler et al. , Nature, 256, 495 (1975)； Mi lstein at aし， Nature 266, 550 (1977)〕 が用いられる。 この方法は、 アミノブテリ ンで生存し得ない H G P R T欠損株 のミエローマ細胞を用いてハイブリ ド一マを得る: p合に有効である。すなわち、 未融合細胞およびハイプリ ドーマを HAT培地で培養することにより、 ァミノ ブテリ ンに対する耐性を持ち合わせたハイプリ ドーマのみを選択的に残存させ、 かつ増殖させることができる。
( f ) .単一細胞クローンへの分割（クロ一ニング）
ハイプリ ドーマのクロ一ニング法としては、 例えばメチルセルロース法、 軟 ァガロース法、 限界希釈法等の公知の方法を用いる ことができる 〔例えば Barbara, B.M. and Stanley, M.S. ： Selected Methods in Cellular Immunology, W.H. Freeman and Company, San Francisco ( 1980) 参照〕。 このクロ一ニング 法としては、 プレートの 1 ゥエルに 1個のハイプリ ドーマが含まれるように希 釈して培養する限界希釈法、 軟寒天培地中で培養しコロニーを回収する軟寒天 法、 マイクロマ二ュピレ一夕一によって 1個づつの細胞を取り出し培養する方 法、 セルソ一ターによって 1個の細胞を分離する 「ソ一夕クローン」 などが挙 げられる。 これらの方法のうち、特に限界希釈法が好適である。 この方法では、 マイク口プレートにラッ ト胎児由来繊維芽細胞株、 あるいは正常マウス脾臓細 胞、 胸腺細胞、 腹水細胞などのフィーダ一（f ee de r)を接種しておく。 一方、 あ らかじめハイプリ ドーマを 0 . 2〜 0 . 5個/ 2 m 1 になるように培地中 で希釈し、 この希釈したハイブリ ド一マの浮遊液を各ゥエルに 0 . 1 m 1 ずつ 入れ、 一定期間毎 （例えば 3 日毎） に約 1 / 3の培地を新しいものに交換しな がら 2週間程度培養を続けることによってハイプリ ドーマのクローンを増殖さ せることができる。
抗体価の認められたゥエルについて、 例えば限界希釈法によるクローニング を 2〜4回繰返し、安定して抗体価の認められたものを抗 DC-STAMPモノクロ一 ナル抗体産生ハイプリ ドーマ株として選択する。
( ) ハイプリ ドーマ培養によるモノク口一ナル抗体の調製
このようにして選択されたハイプリ ドーマは、 これを培養することにより、 モノクローナル抗体を効率よく得ることができるが、 培養に先立ち、 目的とす るモノクローナル抗体を産生するハイプリ ドーマ ¾スク リーニングすることが 望ましい。 このスク リーニングにはそれ自体既知の方法が採用できる。
本発明における抗体価の測定は、 例えば E L I S A法によれば、 以下に記載 するような手順によ り行う こ とができる。 まず,、 精製または部分精製した DC-STAMP ,もしくは DC-STAMP を発現させた細胞を E L I S A用 9 6穴プレート 等の固相表面に吸着させ、 さらに抗原が吸着していない固相表面を抗原と無関 係な蛋白質、 例えばゥシ血清アルブミン （以下 「B S A」 という） により覆い、 該表面を洗浄後、 第一抗体として段階希釈した試料 （例えばハイプリ ドーマの 培養上清） に接触させ、 上記抗原に試料中の抗 DC- STAMP抗体を結合させる。 さ らに第二抗体として酵素標識されたマウス抗体に対する抗体を加えてマウス抗 体に結合させ、 洗浄後該酵'素の基質を加え、 基質分解に基づく発色による吸光 度の変化等を測定することにより、 抗体価を算出する。 なお、 このようなスク リ一ニングは、 上記のようにハイプリ ドーマをクロ一ニングした後で行っても よいし、 その前に行ってもよい。
以上の通りの方法によって得たハイプリ ドーマは、 液体窒素中または一 8 0 °c以下の冷凍庫中に凍結状態で保存することができる。
クローニングを完了したハイプリ ド一マは、 培地を H T培地から正常培地に 換えて培養される。 大量培養は、 大型培養瓶を用いた回転培養、 あるいはスピ ナー培養で行われる。 この大量培養における上清を、 ゲル濾過等、 当業者に周 知の方法を用いて精製することにより、 本発明の蛋白質に特異的に結.合するモ ノクローナル抗体を得ることができる。 また、 同系統のマウス （例えば、 上記 の B AL B/c )、あるいは N u/N uマウスの腹腔内にハイプリ ドーマを注射 し、 該ハイプリ ドーマを増殖させることにより、 本発明のモノクローナル抗体 を大量に含む腹水を得ることができる。 腹腔内に投与する場合には、 事前 （ 3 〜 7 日 前） に 2 ， 6 ， 1 0 , 1 4 — テ ト ラ メ チ ル ペ ン 夕 デカ ン
(2, 6, 10, H-tetramethyl pentadecane) (プリスタン） 等の鉱物油を投与する と、 より多量の腹水が得られる。 たとえば， ハイプリ ドーマと同系統のマウス の腹腔内に予め免疫抑制剤を注射し、 T細胞を不活性化した後、 2 0 日後に 1 06〜 1 07個のハイプリ ドーマ ·ク口一ン細胞を血清を含まない培地中に浮遊
( 0. 5 m l ) させて腹腔内に投与し、 通常腹部が膨満し、 腹水にたまったと ころでマウスより腹水を採取する。 この方法により、 培養液中に比べて約 1 0 0倍以上の濃度のモノクローナル抗体が得られる。
上記方法により得たモノクローナル抗体は、 例えば Weir, D.M.： Handbook of Experimental Immunology Vol . I , II ， III, Black el 1 Scientific Publications, Oxford (1978) に記載されている方法で精製することができる。 すなわち、 硫安塩析法、 ゲル濾過法、 イオン交換クロマトグラフィー法、 ァフ ィニティ一クロマ トグラフィー法等である。 これらの方法のうち、 硫安塩析法 を 3〜4回、 好ましくは 3〜 6回繰り返すことによって、 モノクローナル抗体 を精製することが可能である。 しかしこの方法では精製モノク口一ナル抗体の 収率が極めて,低くなる。 そのため、 硫安分画法を 1〜 2回行った粗精製モノク 口一ナル抗体について、 ゲル濾過法、 イオン交換クロマトグラフィー法、 ァフ ィニティ一クロマ トグラフィ一法等から選ばれた少なく とも 1種類、 好ましく は 2種類の方法を行う ことによって、 高純度に精製されたモノク口一ナル抗体 を高収率で得ることができる。 硫安塩析法と他法との組み合わせおよび順序と しては、 （i)硫安塩析法ーイオン交換クロマトグラフィー法—ゲル濾過法、 （ii) 硫安塩析法一イオン交換ク口マ トグラフィ一法一ァフィ二ティーク口マ トダラ フィ一法、（iii)硫安塩析法ーゲル濾過法—ァフィニティ一クロマトグラフィー 法等を例示することができるが、 高純度でかつ高収率にモノクローナル抗体を 得るためには、 上記（iii)の組み合わせが特に好ましい。
精製の簡便な方法としては、市販のモノクローナル抗体精製キッ ト（例えば、 MA b T'r a p GIIキッ ト；フアルマシア社製）等を利用することもできる。 かく して得られるモノク口一ナル抗体は、 DC- STAMP に対して高い抗原特異性 を有する。
( h ) モノクローナル抗体の検定
かく して得られたモノクローナル抗体のアイソタイプ及びサブクラスの決定 は以下のように行う ことができる。 まず、 同定法としてはォクテルロニー (Ouchterlony) 法、 E L I S A法、 または R I A法が挙げられる。 ォクテル口 二一法は簡便ではあるが、 モノク口一ナル抗体の濃度が低い場合には濃縮操作 が必要である。 一方、 E L I S A法または R I A法を用いた場合は、 培養上清 をそのまま抗原吸着固相と反応させ、 さらに第二次抗体'として各種ィムノグロ ブリ ンアイソタイプ、 サブクラスに対応する抗体を用いることにより、 モノク 口一ナル抗体のアイソタイプ、サブクラスを同定することが可能である。また、 さらに簡便な方法として、 市販の同定用のキッ ト （例えば、 マウスタイパ一キ ッ 卜 ； バイオラッ ド社製） 等を利用することもできる。
さらに、 蛋白質の定量は、 フォーリ ンロウリー法、 及び 2 8 0 nmにおける 吸光度 [ 1. 4 (OD 2 8 0 ) =ィムノグロブリ ン l m g /m 1 ] より算出す る方法により行う ことができる。
( 3 ) ヒ ト化抗 DC-STAMP抗体の作製
免疫グロプリ ン G (以下、 単に 「 I g G」 という。） は、 分子量約 2 3 0 0 0 の軽ポリペプチド鎖 （以下 「軽鎖」 という。）、 分子量約 5 0 0 0 0の重ポリべ プチド鎖 （以下 「重鎖」 という。） 各 2本ずつから構成される。 重鎖、 軽鎖とも 約 1 1 0残基からなる、 アミノ酸配列が保存されている領域の繰り返し構造を 持ち、 これらは I g Gの 3·次元構造の基本単位 （以下、 「ドメイン」 という。） を構成する。 重鎖および軽鎖は、 それぞれ連続した 4個、 および 2個の ドメィ ンから構成されている。 重鎖、 軽鎖いずれにおいても、 ァミノ末端の ドメイン は他のドメインに比べ各抗体分子間でのアミノ酸配列の変異が大きく、 この ド メインは可変ドメイン （variable domain ： 以下、 「Vドメイン」 という。） と 呼ばれる。 I g Gのァミノ末端においては、 重鎖、 軽鎖の Vドメインが相補的 に会合し可変領域を形成している。 これに対し、 残余の ドメイ ンは、 全体とし て定常領域を形成する。定常領域は、各動物種に特徴的な配列を有し、例えば、 マウス I g Gの定常領域はヒ ト I g Gの定常領域とは異なっているので、 マウ ス I g Gはヒ トの免疫系によって異物として認識され、 その結果、 ヒ ト抗マウ ス抗体 （Human Anti Mouse Antibody ： 以下 「HAMA」 という。） 応答が起こ る （シュロッフら、 Cancer Res. , (1985) 45, 879-85)。 従って、 マウス抗体は ヒ トに繰返し投与することはできない。 このような抗体をヒ トに投与するため には、 抗体の特異性を保持したまま HAM A応答を起こさないように抗体分子 を修飾する必要がある。
X線結晶構造解析の結果によれば、 一般に、 このようなドメインは 3本から 5本の β 鎖からなる逆平行 β シー卜が二層重なり合った長円筒状の構造をと る。 可変領域では、 重鎖、 軽鎖の Vドメインそれぞれにっき各 3個のループが 集合 し 、 抗原結合部位を形成する 。 こ の各ルー プは相補性決定領域
(complementarity determining region： 以下、 「CDR」 とレ う。) と H乎ば、れ、 アミノ酸配列の変異が最も著しい。 可変領域の C D R以外の部分は、 一般に、 C D Rの構造を保持する役割を有し、 「フレームワーク」 と呼ばれる。 カバトら は、 重鎖、 軽鎖の可変領域の一次配列を多数収集し、 配列の保存性に基づき、 それぞれの一次配列を C D Rおよびフレームワークに分類した表を作成した
(カ バ ト ら 、 SEQUENCES OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5th edition, NIH publication, No.91-3242, E. A. Kabatt et al. ) 0 また、 各フレームワークは、 ァミノ酸配列が共通の特徴を有する複数のサブグループに分類された。さらに、 ヒ トとマウスの間で対応するフレームワークが存在することも見いだされた。 このような I g Gの構造的特徴に関する研究から以下のヒ ト化抗体の作製法 が考案された。
研究初期の段階では、 マウス由来抗体の可変領域をヒ ト由来の定常領域に接 合したキメラ抗体が提案された（Proc. Nail. Acad. Sci. U.S.A. 81- 6851-6855, (1984) 参照）。 しかし、 そのようなキメラ抗体は、 依然として、 多くの非ヒ ト アミノ酸残基を含むので、 特に長期間投与した場合には HAM A応答を誘導し うる （Begent et al. , Br. J. Cancer, (1990) 62, 487)。
ヒ トに対し HAMA応答を発現する可能性のある、 非ヒ トほ乳動物由来のァ ミノ酸残基を更に少なくする方法として、 C D R部分のみをヒ ト由来の抗体に 組み込む方法が提案された (Nature, 321 , 522-525, (1986)参照） が、 一般に、 抗^に対する免疫グロブリ ン活性を保持するには C D Rのみの移植では不十分 であった。
一方、 チヨ ッチアらは、 1987年、 X線結晶構造解析デ一夕を用い、
(a) C D Rのアミノ酸配列中には、 抗原に直接結合する部位と C D R自体の構 造を維持する部位とが存在し、 C D Rの取り得る三次元構造は、 複数の典型的 なパターン （カノ二カル構造） に分類されること、
(b)カノ二カル構造のクラスは、 C D Rのみならずフレームワーク部分の特定の 位置のアミノ酸の種類によって決定されること、を見いだした（ J. Mol. Biol. , (1987) 196, 90卜 917)。
この知見に基づき、 C D R移植法を用いる場合、 C D Rの配列に加え一部の フレームワークのアミノ酸残基もヒ ト抗体に移植する必要性が示唆された （特 表平 4-502408号参照）。
一般に、 移植すべき C D Rを有する非ヒ ト哺乳動物由来の抗体は 「ドナー」、 C D Rが移植される側のヒ ト抗体は 「ァクセプタ一」 と定義されるが、 本発明 もこの定義に従う ことにする。
C D R移植法を実施する際に考慮すべき点は、 可能な限り C D Rの構造を保 存し、 免疫グロブリ ン分子の活性を保持することにある。 この目的を達成する ため ： .
(a) ァクセプタ一は、 いずれのサブグループに属するものを選択すべきか ；
(b) ドナーのフレームワークからいずれのアミノ酸残基を選択すべきか の 2点に留意する必要がある。
クイーンらは、 ドナーのフレームワークのアミノ酸残基が、 以下の基準の少 なく ともひとつに該当する場合、 C D R配列とともにァクセプ夕一に移植する デザインの方法を提唱した （特表平 4- 502408号参照） ：
(a) ァクセプターのフレームワーク領域中のアミノ酸がその位置において稀で あり、 ドナーの対応するアミノ酸がァクセプ夕一の前記位置において普通であ る。 '
(b) 該アミノ酸が C D Rのひとつのすぐ近くである。 (c) 該アミノ酸が三次元免疫グロプリ ンモデルにおいて C D Rの約 3 A以内に 側鎖原子を有し、 そして抗原とまたはヒ ト化抗体の C D Rと相互作用すること ができると予想される。
本発明の抗 DC - STAMP モノクローナル抗体の重鎖または軽鎖をコードする D N Aは、上記抗 DC- STAMPモノクローナル抗体を産生するハイプリ ドーマ細胞よ り mRNAを調製し、 該 mR NAを逆転写酵素で c D NAに変換してから、 該 抗体の重鎖または軽鎖をコードする D N Aをそれぞれ単離することにより得ら れる。
mR NAの抽出にあたっては、 グァニジン · チオシァネート · ホッ ト · フエ ノ一ル法、 グァニジン ' チオシァネ一トーグァニジン ' 塩酸法なども採用しう るが、 グァニジン · チオシァネート · 塩化セシウム法が好適である。 細胞から の mR NAの調製は、 まず全 RNAを調製し、 該全 RNAからオリゴ （ d T) セルロースやオリ ゴ （ d T) ラテックスビ一ズ等のポリ （A) +RNA精製用担 体を用いて精製する方法、 または細胞ライセ一トから該担体を用いて直接精製 する方法により実施できる。 全 RN Aの調製方法としては、 アルカリ ショ糖密 '度勾配遠心分離法（Dougherty, W. G. and Hiebert, E. , Viology, (1980) 101, 466-474)、 グァニジンチオシァネート ' フエノ一ル法、 グァニジンチオシァネ —ト · トリ フルォロセシウム法、 フエノール · S D S法等も採用し得るが、 グ ァニジンチオシァネートおよび塩化セシウムを用いる方法（Chirgwin, J. M. , et aし， (1979) Biochemistry, (1979) 18, 5294- 5299)が好適である。
上記のごとく して得られたポリ （A) +R N Aを铸型として、 逆転写酵素反応 により一本鎖 c D NAを合成した後、 この一本鎖 c D NAからニ.本鎖 c D N A を合成することができる。この方法としては S I ヌクレア一ゼ法（Eistrati ad is， A., et al. , Cell, (1976) 7, 279-288) , グブラ——ホフマン法（Gub 1 er， U. and Hoffman, B. J. , Gene, (1983) 25, 263-269)、 ォカャマーバーグ法（Okayama, H. and Berg, P. , Mol. Cel 1. Biol. , (1982) 2, 16卜 170)等を採用し得るが、 本発 明においては、 一本鎖 c D N Aを铸型としてポリメラ一ゼ連鎖反応 （以下 「P C R」 という） （Saiki, R. K. , et al. , Science, (1988) 239, 487-49)を行な う、 いわゆる R T— P C R法が好適である。
このようにして得られた二本鎖 c D NAをクローニングベクターに組み込み、 得られた組換えベクターを大腸菌等の微生物に導入して形質転換させ、 テトラ サイクリ ン耐性あるいはアンピシリ ン耐性等を指標として形質転換体を選択す ることができる。大腸菌の形質転換は、ハナハン法（Hanahan, D. , J. Mol. Biol. , (1983) 166， 557-580)、 すなわち塩化カルシウムや塩化マグネシウムまたは塩化 ルビジウムを共存させて調製したコンビテン ト細'胞に、 該組換え D N Αベクタ —を加える方法により実施することができる。 なお、 ベクターとしてブラスミ ドを用いる場合は、 上記の薬剤耐性遺伝子を有することが必要である。 また、 プラスミ ド以外のクロ一ニングベクター、 例えばラムダ系のファージ等を用い ることも可能である。
上記により得られた形質転換株から、目的の抗 DC- STAMPモノクロ一ナル抗体 の各サブユニッ トをコードする c D N Aを有する株を選択する方法としては、 例えば以下に示す各種方法を採用できる。 なお、 上記 R T— P C R法により 目 的の c D N Aを特異的に増幅した場合は、 これらの操作を省略することが可能 である。
( 3— 1 ) ポリメラ一ゼ連鎖反応を用いる方法
目的蛋白質のアミノ酸配列の全部または一部が解明されている場合、 該アミ ノ酸配列の一部に対応するセンスス トランドとアンチセンスス トランドのオリ ゴヌクレオチドプライマ一を合成し、 これらを組み合わせてポリメラーゼ連鎖 反応（Saiki, R. K. , et al. , Science, (1988) 239, 487- 49)を行ない、 目的の 抗 DC- STAMP 抗体重鎖あるいは軽鎖サブュニッ トをコ一ドする D N A断 を増 幅する。 ここで用いる錡型 D NAとしては、 例えば抗 DC - STAMPモノクローナル 抗体を産生するハイプリ ドーマの mRNAより逆転写酵素反応にて合成した c D N Aを用いることができる。
このようにして調製した D N A断片は、 市販のキッ ト等を利用して直接ブラ スミ ドベクタ一に組み込むこともできるし、 該断片を 32 P、 35Sあるいはピオ チン等で標識し、 これをプローブとして用いてコロニーハイブリダィゼ一ショ ンまたはプラークハイブリダィゼ一シヨ ンを行う ことにより 目的のクロ一ンを 選択することもできる。 .
