KR20080035653A - Ｈｉｖ―１ 감염 환자에서 바이러스 부하를 감소시키는방법 - Google Patents

Ｈｉｖ―１ 감염 환자에서 바이러스 부하를 감소시키는방법 Download PDF

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KR20080035653A
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윌리엄 씨. 올슨
폴 제이. 매든
대니얼 씨. 페비어
로버트 제이. 이스라엘
조스 디. 머가
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프로제닉스 파머슈티컬스, 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 환자에게 소정의 간격으로 유효한 HIV-I 바이러스 부하 감소 용량의 (a) PRO 140으로 나타내는 인간화 항체, 또는 (b) 항-CCR5 수용체 단클론 항체를 투여함을 포함하는, HIV-1 감염된 인간 환자에서 HIV-I 바이러스 부하를 감소시키는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 인간 환자에서 HIV-I-관련된 장애의 개시 또는 진행을 억제하는 방법을 제공하며, 상기의 억제는 상기 환자에서 CCR5+CD4+ 표적 세포에 대한 HIV-I의 융합을 억제함으로써 수행된다. 본 발명은 또한 환자에게 (a) (i) 상기 환자의 CD4+ 세포의 표면상의 CCR5 수용체에 결합하고 (ii) 상기 환자의 CCR5+CD4+ 세포에 대한 HIV-I의 융합을 억제하는 단클론 항체, 및 (b) 비 항체 CCR5 수용체 길항물질을, 상기 환자를 치료하기에 유효한 양으로 투여함을 포함하는, HIV-I에 감염된 환자를 치료하는 방법을 제공한다.
인간화 항체, 항-CCR5 수용체 단클론 항체, HIV-I

Description

ＨＩＶ―１ 감염 환자에서 바이러스 부하를 감소시키는 방법{METHODS FOR REDUCING VIRAL LOAD IN HIV-1-INFECTED PATIENTS}
본 출원은 2005년 7월 22일자로 출원된 미국 가출원 제60/702,064호; 2005년 7월 23일자로 출원된 미국 가출원 제60/701,889호; 2005년 8월 26일자로 출원된 미국 가출원 제60/711,528호; 및 2005년 9월 9일자로 출원된 미국 가출원 제60/715,619호의 이점을 청구하며; 이들 각각의 내용은 내용 전체가 본 출원에 참고로 인용된다.
본 발명은 국립 알러지 및 감염 질병 연구소로부터의 미국 정부 승인 제AI046871호 및 제AI066329호의 지원하에 수행되었다. 따라서, 미국 정부는 본 발명에 대해 특정한 권리를 갖는다.
본 출원 전체를 통해, 다양한 공보들이 괄호 안에 저자의 성명 및 날짜, 또는 특허 또는 특허 공보 번호와 함께 언급된다. 이들 공보의 전체적인 인용은 청구의 범위 바로 앞에 있는 명세서의 끝 부분에서 찾을 수 있다. 이들 각각의 공보는 본 출원일 당시에 당업자들에게 공지된 기술 수준을 보다 충분히 개시하기 위해서 내용 전체가 본 발명에 참고로 반영된다.
인간 면역결핍 바이러스 타입 1(HIV-1: human immunodeficiency virus type 1)에 의한 세포의 감염은 바이러스 피막(Env) 당단백질 gp120 및 gp41에 의해 매개되며, 상기 당단백질들은 바이러스 및 바이러스 감염된 세포의 표면상에 비 공유된 올리고머 복합체로서 발현된다. 상기 바이러스의 표적 세포 내로의 침입은 (1) 세포 표면 수용체에 대한 바이러스 표면 당단백질 gp120의 결합, (2) 융합 보조 수용체에 대한 Env 결합, 및 (3) gp41에서 다양한 형태 변화를 포함한, 상기 세포 표면에서의 연속적인 사건들(events)을 통해 진행한다.