例えば、本発明の抗 DC- STAMPモノク口一ナル抗体の各サブュニッ トの部分ァ ミノ酸配列を調べる方法としては、 電気泳動やカラムクロマトグラフィーなど の周知の方法を用いて各サブュニッ トを単離してから、 自動プロテインシーク ェンサ一 （例えば、 島津製作所 （株） 製 PPSQ- 10) 等を.利用してそれぞれのサ プユニッ トの N末端アミノ酸配列を解析する方法が好適である。
上記のごとく して得られた目的の形質転換株より、抗 DC-STAMPモノクローナ ル抗体蛋白質の各サブュニッ トをコ一ドする c D N Aを採取する方法は、 公知 の方法 (Mani at i s， T. , e t al . (1982) in Molecular Cloning A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory, NY. )に従い実施できる。 例えば細胞 よりべクタ一 D NAに相当する画分を分離し、 該プラスミ ド D NAより 目的と するサブユニッ トをコードする D NA領域を切り出すことにより行う ことが可 能である。
( 3 - 2 ) 合成オリゴヌクレオチドプローブを用いるスクリーニング法 目的蛋白質のアミ ノ酸配列の全部または一部が解明されている場合 （該配列 は、 複数個連続した特異的配列であれば、 目的蛋白質のどの領域のものでもよ い）、 該アミノ酸配列に対応するオリゴヌクレオチドを合成し （この場合、 コ ド ン使用頻度を参考に推測されるヌクレオチド配列、 または考えられるヌクレオ チド配列を組み合わせた複数個のヌクレオチド配列のいずれも採用でき、 また 後者の場合ィノシンを含ませてその種類を減らすこともできる）、これをプロ一 ブ （32P、 35Sあるいはピオチン等で標識する） として、 形質転換株の D NAを 変性固定したニトロセルロースフィルタ一とハイブリダィズさせ、 得られたポ ジティブ株を選別する。
このようにして得られる D N Aの配列の決定は、 例えばマキサムーギルバ一 . 卜のィ匕学修飾法（Maxam, A. M. and Gilbert, 'ff. , Methods in Enzymol ogy, (1980) 65， 499-576)ゃジデォキシヌ ク .レオチ ド鎖終結法 （Messing, J. and Vieira, J. , Gene (1982) 19, 269-276)等により実施することができる。
また近年、 蛍光色素を用いた自動塩基配列決定システムが普及している （例 えばパーキンエルマ一ジャパン社製シークェンス 0ボッ ト" CATALYST 800"およ びモデル 373AD NAシークェンサ一等）。
こう したシステムを利用することで、 D NAヌクレオチド配列決定操作を能 率よく、 かつ安全に行う ことも可能である。 このようにして決定された本発明 の D NAの各ヌクレオチド配列、 および重鎖および軽鎖の各 N末端アミノ酸配 列データから、 本発明のモノク口一ナル抗体の重鎖および軽鎖の全アミノ酸配 列を決定することができる。
ィムノグロプリ ンの重鎖および軽鎖は、 いずれも可変領域および定常領域か らなり、 可変領域はさらに相補性決定領域 下 「C D R」 と記す ； 重鎖 · 軽 鎖ともに各 3か所） およびそれらに隣接するフレームワーク領域 （重鎖 · 軽鎖 ともに各 4か所） からなる。
このうち、 定常領域のアミノ酸配列は、 抗原の種類に関係なく、 ィムノグロ ブリ ンサブクラスが同一である抗体間では共通である。 一方、 可変領域、 特に C D Rのアミノ酸配列は各抗体に固有のものであるが、 数多くの抗体のァミノ 酸配列データを比較した研究によれば、 C D Rの位置やフレームワーク配列の 長さは、 同じサブグループに属する抗体サブュニッ 卜の間ではほぼ類似してい ることが知られている（Kabat, E. A., et al. , in " Sequence of Proteins of Immunological Interest Vol. II" : U.S. Department of Health and Human Services, (1991))。 従って、 例えば抗 DC-STAMPモノクローナル抗体の重鎖お よび軽鎖の各アミノ酸配列とそれら公知のアミノ酸配列デ一夕とを比較するこ とにより、 各アミノ酸配列における C D Rやフレームワーク領域および定常領 域の位置を決定することができる。 なお、 F RHい すなわち重鎖の最も N末端 側のフレームワーク領域の鎖長については、 通常 （ 3 0アミ ノ酸） より短いこ とがあり、 例えば、 該フレームワーク領域が最小 1 8アミノ酸である例などが 知られている （前出 Kabat et al.)。 このことから本発明の抗体においては、 抗 DC-STAMP抗体としての機能を損なわない限りにおいて、重鎖の N末端のフレ —ムワーク領域の鎖長を 1 8アミノ酸以上 3 0アミノ酸以下とするが、 好適に は 3 0アミノ酸である。
なお、 上記のようにして決定された軽鎖または重鎖のそれぞれの C D Rと同 じアミノ酸配列、 もしくはその中の連続した部分アミノ酸配列を有するベプチ ドを、人為的な修飾操作を施して該 C D Rが抗 DC- STAMP抗体分子中で形成する 立体構造に近付けることにより、単独で DC- STAMP に対する結合活性を付与せし めることが可能である [例えば、 米国特許第 5 3 3 1 5 7 3号公報参照]。 した がって、 そのように修飾された、 C D Rと同じアミノ酸配列、 もしくはその中 の連続した部分アミノ酸配列を有するぺプチドも、本発明の分子に包含される。 アミノ酸配列中の任意の一つもじくは二つ以上のアミノ酸を欠失させた改変 体を作製するにあたっては、 カセッ ト変異法 （岸本利光、 "新生化学実験講座 2 ·核酸 III 組換え DNA技術" 242- 251参照） などに従う ことができる。 こ の様な各種の D N Aは、 例えばフ ォス フ ァイ ト · ト リ エステル法 (Hunkapiller, M. , et al.， Nature (1984) 310, 105- 111)等の常法に従い、 核 酸の化学合成により製造することもできる。 なお、 所望アミノ酸に対するコ ド ンは、 それ自体が公知であり、 その選択も任意でよく、 例えば使用する宿主の コ ドン使用頻度を考慮して常法に従い決定することも可能である。 これらヌク レオチド配列コ ドンの一部改変は、 常法に従い、 所望の改変をコ一ド.する合成 オリゴヌクレオチドからなるプライマ一を利用した部位特異的変異導入法 （サ ィ トスぺシフィ ック · ミュー夕ジエネシス） （Mark, D.F., et al.， Proc. Nat 1. Acad. Sci. USA (1984) 81， 5662 - 5666)等に従う ことができる。
また、ある D N Aが本発明の抗 DC-STAMPモノクローナル抗体の重鎖または軽 鎖をコードする D N Aとハイブリダィズするか否かは、 例えば、 該 D N Aを、 ランダムフライマ一法 (Feinberg, A. P. and Vogelstein, B. , Anal . i ochem. , (1983) 132, 6- 13)やニック トランスレーショ ン法 Maniatis, T.， et al. , in "Molecular Cloning A laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory, NY. , (1982))等に従い [ α—32 P] d C T P等で標識したプロ一ブ D N Aを用いて、 以下に記載するような実験を行う ことにより調べることができる。
まず調べようとする D N Aを、 例えばニトロセルロース膜やナイ口ン膜等に 吸着させ、 必要に応じてアルカリ変性等の処理を行ってから、 加熱あるいは紫 外線等により固相化させる。 この膜を、 6 XS S C ( 1 XS S Cは 0. 1 5 M 塩化ナトリ ウム、 0. 0 1 5 M クェン酸三ナトリウム溶液） と 5 % デンハ —ト溶液、 0. 1 % ドデシル硫酸ナトリウム （S D S) を含むプレハイプリ ダイゼ一シヨ ン溶液に浸し、 5 5 °Cで 4時間以上保温してから、 先に調製した プローブを同様のプレハイブリダィゼ一シヨ ン溶液に最終比活性 1 X I 06c pmZm l となるように加え、 6 0 °Cで一晩保温する。 その後、 膜を室温下で 6 X S S Cで 5分間洗浄する操作を数回繰り返し、 さらに 2 XS S Cで 2 0分 間洗浄してから、 オートラジオグラフィーを行う。
上記のような方法を利用して、 任意の c DNAライブラリ一またはゲノムラ イブラリ一から、本発明のヒ ト化抗 DC- STAMP抗体の重鎖または軽鎖をコ一ドす る D N Aと八イブリダィズする D N Aを単離することができる（Maniatis, T.， et al . , in "Molecular Cloning A laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, NY. , (1982))。
上記のごとく して得られる各 D NAを、 それぞれ発現べクタ一に組み込むこ とにより、 原核生物または真核生物の宿主細胞に導入し、 それらの宿主細胞で 各遺伝子を発現させることが可能である。 発現方法は上記 「 6. 抗 DC- STAMP 抗体の製造」 の項の 「（ 1 ) 抗原の調製」 の項に記載した方法と同一の方法によ つて行う ことができる。 '
形質転換体の細胞内または細胞外に生産される、抗 DC- STAMP抗体蛋白質を含 む画分は、 該蛋白質の物理的性質や化学的性質等を利用した各種公知の蛋白質 分離操作法により、 分離 · 精製することができる。 かかる方法としては、 具体 的には例えば通常の蛋白質沈澱剤による処理、 限外濾過、 分子ふるいクロマト グラフィ一 （ゲル濾過）、 吸着クロマトグラフィー、 イオン交換クロマトグラフ ィ一、 ァフィ二ティ一クロマトグラフィー、 高速液体クロマトグラフィー （H P L C) 等の各種クロマトグラフィー、 透析法、 およびこれらの組み合わせ等 を採用できる。
抗 DC- STAMPマウスモノク口一ナル抗体をヒ ト化するためには、決定された C D R配列全体および F R配列の一部のアミノ酸残基をヒ ト抗体へ移植するよう に、 可変領域のアミ ノ酸配列を設計する必要がある。 この設計は、 以下の方法 に従う。
従来、 ヒ ト化のデザインを行う場合、 ァクセプタ一のサブグループの選択指 針としては、 （a)天然のアミノ酸配列を有する公知のヒ ト抗体の重鎖、 軽鎖の天 然の組み合わせをそつ く りそのまま用いる、
(b)重鎖、 軽鎖が属するサブグループとしての組み合わせは保存するが、 重鎖、 軽鎖としては、 それぞれ異なるヒ ト抗体に由来し、 ドナ一の重鎖、 軽鎖のアミ ノ酸配列と同一性が高いアミノ酸配列、 または、 コンセンサス配列を用いる、 のいずれかが選択されている。 本発明においても、 上記の指針に従うことがで きるが、 これらと異なる方法として、
(c)サブグループの組み合わせを考慮することなく、 ドナーの F Rと最も同一性 の高い重鎖、 軽鎖の F Rをヒ ト抗体の一次配列のライブラリーの中から選択す る、
という方法を採用することも可能である。 これらの選択法により、 ドナ一およ びァクセプタ一間での、 F R部分のアミノ酸の同一性を少なく とも 7 0 %以上 とすることが可能となる。 この方法を採用することにより、 ドナーより移植す るアミノ酸残基の数をより少なくすることが可能となり、 H A M A応答誘導を 減少させることができる。
また、 抗体分子の一次配列より三次構造を予測する操作 （以下、 この操作を 「分子モデリ ング」 という） はその予測精度に限界があり、 そのドナ一が属す るサブグループにおいて稀にしか出現しないアミノ酸残基の役割を十分に特定 することができない。 クイーンらの方法に従い、 かかる位置においてドナー、 ァクセプタ一のいずれのアミノ酸残基を選択すべきかを判断することは一般に 困難である。 （c)の選択法によれば、 このような判断をする機会を著しく減少す ることができる。
本発明者らは、 ドナーの C D Rの構造および機能を維持するために重要なド ナ一の F R由来のアミ ノ酸を同定するための新規な方法を提供.することによつ て、 このヒ ト化の方法をさらに改良している。
軽鎖、 重鎖それぞれのヒ トァクセプ夕一分子が選択された後、 ドナ の F R より移植するアミノ酸残基を選択する方法は、 以下に記載する通りである。 ドナーとァクセプタ一のアミノ酸配列を並べ、 両者の F Rの対応する位置で アミノ酸残基が異なっていた場合、 どちらの残基を選択するべきかを決定する 必要があるが、 この選択においては、 ドナ一由来の C D Rの三次元構造を損な わないよう選択を行う必要がある。
クイーンらは前述の特表平 4— 5 0 2 4 0 8号において、 F R上のアミノ酸 残基が、 以下の要件の少なく ともひとつに該当する場合、 C D R配列とともに ァクセプターに移植する方法を提唱した ：
1 ) ァクセプタ一のヒ ト F R領域中のアミノ酸がその位置において稀であり、 ドナーの対応するアミノ酸がァクセプターの前記位置において普通である ；
2 ) 該アミノ酸が C D Rのひとつのすぐ近くである ；
3 ) 該アミノ酸が三次元免疫グロプリ ンモデルにおいて C D Rの約 3 A以内に 側鎖原子を有し、 そして抗原とまたはヒ ト化抗体の C D Rと相互作用すること ができると予想される。
ここで 2 ) で示された残基はしばしば 3 ) の性質を示すことより、 本発明で はこの 2 ) の要件を削除し、 別に新たに 2種の要件を設ける。 すなわち、 本発 明では、 C D Rと共に移植すべきドナ一の F R上のアミノ酸残基については ： a ) ァクセプターの F R中のアミノ酸がその位置において稀であり ドナーの対 応するァミノ酸が当該位置において普通であるか ；
b ) 該アミノ酸が三次元構造モデルにおいて、 C D Rの構成アミノ酸原子と抗 原または移植すべき C D Rループとめ相互作用が予想されるか ；
c ) 当該位置がカノ二カルクラス決定残基であるか ；
d ) 当該位置が重鎖と軽鎖の接触面を構成するか、
である場合に、 ドナーの F Rから当該アミノ酸残基を移植することにする。
a ) の要件では、 前述したカバトの表に従い、 同一サブクラスの抗体につい て当該位置で 9 0 %以上の頻度で見いだされるアミノ酸を 「普通」、 1 0 %未満 の頻度で見いだされるアミノ酸を 「稀」 と定義する。
c ) の要件では、 「当該位置がカノ二カルクラス 定残基であるか」 否かにつ いては、 前述したチヨ ッチアの表に従い、 一義的に決定することができる。 b )、 d ) の要件については、 予め抗体可変領域の分子モデリ ングが必要とな る。 分子モデリ ング用ソフ トウェアとしては、 市販のものならいずれのものも 採用し得るが、 好適には、 A b M (オックスフォード · モレキュラー · リミテ イ ツ ド社製） を使用することができる。
分子モデリ ングの予測精度には一定の限界があるので、 本発明においては、 種々の抗体の可変領域の X線結晶解析の実験結果を参照することにより、 分子 モデリ ングから得られる構造予測の確からしさを 2段階に区別する。
本発明においては、 A b M等の分子モデリ ング用ソフ トウェアによって構築 されたところの可変領域の 3次元構造において、 2原子間 距離が、 各々のフ アンデルワールス半径の和に 0 . 5 Aを加えた値より短いとき、 当該 2原子間 はファンデルワールス接触していると推定した。主鎖および側鎖のアミ ド窒素、 カルボニル酸素など極性の原子間距離が平均の水素結合距離である 2 . 9 Aに 0 . 5 A加えた距離より短い場合は、その間に水素結合が存在すると推定した。 さらに、 相反する電価を持つ原子間が、 2. 8 5 Aに 0. 5 A加えた距離より 短い場合は、 その間にイオン対が形成されているものと推定した。
一方、 種々の抗体の可変領域の X線結晶構造解析の実験結果から、 サブダル —プと無関係に、高頻度に C D Rとの接触が見いだされる F R上の位置として、 軽鎖では、 1、 2、 3、 4、 5、 2 3、 3 5、 3 6、 4 6、 4 8、 4 9、 5 8、 6 9、 7 1、 8 8番の位置、 重鎖では、 2、 4、 2 7、 2 8、 2 9、 3 0、 3 6、 3 8、 4 6、 4 7、 4 8、 4 9、 6 6、 6 7、 6 9、 7 1、 7 3、 7 8、 9 2、 9 3、 9 4、 1 0 3番の位置が特定される （数字はいずれも前出カバト らの文献において定義されるアミノ酸番号を表わす。 以下において同じ）。 分子 モデリ ングと同じ基準を適用した場合、 これらの位置のアミノ酸残基は、 公知 の抗体可変領域の 3分の 2において C D Rのアミノ酸残基との接触が認められ る。 これらの知見に基づき、 b) の 「該アミノ酸が三次元構造モデルにおいて、 CD Rの構成アミノ酸原子が抗原または移植すべき C D Rループとの相互作用 が予想される」 とは、 以下の要件を意味する。
分子モデリングにおいて、 F Rと C D Rとの接触の可能性が予見された F R の位置が、 X線結晶解析により実験的に F Rと C D Rとの接触が高頻度に検出 される位置のいずれかに一致する場合は、 ドナーのアミ ノ酸残基の移植を優先 する。
それ以外の場合は、 この要件 b) 'は考慮しない。
d ) の 「当該位置が重鎖と軽鎖の接触面を構成する」 とは、 以下の要件を意 味する。 種々の抗体の可変領域の X線結晶解析の実験結果から、 軽鎖において は、 3 6、 3 8、 4 3、 44、 4 6、 4 9、 8 7、 9 8番目のアミノ酸残基、 重鎖においては、 3 7、 3 9、 4 5、 4 7、 9 1、 1 0 3、 1 04番目のアミ ノ酸残基が、 高頻度に重鎖—軽鎖間接触をすることが認められている。 分子モ デリ ングにおいて、 重鎖—軽鎖間接触の可能性が予見され、 その位置が上述の 位置のいずれかに一致する場合は、 ドナ一のアミノ酸残基の移植を優先する。 それ以外の場合は、 この要件 d) は考慮しない。
本発明のヒ ト化抗 DC- STAMP 抗体の重鎖および軽鎖の可変領域をコードする D N Aは、 以下に記載する方法で製造することができる。
例えば、 6 0乃至 7 0ヌク レオチドの、 該 D N Aの部分ヌクレオチド配列か らなる複数のポリヌクレオチド断片を、 センス側およびアンチセンス側におい て互い違いになるように化学合成し、 その後各ポリヌクレオチド断片をァ二一 リ ングし'、 DN Aリガ一ゼにより結合し、 所望のヒ ト化抗 DC- STAMP抗体の重鎖 および軽鎖の可変領域をコ一ドする DNAを有する DNAを得ることができる。 別の方法として、 ァクセプターの可変領域の全アミノ酸配列をコードする D NAをヒ 卜リ ンパ球より分離し、 C DRをコ一ドする領域に当業者に周知の方 法でヌクレオチド置換を行う ことにより、 制限酵素切断配列を導入する。 対応 する制限酵素で該領域を切断した後、 ドナ一の CDRをコードするヌクレオチ ド配列を合成し、 D N Aリガ一ゼにより結合して、 所望のヒ ト化抗 DC-STAMP 抗体の重鎖および軽鎖の可変領域をコードする D N Aを得ることができる。 さ らに、 本発明では、 好適には以下に述べるォ一パーラップ ' ェクステンシ ヨ ン * P C R法 （ホルトンら、 Gene, 77, 61-68, (1989) 参照） に従い、 所望 のヒ ト化抗 DC- STAMP 抗体の重鎖および軽鎖,の可変領域をコ一ドする DN Aを 得ることができる。
すなわち、 接続を所望する 2種のアミノ酸配列をそれぞれコードする 2種の DNAを、 便宜的に （A) および （B) とする。 （A) の 5 ' 側にァニールする 2 0乃至 4 0ヌクレオチドのセンスプライマー (以下、 このプライマ一を ( C ) とする。） および （B) の 3 ' 側にァニールする 2 0乃至 4 0ヌクレオチドのァ ンチセンスプライマ一 （以下、 このプライマ一を （D) とする） を化学合成す る。 さらに、 （A) の 3 ' 側の 2.0乃至 3 0ヌクレオチドと （B) の 5 ' 側 2 0 乃至 3 0ヌクレオチドを連結した、 キメラ型のセンスプライマ一 （以下、 この プライマーを （E) とする） およびこれに相補的なアンチセンスプライマー （以 下、 このプライマ一を （F) とする） を合成する。 （A) を含む適当なベクタ一 DN Aを基質にして、 センスプライマ— （C) およびキメラ型アンチセンスプ ライマ一 （F) を用いた P C Rを行うことにより、 （A) の 3 ' 末端に （B) の 5 ' 末端側 2 0乃至 3 0ヌク レオチドが付加した D N Aを得ることができる (この新たに得られた D N Aを （G) とする）。 同様に、 （B) を含む適当なベ クタ一 D N Aを基質にして、 アンチセンスプライ'マー （D) およびキメラ型セ ンスプライマー（E)を用いた P C Rを行う ことにより、（B)の 5 ' 末端に（A) の 3 ' 末端側 2 0乃至 3 0ヌクレオチドが付加した D N Aを得ることができる (この新たに得られた DNAを （H) とする ）。 このようにして得られた （G) と （H) は、 （G) の 3 ' 側 4 0乃至 6 0ヌクレオチドと （H) の 5 ' 側 4 0乃 至 6 0ヌク レオチドにおいて相補的なヌクレオチド配列を保持している。 増幅 された （G) および （H) を混合して P C Rを行った場合、 1回目の変性反応 で （G) と （H) は 1本鎖になり、 その後のアニーリ ング反応で殆どの D N A は元に戻るが、 一部の D N Aについては相補的ヌクレオチド配列領域でァニー リ ングするへテロ D N A 2本鎖を形成する。 その後の伸長反応で、 突出した 1 本鎖部分が修復され、 （A) と （B) が連結したキメラ型の D N A (以下、 この DNAを （ I ) とする。） を得ることができる。 さらにこの （ I ) を基質として、 センスプライマ一 （C) とアンチセンスプライマー （D) を用い P C Rを行う ことにより、 （ I ) を増幅することができる。 本発明では、 抗ヒ ト DC- STAMPマ ウスモノク口一ナル抗体の重鎖および軽鎖の C D R領域をコードする DNAお よびヒ ト免疫グロプリ ン I g Gの F R領域をコー ドする DNA、 さらには、 ヒ ト免疫グロブリ ン I g Gの分泌シグナルをコードする DNAを、 それぞれケ一 ス ， バイ ' ケースにより （A) および （B) として上記の連結反応を行う こと ができる。
なお、 所望アミ ノ酸に対するコ ドンは、 それ自体公知であり、 その選択も任 意でよく、 例えば使用する宿主のコ ドン使用頻度を考慮して常法に従い決定で きる。 これらヌクレオチド配列コ ドンの一部改変は、 常法に従い、 所望の改変 をコードする合成オリゴヌク レオチドからなるプライマーを利用したサイ トス ぺシフィ ック · ミュ一夕ジエネシス (site specific mutagenesis ) (Mark, D. F. , et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1984) 81， 5662-5666) 等に従う こ とができる。 したがって、 各プライマ一を化学合成する際に、 予め点突然変異 を導入するように各プライマ一を設計することにより、所望の抗 DC- STAMP抗体 の重鎖および軽鎖の可変領域をコ一ドする DNAを得ることができる。
このようにして得られた本発明の各 DNAをそれぞれ発現ベクターに組み込 むことにより、 原核生物または真核生物の宿主細胞を形質転換させることがで きる。 さらに、 これらべクタ一に適当なプロモータ一および形質発現に関わる 配列を導入することにより、 各々の宿主細胞において各遺伝子を発現させるこ とが可能である。 上記方法により、 容易に高収率、 高純度で組換え抗 DC- STAMP抗体を製造でき る。
( 4 ) 抗 DC- STAMP完全ヒ ト抗体の作製
完全ヒ ト抗体とは、 ヒ ト染色体由来の抗体の遺伝子配列のみを有するヒ ト抗 体を意味する。 抗 DC- STAMP完全ヒ ト抗体は、 ヒ ト抗体の H鎖と L鎖の遺伝子を 含むヒ ト染色体断片を有するヒ ト抗体産生マウスを用いた方法 （Tomizuka, K. et al. , Nature Genetics, (1977) 16, 133-143; Kuroi a, Y. et.al., Nuc. Acids Res. , (1998) 26, 3447-3448; Yoshida, H. et.al., Animal Cell Technology: Basic and Applied Aspects, (1999) 10, 69-73 (Ki tagawa, Y. , Matuda, T. and I i j ima, S. eds. ) , Klu er Academic Publishers; Tomizuka, K. et.al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (2000) 97, 722-727) や、 ヒ ト抗体ラ イブラリーより選別したファージディスプレイ由来のヒ ト抗体を取得する方法 (Worms tone, I. M. et.al, Investigative Ophthalmology & Visual Science., (2002)43 (7), 2301-8; Carmen, S. et.al., Briefings in Funct ional Genomics and Proteoinics, (2002) 1 (2) , 189-203; Siriwardena, D. et. al. , Opthalmology (2002) 109 (3), 427- 431 等）によって取得するこ ができる。 ' このようにして作製されるヒ ト抗 DC- STAMP抗体が DC-STAMP と特異的に結合 することを確認する方法としては、 例えば、 マウス免疫時に抗体価の評価を行 う場合と同様の E L I S A法が好適である。
7. 抗 DC- STAMP抗体を含有する医薬
上述の 「 6. 抗 DC-STAMP 抗体の製造」 の項に記載された方法で得られる 抗 DC-STAMP抗体の中から、 DC-STAMPの生物活性を中和する抗体を得るこ とがで.きる。 これら DC-STAMP の生物活性を中和する抗体は、 生体内での DC-STAMPの生物活性、 即ち、 破骨細胞の分化及び Z又 fま成熟化を阻害するこ とから、 医薬として、 破骨細胞の分化異常に起因する骨代謝異常症に対する治 療剤として用いることができる。
i n V i t r oでの抗 DC-STAMP抗体による DC-STAMPの生物活性の中 和活性は例えば、 D C - S TAMPを過剰発現している細胞における細胞の破骨細胞 への分化の抑制活性で測定することができる。例えば、 DC-STAMP を過剰発現 しているマウス単球由来細胞株 RAW264.7細胞、 RAW264細胞又は RAW- D細胞を 培養し、培養系に種々の濃度で抗 DC-STAMP抗体を添加し、 RANKLおよび TNF- α刺激による、 破骨細胞への分化の抑制活性を測定することができる。また、 骨 髄由来の初代培養細胞に種々の濃度で抗 DC-STAMP抗体を添加し、 RANKLおよ ぴ TNF- α刺激による、 破骨細胞への分化の抑制活性を測定することができる。 さらに、 大腿骨および/又は脛骨由来の細胞を用いたピッ トアツセィ （Takada et al. , Bone and Mineral, (1992) 17, 347-359) 実験において、 大腿骨および ノ又は脛骨由来の細胞に種々の濃度で抗 DC-STAMP 抗体を添加して象牙切片 上のピッ トの形成を観察することによって破骨細胞の骨吸収活性の抑制活性を 測定することがでぎる。 i n V i v oでの実験動物を利用した抗 DC-STAMP 抗体の骨代謝異常に対する治療効果は、 例えば、 DC-STAMP を過剰に発現して いる トランスジエニック動物に抗 DC-STAMP 抗体を投与し、 破骨細胞の変化 を測定することで確認することができる。
このようにして得られた DC-STAMPの生物活性を中和する抗体は、 医薬として 、 特に骨粗鬆症、 関節リ ウマチ、 癌性高カルシウム血症等の骨代謝異常に起因 して起こる疾患の治療を目的とした医薬組成物として、 あるいはこのような疾 患の免疫学的診断のための抗体として有用である。
抗 DC- STAMP抗体は、 一つの例としては、 骨代謝異常症の治療に対しては該抗 体単独で、 あるいは少なく とも一つの骨に関する疾患の治療剤と一緒に投与す ることができる。 また一つの例として、 抗 DC-STAMP抗体は治療上有効な *の抗 骨代謝異常治療薬剤と一緒に投与することができる。抗 DC- STAMP抗体と一緒に 投与できる治療剤としては、 ビスホスホネート、 活性型ビタミン！ )3、 カルシト ニンおよびその誘導体、 ェス トラジオ一ル等のホルモン製剤、 SERMs (Selective estrogen receptor modul ators ィフ リ フラ不ン、 ヒ夕ミン 2 (メナテ卜レ ノン） 及びカルシウム製剤等を挙げることができるがこれらに限定されない。 骨代謝異常の状態やどの程度の治療を目指すかによつて、 2、 3 あるいはそれ 以上の種類の薬剤を投与することもできるし、 それらの薬剤は同じ製剤の中に 封入する こ とによ っ て一緒に供給する こ とができる。それら の薬剤と抗 DC-STAMP 抗体は同じ製剤の中に封入することによって一緒に供給することも できる。また、それらの薬剤は治療用キッ トとして封入することによって一緒に 供給することもできる。また、 それらの薬剤と抗 DC- STAMP抗体は別々に供給す ることもできる。遺伝子治療によって投与する場合には、蛋白質性の骨疾患治療 剤の遺伝子と抗 DC-STAMP抗体の遺伝子は、同時にあるいは別々に同じプロモー ター領域の下流に揷入することができ、 別々のあるいは、 同じべクタ一に導入 することができる。
抗 DC- STAMP抗体、あるいはそのフラグメン トに対し骨疾患治療剤を結合させ る こ と によ り 、 M.C. Garnet 「 Targeted drug conjugates: principles and progressj ， Advanced Drug Delivery Reviews, (2001) 53, 171-216 記載の標 的型薬物複合体を製造することができる。 この目的には、 抗体分子のほか、 破 骨細胞の認識性を完全消失していない限り、 いずれの抗体フラグメントも適用 可能であるが、 例えば、 Fab、 F(ab' )2、 Fv 等のフラグメントを例として挙げ ることができ、 本発明においても同様に、 抗体および該フラグメントを使用す ることができる。抗 DC- STAMP抗体または該抗体のフラグメントと骨疾患治療剤 との結合様式は、 M. C. Garnet 「Targeted drug conjugates： principles and progress 」 ， Advanced Drug Delivery Reviews, (2001) 53, 171-216 、 G. T. Hermaiison「Bioconjugate TechniquesjAcademic Press, California (1996)、 Putnam and J. Kopecek 「Polymer Conjugates with Ant i cancer ' Ac t ivi ty」 Advances in Polymer Science (1995) 122, 55-123 等に記載される種々の形態 があり得る。 すなわち、 抗 DC-STAMP抗体と骨疾患治療剤が化学的に直接あるい はオリゴぺプチド等のスぺーサ一が介在して結合される様式や、 適当な薬物担 体を介在して結合される様式を挙げることができる。 薬物担体の例としては、 リボソームや水溶性高分子を挙げることができる。 これら薬物担体が介在され る様式としては、 より具体的には、 抗体と骨疾患治療剤とがリボソームに包含 され、 該リボソームと抗体とが結合した様式、 および、 骨疾患治療剤が水溶性 高分子 （分子量 1000乃至 10万程度の化合物） に化学的に直接あるいはオリゴ ペプチド等のスぺーサーを介在させて結合され、 該水溶性高分子に抗体が結合 した様式、 を例として挙げることができる。 抗体 （または該フラグメント） と 骨疾患治療剤、 リボソームおよび水溶性高分子等の薬物担体との結合は、 G. T. Hermanson「Bioconjugate TechniquesjAcademic Press, California (1996)、 Putnam and J. Kopecek 「Polymer Conjugates with Anticancer Activityj Advances in Polymer Science (1995) 122, 55-123 に記載の方法等の当業者周 知の方法により実施することができる。骨疾患治療剤のリポソームへの包含は、
D.D.Lasic 「Liposomes: From Physics to App 1 i ca ί i ons」 ， Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam (1993)等に記載の方法等の当業者周知の方法によ り実施することができる。 骨疾患治療剤の水溶性高分子への結合は、 D. Putnam and J. Kopecek 「Polymer Conjugates with Anticancer Activityj Advances in Polymer Science (1995) 122, 55-123記載の方法等の当業者周知の方法により、 実施することができる。 抗体 （または該フラグメント） と蛋白質性の骨疾患治 療剤 （または該フラグメント） との複合体は、 上記の方法のほか、 遺伝子工学 的に、 当業者周知の方法により実施することができる。
本発明は、 治療に有効な量の抗 DC-STAMP抗体と薬学上許容される希釈剤、 担 体、 可溶化剤、 乳化剤、 保存剤及び Z又は補助剤を含む医薬組成物も提供する。 本発明は、治療に有効な量の抗 DC- STAMP抗体と治療に有効な量の少なく とも 一つの骨疾患治療剤と薬学上許容される希釈剤、 担体、 可溶化剤、 乳化剤、 保 存剤及び Z又は補助剤を含む医薬組成物も提供する。骨疾患治療剤としては、ビ スホスホネート、 活性型ビタミン！) 3、 カル トニンおよびその誘導体、 ェス ト ラ ジ オ一 ル等 の ホ ルモ ン製剤 、 SERMs ( selective estrogen receptor modulators), ィプリ フラボン、 ビタミン K2 (メナテトレノン）、 カルシウム製 剤、 PTH(parathyroid hormone)製剤、 非ステロイ ド性抗炎症剤、 抗 TNFa抗体、 抗 PTHrP (parathyroid hormine- related protein)抗体、 IL-1 レセプ夕一アン夕 ゴニス 卜、 抗 RANKL抗体及び OCIF(osteoclastogenesis inhibi tory factor)等 を挙げることができるがこれらに限定されない。
本発明の医薬組成物において許容される製剤に用いる物質としては好ましく は投与量や投与濃度において、 医薬組成物を投与される者に対して非毒性のも のが好ましい。