비리온과 세포 표면 간의 첫 번째 고(高)친화성 상호작용은 세포 표면 CD4(HIV-1에 대한 1 차 수용체이다)에 대한 gp120의 결합이다(Dalgleish et al.; 1984; Klatzmann et al., 1984; Maddon et al., 1986; McDougal et al., 1986). 상기 결합은 gp120에서 형태 변화를 유도하며, 이는 상기 gp120을 여러 케모카인 수용체들 중 하나와 상호작용하게 할 수 있다(Berger, 1997; Bieniasz et al., 1998; Dragic et al., 1997; Littman, 1998). CC-케모카인 수용체 5(CCR5)는 대식세포-향성(R5) 균주에 대한 주요 보조 수용체이며, HIV-1의 전파에 결정적인 역할을 한다(Berger, 1997; Bieniasz et al., 1998; Dragic et al., 1997; Littman, 1998). T 세포주-향성(X4) 바이러스는 CXCR4를 사용하여 표적 세포에 들어가며, 항상은 아니지만 대개는, 질병 진행의 말기에 또는 조직 배양물에서 바이러스 증식의 결과로서 나타난다. 일부 주요 HIV-1 단리물들은 이들이, 항상 동일한 효율을 갖는 것은 아니지만, 2개의 보조 수용체를 모두 사용할 수 있기 때문에 이중 향성(R5X4)이다(Connor et al., 1997; Simmons et al., 1996). 차례로 케모카인 수용체에 대한 gp120의 결합은 바이러스 막통과 당단백질 gp41(바이러스 및 세포막의 융합을 매개한다)에서 형태 변화를 촉발한다.
상기 다단계 과정의 각 단계들은 적합한 바이러스 또는 세포 단백질의 억제제에 의해 차단될 수 있으며, gp120, gp41, CD4 및 보조 수용체의 억제제들은 집합적으로 침입 억제제로서 공지되어 있다. 침입 억제제들은 그들의 분자 표적 및 바이러스 내성의 결정인자를 기준으로 4개 이상의 독특한 작용제들의 그룹을 나타낸다(Olson and Maddon, 2003). 표 1은 임상적으로 개발중이거나 임상 사용이 승인된 것으로 공지된 HIV-1 침입 억제제를 나타낸다.
PRO 542는 인간 IgG2의 중쇄 및 경쇄 불변 부위에 유전적으로 융합된 CD4의 D1D2 영역을 포함하는 4 가의 3 세대 CD4-IgG2 융합 단백질이다(Allaway et al., 1995; Zhu et al., 2001). 상기 작용제는 상기 HIV-1 피막 당단백질 gp120과 나노몰 친화성으로 결합하며 수용체 봉쇄에 의해서, 및 gp120을 상기 비리온 표면으로부터 분리시켜 바이러스 부착을 억제함으로써 상기 바이러스를 비 가역적으로 불활성화시킬 수 있다.
HIV-1 침입 억제제
화합물 분자 부류 표적 침입 단계 개발자
PRO542 CD4-Ig 융합 단백질 gp120 부착 Progenics
BMS-488043 소 분자 gp120 부착 Bristol-Myers Squibb
TNX-355 인간화 항체 CD4 부착 후 Tanox
PRO 140 인간화 항체 CCR5 보조 수용체 Progenics
CCR5mAb004 인간 항체 CCR5 보조 수용체 Human Genome Sciences
SCH-D (비크리비록) 소 분자 CCR5 보조 수용체 Schering-Plough
UK-427,857 (마라비록) 소 분자 CCR5 보조 수용체 Pfizer
GW873140 소 분자 CCR5 보조 수용체 GlaxoSmithKline
TAK-652 소 분자 CCR5 보조 수용체 Takeda
AMD070 소 분자 CXCR4 보조 수용체 AnorMed
T-20(엔푸비르타이드) 펩타이드 gp41 gp41 융합 Trimeris/Roche
BMS-488043은 CD4에 대한 gp120 부착(Lin et al., 2002; 2003) 및 부착 후 사건들(Si et al., 2004)을 차단하는 것으로 다양하게 보고된 BMS-378806(PCT 국제 공보 제WO 01/62255 A1호 및 제WO 03/082289 A1호 참조)의 최적화된 동족체이다.
TNX-355는 CD4에 대한 gp120의 부착 후 발생하는 융합 사건들을 차단하는 항-CD4 단클론 항체(mAb) 5A8의 인간화 IgG4 버전이다(Burkly et al., 1992; Moore et al., 1992).
PRO 140, 인간화 항-CCR5 mAb 및 소 분자 CCR5 길항물질, SCH-D(또한 현재는 SCH 417670 또는 비크리비록으로 나타냄), UK-427,857(또한 마라비록으로 나타냄) 및 GW873140은 하기에 논의된다.