本発明の医薬組成物は、 ρΗ、 浸透圧、 粘度、 透明度、 色、 等張性、 色、 無 菌性、 安定性、 溶解率、 徐放率、 吸収率、 浸透率を変えたり、 維持したり、 保 持したりするための製剤用の物質を含むことができる。製剤用の物質として以 下のものを挙げることができるが、 これらに制限されない ： グリ シン、 ァラニ ン、 グルタミン、 ァスパラギン、 アルギニンまたはリジン等のアミノ酸類、 抗 菌剤、 ァスコルビン酸、 硫酸ナトリ ウムまたは亜硫酸水素ナト リウム等の抗酸 化剤、リ ン酸、、クェン酸、ホウ酸バッファ一、炭酸水素、 トリスー塩酸（Tris-Hcl) 溶液等の緩衝剤、 マンニトールやグリ シン等の充填剤、 エチレンジァミン四酢 酸 （EDTA) 等のキレート剤、 カフェイ ン、 ポリ ビニルピロリ ジン、 β —シク ロデキス トリ ンゃヒ ドロキシプロピル一 i3 —シクロデキス トリ ン等の錯化剤、 グルコース、 マンノースまたはデキス トリ ン等の増量剤、 単糖類、 二糖類等の 他の炭水化物、 着色剤、 香味剤、 希釈剤、 乳化剤やポリ ビニルピロリジン等の 親水ポリマー、 低分子量ポリペプチド、 塩形成対イオン、 塩化べンズアルコニ ゥム、 安息香酸、 サリチル酸、 チメロサール、. フエネチルアルコール、 メチル パラベン、 プロピルパラベン、 クロレキシジン、 ソルビン酸または過酸化水素 等の防腐剤、 グリセリ ン、 プロピレン · グリコールまたはポリエチレン ' ダリ ' コール等の溶媒、マンニトールまたはソルビトール等の当アルコール、懸濁剤、 ソルビタンエステル、 ポリソルビテ一卜 20やポリ ソルビテート 80等ポリ ソル ビテー卜、 トリ トン riton) 、 トロメタミン （tromethamine) 、 レシチンま たはコレステロール等の界面活性剤、 スク口一スゃソルビトール等の安定化増 強剤、 塩化ナト リウム、 塩化力リウムゃマンニトール 'ソルビト一ル等の弾性増 強剤、 輸送剤、 希釈剤、 賦形剤、 及び Z又は薬学上の補助剤。 これらの製剤用 の物質の添加量は、抗 DC-STAMP抗体の重量にたいして 0 . 0 1 〜 1 0 0倍、 特に 0 . 1 ~ 1 0倍添加するのが好ましレ 製剤中の好適な医薬組成物の組成は 当業者によって、 適用疾患、 適用投与経路などに応じて適宜決定することがで きる。
医薬組成物中の賦形剤や担体は液体でも固体でもよい。適当な賦形剤や担体 は注射用の水や生理食塩水、 人工脳脊髄液や非経口投与に通常用いられている 他の物質でもよい。中性の生理食塩水や血清アルブミンを含む生理食塩水を担 体に用いることもできる。医薬組成物には p H7.0—8.5 の Tris バッファ一や PH4.0-5.5 の酢酸バッファ一やそれらにソルビトールや他の化合物を含むこと もできる。本発明の医薬組成物には抗 DC-STAMP抗体を含む医薬組成物並びに、 抗 DC-STAMP 抗体及び少なく とも一つの骨疾患治療剤を含む医薬組成物を挙 げることができ、 本発明の医薬組成物は選択された組成で必要な純度で適当な 薬剤として、 凍結乾燥品あるいは液体として準備される。抗 DC-STAMP抗体を 含む医薬組成物並びに、 抗 DC-STAMP 抗体及び少なく とも一つの抗骨代謝異 常治療薬剤を含む医薬組成物はスクロースのような適当な賦形剤を用いた凍結 乾燥品として成型されることもできる。
本発明の医薬組成物は非経口投与用に調製することもできるし、 経口による 消化管吸収用に調製することもできる。製剤の組成及び濃度は投与方法によつ て決定することができるし、 本発明の医薬組成物に含まれる、 抗 DC-STAMP 抗体の DC-STAMPに対する親和性、 即ち、 DC-STAMPに対する解離定数 （K d値） に対し、 親和性が高い （K d値が低い） ほど、 ヒ トへの投与量を少なく 薬効を発揮することができるので、 この結果に基づいて本発明の医薬組成物の 人に対する投与量を決定することもできる。投与量は、 ヒ ト型抗 DC -STAMP抗 体をヒ トに対して投与する際には、 約 0 . l ~ 1 0 0 m g / k gを ：！〜 3 0 曰 間に 1回投与すればよい。
本発明の医薬組成物の形態としては、 点滴を含む注射剤、 坐剤、 経鼻剤、 舌 下剤、 経皮吸収剤などが挙げられる。
8 . 直接相互作用する物質の探索
本発明の他の一つの態様としては、 DC- STAMPの活動を抑制するような物質を 得ることを目的とした、 該蛋白質の立体構造をベースとしたドラッグデザイン の手法を含む。 このような手法は、 ラショナルドラッグデザイン法として知ら れており、 酵素活性などの機能や、 リガンド、 コファクタ一、 または D N Aへ の結合などを効率よく阻害もしくは活性化させるような化合物の探索に利用さ れている。 この例として、 すでに上市されている抗 H I V剤であるプロテア一 ゼの阻害剤がよく知られている。 本発明の DC- STAMPの三次元構造解析において も、 X線結晶解析や核磁気共鳴法といった一般的によく知られている手法が利 用できると考えられる。 さらに、 DC- STAMPの機能を抑制する物質の探索には、 コンピュータ一ドラッグデザイン （ C A D D ) を活用した設計も可能である。 この例としては、 関節リゥマチ治療の新たなゲノム新薬として期待されている A P - 1 の働きを阻害する低分子化合物 （国際特許出願公開 W O 9 9 / 5 8 5 1 5号） などが知られている。 このような方法により、 DC- STAMPに直接結合す るか、 あるいは DC- STAMPと他の因子との相互作用を阻害することにより、 DC - STAMPの機能を抑制するような物質を得ることができる。
さ らに、 他の一つの態様は、 本発明の DC- STAMPが会合するポリペプチド、 す なわち DC- STAMPのパ一トナー蛋白質に関する。 すなわち、 本発明は、 DC- STAMP の活性を調節するパートナー蛋白質のスクリーニング方法に関する。
このスクリ一ニング方法の一つの態様は、 DC-STAMPに被験蛋白質試料を接触 させ、 DC- STAMPに結合する蛋白質を選択する工程を含む。 このような方法とし ては、 例えば、 精製した DC- STAMPを用いて、 これに結合する蛋白質のァフィ二 ティ一精製を行う方法が挙げられる。 具体的な方法の一例を示せば、 DC- STAMP にヒスチジン 6個よりなる配列をァフィ二ティ一タグとして融合したものを作 製して、 これを細胞の抽出液 （予めニッケル一ァガ口一スカラムにチャージし て、 このカラムを素通り した画分） と 4 °Cで 1 2時間インキュベートし、 次い で、 この混合物に別途ニッケルーァガロース担体を加えて 4 °Cで 1時間ィンキ ュべ一卜する。ニッケルーァガロース担体を洗浄バッファ一で十分洗浄した後、 1 0 0 m Mィミダゾ一ルを加えることにより、 DC- STAMPと特異的に結合する細 胞抽出液中の蛋白質を溶出させて精製し、 この構造を決定する。 このようにし て、 DC-STAMPと直接結合する蛋白質、及び DC- STAMPとの結合活性は持たないが、 サブュニッ トとして DC- STAMPに直接結合する蛋白質と複合体を形成することに より間接的に DC- STAMPに結合する蛋白質が精製できる （実験医学別冊、 バイオ マニュアルシリーズ 5 「転写因子研究法」 2 1 5— 2 1 9 (羊土社刊））。
別の方法としては、 ファーウエスタンプロッ ト法 （実験医学別冊、 「新遺伝子 工学ハン ドブック」 7 6— 8 1 ( 土社刊）） や、 酵母や哺乳類動物細胞を用い たッ一ハイブリ ッ ドシステム法 （実験医学別冊、 「新遺伝子工学ハンドブック」 6 6 - 7 5 (羊土社刊）、 「チエツクメイ ト · マンマリアン · ッ一ハイプリ ッ ド システム」 （プロメガ社製）） によるクローニングも可能であるが、 これらの方 法に限定されない。
このようにして、 DC- STAMPと直接もしくは間接的に相互作用するパー トナー 蛋白質の c D N Aが得られれば、 DC- STAMPと該パ一トナー蛋白質との相互作用 を阻害する物質の機能的スク リーニングに利用することができる。具体的には、 例えば、 DC- STAMPとダルタチオン S — トランスフェラ一ゼとの融合蛋白質を調 製して、 抗グル夕チオン S — トランスフエラーゼ抗体で覆ったマイクロプレー トに結合させた後、 ピオチン化した該パートナー蛋白質をこの融合蛋白質と接 触させ、 該融合蛋白質との結合をス トレブトアビジン化アルカリホスファタ一 ゼで検出する。 ピオチン化した該パ一トナー蛋白質添加の際、 被験物質も添加 し、 融合蛋白質と該パ一卜ナ一蛋白質との結合を促進あるいは阻害する物質を 選択する'。 この方法では、 融合蛋白質に直接作用する物質または該パートナー 蛋白質に直接作用する物質が得られる。
融合蛋白質と該パートナー蛋白質との結合が間接的であり、 何らかの別の因 子を介しているような場合には、 例えば該因子を含むような細胞抽出液存在下 で、 同様に上記アツセィを行う。 この場合には、 該因子に対して作用するよう な物質も選択される可能性がある。
また、 得られたパートナー蛋白質が、 DC- STAMPの機能を促進する活性を有し ている場合には,、 既に記載した DC- STAMP遺伝子の発現べクタ一を応用した試験 方法に従って、 骨代謝異常治療剤、 例えば、 骨粗鬆症の治療剤として有用な候 補物質のスクリーニングを行うことができる。 また、 得られたパートナー蛋白 質が、 DC- STAMPの機能を抑制す.る活性を有している場合には、 このような抑制 因子をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドは、 骨代謝異常 の遺伝子治療に用いることができる。
そのようなポリヌクレオチドは、 例えば同定された阻害因子のアミノ酸配列 を解析し、 該アミノ酸配列をコ一ドするヌクレオチド配列からなるオリゴヌク レオチドプローブを合成して c D N Aライブラリ一やゲノムライプラリーのス クリーニングを行う ことにより取得できる。 また、 DC- STAMPの機能の阻害活性 を有するぺプチドが、 ランダムに合成された人エペプチドライブラリ一由来で ある場合は、 該ペプチドのアミノ酸配列をコ一ドするヌクレオチド配列からな る D N Aを化学合成する。
遺伝子治療においては、 そのようにして得られた阻害因子をコードする遺伝 子を、 例えばウィルスベクタ一に組み込んで、 該組換えウィルスベクタ一を有 するウィルス （無毒化されたもの） を患者に感染させる。 患者体内では抗骨破 壊因子が産生され、 破骨細胞の分化抑制.機能を有するので、 骨代謝異常の治療 が可能となる。
遺伝子治療剤を細胞内に導入する方法としては、 ウィルスベクタ一を利用し た遺伝子導入方法、 あるいは非ウィルス性の遗伝子導入方法 （日経サイェン ス， 1 994年 4月号， 20- 45頁、 実験医学増刊， 1 2 ( 1 5 ) ( 1 994)、 実験医学別冊 「遣伝子 治療の基礎技術」 ，羊土社 （ 1996)) のいずれの方法も適用することができる。 ウィルスベクターによる遺伝子導入方法としては、 例えばレトロウイルス、 アデノウイルス、 アデノ関連ウィルス、 ヘルぺスウィルス、 ワクシニアウィル ス、 ボックスウィルス、 ポリオウイルス、 シンビスウィルス等の DNAウィル スまたは R N Aウィルスに、 DC-STAMPの阻害因子あるいはその変異体をコード する D N Aを組み込んで導入する方法が挙げられる。 このうち、 レトロウィル ス、 アデノウイルス、 アデノ関連ウィルス、 ワクシニアウィルスを用いた方法 が、 特に好ましい。 非ウィルス性の遺伝子導入方法としては、 発現プラスミ ド を直接筋肉内に投与する方法 （DNAワクチン法）、 リボソーム法、 リボフェク チン法、 マイクロインジェクショ ン法、 リ ン酸カルシウム法、 エレク トロボレ ーシヨ ン法等が挙げられ、 特に DNAワクチン法、 リボソーム法が好ましい。 また遺伝子治療剤を実際に医薬として作用させるには、 D N Aを直接体内に 導入するイ ンビポ （invivo) 法及びヒ 卜からある種の細胞を取り出し体外で D NAを該細胞に導入し、 その細胞を体内に戻すェクスビポ （exvivo) 法がある (日経サイエンス， 1994年 4月号， 20-45頁、 月刊薬事， 36 (1) , 23-48 ( 1994)、 実験 医学増刊， 12 (15) (1994))。
例えば、 該遺伝子治療剤がインビポ法により投与される場合は、 疾患、 症状 等に応じ、 静脈、 動脈、 皮下、 皮内、 筋肉内等、 適当な投与経路により投与さ れる。 またインビポ法により投与する場合は、 該遺伝子治療剤は一般的には注 射剤等とされるが、 必要に応じて慣用の担体を加えても、よい。 また、 リポソ一 ムまたは膜融合リボソーム （センダイウィルス—リポ.ゾーム等） の形態にした 場合は、 懸濁剤、 凍結剤、 遠心分離濃縮凍結剤等のリボソーム製剤とすること ができる。
配列表の配列番号 1に示されるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配 列または該配列の部分配列に相補的なヌクレオチド配列は、 いわゆるアンチセ ンス治療に用いることができる。 アンチセンス分子は、 配列表の配列番号 1、 3及び 5に示されるヌクレオチド配列から選択されるヌクレオチド配列の一部 に相補的な、 通常 1 5乃至 3 0 me rからなる DNA、 もしくはそのホスホロ チォエート、 メチルホスホネ一トまたはモルフォリ ノ誘導体などの安定な DN A誘導体、 2 ' —〇—アルキル RN Aなどの安定な RN A誘導体として用いら れ得る。 そのようなアンチセンス分子を、 微量注入、 リボソームカプセル化に より、あるいはアンチセンス配列を有するベクターを利用して発現させるなど、 本発明の技術分野において周知の方法で、 細胞に導入することができる。 この ようなアンチセンス療法は、 配列表の配列番号 1に示されるヌクレオチド配列 がコードする蛋白質の活性が増加しすぎることによって引き起こされる病気の 治療に有用である。 . また、 二本鎖の短鎖 RN A (siRNA) を用いる方法を挙げることもできる （「ジ —ンズ · アンド ' デヴエロップメンッ （Genes and Development s)」）、 2 0 0 1 年 1月 1 5 日、 第 1 5巻、 第 2号、 p. 1 8 8— 2 0 0 ) 。 例えば、 DC- STAMP 遺伝子に対する siRNAを作製し、文献記載の方法に従って導入することによって、 DC-STAMPの過剰発現によって引き起こされる骨代謝異常に起因する疾患の治療 剤とすることができる。
上記アンチセンスオリゴヌクレオチド及び 又は siRNAを含む医薬として有 用な組成物は、 医薬として許容できる担体の混合などの公知の方法によって製 造され得る。 アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む医薬の担体と製造方法の 例は、 Applied Ant i sense Oligonucleotide Techn 1 ogy ( 1998 Wiley— Liss、 Inc. ) に記載されている。 アンチセンスオリゴヌクレオチド及び/又は siRNA を含む製剤は、 そ 自体あるいは適宜の薬理学的に許容される、 賦形剤、 希釈 剤等と混合し、 錠剤、 カプセル剤、 顆粒剤、 散剤若しくはシロップ剤等により 経口的に、 または、 注射剤、 坐剤、 貼付剤、 若しくは、 外用剤等により非経口 的に投与することができる。 これらの製剤は、 賦形剤 （例えば、 乳糖、 白糖、 葡萄糖、 マンニトール、 ソルビトールのような糖誘導体 ； トウモロコシデンプ ン、 バレイショデンプン、 α澱粉、 デキス トリ ンのような澱粉誘導体 ； 結晶セ ルロースのようなセルロース誘導体 ； アラビアゴム ； デキス トラン ； プルラン のような有機系賦形剤 ； 及び、 軽質無水珪酸、 合成珪酸アルミニウム、 珪酸カ ルシゥム、 メタ珪酸アルミン酸マグネシウムのような珪酸塩誘導体 ； 燐酸水素 カルシウムのような燐酸塩 ； 炭酸カルシウムのような炭酸塩 ； 硫酸カルシウム のような.硫酸塩等の無機系賦形剤を挙げることができる。）、 滑沢剤 （例えば、 ステアリ ン酸、 ステアリ ン酸カルシウム、 ステアリ ン酸マグネシウムのような ステアリ ン酸金属塩 ； タルク ； コロイ ドシリカ ； ビーズワックス、 ゲイ蠟のよ うなワックス類 ； 硼酸 ； アジピン酸 ； 硫酸ナトリウムのような硫酸塩 ； グリコ ール ； フマル酸 ； 安息香酸ナトリウム ； D Lロイシン ； ラウリル硫酸ナトリ ウ ム、 ラウリル硫酸マグネシウムのようなラウリル硫酸塩 ； 無水珪酸、 珪酸水和 物のような珪酸類；及び、 上記澱粉誘導体を挙げることができる。）、 結合剤 （例 えば、ヒ ドロキシプロピルセルロース、ヒ ドロキシプロピルメチルセルロース、 ポリ ピニルピロリ ドン、 マクロゴール、 及び、 前記賦形剤と同様の化合物を挙 げることができる。）、 崩壊剤 （例えば、 低置換度ヒ ドロキシプロピルセル口一 ス、 カルポキシメチルセルロース、 カルボキシメチルセルロースカルシウム、 内部架橋カルボキシメチルセルロースナトリウムのようなセルロース誘導体 ； カルポキシメチルスターチ、 カルポキシメチルスターチナトリウム、 架橋ポリ ビニルピロリ ドンのような化学修飾されたデンプン · セルロース類を挙げるこ とができる。）、 乳化剤 （例えば、 ベントナイ ト、 ビ一ガムのようなコロイ ド性 粘土 ； 水酸化マグネシウム、 水酸化アルミニウムのような金属水酸化物 ； ラウ リル硫酸ナトリ ウム、 ステアリ ン酸カルシウムのような陰イオン界面活性剤 ； 塩化ベンザルコニゥムのような陽イオン界面活性剤 ； 及び、 ポリォキシェチレ ンアルキルエーテル、 ポリオキシエチレンソルビ夕ン脂肪酸エステル、 ショ糖 脂肪酸エステルのような非イオン界面活性剤を挙げることができる。）、 安定剤