CCR5mAb004는 CCR5를 특이하게 인식하고 상기에 결합하는, 아브제닉스 제노마우스(Abgenix XenoMouse)(등록상표) 기술을 사용하여 생산된, 완전한 인간 mAb이다. CCR5mAb004는 인간 세포 내로의 HIV-1 바이러스의 CCR5-의존성 침입을 억제하는 것으로 보고되었으며, 최근 1 기 임상 시험(HGS Press Release, 2005)에 들어갔다.
HIV-1 감염을 억제할 수 있는 것으로서 확인된 첫 번째 소 분자 항-CCR5 길항물질은 TAK-779이었다(Baba et al., 1999). 그러나, TAK-779는 빈약한 경구 생체이용률(Baba et al., 2005) 및 국소적인 주사 부위 자극(Iizawa et al., 2003)을 나타내었으며, 임상 개발 중 TAK-779 유도체인 TAK-652(Baba et al., 2005)로 대체되었다. TAK-652는 생체 외에서 나노몰 범위로 강력한 항-HIV-1 활성을 갖고 생체 내에서 유망한 약물학적 프로파일을 갖는, 경구에 의해 생체이용 가능한 CCR5 길항물질이다(Baba et al., 2005).
AMD070은 2 세대 CXCR4 억제제이며; 1 세대 CXCR4 억제제인 AMD3100은 HIV-1 치료에 유리한 안전 창을 나타내지 않았다(Schols et al., 2002).
마지막으로, T-20은 2개의 중요한 3 기 연구 각각에서 유리한 항바이러스 및 안전한 프로파일에 따른 HIV-1 감염의 구조 요법에 대해 승인되었다(Lalezari et al., 2003; Lazzarin et al., 2003).
항- HIV -1 요법에 대한 표적으로서 CCR5
1986년에 처음 입증된 바와 같이, HIV-1은 CD4 수용체를 통해 표적 세포에 결합하나, 침입을 매개하는 추가적인 숙주 세포 인자들을 필요로 한다(Maddon et al., 1986). 그 다음 10년에 걸쳐, 다수의 보조 수용체 후보들이 제안되었지만, 다른 비 허용 세포에서 CD4와 함께 발현 시 어느 것도 바이러스 침입을 매개하지 않았다. 그러나, 1996년에, 몇몇 케모카인 수용체들, 즉 CCR5 및 CXCR4가 HIV-1에 대한 필수적인 융합 보조 수용체로서 작용함이 입증되었다.
코치(Cocchi) 등(1995)은 HIV-1과 케모카인(작은(∼8 kDa) 동종의 용해성 단백질이다) 간의 첫 번째 결합을 제공하였다. 케모카인은 면역 세포의 보충과 활성화를 매개한다. 상기는 4개의 보존된 시스테인 잔기 중 처음 2개의 수 및 순차 관계를 근거로 CC-, CXC-, CX3C- 및 XC-케모카인으로 분류되며; 대부분 CC- 또는 CXC-케모카인이다. 상기 CC-케모카인 RANTES, MIP-1α 및 MIP-1β는 HIV-1의 주요 대식세포-향성 균주의 복제를 차단하는 것으로 나타났다(Cocchi et al., 1995). 발현 클로닝 기법을 사용하여, 펭(Feng) 등(1996)은 케모카인 수용체 푸신(나중에 CXCR4라 다시 명명됨)이 T 세포주 상에서의 생육에 적합한 HIV-1의 균주의 융합 보조수용체임을 발견하였다. 그 후 곧, 여러 그룹들이 RANTES, MIP-1α 및 MIP-1β에 대해 특이성을 갖는 CC 케모카인 수용체인 CCR5의 클로닝을 보고하였으며(Combadiere et al., 1996; Raport et al., 1996; Samson et al., 1997), 다른 그룹들은 CCR5가 주요 대식세포-향성 HIV-1 단리물에 의해 사용되는 주 침입 보조인자임을 입증하였다(Alkhatib et al., 1996; Choe et al., 1996; Deng et al., 1996; Doranz et al., 1996; Dragic et al., 1996). CCR5 및 CXCR4 발현 패턴은 HIV-1의 상이한 균주들의 향성에 관한 오래 계속된 난제들을 푸는데 일조하였다. 대식세포-향성, T-세포주-향성 및 이중-향성 바이러스들을 각각, 침입을 위해 CCR5, CXCR4 또는 이들 두 수용체 모두를 이용하는 그들의 능력을 근거로 R5, X4 및 R5X4로서 보다 설명적으로 분류할 수 있었다.
다양한 다른 케모카인 수용체들은 생체 외에서 과발현 시 HIV-1 보조수용체로서 작용할 수 있다. 상기 목록은 CCR8, Apj, V28, US28, CCR2b, CCR3, gprl, Bonzo(STRL33, TYMSTR) 및 BOB(gprl5)를 포함한다. 분명히, 상기 케모카인 수용체 계열에 속하는 단백질들은 HIV-1 막 융합을 촉진하는 생화학적 성질들을 갖는다. 그러나, 상기 언급한 보조수용체들 중 대부분은 그 다지 효율적이지 않으며, CD4와 통상적으로 함께 발현되지 않고, 단지 HIV-1, HIV-2 또는 SIV의 몇몇 균주들과만 작용한다. 이들 선택적인 보조수용체들의 생체 내 관련성은 확립되지 않았다.
여러 인자가 CCR5를 새로운 레트로바이러스 억제 요법에 매력적인 표적으로 만든다. CCR5는 HIV-1 전파 및 발병기전에서 중추적인 역할을 하며, CCR5의 천연 돌연변이는 HIV-1 감염 및 질병 진행으로부터의 보호를 제공한다. 가장 주목할만한 CCR5 다형성은 CCR5의 암호화 부위 중의 32 bp 결실을 포함한다(A32)(Liu et al., 1996). A32 대립유전자는 세포 표면에 도달하지 못하는 비작용성 수용체를 암호화한다. 하나의 정상 및 하나의 돌연변이 CCR5 유전자를 갖는 개인들은 보다 낮은 수준의 CCR5를 발현하며, 그들의 T 세포는 생체 외에서 R5 바이러스 감염에 대해 덜 민감하다(Liu et al., 1996; Wu et al., 1997). A32 이형접합체는 감소된 바이러스 부하 및 지연된 AIDS로의 진행을 특징으로 하는 보다 가벼운 질병 과정을 겪는다(Huang et al., 1996; Michael et al., 1997). 이러한 결과는 감소된 CCR5 유용성이 바이러스 복제를 보다 낮추고 질병 진행을 늦출 수 있다는 개념을 뒷받침한다.
2개의 돌연변이 CCR5 유전자를 갖는 개인들은 북유럽 출신 인구의 상당 부분을 차지하며; 상기 인구 통계학은 CCR5-사용 병원체의 사전 유행병을 암시한다. 상기와 같은 개인들은 이들이 작용성 CCR5 단백질을 발현하지 않는다는 점에서 인간 CCR5 "녹아웃"(knockout)을 나타낸다. 드문 경우(Balotta et al., 1997; Biti et al., 1997; O'Brien et al., 1997)를 제외하고, 이들 개인은 HIV-1 감염에 내성이며(Huang et al., 1996; Liu et al., 1996; Michael et al., 1997; Samson et al., 1997), 이들의 T 세포를 생체 외에서 R5 바이러스로 감염시킬 수 없다(Liu et al., 1996). 이러한 발견은 HIV-1 전파에서 CCR5의 중심 역할을 뒷받침한다. 실제로, 현재 R5 바이러스가 거의 모든 경우에 전파를 매개하며 대부분의 경우에 AIDS로의 진행을 매개하는 것으로 공지되어 있다.
중요하게는, CCR5가 결여된 개인들은 정상적인 건강을 누리며 명백한 면역학적 또는 다른 결함들을 나타내지 않는다. 이는 과잉의 케모카인 신호전달 경로 및 CCR5의 다소 제한된 발현 패턴을 반영할 수 있다. CCR5 발현은, 낮은 수준의 CCR5 발현이 다른 조직들, 예를 들어 평활근 상에서 보고되었지만(Schecter et al., 2000), 주로 활성화된 T 세포 및 대식세포(이들은 생체 내에서 HIV-1 감염에 대한 주요 표적을 나타낸다)로 제한된다.
CCR5 녹아웃 마우스가 생산되었으며 CCR5 작용을 폐기하는 효과가 추가로 간파되었다. CCR5 녹아웃 마우스는 정상적으로 발육하며 표면상 건강하지만, 특정한 병원체의 공격 시 면역 반응에서 약간의 변경을 관찰할 수 있다(Huffnagle et al., 1999; Schuh et al., 2002; Tran et al., 2000; Zhou et al., 1998). 대조적으로, CXCR4 녹아웃은 마우스에서 치명적인 표현형이며(Lapidot et al., 2001), 인간에서는 관찰되지 않았다.