(メチルパラベン、 プロピルパラベンのようなパラォキシ安息香酸エステル 類 ； クロロブタノ一ル、 ベンジルアルコール、 フエニルエチルアルコールのよ うなアルコール類 ； 塩化ベンザルコニゥム ； フエノ一ル、 クレゾールのような フェノール類 ； チメ口サール ； デヒ ド口酢酸 ； 及び、 ソルビン酸を挙げること ができる。）、 矯味矯臭剤 （例えば、 通常使用される、 甘味料、 酸味料、 香料等 を挙げることができる。）、希釈剤等の添加剤を用いて周知の方法で製造される。 これらの医薬を患者へ導入する方法については、 上記に加えてコロイ ド分散 系を用いることができる。 コロイ ド分散系は化合物の生体内の安定性を高める 効果や、 特定の臓器'、 組織または細胞へ化合物を効率的に輸送する効果が期待 される。 コロイ ド分散系は、 通常用いられるものであれば限定しないが、 高分 子複合体、 ナノカプセル、 ミクロスフエア、 ビーズ、 及び水中油系の乳化剤、 ミセル、 混合ミセル及びリボソームを包含する脂質をべ一スとする分散系を挙 げる事ができ、 好ましくは、 特定の臓器、 組織または細胞へ化合物を効率的に 輸送する効果のある、 複数のリボソーム、 人工膜の小胞である （Mannino et a 1. , Biotechniques, (1988) 6, 682 ;Blume and Cevc, Biochem. et Biophys. Acta, (1990) 1029, 91 ;Lappalainen et al. , Antiviral Res. , (1994) 23, 119 ;Chon n and Cul 1 is, Current Op. Biotech. , (1995) 6， 698)。
0. 2 — 0. 4 mのサイズ範囲をとる単膜リボソームは、 巨大分子を含有 する水性緩衝液のかなりの割合を被包化し得、 化合物はこの水性内膜に被胞化 され、 生物学的に活性な形態で脳細胞へ輸送される （Fral y et al. , Trends Biochem. Sci., (1981) 6, 77 )。 リボソームの組成は、 通常、 脂質、 特にリ ン脂 質、 とりわけ相転移温度の高いリン脂質を 1種またはそれ以上のステロイ ド、 特にコレステロールと通常複合したものである。 リポソーム生産に有用な脂質 の例は、 ホスファチジルグリセロール、 ホスファチジルコリ ン、 ホスファチジ ルセリ ン、 スフイ ンゴ脂質、 ホスファチジルェタノ一ルァミン、 セレブロシド 及びガングリオシドのようなホスファチジル化合物を包含する。 特に有用なの はジァシルホスファチジルグリセロールであり、 ここでは脂質部分が 1 4— 1 8の炭素原子、 特に 1 6 — 1 8の炭素原子を含有し、 飽和している （ 1 4— 1 8の炭素原子鎖の内部に二重結合を欠いている）。 代表的なリン脂質は、 ホスフ ァチジルコリ ン、 ジパルミ トイルホスファチジルコリ ン及びジステアロイルホ スファチジルコリ ンを包含する。
リボソームを包含するコロイ ド分散系の標的化は、 受動的または能動的のい ずれかであってもよい。 受動的な標的化は、 洞様毛細血管を含有する臓器の網 内系細胞へ分布しょうとするリポソ一ム本来の傾向を利用することによって達 成される。 一方、 能動的な標的化は、 例えば、 ウィルスの蛋白質コート （Mori shita et al. , Proc. Nat 1. Acad. Sci. USA, (1993) 90, 8474)、 モノクローナル 抗体 （またはその適切な結合部分）、 糖、 糖脂質または蛋白質 （またはその適切 なオリゴペプチドフラグメント） のような特定のリガンドをリボソームへ結合 させること、 または天然に存在する局在部位以外の臓器及び細胞型への分布を 達成するためにリボソームの組成を変えることによってリボソームを修飾する 手法等を挙げる事ができる。 標的化されたコロイ ド分散系の表面は様々なやり 方で修飾され得る。 リボソームで標的したデリバリーシステムでは、 脂質二重 層との緊密な会合において標的リガンドを維持するために、 リポソ一ムの脂質 二重層へ脂質基が取込まれ得る。 脂質鎖を標的リガンドと結びつけるために様 々な連結基が使用され得る。 本発明のオリゴヌク レオチドのデリバリ一が所望 される細胞の上に支配的に見出される特定の細胞表面分子に結合する標的リガ ンドは、 例えば、 （ 1 ) デリバリーが所望される細胞によって支配的に発現され る特定の細胞受容体と結合している、 ホルモン、 成長因子またはその適切なォ リゴペプチドフラ,グメント、 または （.2 ) 標的細胞上で支配的に見出される抗 原性ェピトープと特異的に結合する、 ポリクローナルまたはモノクロ一ナル抗 体、 またはその適切なフラグメント （例えば、 F a b ； F ( a b ') 2 )、 で あり得る。 2 種またはそれ以上の生物活性剤は、 単一のリボソーム内部で複合 し、 投与することもできる。 内容物の細胞内安定性及び/又は標的化を高める 薬剤をコロイ ド分散系へ追加することも可能である。
その使用量は症状、 年齢等により異なるが、 経口投与の場合には、 1回当り 下限 l mg (好適には、 3 0 mg)、 上限 2 0 0 0 mg (好適には、 1 5 0 0 nig) を、 注射の場合には、 1 回当り下限 0. l mg (好適には、 5 mg)、 上限 1 0 0 0 mg (好適には、 5 0 0 mg) を皮下注射、 筋肉注射または静脈注射によって投与す ることができる。 ' 以下、 実施例を示してこの発明を詳細かつ具体的に説明するが、 本発明はこれ らの実施例に限定されるものではない。 なお、 下記実施例において遺伝子操作 に関する各操作は特に明示がない限り、「モレキュラークロ一ニング（Molecular Cloning ) 」 （ Sambrook, J. , Fritsch, E.F. 及 び Maniatis, Τ· 著 ， Cold SpringHarbor Laboratory Press より 1989年に発刊） に記載の方法により行う か、 又は、 市販の試薬やキッ トを用いる場合には市販品の指示書に従って使用 した。 ·
[参考例 1] RAW- D細胞おょぴ RAW- N細胞の樹立
a) 限界希釈培養法による RAW- D細胞および RAW-N細胞の取得
マウス単球由来細胞株 RAW264.7 を可溶性 RANKLで刺激すると、酒石酸耐性酸 ホスファタ一ゼ （以下 「TRAP」 という） やカテブシン Kなどの破骨細胞分化マ 一力一の遺伝子発現が強く誘導されることが知られている （Hsu et aし， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1999) 96, 3540-3545)。 従って、 RAW264.7細胞は RANKL で刺激することによ り、 破骨細胞へと分化誘導され得ると考えられている。 そ こで、 RAW264.7細胞の親株である RAW264細胞から、 ' RANKL および TNF- αに対 する感受性がより強い、 すなわちこれらの刺激により破骨細胞に分化しやすい サブク ロー ン細胞の取得を試みた （ Watanabe et al.， J. Endocrinol. , (2004) 180, 193- 201 )。なお、 RAW264細胞は European Collection of Cell Culture から購入することができる（Catalog No. 85062803)。 RAW264細胞を 10 ゥシ胎 児血清を含む a- MEM培地を用いて、 常法に従い'限界希釈して 96 穴プレートに 100 ^ 1播種した。 10〜14 日間培養し、 形成されたコロニーを採取した。 各コロ ニーについて 10%ゥシ胎児血清を含む α- MEM培地で 4.5X104細胞/ ml に調製し たものを 96穴プレートに 150 1/穴まき、 ヒ ト RANKL (ペブロテツク社製） を 終濃度 20 ng/ml およびヒ ト TNF-α (ペブロテ ク社製） を終濃度 1 ng/ml と なるように添加した。 3 日間培養した後、 Leukocyte Acid Phosphatase ki t (シ ダマ社製） を用いて、 添付のプロ トコ一ルに従い TRAP 染色を行い、 TRAP 陽性 多核破骨細胞形成の有無を確認した。 この一連の限界希釈培養法によるク口一 ニング操作は、 それぞれのコロニーにつき 2 回繰り返した。
その結果、 RANKLおよび TNF-a刺激により効率よく破骨細胞に分化する RAW-D 細胞、並びに、 RANKLおよび TNF- α刺激により全く破骨細胞に分化しない RAW- Ν 細胞を取得した。
b) TRAP染色による RAW- D細胞及び RAW- N細胞の破骨細胞分化指向性の検討 RAW- D細胞および RAW- N細胞が、 RANKLおよび TNF-α といった破骨細胞誘導 作用を持つ物質で刺激した時にどのように反応するかを調べた。 RAW- D、 RAW-N および RAW264を、 10%ゥシ胎児血清を含む a -MEM培地で 4.5 X 104細胞/ m 1 に調 製した後 96穴プレートに 150 μ 1/穴まき、 ヒ ト TNF-α (ペブロテツク社製） を 終濃度 1 ng/ml、 ヒ ト RAML (ぺプロテツク社製） を終濃度 10、 20、 40、 80 ng/ml とな る よ う にそれぞれ添加 した。 3 日 間培養 し た後、 Leukocyte Acid Phosphatase kit (シグマ社製） を用いて、 添付のプロ トコ一ルに従い TRAP染 色を行い、 形成された TRAP陽性多核破骨細胞数を計測した。 その結果、 RAW- D では添加した RANKLの濃度依存的に TRAP陽性多核破骨細胞が形成された（図 0。 一方、 RAW- Nおよび親株細胞である RAW264においては、 RANKL添加による TRAP 陽性破骨細胞形成は認められなかった。
[実施例 1 ] RAW-Dおよび RAW - Nにおけるマウス DC-STAMP の mRNA発現 （ノー ザンブロッ ト解析）
a) 全 RNAの抽出
RAW- Dあるいは RAW-Nを 10 ゥシ胎児血清を含む α- MEM培地で 7X104細胞/ ml に調製したものを 24穴プレートに 500 1/穴まき、 ヒ ト RANKL (ペブロテック 社製） を終濃度 20 ng/ml、 ヒ ト TNF- （ペブロテック社製） を終濃度 2 ng/ml およびマウス MIP- 1 α (ペブロテック社製） を終濃度 1 ng/ml となるように加 え、 3 日間培養した。 またヒ ト RANKL (ペブロテック社製）、 ヒ ト TNF- α;および マウス MIP-1 α未添加の培養も同様に行つた。
培養終了後、 全 RNA抽出用試薬 （TRIZol試薬 ： インビトロジェン社製） を添 付のプロ トコールに従って用いる ことによ り、 それぞれの条 ί牛で培養した RAW- Dおよび RAW-N より全 RNAを抽出した。回収した全 RNAは- 80°Cに保存した。 b) 全 RNAの電気泳動おょぴブロッテイ ング ' 回収した全 MAを RNA試料緩衝液 （1XM0PS緩衝液 （ 1 X MOPS緩衝液は 20 mM
MOPS, 8 mM 酢酸ナトリ ウム、 1 mM EDTAを含む）、 50¾ ホルムアミ ド、 18 g/nil ブロモフエノールブル一、 5. Π ホルムアルデヒ ド、 5% グリセロール） で 0.5 g/μ 1 に調製し、 65°C、 15 分間保温した後、 氷上で 5 分間急冷した。 この試料液 20 / 1 を、ホルムアルデヒ ドを含む電気泳動用 ァガロースゲル（1 XM0PS 緩衝液、 1.2% ァガロース （シグマ社製）、 6¾ ホルムアルデヒ ド） の ひとつのゥエルへ注入し、 電気泳動した。 電気泳動は、 1XM0PS 緩衝液の入つ たサブマリ ン電気泳動層中、 100Vで約 3時間通電することにより行った。
電気泳動終了後、 ァガ口一スゲル中の RNAをキヤビラリ一トランスファ一法 (Maniat is, T. et al.， i n 'Molecular Cloning A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, NY, (1982)) に従ってナイロンメンブレン （ハイ ポンド N十、 アマシャム · フアルマシア社製） にー晚かけて転写した （転写用 溶液は 20XSSC を用いた）。 このメンブレンを 2XSSCで 5分間洗浄し、 風乾さ せ、 クロスリ ンク用紫外線照射装置 （St ratal inker 2400、 ス トラタジーン社製） で紫外線を照射 （ 300 mJ/cm2) して RNAを固定した。 C) プローブの調製
マウス DC- STAMPAT7 cDNA (配列表の配列番号 ： 5、 GenBankァクセッショ ン 番号： AB109561) のヌクレオチド番号 457乃至 1208 に示されるヌクレオチド配 列が、 pGEM-T Easyベクター （プロメガ社製） の TAクローニング部位に挿入さ れているプラスミ ド DNA を、 TAクローニング部位近傍に存在する Ncol 部位を 利用して Ncol (宝酒造） 消化により直鎖状 MAにした。 DIG RNA labeling mix (ロッシュ . ダイァグノスティ クス社製） および SP6 RNA polymerase (ロッシ ュ · ダイァグノステイ クス社製） を添付のプロ トコールに従って用いることに より、 DIG (ジゴキシゲニン） で標識されたアンチセンス RNAプローブを調製し た。 このプロ一ブ調製液に 20ユニッ ト RNase- free DNase I (ロッシュ ' ダイ ァグノステイ クス社製） を添加し、 铸型 DNAを分解した。 なお調製した RNAプ ロープは、 配列表の配列番号 3 (マウス DC-STAMP cDNA) のヌクレオチド番号 457 乃至 1078 および 1247 乃至 1376 の配列に相当するため、 DC- STAMP および DC-STAMP ΔΤ7の両方の mRNAを検出可能である。
d) ハイブリダイゼ一ショ ン
b)で作成したメンブレンを 6 mlのハイブリダィゼーショ ン溶液（DIG Easy Hyb Granules を添付プロ トコ一ルに従つて再蒸留水に溶解したもの ： ロッシュ ' ダ ィァグノステイ クス社製） 中に入れて 65°Cで 15 分インキュベーショ ン （プレ ハイプリダイゼ一シヨ ン） した後、 DIG標識 RNAプローブを含む 6 ml のハイブ リダィゼ一シヨ ン溶液中で 65°C、 16時間インキュベートした。 その後、 メンブ レンを 2XSS (：、 0.1¾ SDS を含む溶液中、 室温で 5 分間、 1 回洗浄し、 さらに 0.5XSSC, 0.1¾ SDS を含む溶液中、 65°Cで 30分間、 2回洗浄した。 次に.メン ブレンを Blocking溶液 （Blocking reagent を添付プロ トコ一ルに従ってマレ イン酸バッファーに溶解したもの ： ロッシュ · ダイァグノステイ クス社製） で 30 分処理した後、 アルガリホスファタ一ゼ標識抗ジゴキシゲニン Fab 断片
(0.075 units/ml) (ロシュ · ダイァグノステイクス社製） を含む Blocking溶 液で 30分処理した。その後、洗浄パッファ一（5 mMマレイン酸パッファ一 pH7.5、 150 niM NaCl、 0.3¾ Tween 20) で 15分間、 3回洗浄し、 発光基質である CDP- Star
(ロシュ ■ ダイァグノステイ クス社製） を添加し、 ルミノ · イメージアナライ ザ一 （富士写真フィルム社製、 LAS- 1000 plus) による解析を行った。 その結果、 RAW-D では、 RANKL および TNF- αを添加しない場合にはマウス DC-STAMPはほとんど発現しないが、 RANKLおよび TNF- αを添加すると、 マウス DC-STAMP の発現量が著明に上昇することが明らかとなった （図 2)。 マウス DC-STAMPの発現量は、 さらに MIP-l Q!を添加しても増加しなかった。
一方、 RAW-N では、 RANKL および TNF- αの添加の有無に関わらず、 DC- STAMP の発現はほとんど認め られなかった。 なお、 コ ン ト ロールと してマウス Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)の発現量を同様に求めた。
[実施例 2] RAW- Dにおけるマウス DC-STAMPの mRNA発現 （RT- PCR解析） RAW- D を 10%ゥシ胎児血清を含む α- MEM培地で 7X104細胞/ ml に調製したも のを 24穴プレートに 500 ^ 1/穴まき、 ヒ ト RANKL (ペブロテック社製） を終濃 度 20 ng/ml、 ヒ ト TNF- α (ペブロテック社製） を終濃度 2 ng/ml およびマウス MIP-1 (ぺプロテック社製） を終濃度 1 ng/ml となるように加え、 0、 4、 8、 16、 32、 48、 72時間培養した。
次いで、 全 RNA抽出用試薬 （TRIZol試薬 ： インビトロジェン社製） を添付の プロ トコ一ルに従って用いることにより、 それぞれの培養時点における RAW-D より全 RNA を抽出した。 回収した全 RNA は使用時まで- 80X に保存した。 1 g 全 RNAおよび 1 μ 1 ol igo(dT) 18プライマー（ 0.5 g/ 1 )を H20で 11 1 にし、 70°Cで 10 分間加熱した後、 4°Cで保温した。 この溶液に 4 1 5Xlst Strand Buffer (インビトロジェン社製）、 1 [i 1 lOmM dNTPs、 In 1,0.1M di thiothrei toK 1 ^ 1 Superscript II逆転写酵素 （ 200U/ し インビトロジェン社製）、 1 ^ 1 H20 を加えて全量を 20 ;ii 1 とし、 42°Cで 1時間反応させた後、 70°Cで 10分間加熱し、 4°Cで保温した。 .