이와 함께, 상기 유전자 분석은 약물 표적으로서 CCR5를 기본으로 하는 신규의 치료학적 접근법을 강력히 지지한다. 역 전사효소의 실수유발 성질은 약물 내성 단리물의 개발을 촉진하는 광대한 유전적 다양성을 생성시키고 다수의 융합 보조수용체들을 이용하는 HIV-1의 능력은 내성에 대한 경로를 제공한다. 모든 시중의 레트로바이러스 억제제들에 대해 약물 내성 바이러스들이 단리되었으나, 그럼에도 불구하고 상기 레트로바이러스 억제제들을 적절한 조합으로 사용할 경우 중요한 치료상의 이점을 제공한다. 따라서, 약물 내성 바이러스의 잠재적인 출현에도 불구하고, CCR5-표적화제는 HIV-1 감염에 대한 새로운 치료 범례로서 작용할 수 있다.
CCR5의 명백한 필수적이지 않은 성질은, CCR5 길항물질이 생체 내에서 잘 허용될 수 있음을 시사하지만, CCR5를 폐기시키는 장기적인 효과가 그의 존재 하에서 발생한 면역계를 갖는 개인들에서 작용할 수 있는지를 결정하기 위해서는 추가적인 연구가 필요하다. 상기와 같은 잠재적으로 유해한 효과는, CCR5에 결합하고 상기에 대한 HIV-1의 결합을 억제하지만 통상적인 CCR5 기능은 손상시키지 않는 작용제들을 사용함으로써 경감시킬 수 있다. 상기와 같은 성질을 갖는 것으로 입증된 하나의 작용제는 인간화 항-CCR5 mAb인 PRO 140이며, 이는 CCR5의 생리 활성을 저해하지 않는 농도에서 HIV-1 복제를 강력하게 차단한다(Olson et al., 1999). PRO 140은 항-HIV 활성에 대한 형광 공명 에너지 전달(Resonance Enerty Transfer, RET) 분석 스크린을 사용하여 동정되었다. 상기는 바이러스를 강력하게 억제하며, 약 4 ㎍/㎖의 IC90를 갖고(Olson et al., 1999; Trkola et al., 2001), 다양한 주요 표적 세포 유형들을 보호한다(Ketas et al., 2003; Olson and Maddon, 2003). PRO 140의 반복된 투여는 hu-PBL SCID 마우스 모델에서 바이러스 이탈 없이 HIV-1 복제의 장기적인 관리를 유도하였으며, PRO 140은 현재 1기 인간 임상 시험 중이다.
상기 소 분자 CCR5 길항물질인 TAK-779의 동정에 이어서(Baba et al., 1999), 여러 가지 다른 소 분자 CCR5 길항물질들이 동정되었다. 이들 중 4개(SCH-C, SCH-D, UK-427,857, GW873140)는 HIV-감염된 개인에서 유사하게 계획된 1기 연구를 마쳤다(Reynes et al., 2002; Schurmann et al., 2004; Dorr et al., 2003; Lalezari et al., 2004). 이들 작용제는 각각 10 내지 14일의 치료기간 동안 HIV-1 RNA 수준의 용량 의존적인 ∼1 log10 평균 감소를 매개하였다. 예상한 바와 같이, 바이러스 부하는 치료의 중지에 이어서 기준선 수준으로 만회되었다. 가장 흔한 약물 관련 부작용은 신경학적(두통, 현기증) 및 위장(오심, 설사, 위 고창) 부작용이었으며, 이들은 용량 제한적이지 않았다. SCH-C를 제외하고(Reyes et al., 2001), 상기 동정된 작용제들 중 어느 것도 QTc 간격에서 임상적으로 현저한 변화를 유발하지 않았다.
건강한 남성 지원자에서, TAK-779에 대한 대체 화합물인 TAK-652의 안전성, 허용성, 및 약동학을 평가하기 위해 이중 맹검의 위약 조절된 1회 경구 용량 연구e도 수행되었다(Baba et al., 2005). TAK-652 용액의 1회 투여는 들리는 바에 의하면 안전하고 잘 허용었다(Baba et al., 2005).
종합적으로, 이들 연구는 HIV-1 요법에 대한 표적으로서 CCR5의 예비적인 비준을 제공한다. 상기 소 분자 CCR5 길항물질들이 상이한 약동학 및 대사 성질들을 갖는 명백히 다른 화학적 계열들을 나타내지만, 상기 화합물들은 그의 CCR5 작용의 억제, CCR5 상의 결합 부위, 내성 프로파일, 및 투여 섭생에 있어서 많은 성질들을 공유한다. 이러한 유사성은 생각건대 소 분자 CCR5 길항물질에 의해 제공되는 진정한 치료 선택권들의 수를 제한할 수 있다. 더욱이, CCR5 작용의 만성적인 봉쇄의 성가신 결과들이 존재하는지를 결정하는 것이 여전히 남아있고, HIV-1 요법에 대한 소 분자 CCR5 길항물질의 유용성은 3 기 임상 연구에서 적합한 안전성과 효능의 입증에 의해 여전히 확립해야 한다.
단클론 항체 요법
최근 수년간, mAb 제품들이 다양한 질병 환경에 새로운 간호 표준을 제공하였다. 현재, 18개의 mAb가 암, 자가면역 질병, 이식 거부반응 및 바이러스 감염을 포함한 적응증들에 대해 미국 식품의약품 안전청(FDA)에 의해 승인되었다. 그 중에서도 특히, 14개의 mAb가 2000년 이래로 승인되었다. 다수의 경우에, mAb는 소 분자 화합물에 비할 수 없는 안전성, 효능 및 편리성 프로파일을 제공한다. 예로서 시나지스(Synagis)(MedImmune, Inc., Gaithersburg, MD), 호흡기 세포융합 바이러스(RSV)에 대한 인간화 mAb, 및 비호지킨 림프종에 대한 간호 표준을 제공하는 항-CD20 mAb인 리툭산(Rituxan)(Genentech, San Francisco, CA)이 있다.
인간화 항 CCR5 mAb인 PRO 140은 상기 소 분자 CCR5 길항물질과 구조, 기능 및 기전이 다르며, 따라서 독특한 CCR5 억제제 부류를 나타낸다. PRO 140은, CD4+CCR5+ 세포에 대해 생성된 쥐 mAb, PA14의 인간화 버전이다(Olson et al., 1999). PRO 140은 세포의 표면상에서 발현된 CCR5에 결합하며, 생체 외 및 HIV-1 감염의 hu-PBL-SCID 마우스 모델에서 CCR5 케모카인 수용체 활성에 영향을 미치지 않는 농도에서 HIV-1 침입 및 복제를 강력하게 억제한다(Olson et al., 1999; Trkola et al., 2001). 상기 후자의 발견은 PRO 140 항 HIV-1 요법에 생체 내 개념 증명(proof-of-concept)을 제공하며, PRO 140은 현재 1a기 임상 연구 중에 있다.
PRO 140과 소 분자 CCR5 길항물질 간의 중요한 차이를 표 2에 요약한다. 표 2로부터, 개발 중인 소 분자 CCR5 길항물질이 많은 성질들을 공유하는 반면, PRO 140은 상기 소 분자 억제제와 분명히 상이함이 자명하다. 상기 두 CCR5 억제제 부류 간의 차이는 PRO 140이 소 분자 CCR5 길항물질의 경우와 본질적으로 상이하고 여러 방식으로 상보적인 생성물 프로파일을 제공할 수 있음을 보인다. 실제로, PRO 140은 HIV-1 감염의 치료에 신규의 치료학적 접근법을 나타내며 소 분자 CCR5 길항물질이 임상적으로 최종 승인되는지의 여부와 관계없이 HIV-1 치료에서 중요한 역할을 할 수 있다.