このようにして作製した一本鎖 cDNA を以下のプライマ一の組み合わせで増幅 した。
PCR条件 ：
マウス DC-STAMPおよびマウス DC- STAMP ΔΤ7増幅用プライマ一 ：
5' -aaaacccttg ggc tgt tc 11-3 ' (mDC-STAMP- F： 配列表の配列番号 7) および
5' -cttcgcatgc aggtattcaa-3' (mDC- STAMP-R： 配列表の配列番号 8)、 マウスカテブシン K増幅用ブラ rマ—
5 ' -gagggccaac tcaagaagaa-3' (mcatK-F： 配列表の配列番号 9)
および
5 -gccgtggcgt tatacataca-3 (mcatK-R： 配列表の配列番号 10)、
マウス TRAP増幅用プライマ一 ：
5 -cagctgtcct ggc t caaaa-3 ' (mTRAP-F： 配列表の配列番号 11)
および
5 -acatagccca caccgt tctc-3 (mTRAP-R： 配列表の配列番号 12)、
マウス GAPDH増幅用プライマ一
5 ' -aaacccatca ccatcttcca-3' (mGAPDH-F： 配列表の配列番号 13)
および
5 -gtggt tcaca cccatcacaa-3 (mGAPDH-R： 配列表の配列番号 14)。 サ一マルサイクラ一 （ジーンアンプ ： PCR システム 9700、 （株） パーキンエルマ 一ジャパン · アプライ ドバイオシステムズ事業部製） を使用して以下の条件で PCRを行った。 なお反応にあたっては、 Platinum Taq DNAポリ メラーゼ （イ ン ビトロジェン社製） を使用した。 まず各 8 pmol のプライマ一、 20 ng 一本鎖 cDNA、 0.5 1の lOXReactionノ ッファー、 0.2 1の 50 mM MgClい 0.4μ 1 の 各 2.5 mM dNTP、 0.05 1 の 5 units/^ 1 Taq DNAポリメラーゼを加え、 蒸留水 で 5 1 として反応液を調製した。 この反応液を、 ' 94°C2分加熱し、 94°Cで 0.5 分、 65°Cで 1分、 72°Cで 1分の温度サイクルを 30回繰り返した後 7 C 10分加 熱し、 4°Cで保温した。 なお、 このときの反応液全量を 2.0 ァガロースゲルで 電気泳動した。 ·
DC-STAMP遺伝子の発現は RAML、 TNF- αおよび ΜΙΡ- 1 の添加から、 8時間後 より上昇し始め、 発現量の上昇は 72時間後まで持続した （図 3)。 第 3ェクソ ンが短いスプライシングバリアントである DC- STAMPAT7も、 RANKL、 TNF- αお よび ΜΙΡ- 1 添加から 16時間後より発現亢進が認められた。 また、 破骨細胞の マーカ一分子として知られているカテブシン Κおよび TRAP遺伝子も、 16時間 後より発現亢進が確認された。 図 3において、 上側の数値は、 RANKL、 TNF -ひお よび MIP- 1 α添加後の経過時間数を、 また、 右側にはそれぞれの遺伝子につい て PCR反応により増幅された産物のサイズを塩基対で示している。
[実施例 3] マウス骨髄由来初代培養細胞におけるマウス DC- STAMP の mRNA 発現 （RT-PCR解析）
マウス骨髄由来初代培養細胞を、 活性型ビタミン D3 存在下で培養すると、 TRAP 陽性多核破骨細胞が多数出現する （Takahashi et al.， Endocrinology, (1988) 122, 1373-1382) 0
6 週齢雄性 DDY マウスをエーテル麻酔下頸椎脱臼にて安楽死させ、 大腿骨お よび脛骨を摘出した。 軟組織を除去した後、 大腿骨あるいは脛骨の両端を切り 落とし、 25ゲージの注射針のついた注射筒を用いて血清を含まない α- MEM培地 を骨髄中に注入し、 骨髄細胞を採取した。 細胞数を計測後、 15%ゥシ胎児血清 を含む a -MEM培地で 2 X106細胞/ ml に調製したものを 24穴プレートに 500 1/穴まき、 活性型ビタミン D3 (バイオモル社製） を終濃度 1X10—8 M となるよ うに加え、 1、 3、 5、 6 日間培養した。
次いで、 全 RNA抽出用試薬 （TRIZol試薬 ： イ ンビトロジェン社製） を添付の プロ トコ一ルに従って用いることにより、 それぞれの培養時点における細胞よ り全 RNAを抽出した。 回収した全 MAは使用時まで- 80°Cに保存した。
RT-PCR反応は、 RNA LA PCR ki t (AMY) Ver 1.1 (夕カラバイオケミカルズ社製） を使用して行った。 まず、 2 1 25mM MgClい 1 1 10XRNA PCR Buffer, 1 n 1 dNTP Mix (各 10mM)、 0.25/^ 1 RNase Inh i b i t or (40 U/ 1)、 0.5 ^ 1 逆転写酵素 （5 U/ μ 1)、 0.5^ 1 01 igo dT-Adaptor primer (2.5 pmol/ t 1) , 1 g全 RNA をカロえ、 RNase Free dH20で 10 1 として反応液を調製した。 この反応液を、 50°Cで 25 分間加熱した後、 99°Cで 5分間加熱し、 4°Cにて保温した。 この一本鎖 cDNAを 実施例 2 に記載のプライマーの組み合わせで増幅した。
サ一マルサイクラ一 （ジーンアンプ PCRシステム 9700) を使用して以下の条件 で RT-PCRを行った。 cDNAを含む反応液 5 i 1 に、 1 , 5 1 25mM MgClい 2^ 1 10 XLA PCR Buffer II (Mgn free) , 0.125 n 1 Takara LA Taq (5 U/^ 1)、 プラ イマ一セッ ト （終濃度各 1 μ Μ) を加え、 再蒸留水で 25 1 として、 反応液を調 製した。 この反応液を 94^で 2分間加熱した後、 94°Cで 30秒、 60°Cで 30秒、 °Cで 30秒の温度サイクルを 25回繰り返し、 4でで保温した。 その後、 反応液 9 μ 1分を 2.0 %ァガロースゲルに電気泳動した。
その結果、 DC- STAMP遺伝子は、 活性型ビタミン ]) 3添加後 1 日目ではわずか に発現しているだけだったが、 単核の破骨細胞前駆細胞が形成される 3 日目で は顕著に発現し、 多核化が盛んに起こる 5、 6 日 目でも顕著な発現が維持された (図 4)。
また、 DC- STAMPAT7 は DC- STAMP よりも発現量は低いものの、 発現量の変化 は DC-STAMPと同様の時間経過を示した。 図 4において、 上側の数値は、 活性型 ビタミン D3添加後の経過日数を示している。
[実施例 4] ゥサギ抗マウス DC- STAMPポリクローナル抗体の作製
マウス DC-STAMP アミノ酸配列 （配列表の配列番号 ： 4、 GenBankァクセヅシ ヨ ン番号 ： AB109560) において、 第 6番目から第 7番目の膜貫通ドメインの間 に位置する、 アミノ酸番号 330乃至 343に示されるアミノ酸配列からなる.ぺプ チドを元に、 マウス DC- STAMPタンパク質の部分ペプチドの作製を試みた。 前述 配列の N末端にシスティン残基を 1つ付加した部分べプチド ：
Cys Ser Leu Pro Gly Leu Glu Val His Leu Lys Leu Arg Gly Glu (配列表の配 列番号 ： 15)
を合成した。 このペプチ ドを抗原刺激性キャ リ ア一タ ンパク質である KLH (Keyhole limpet hemocyanin) に、 MBS (マレイミ ドベンゾィルォキシコハク 酸イミ ド） 法によりコンジュゲートした後ゥサギに免疫し、 常法に従いゥサギ 抗血清を得た。 この抗血清を、 免疫に使用した部分ペプチドを練り込んだぺプ チ ドアフィ ニティ 一カ ラムを用いて精製する こ とによ り、 ゥサギ抗マウス DC - STAMPポリクロ一ナル抗体を得た。 なお、 DC- STAMP ΔΤ7 (GenBankァクセッ シヨ ン番号 AB109561) もこのペプチド配列を持っため、 本抗体は DC- STAMPお よび DC-STAMP ΔΤ7の両方に結合すると考えられた。 さらに、 このべプチド配列 を、 ヒ ト DC-STAMPアミノ酸配列 （配列表の配列番号 ： 2、 GenBank ァクセッシ ヨ ン番号： NM_030788) におけるアミノ酸番号 330乃至 343に示される配列と比 較したところ、 334番目の Leu (マウス） 力 Phe (ヒ ト） に、 341番目の Arg (マ ウス） が His (ヒ ト） に変化しているのみであつたため、 本抗体がヒ ト DC-STAMP にも結合する可能性が高いと考えられた。 [実施例 5 ] 新生仔マウス脛骨由来破骨細胞における免疫染色 a) · 新生仔マウス脛骨由来破骨細胞の採取
1 日齢 DDY マウスより脛骨を摘出し、 '軟組織を除去した後、 15 %ゥシ胎児血 清を含む α -MEM培地中にて解剖用ハサミを用いてミンチ状にした。 その後やや 激しく ピベッティ ングすることにより細胞をほぐして懸濁させ、 チェンパース ライ ド （ナルジェ · ヌンクインタ一ナショナル社製） に播種した。 一時間培養 後、 スライ ドに接着した多核細胞を破骨細胞として使用した。
b) 免疫染色による DC- STAMPタンパク質の発現
a) により得られた破骨細胞を、 4 %パラホルムアルデヒ ド溶液を用いて、 室 温にて 20分間固定反応を行い、 リ ン酸緩衝液（PH7. 4)により 4回洗浄後、 3 %ャ ギ血清を含むリ ン酸緩衝液 （PH7. 4) により室温で 30分間ブロッキング反応を 行った。 ブロッキング液を除いた後、 実施例 4において作製したゥサギ抗マウ ス DC- STAMP ポリク口一ナル抗体 10 g/m l を含むリ ン酸緩衝液（1 %ゥマ血清を 含む）を添加し、率温で 30分間反応させた。 また、 免疫されていないゥサギ I gG 抗体（ダコ ·ジャパン社製） を陰性対照として用意し、 同様の操作を行った。 1 % ゥマ血清を含むリ ン酸緩衝液で 4回洗浄し、 ピオチン化ャギ抗ゥサギ IgG抗体 (ベクタ一 · ラポラ トリーズ社製） を二次抗体として用い、 室温で 30分間細胞 と反応させた。 リ ン酸緩衝液で 4回洗浄後、 ABC- APキッ ト （ベクター ' ラポラ トリーズ社製） を添付のプロ トコールに従って用いることにより、 発色反応を 行つた。 この結果、 抗 DC- STAMP抗体で反応させた破骨細胞において強い染色が 認められたことから、新生仔マウス脛骨由来破骨細胞において DC-STAMPが発現 していることが明らかとなった。 なお、 陰性対照のコントロール抗体を用いた 場合では、 破骨細胞は全く染色されなかった。
[実施例 6] 新生仔マウス下顎骨組織における免疫染色
a) 新生仔マウス下顎骨組織標本の作製
1 日齢 DDYマウスをエーテル麻酔し、 4 %パラホルムアルデヒ ドを含むリ ン酸 緩衝液 （pH 7. 4) を左心室より注入し灌流固定した。 下顎骨を摘出し、 前述の 4 %パラホルムアルデヒ ドを含むリ ン酸緩衝液 （pH 7. 4) に溃け、 4でにてさら に 12時間固定反応を行い、 リ ン酸緩衝液にて 3回洗浄後、 更にリ ン酸緩衝液に て 4 でー晚洗浄を行った。 その後 10%EDTA (エチレンジァミン四酢酸） を用 いて ·4·Ό、 1 週間脱灰反応を行った。 30%スクロースを含むリ ン酸緩衝液中 4°C でー晚洗浄後、 OCT コンパウンド （サクラ ' ファインテック社製） を用いて包 埋し、 ドライアイス含有イソペンタンに漬け凍結させた。 こう して作製された 包埋ブロックを、 クリオミクロ トーム （ライカ社製） を用いて 10/iinに薄切し、 下顎骨組織切片を作製した。
b) 免疫染色による DC-STAMPタンパク質の発現
a) により作製された下顎骨組織切片から、 風乾により.水分を除去した後、 0.3%過酸化水素を含むメタノールと室温で 30分間反応させ内因性ペルォキシ ダーゼ活性を消失させた。 リ ン酸緩衝液で 3回洗浄後 （室温 · 各 5分） 、 10% ロバ血清を含むリ ン酸緩衝液を用いて室温で 30 分間反応させブロッキングを 行った。 ブロッキング液を除去し、 実施例 4において作製したゥサギ抗マウス DC-STAMP ポリクロ一ナル坊体 10 ig/ml を含むリ ン酸緩衝液（2%ロバ血清を含 む）を添加し、 湿潤箱に入れ 4°Cでー晚反応させた。 また、 免疫されていないゥ サギ IgG抗体 （ダコ · ジャパン社製） を陰性対照として用意し、 同様の操作を 行った。 リ ン酸緩衝液で 3回洗浄後 （室温 · 各 5分）： ピオチン化ロバ抗ゥサギ IgG 抗体 （ジャクソン · ィムノ リサーチ · ラポラ トリーズ社製） をリ ン酸緩衝 液で 200倍希釈したものを二次抗体として用い、 室温で 1 時間反応させ、 リ ン 酸緩衝液で 3回洗浄後 （室温 '各 5分）、 ペルォキシダ一ゼ標識ス トレブトアビ ジン複合体 （ダコ · ジャパン社製） を蒸留水で 300倍に希釈したものと室温で 30分間反応させた。 リ ン酸緩衝液で 3回洗浄後 （室温 '各 5分）、 DAB substrate キッ ト （ベクター . ラボラ トリーズ社製） を添付のプロ トコールに従って用い ることにより、 発色反応を行った。 その結果、 抗 DC- STAMP抗体で反応させた下 顎骨組織切片では、 破骨細胞においてのみ強い染色が認められ、 新生仔マウス 下顎骨由来破骨細胞で DC- STAMPが発現していることが明らかとなった。 なお、 陰性対照のコントロール抗体を用いた場合では、 いずれの細胞も染色されなか つた。
[実施例 7] RAW- D細胞の siRNAによる破骨細胞分化抑制 a) マウス DC- STAMP遺伝子に対する siRNAの作製
センス鎖、 アンチセンス鎖それぞれの 3' 端に、 ゥリジンが 2塩基 （UU) 付 加された各マウス DC- STAMP siRNAは、 S i 1 encer s iRNA cons t rue ti onキッ ト （ァ ンビオン社製）を用レ 添付のプロ トコールに従って転写により調製した。 siRNA 調製に必要なテンプレートオリ ゴ MAセッ トは次の通りである。
まず、 第 3ェクソンの 5' 側 （ヒ ト DC- STAMP cDNA配列より推定されたアミ ノ酸配列において、 第 7膜貫通領域に相当） に対する siRNA及び変異を入れた siRNAの作製には、 次のテンプレートオリゴ DNAの組み合わせを用いた。
siRNA #135テンプレ一卜 ：
5' -aatactagga ttgttgtctt ccctgtctc-3' (mDC - STAMP - #135 - AS： 配列表の配 列番号 16)
および
5' -aagaagacaa caatcctagt acctgtctc-3' (mDC - STAMP - # 135 - S： 配列表の配列 番号 17)、
変異 siRNA #135テンプレニト ：
5， -aatactagga gcgttgtctt ccctgtctc-3' (mDC- STAMP-#135- Mut-AS： 配列表 の配列番号 18、 ヌクレオチド番号 Π は t を gに、 〗2は i を cに変異させてい る。）
および '
5' -aagaagacaa cgctcctagt acctgtctc-3' (mDC— STAMP— #135— Mut— S： 酉己列表の 配列番号 19、 ヌクレオチド番号 12に示されるヌクレオチドは aを gに、 13に 示されるヌクレオチドは aを cに変異させている。）。
また、 第 3ェクソンにおいて上記 siRNA(#135)の部分より 3'側に位置するマ ウス DC- STAMPに特有の cDNA配列部分に対する siRNA及び変異 siRNAの作製に は、 次のテンプレートオリゴ DNAの組み合わせを用いた。
siRNA * 6テンプレート ：
5， -aattctcgtg tcagtctcct tcctgtctc-3' (mDC- STAMP- *6 - AS： 配列表の配列 番号 20)
および
5' -aaaaggagac tgacacgaga acctgtctc-3' (mDC— STAMP— *6— S： 酉己列表の配列番 号 21)、
変異 siRNA *6テンプレ一ト ：
5' -aattctcgta ccagtctcct tcctgtctc-3' (mDC- STAMP- *6- Mut- AS ： 配列表の 配列番号 22、 ヌクレオチド番号 9 に示されるヌクレオチドは gを aに s 10 に示 されるヌクレオチドは t を c に変異させている。）
および
5， -aaaaggagac tggtacgaga acctgtctc-3' (mDC- STAMP- *6-Mut-S： 配列表の配 列番号 23、 ヌク レオチド番号 13 に示されるヌクレオチドは a を gに、 ヌクレ ォチド番号 14に示されるヌクレオチドは c を t に変異させている。）
b) RAW-D細胞の siRNAによる破骨細胞分化抑制
RAW- D を 10¾ゥシ胎児血清を含む - MEM培地で 4.5X104細胞/ ml に調製した ものを 96穴プレートに 80 1/穴播種した。 翌日、 OPTI-MEM I培地 （インピト ロジェン社製） 80^ 1 に培地交換し、 a) において作製した DC- STAMP siRNAお よび変異 siRNAを終濃度 0· 1、 1、 5ηΜ となるように調製し、 トランスフエクシ ヨ ン試薬である siPORT Lipid (アンビオン社製） を用い、 添付のプロ トコ一ル に従い細胞にトランスフエクシヨ ンした （20 1 ^加） '。 また、 siRNAを含まな い、 トランスフエクシヨ ン試薬のみのコントロール （モック） も用意した。 C02 インキュベータ一中で 4 時間トランスフエクシヨ ンした後、 ヒ ト RANKL (ぺプ 口テック社製） 40 ng/ml、 ヒ ト TNF- α (ぺプロテック社製） 2 ng/ml および 20% ゥシ胎児血清を含むひ- MEM培地を 100 1 添加した。 3 日間培養後、 Leukocyte Acid Phosphatase kit (シグマ社製） を用いて、 添付のプロ トコールに従い TRAP 染色を行い、 形成された TRAP 陽性多核破骨細胞数を計測した。 DC-STAMP siRNA#135 の添加濃度が、 0.1、 1、 5nM のいずれの濃度でも、 変異 siRNA #135 を添加した場合と異なり有意に破骨細胞形成を抑制した。 変異 siRNAの添加濃 度が 5nMの場合には若干の破骨細胞形成抑制効果が認められたが、 変異 siRNA の添加濃度が 0.1、 InMでは破骨細胞形成抑制効果は認められなかった。 その結 果、 モックコントロール （siRNA濃度 = 0nM) およびネガティブコントロールで ある変異 siRNAに比べ、 いずれの DC- STAMP siRNAも、 RANKLおよび TNF- αによ り誘導される RAW- Dの TRAP陽性多核破骨細胞形成を濃度依存的に抑制した（図 5A、 図 5B)。 このように、 siRNAにより DC- STAMP遺伝子の発現を抑制すると、 RAW- Dの破骨細胞への分化が抑制されたことから、 DC- STAMPが破骨細胞分化に 必須な因子であることが示唆された。 .
[実施例 8] マウス DC- STAMPオープンリーディ ングフレーム （ORF) cDNAク ローンの取得
a) RAW-Dからの全 RNAの抽出
RAW-D を 1( ^ゥシ胎児血清を含む α - MEM培地で 7X104細胞/ ml に調製したも のを 24穴プレートに 500 1/穴まき、 ヒ ト RANKL (ぺプロテック社製） を終濃 度 20 ng/ml、 ヒ ト TNF- α (ペブロテック社製） を終濃度 2 ng/ml.およびマウス MIP-1 a (ペブロテック社製） を終濃度 1 ng/ml となるように加え、 3 日間培養 した。
次いで、 全 RNA抽出用試薬 （TRIZol試薬 ： インビトロジェン社製） を添付の プロ トコールに従って用いることにより、 RAW- Dより全 RNAを抽出した。なお、 回収した全 RNAは- 80°Cに保存した。
b) ファース トス トランド cDNA合成
1 g全 RNAおよび 1 1 oligo(dT) 18 プライマ一 （0.5/i g/ l) を H20で 11 にし、 70°Cで 10分間加熱した後、 4°Cで保温した.。 この溶液に 4^ 1 5Xlst Strand Buffer (イ ン ビ ト ロ ジェ ン社製）、 l ^ l lOmM dNTPs、 2 1 0.1Μ di thiothrei toK 1 1 Superscript II 逆転写酵素 （20011/ 1、 インピトロジ ェン社製）、 1 μ 1 H20を加えて全量を 20^ 1 とし、 42°Cで 1 時間反応させた後、 70°Cで 10分間加熱し、 4°Cで保温した。
c) PCR反応
マウス DC-STAMPおよび DC- STAMP Δ Τ7の ORF cDNAを PCRで増幅するためのプ ライマーとして
5 ' -t t tgtcgaca tgaggctctg gacct tgggc accagtat 11 t-3 、mDC - STAMP - cDNA - F： 配列表の.配列番号 24)
および
5' -tttgcggccg c teat agate atcttcattt gcagggattg t-3' (mDC - STAMP - cDNA - R： 配列表の配列番号 25)、
の配列を有するオリゴヌクレオチドを常法に従って合成した。 このプライマ一 の組み合わせを用い、 サーマルサイクラ一 （ジーンアンプ PCRシステム 9700) を使用して以下の条件で PCRを行った。プライマ一（終濃度各 1.0^Μ)、 5 1 10 X Pyrobest PCRバッファ一 （宝酒造社製）、 4μ 1 2.5mM dNTPs, 1 μ.1 cDNA (b) にて作製）、 再蒸留水で 50 1 とした。 さらに 0.5< 1 の 5U/ 1 Pyrobest DNA ポリ メラーゼ （宝酒造社製） を添加し、 反応液を調製した。 この反応液を、 ま ず 94°Cで 2分間加熱した後、 94°Cで 0.5分、 60 で 0.5分、 72でで 5分の温度 サイクルを 30回繰り返してから、 7 C10分加熱し、 4°Cで保温した。
d) pCI- neoベクタ一へのクローニング
c) で得られた PCR反応液の全量を QIAquick PCR Purification Kit (キアゲ ン社製） を添付のプロ トコールに従って用いることにより精製した。 得られた フラグメン トは、 制限酵素 Sailおよび NoUで消化した後、 同様に Sailおよび Notl 消化した pCI- neo (プロメガ社製） と DNA Ligat ion Ki t Ver.1 (宝酒造社 製） を用いてライゲ一シヨ ンし、 大腸菌 XL卜 Blue MRF' (ス トラタジーン社製） へトランスフォーメーショ ンした。 このようにして得られた大腸菌コロニ一か ら、 プラスミ ド pCI-neo-マウス DC-STAMP を保持する形質転換大腸菌を単離し た。
得られたプラスミ ドに揷入されている 0RF cDNAの全ヌクレオチド配列を MA シークェンサ一 （（株） パーキンエルマ一ジャパン ' アプライ ドバイオシステム ズ事業部製 ABI プリズム 310 DNAシークェンサ一） を用いて解析した結果、 配 列表の配列番号 26 に示される配列であることが判明した。このヌクレオチド配 列は、 NCBI GeneBankデータベースに 「マウス DC- STAMP」 （登録番号： AB109560) として登録されている配列の 0RF コード領域と同一であり、 また、 該ヌクレオ チド配列にコー ドされるアミ ノ酸配列 （配列表の配列番号 27) は、 マウス DC-STAMPのアミノ酸配列と 100—致していた。
[実施例 9] マウス DC- STAMP蛋白強制発現による、 RAW- D細胞の破骨細胞分 化への影響
実施例 8 で得た pCI- neo-マウス DC- STAMP のプラスミ ドは、 pCI-neo 由来の CMVプロモータ一支配下に、 マウス DC- STAMPのオープンリ一ディ ングフレーム 配列が連結されているので、 このプラスミ ドを宿主に導入することによりマウ ス DC- STAMP 夕ンパク質の発現が可能である。
上記発現プラスミ ドの RAW- Dへの遺伝子導入 （トランジェント ' トランスフ ェクシヨ ン） は、 DEAE-デキス トラン法により行った。
pCI- neo-マウス DC- STAMPあるいは何も組み込んでいない空の pCI- neoベクタ 一それぞれ 3 g に、 10mg/ml DEAE -デキス トラン溶液 （プロメガ社製） 50 1 と 0PTI- MEMI (インビトロゲン） 950 i 1 を混合したものを添加し、 トランスフ ェクシヨ ン溶液を調製した。
血清を含まない a- MEM (10ml) で 2回洗浄 （200Xg、 5分間遠心） した RAW - D (3.0X106個） を上記トランスフエクシヨ ン溶液 （1ml) に懸濁した。 C02イン キュベータ一中 （37°C) で 30分間保温した後、 血清を含まないひ- MEM (10ml) で 1 回洗浄（200 Xg、 5分間遠心）後、 更に 5%ゥシ胎児血清を含む a -MEM (10ml) で 1 回洗浄を行った。 200Xg、 10 分間遠心して細胞を沈降させ、 1( ^ゥシ胎児 血清を含む a- MEM (2ml) に再懸濁させた。 細胞濃度を血球計算板にて測定し、 4.5X104個/ ml の細胞濃度に調製し、 96 ゥエルプレートに 0.15ml/穴播種し、 ヒ ト RANKL (ぺプロテック社製） を終濃度 20 ng/ml、 ヒ ト TNF-ひ （ぺプロテツ ク社製） を終濃度 1 ng/ml となるように添加し、 あるいは添加せず 3 日間培養 した後、 Leukocyte Acid Phosphatase kit (シグマ社製） を用いて、 添付のプ 口 トコ一ルに従い. TRAP染色を行い、 形成された TRAP陽性多核破骨細胞数を計 測した。 その結果、 RANKL、 TNF-α非存在下ではマウス DC- STAMPタンパク質を 強制発現させても TRAP陽性多核破骨細胞が全く誘導されなかったが、 RAML、 TNF- α存在下では、 コントロールである空の pCI- neoベクタ一を RAW- Dに遺伝 子導入した時に比べ、マウス DC-STAMP夕ンパク質を強制発現させることにより TRAP 陽性多核破骨細胞の形成が有意に促進された （図 6)。 このことから、 DC-STAMPが、 破骨細胞分化を促進する因子であることが示唆された。
[実施例 10] 抗マウス DC- STAMPポリク口一ナル抗体添加による RAW- D細胞 の破骨細胞分化への影響
実施例 4において作製したゥサギ抗マウス DC-STAMPポリク口一ナル抗体を用 い、 RAW- Dの破骨細胞分化への影響を検討した。
RAW- D を 10%ゥシ胎児血清を含むひ- MEM培地で 4.5X104細胞/ ml に調製した ものを 96穴プレー トに 150 μ 1/穴まき、 ヒ ト RANKL (ぺプロテック社製） を終 濃度 20 ng/ml、 ヒ ト TNF- α (ペブロテック社製） を終濃度 1 ng/ml となるよう に添加した。 この細胞培養上清に、 実施例 4において作製したゥサギ抗マウス DC-STAMPポリクローナル抗体を終濃度 0、 5、 10、 20 g/ml となるよう添加し 3 日間培養した後、 Leukocyte Acid Phosphatase kit (シグマ社製） を用いて、 添付のプロ トコールに従い TRAP染色を行い、 形成された TRAP陽性多核破骨細 胞数を計測した。 その結果、 添加した抗マウス DC- STAMPポリ ク口一ナル抗体の 用量依存的に TRAP 陽性多核破骨細胞の形成が抑制された （図 7)。 なお、 抗マ ウス DC- STAMP ポリク口一ナル抗体を添加しなかった場合に比べて抗体を 10 μ g/ml 以上添加すると破骨細胞の形成の有意な抑制が認められた。
このように、 DC-STAMP および DC-STAMP ΔΤ7 と特異的に結合すると考えられ る抗体により RAW - D の TRAP 陽性多核破骨細胞形成が抑制されたことから、 DC-STAMP および DC- STAMPA T7 が、 破骨細胞分化に深く関与していることが示 唆された。 '
[実施例 11] 抗マウス DC- STAMP ポリク口一ナ 抗体添加によるマウス骨髄 由来初代培養細胞の破骨細胞分化への影響
6 週齢雄性 DDY マウスをエーテル麻酔下頸椎脱臼にて安楽死させ、 大腿骨お よび脛骨を摘出した。 軟組織を除去した後、 大腿骨あるいは脛骨の両端を切り 落とし、 25ゲージの注射針のついた注射筒を用いて血清を含まない α- MEM培地 を骨髄中に注入し、 骨髄細胞を採取した。 細胞数を計測後、 15%ゥシ胎児血清 を含む a -MEM培地で 2 X 106細胞/ ml に調製したものを 24穴プレートに 500 1/ 穴まき、 活性型ビ夕ミン D3 (バイオモル社製） を終濃度 1 X 10— 8 M となるよう に添加した。 この細胞培養上清に、 実施例 4において作製したゥサギ抗マウス DC-STAMPポリ ク口一ナル抗体を終濃度 0、 5、 10、 20 g/ml となるよう添加し 6 日間培養した後、 Leukocyte Acid Phosphatase kit (シグマ社製） を用いて、 添付のプロ トコ一ルに従い TRAP染色を行い、 形成された TRAP陽性多核破骨細 胞数を計測した。 その結果、 添加した抗マウス DC- STAMPポリク口一ナル抗体の 用量依存的に TRAP 陽性多核破骨細胞の形成が抑制された （図 8)。 なお、 抗マ ウス DC-STAMP ポリ クロ一ナル抗体を添加しなかった場合に比べて抗体を 5 β g/mlおよび 20 g/mlの濃度で添加した場合において有意な抑制が認められた。 このように、 DC- STAMPおよび DC- STAMPAT7 と特異的に結合する抗体により、 マウス骨髄細胞からの TRAP 陽性多核,破骨細胞形成が抑制されたことから、 DC-STAMPおよび DC- STAMP ΔΤ7は、 RAW- Dのような細胞株のみならず、 より生体 に近い初代培養細胞の破骨細胞分化にも関与していることが明らかとなった。
[実施例 12] 抗マウス DC- STAMPポリク口一ナル抗体添加による骨吸収窩形 成への影響
マウス大腿骨および脛骨由来の細胞を、 活性型ピタミン！) 3存在下象牙切片上 で培養すると、 破骨細胞により象牙表面が侵食され、 虫食い状の骨吸収窩 ピ ッ ト） が観察される （Takada et al. , Bone and Mineral 17， 347- 359 (1992))。
14 日齢 ICRマウス （雌雄不問） をエーテル麻酔下頸椎脱臼にて安楽死させ、 大腿骨および脛骨を摘出した。 軟組織を除去した後、 10%ゥシ胎児血清を含む DMEM培地 1ml の入つた直径 60mmのデッシュの中で、 骨を粥状になるまでハサ ミで刻んだ。 15ml遠心チューブに移し、 10%ゥシ胎児血清を含む DMEM培地 10ml を加え、 ポルテックスミキサー （ェムエス機器） で, 30秒間攪拌後、 2分間静置 した。 上清を回収し、 細胞数を計測後、 10%ゥシ胎児血清を含む DMEM培地で 1 X107細胞/ ml に調製したものを、 厚さ 150〜 200 m、 直径 6mmの象牙切片 （呉 羽化学工業にて作製） を敷いた 96穴プレートに 100 1/穴まき、 C02インキュ ベ—ター中で 4時間培養した。 その後 10%ゥシ胎児血清を含む DMEM培地 200 1 に交換し、 活性型ピ夕ミン D3 (シグマ社製） を終濃度 1X10-8Mとなるよう に添加した （非添加群も用意した）。 この細胞培養上清に、 実施例 4において作 製したゥサギ抗マウス DC- STAMPポリク口一ナル抗体を終濃度 0、 2、 6、 20 g/ml となるよう添加し 4日間培養した。 培養終了後、 象牙の入ったプレートから培 養上清を除去し蒸留水を加えて 1回洗浄し、 新たに蒸留水を加えた。 ハンドモ —夕一 （東京中井 （株） 製） に接続させたポリ ツシンダブラシ （多賀谷製作所 製） を用いて象牙切片上に付着した細胞を剥離した。 蒸留水にて 2回洗浄した 後、 象牙表面上に形成されたピッ トを酸へマトキシリ ン液 （シグマ社製） で 13 分間染色し、 蒸留水にて 2回洗浄した。 象牙切片を裏返し、 顕微鏡下でピッ ト 面積を計測した。 ピッ トの総面積を測定する方法として、 顕微鏡の接眼レンズ に装着したマイクロメーター （10X10マス） を用い、 ピッ 卜が存在する全ての マスメ （メッシュ） の数を数え、 ピッ ト面積とした。 その結果、 活性型ビタミ ン D3の添加により象牙切片上に多数のピッ トが形成されたが、 同時に添加した 抗マウス DC- STAMPポリク口一ナル抗体の用量依存的に、ピッ ト形成が抑制され た （図 9)。 このように、 DC- STAMPおよび DC- STAMP ΔΤ7 と特異的に結合すると 考えられる抗体により、 マウス大腿骨 · 脛骨由来破骨細胞によるピッ ト形成が 抑制されたことから、 DC-STAMP および DC- STAMP ΔΤ7 が、 破骨細胞の骨吸収活 性の調節にも関与していることが示唆された。
[実施例 13] 巨細胞腫組織におけるヒ ト DC-STAMP遺伝子の発現
巨細胞腫 （Giant cell tumor; GCT) は、 組織学的に破骨型の多核巨細胞が多 数出現する骨腫瘍であ り、 臨床的所見として骨溶解性の骨破壊を特徴とする
(Bui lough et al. , Atlas of Orthopedic Pathology 2nd edition, 17.6-17.8, Lippincott Williams ■& Wilkins Publ ishers (1992))。 ヒ ト DC-STAMP遺伝子と 部分的に重複するヌ ク レオチ ド配列を有する EST プロ一ブ （Affymetrix Genechip HG-U133 probe 221266— s— at ： ァフィ メ ト リ クス社製） について、 GeneLogic 社製のデータべ一ス （Genesis 2003 Release 2.0) を用いて GCT 組 織における発現プロファイル解析を行った。 また、 破骨細胞分化に重要な役割 を果たしている RANK (Affymetrix Genechip HG-U133 probe 207037— at ： ァフ ィ メ ト リ クス社製） および RANKL ( Affymetrix Genechip HG-U133 probe 210643— t ： ァフィ メ トリ クス社製）、 さらに破骨細胞分化マ一カーであるカテ プシン K (Affymetrix Genechip HG-U133 probe 202450— s— at ： ァフィ メ トリ クス社製） および TRAP (Affymetrix Genechip HG-U133 probe 204638— at ： ァ フィ メ トリクス社製） の ESTプローブについても、 同様に GCT組織における発 現プロフアイル解析を行った。
正常骨組織 9例、 GCT組織 14例、 GCT以外の骨腫瘍組織 10例において発現量 を比較したところ、正常組織に比べ. GCT組織において RANKおよび RANKL の転写 が特異的に亢進していることが明らかとなった （図 10A)。 一方、 骨吸収の亢進 が必ずしも起こらないと考えられる GCT以外の骨腫瘍組織では、 GCTに比べ RANK および RANKLの転写が有意に低く、正常組織と同等の発現量であったことから、 GCT では破骨細胞の形成及び活性化が促進される環境であることが示唆された。 また、 カテブシン Kおよび TRAP の発現量を比較したところ、 GCTにおいて有意 に高く転写されており （図 10B)、 骨吸収活性を持つ破骨細胞が多数出現してい ることが示唆された。同様に DC - STAMP について転写量を比較したところ、 RANK、 RANKL、 カテブシン Kおよび TRAP と同じように GCTで特異的に高く転写されて いることが明らかとなった （図 11 )。 このことから、 GCTのような骨吸収が亢進 するヒ トの病態においても、 DC- STAMPが関与していることが示唆された。
[実施例 14] 抗マウス DC - STAMP ポリクローナル抗体'添加によるヒ ト破骨細 胞形成への影響