상이한 억제제 부류에 의한 HIV -1 감염의 상승 작용적인 억제
HIV-1 침입의 상승작용적인 억제는 앞서 다른 항-Env 항체(Thali et al., 1992; Tilley et al., 1992; Laal et al., 1994; Vijh-Warrier et al., 1996; Li et al., 1997; Li et al., 1998), 항-CD4 항체(Burkly et al., 1995), 또는 CD4-기재 단백질(Allaway et al., 1993)과 병용된 몇몇 항-Env 항체들에 의해 입증되었다. 유사하게, 다른 항-CCR5 항체, CC-케모카인 또는 CD4-기재 단백질과 병용된 항-CCR5 항체를 사용하여 상승작용을 관찰하였다(Olson et al., 1999). 2000년 6월 22일자로 공개된, PCT 국제 공보 제WO 00/35409호에 개시된 선행 연구들은 HIV-1 부착 억제제와 CCR5 보조수용체 억제제의 병용을 조사하였다. 2001년 8월 2일자로 공개된 PCT 국제 공보 제WO 01/55439호에 개시된 선행 연구들은 gp41 융합 중간체와 HIV-1 부착 억제제들의 병용을 조사하였다. 2002년 3월 21일자로 공개된 PCT 국제 공보 제WO 02/22077호에 개시된 선행 연구들은 융합 억제제와 CCR5 보조수용체 억제제의 병용뿐만 아니라, 융합 억제제, CCR5 보조수용체 억제제 및 HIV-1 부착 억제제의 3 중 병용을 조사하였다. 그러나, 어떠한 선행 연구도 CCR5 보조수용체 억제제, 예를 들어 항 CCR5 mAb 및 비 항체 CCR5 길항물질의 상이한 부류의 병용을 조사하지 않았다.
개발 중인 PRO 140과 소 분자 CCR5 길항물질의 비교
소 분자 PRO 140
확인 스크린 케모카인 결합 HIV-1 침입
CCR5의 천연 활성 차단 있음 없음
면역 억제/조절 장애 가능성 있음 없음
허용성 일부에 대해 심장, 신경 독성 독성 없음
CCR5 상의 결합 부위 CCR5의 막통과 부위들에 의해 한정된 공통의 소수성 포켓 다수의 친수성 영역들에 걸쳐있는 세포 외 에피토프
바이러스 교차 내성 유의수준 제한됨
생체 외에서 내성의 진전 6 내지 19 주 40 주째에 없음
약물-약물 상호작용 유의수준 없는듯함
음식물 상호작용 유의수준 없는듯함
투여 하루에 1 또는 2회 격주 내지 월 1회
발명의 요약
본 발명은 환자에게 소정의 간격으로 유효한 HIV-1 바이러스 부하 감소 용량의 (a) PRO 140으로 나타내는 인간화 항체, 또는 (b) (i) 상기 환자에서 CD4+CCR5+ 세포에 결합하고 상기와 같은 세포와 HIV-1과의 융합을 억제하며, (ii) PRO 140의 효능과 같거나 그보다 큰 효능으로 CD4+CCR5+ 세포와 HIV-1와의 융합을 억제하고, (iii) 상기 환자에서 상기와 같은 세포의 수를 감소시키지 않으면서 상기 환자에서 CD4+CCR5+ 세포를 피복하고/하거나 (iv) 상기 환자의 순환하는 β-케모카인의 혈장 농도 증가를 유발시키지 않으면서 상기 환자의 CD4+CCR5+ 세포에 결합하는 항-CCR5 수용체 단클론 항체를 투여하여 상기 환자의 HIV-1 바이러스 부하를 감소시킴을 포함하는, HIV-1 감염된 인간 환자에서 HIV-1 바이러스 부하를 감소시키는 방법을 제공하며, 여기에서 PRO 140은 (i) 각각의 경쇄가 pVK:HuPRO140-VK(ATCC 기탁 명칭 PTA-4097)로 나타내는 플라스미드의 발현 산물을 포함하는 2개의 경쇄, 및 (ii) 각각의 중쇄가 pVg4:HuPRO140 HG2-VH(ATCC 기탁 명칭 PTA-4098)로 나타내는 플라스미드 또는 pVg4:HuPRO140(mut B+D+I)-VH(ATCC 기탁 명칭 PTA-4099)로 나타내는 플라스미드의 발현 산물을 포함하는 2개의 중쇄를 포함하고, 상기 유효한 HIV-1 바이러스 부하 감소 용량은 상기 환자의 체중 ㎏ 당 0.1 ㎎ 내지 10 ㎎을 포함한다.