ヒ ト末梢血単核球 (Human Peripheral Blood Mononuclear Cell; HPBMC) を M-CSFおよびデキサメタゾン存在下 RANKLで刺激すると、 TRAP陽性多核破骨細 '胞が形成 さ れる ( Mat suzaki et al . , Biochem. Biophys. Res. Commun. , (1998) 246, 199-204) 。 夕カラバイオ社より購入した HPBMCを、 10%ゥシ胎児血 清を含む α- MEM培地で 5X106細胞/ ml に調製した後 96 穴プレートに 100 1/ 穴まき、ヒ ト M-CSF (アール'アンド*ディ一システムズ社製）が終濃度 200ng/ml、 デキサメタゾン （和光純.薬工業社製） が終濃度 1Χ1(Γ7Μおよびヒ ト RAML (ぺ プロテック社製） が終濃度 100 ng/ml となるように調製した培地を添加し、 200 1/穴とした （RANKL非添加群も用意した）。 この細胞培養上清に、 実施例 4に おいて作製したゥサギ抗マウス DC- STAMPポリク口一ナル抗体を終濃度 0、 2、 6 IX g/ml となるよう添加した。 培養 4、 7、 11 日後に培地交換および検体の添加 を行い、 培養 13 日後、 Leukocyte Acid Phosphatase kit (シグマ社製） を用い て、 添付のプロ トコ一ルに従い TRAP染色を行い、 形成された TRAP陽性多核破 骨細胞数を計測した。 その結果、 RANKL 刺激により多数の破骨細胞が形成され たが、 抗マウス DC- STAMPポリ ク口一ナル抗体の用量依存的に TRAP陽性多核破 骨細胞の形成が抑制された （図 Π)。 このように、 抗マウス DC- STAMP抗体によ り、 HPBMCからの TRAP陽性多核破骨細胞形成が抑制されたことから、 DC - STAMP は、 マウスのみならず、 ヒ トの破骨細胞分化にも関与していることが強く示唆 された。 産業上の利用の可能性
本発明によれば、 破骨細胞の活動の阻害を作用機序とする、 骨代謝異常の予 防剤および/または治療剤を得ることができる。 配列表フリ一テキス ト
配列番号 1 5 一人工配列の説明 ： ： マウス DC- •STAMPの合成部分べプチド 配列番号 1 6 一人工配列の説明 ： ： マウス DC - STAMPの铸型 DNA 1
配列番号 1 7 一人工配列の説明 ： ： マウス DC - STAMPの铸型 DNA 2
配列番号 1 8 一人工配列の説明 ： ： マウス DC- ■STAMPの铸型 DNA 3
配列番号 1 9 一人工配列の説明 ： ： マウス DC- •STAMPの铸型 DNA 4
配列番号 2 0 一人工配列の説明 ： ： マウス DC- •STAMPの铸型 DNA 5
配列番号 2 1 -人工配列の説明 ： ： マウス DC- STAMPの铸型 DNA 6
配列番号 2 2 一人工配列の説明 ： ： マウス DC- STAMPの铸型 DNA 7
配列番号 2 3 一人工配列の説明 ： ： マウス DC- STAMPの铸型 DNA 8
配列番号 2 4 一人工配列の説明 ： ： マウス DC - •STAMPの順方向 P CRプライマ一 配列番号 2 5 一人工配列の説明 ： ： マウス DC- •STAMPの逆方向 PCRプライマー

Claims

請 求 の 範 囲
1. · DC- STAMPと特異的に結合し、 破骨細胞の形成を抑制する抗体。
2. 配列表の配列番号 2に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、 配列番号 4 に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質及び配列表の配列番号 6に示される アミノ酸配列からなる蛋白質からなる群から選択される少なく とも一つの蛋白 質と特異的に結合し、 破骨細胞の形成を抑制する抗体。
3. モノクローナル抗体であることを特徴とする、 請求項 1又は 2に記載の 抗体。
4. ヒ ト化されていることを特徴とする、 請求項 1乃至 3のいずれか 1項に 記載の抗体。
5. ' 完全ヒ ト抗体であることを特徴とする、 請求項 1乃至 4のいずれか 1項 に記載の抗体。
6. I g G抗体であることを特徴とする、 請求項 1乃至 5のいずれか一つに 記載の抗体。
7. 下記の工程 1 ) 乃至 4) を含む、 骨代謝異常の検出方法 ：
1 ) 被験者より採取した検体より、 全 R N A画分を抽出する工程 ；
2) 正常人より採取した検体より、 全 R N A画分を抽出する工程 ；
3) 上記工程 1 ) 由来の全 RN A画分と上記工程 2 ) 由来の全 RNA画分にお ける、 下記の a)または b)のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドの発現量を 測定する工程 ；
a)配列表の配列番号 1、 3及び 5の少なく ともいずれか一つに示されるヌクレ ォチド配列からなるポリヌクレオチド、
b)上記 a)に記載のポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列からなるポリ ヌクレオチドとス トリ ンジェン卜な条件下でハイプリダイズするポリヌクレオ チド ；
4 ) 上記工程 1 ) 由来の全 R N A画分と上記工程 2 ) 由来の全 RNA画分との 間における上記工程 3 ) によって測定されたポリヌクレオチドの発現量の差を 解析し、 上記工程 1 ) に記載の被験者の骨代謝異常を検出する工程。
8. 下記の工程 1 ) 乃至 3 ) を含む、 骨代謝異常の検出方法 ： 1 ) 被験者より採取した検体における、 配列表の配列番号 2 、 4及び 6の少なく ともいずれか一つに示されるアミノ酸配列からなる蛋白質の発現量を測定する 工程 ；
2 ) 正常人から採取した検体における、 上記工程 1 ) に記載の少なく ともいずれ か一つの蛋白質の発現量を測定する工程 ；
3 ) 上記工程 1 ) で検出された蛋白質の発現量と上記工程 2 ) で測定された該蛋 白質の発現量の差を解析し、 被験者の骨代謝異常を検出する工程。
9 . 骨代謝異常が骨粗鬆症、 閧節リゥマチ及び/又は癌性高カルシウム血症で あることを特徴とする、 請求項 7又は 8に記載の方法。
1 0 . 骨代謝異常が骨粗鬆症であることを特徴とする、 請求項 7又は 8 に記載 の方法。
1 1 . 骨代謝異常が関節リウマチであることを特徴とする、 請求項 7又は 8 に 記載の方法。
1 2 . 骨代謝異常が癌性高カルシウム血症であることを特徴とする、 請求項 7 又は 8に記載の方法。
1 3 . ポリヌクレオチドの発現量を測定する方法が、 ノーザンプロッ ト法、 ドッ トプロッ ト法、 スロッ トプロッ ト法、 R T— P C R、 リボヌク レア一ゼ保 護アツセィまたはランオン · アツセィであることを特徴とする、 請求項 7 、 9 乃至 1 2のいずれか一つに記載の方法。 '
1 4 . ポリヌクレオチドの発現量を測定する方法が検体由来の相補的 D N A 群または該 D N A群の各 D N Aの部分配列からなる D N Aで作製された遺伝子 チップまたはアレイを用いることを特徴とする、 請求項 7 、 9乃至 1 2のいず れか一つに記載の方法。
1 5 . ' 蛋白質の発現量の測定方法が、 該蛋白質に特異的に結合する抗体または リガンドを用いることを特徴とする、請求項 8乃至 1 2のいずれか一つに記載の 方法。
1 6 . 蛋白質の発現量の測定方法が、 ウエスタンプロッ ト法、 ドッ トプロッ ト 法、 スロッ トプロッ ト法または固相酵素免疫定量法 （E L I S A法） であること を特徴とする、 請求項 8乃至 1 2のいずれか一つに記載の方法。
1 7 . 下記の 1 ) 乃至 3 ) からなる群から選択される少なく とも一つ以上を含 む骨代謝異常の検出用キッ ト ： .
1 ) 配列表の配列番号 1、 3及び 5の少なく ともいずれか一つに示されるヌク レオチド配列からなるポリヌクレオチドを特異的に増幅するための 1 5乃至 3 0塩基長の連続したオリゴヌクレオチドプライマー ；
2 ) 配列表の配列番号 1、 3及び 5の少なく ともいずれか一つに示されるヌク レオチド配列からなるポリヌクレオチドにス トリ ンジェン トな条件下で八イブ リダィズし、 該ポリヌクレオチドを検出するための 1 5ヌクレオチド以上の連 続したポリヌクレオチドプローブ ；
3) 配列表の配列番号 1、 3及び 5の少なく ともいずれか一つに示されるヌク レオチド配列からなるポリヌクレオチドが固定された固相化試料。
1 8. 下記の 1 ) 及び 2 ) を含む骨代謝異常の検出用キッ ト ：
1 ) 配列表の配列番号 2、 4及び 6の少なく ともいずれか一つに示されるアミ ノ酸配列からなる蛋白質に特異的に結合し、 該蛋白質を検出するための抗体 ；
2 ) 上記 1 ) に記載の抗体に結合し得る二次抗体。
1 9. 骨代謝異常が骨粗鬆症、 関節リウマチ又は癌性高カルシウム血症であ ることを特徵とする、 請求項 1 7又は 1 8に記載のキッ ト。
2 0. 骨代謝異常が骨粗鬆症であることを特徴とする、 請求項 1 7又は 1 8 に記載のキッ ト。
2 1. 骨代謝異常が関節リウマチであることを特徴とする、 請求項 1 7又は 1 8に記載のキッ ト。
2 2. 骨代謝異常が癌性高カルシウム血症であることを特徴とする、 請求項 1 7又は 1 8に記載のキッ ト。
2 3. 請求項 1乃至 6に記載の抗体の少なく ともいずれか一つを含有するこ とを特徴とする、 骨代謝異常の治療用医薬組成物。
2 4. 請求項 1乃至 6に記載の抗体の少なく ともいずれか一つ、 並びに、 ビ スホスホネート、 活性型ビタミン！ )3、 カルシトニンおょぴその誘導体、 ェス ト ラ ジ オー ル等 の ホ ルモ ン製剤 、 SERMs ( selective estrogen receptor modulators), ィプリ フラボン、 ビタミン （メナテトレノン）、 カルシウム製 剤、 PTH(parathyroid hormone)製剤、 非ステロイ ド性抗炎症剤、 抗 TNFo;抗体、 抗 PTHrP(parathyroid hormone - related protein)抗体、 IL-1 レセプターアン夕 ゴニス ト、 抗 RANKL抗体及び OCIF(osteoclastogenesis inhibitory factor)か らなる群から選択される少なく ともいずれか一つを含有することを特徴とする、 骨代謝異常の治療用医薬組成物。
2 5. 配列表の配列番号 1、 3及び 5に示されるヌクレオチド配列のいずれか 一つまたは該配列の部分配列に相補的なヌク レオチド配列を有するオリ ゴヌク レオチドを含む骨代謝異常の治療用医薬組成物。
2 6. 骨代謝異常が骨粗鬆症、 関節リウマチ又は癌性高カルシウム血症であ ることを特徴とする、請求項 2 3乃至 2 5のいずれか一つに記載の医薬組成物。
2 7. 骨代謝異常が骨粗鬆症であることを特徴とする、 請求項 2 3乃至 2 5 のいずれか一つに記載の医薬組成物。
2 8. 骨代謝異常が関節リゥマチであることを特徴とする、 請求項 2 3乃至 2 5のいずれか一つに記載の医薬組成物。
2 9. 骨代謝異常が癌性高カルシウム血症であることを特徴とする、 請求項
2 3乃至 2 5のいずれか一つに記載の医薬組成物。
3 0. 下記の工程 1 ) 乃至 4) を含むことからなる、 骨代謝異常に対する治 療効果及び Zまたは予防効果を有する物質のスク リーニング方法 ：
1 ) 被験物質を添加した培地で培養した哺乳動物由来培養細胞より、 全 RNA 画分を抽出する工程 ；
2 ) 被験物質を添加しないで培養した哺乳動物由来培養細胞より、 全 RNA画 分を抽出する工程 ：
3 ) 上記工程 1 ) 由来の全 R N A画分と上記工程 2 ) 由来の全 RNA画分にお ける、 下記いずれか一つに記載のポリヌクレオチドまたはその部分ポリヌクレ ォチドの発現量を測定する工程 ；
配列表の配列番号 1 に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、 配列番号 3に示されるヌグレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番 号 5に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドからなる群から選 択される少なく ともいずれか一つのポリヌクレオチド、
4) 上記工程 1 ) 由来の全 RN A画分と'上記工程 2 ) 由来の全 RNA画分との 間における上記工程 3 ) によって測定されたポリヌクレオチドの発現量の差を 解析し、 被験物質の、 骨 謝異常に対する治療効果及び または予防効果を判 定する工程。
3 1. 下記の工程 1 ) 乃至 4) を含むことからなる、 骨代謝異常の治療効果 及び Zまたは予防効果を有する物質のスクリ一二ング方法 ：
1 ) 被験物質を投与した哺乳動物個体より採取した検体より、 全 RNA画分を 抽出する工程 ；
2 ) 被験物質を投与しなかった哺乳動物個体より採取した検体より、 全 RNA 画分を抽出する工程 ；
3 ) 上記工程 1 ) 由来の全 R N A画分と上記工程 2 ) 由来の全 RNA画分にお ける、 下記のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドまたはその部分ポリヌク レオチドの発現量を測定する工程 ；
配列表の配列番号 1に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、 配列番号 3に示されるヌク レオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番 号 5に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドからなる群から選 択される少なく ともいずれか一つのポリヌクレオチド、
4)上記工程 1 )由来の全 RNA画分と上記工程 2 ) 由来の全 RNA画分との間 における上記工程 3 ) よって測定されたポリヌクレオチドの発現量の差を解析 し、 被験物質の骨代謝異常に対する治療効果及び Zまたは予防効果を判定する 工程。
3 2. 下記の工程 1 ) 乃至 3 )'を含むことからなる、 骨代謝異常の治療効果 及びノまたは予防効果を有する物質のスクリーニング方法 ：
1 ) 被験物質を添加した培地で培養した哺乳動物由来培養細胞における、 下記 のいずれか一つに記載の蛋白質またはその部分ポリぺプチドの発現量を測定す る工程 ；
配列表の配列番号 2に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、 配列番号 4に示 されるアミノ酸配列からなる蛋白質及び配列番号 6に示されるアミノ酸配列か らなる蛋白質からなる群から選択される少なく ともいずれか一つの蛋白質、
2 ) 被験物質を添加しない培地で培養した哺乳動物由来培養細胞における、 上 記工程 1 ) のいずれか一つに記載の蛋白質の発現量を該蛋白質に特異的に結合 する抗体またはリガンドを用いて検出する工程 ；
3 ) 上記工程 1 ) で検出された蛋白質の発現量と、 上記工程 2 ) で検出された 該蛋白質の発現量の差を解析し、 被験物質の骨代謝異常に対する治療効果及び /または予防効果を判定する工程。
3 3 . 下記の工程 1 ) 乃至 3 ) を'含むことからなる、 骨代謝異常の治療効果 及び/または予防効果を有する物質のスクリ一二ング方法 ：
1 ) 被験物質を投与された哺乳動物個体より採取した検体における、 下記のい ずれか一つに記載の蛋白質またはその部分ポリぺプチドの発現量を測定するェ 程 ；
配列表の配列番号 2 に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、 配列番号 4に示 されるアミノ酸配列からなる蛋白質及び配列番号 6 に示されるアミノ酸配列か らなる蛋白質からなる群から選択される少なく ともいずれか一つの蛋白質、
2 ) 被験物質を投与されなかった哺乳動物個体より採取した検体における、 上 記工程 1 ) のいずれか一つに記載の蛋白質またはその部分ポリベプチドの発現 量を測定する工程 ；
3 ) 上記工程 1 ) で検出された蛋白質の発現量と、 上記工程 2 ) で検出された 該蛋 S質の発現量の差を解析し、 被験物質の骨代謝異常に対する治療効果及び /または予防効果を判定する工程。
3 4 . ポリヌクレオチドの発現量を測定する方法が、 ノーザンプロッ ト法、 ドッ トプロッ ト法、 スロッ トブロッ ト法、 R T — P C R、 リボヌクレア一ゼ保 護アツセィまたはランオン · アツセィであることを特徴とする、 請求項 3 0又 は 3 1 に記載の方法。
3 5 . ポリヌクレオチドの発現量を測定する方法が動物組織または動物細胞 由来の相補的 D N A群または該 D N A群の各 D N Aの部分配列からなる D N A で作製された遺伝子チップまたはアレイを用いることを特徴とする請求項 3 0 又は 3 1 に記載の方法。
3 6 . 蛋白質の発現量の測定方法が、 該蛋白質に特異的に結合する抗体また はリガンドを用いることを特徴とする、 請求項 3 2又は 3 3 に記載の方法。
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