본 발명은 또한 환자에게 소정의 간격으로 유효한 융합 억제 용량의, PRO 140으로 나타내는 인간화 항체, 또는 (i) 상기 환자에서 CD4+CCR+ 세포에 결합하고 상기와 같은 세포와 HIV-1과의 융합을 억제하며, (ii) 10 ㎍/㎖ 이하의 IC90을 특징으로 하는 효능으로 상기 환자의 CD4+CCR5+ 세포와 HIV-1과의 융합을 억제하고, (iii) 상기 환자에서 상기와 같은 세포의 수를 감소시키지 않으면서 상기 환자의 CD4+CCR5+ 세포를 피복하고/하거나 (iv) 상기 환자의 순환하는 β-케모카인의 혈장 농도 증가를 유발시키지 않으면서 상기 환자의 CD4+CCR5+ 세포에 결합하는 항-CCR5 수용체 항체를 투여하여 상기 환자에서 HIV-1 관련된 장애의 개시 또는 진행을 억제함을 포함하는, 인간 환자에서 HIV-1 관련된 장애의 개시 또는 진행을 억제하는 방법을 제공하며, 상기 억제를 상기 환자에서 CCR5+CD4+ 표적 세포에 대한 HIV-1의 융합을 억제함으로써 수행하고, 여기에서 PRO 140은 (i) pVK:HuPRO140-VK(ATCC 기탁 명칭 PTA-4097)로 나타내는 플라스미드의 발현 산물을 각각 포함하는 2개의 경쇄, 및 (ii) pVg4:HuPRO140 HG2-VH(ATCC 기탁 명칭 PTA-4098)로 나타내는 플라스미드 또는 pVg4:HuPRO140(mut B+D+I)-VH(ATCC 기탁 명칭 PTA-4099)로 나타내는 플라스미드의 발현 산물을 각각 포함하는 2개의 중쇄를 포함하고, 상기 항체의 각 투여는 상기 환자에게 상기 환자의 체중 ㎏ 당 0.1 ㎎ 내지 10 ㎎을 전달한다.
본 발명은 또한 환자에게 소정의 간격으로 유효한 융합 억제 용량의, PRO 140으로 나타내는 인간화 항체, 또는 (i) 상기 환자에서 CD4+CCR5+ 세포에 결합하고 상기와 같은 세포와 HIV-1과의 융합을 억제하며, (ii) 10 ㎍/㎖ 이하의 IC90을 특징으로 하는 효능으로 상기 환자의 CD4+CCR5+ 세포와 HIV-1의 융합을 억제하고, (iii) 상기 환자에서 상기와 같은 세포의 수를 감소시키지 않으면서 상기 환자의 CD4+CCR5+ 세포를 피복하고/하거나 (iv) 상기 환자의 순환하는 β-케모카인의 혈장 농도 증가를 유발시키지 않으면서 상기 환자의 CD4+CCR5+ 세포에 결합하는 항-CCR5 수용체 항체를 투여하여 상기 환자가 HIV-1 감염에 걸릴 가능성을 감소시킴을 포함하는, 인간 환자가 HIV-1 감염에 걸릴 가능성을 감소시키는 방법을 제공하며, 여기에서 PRO 140은 (i) 각각의 경쇄가 pVK:HuPRO140-VK(ATCC 기탁 명칭 PTA-4097)로 나타내는 플라스미드의 발현 산물을 포함하는 2개의 경쇄, 및 (ii) 각각의 중쇄가 pVg4:HuPRO140 HG2-VH(ATCC 기탁 명칭 PTA-4098)로 나타내는 플라스미드 또는 pVg4:HuPRO140(mut B+D+I)-VH(ATCC 기탁 명칭 PTA-4099)로 나타내는 플라스미드의 발현 산물을 포함하는 2개의 중쇄를 포함하고, 상기 항체의 각 투여는 상기 환자에게 상기 환자의 체중 ㎏ 당 0.1 ㎎ 내지 10 ㎎을 전달한다.
본 발명은 환자에게 (a) (i) CD4+ 세포의 표면상의 CCR5 수용체에 결합하고 (ii) CCR5+CD4+ 세포에 대한 HIV-1의 융합을 억제하는 항체 및 (b) CCR5 수용체의 비 항체 길항물질을, 상기 환자를 치료하기에 유효한 양으로 투여함을 포함하는, HIV-1에 감염된 환자의 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 환자에게 (a) (i) CD4+ 세포의 표면상의 CCR5 수용체에 결합하고 (ii) CCR5+CD4+ 세포에 대한 HIV-1의 융합을 억제하는 항체, 및 (b) CCR5 수용체의 비 항체 길항물질을, 상기 CCR5+CD4+ 표적 세포에 대한 HIV-1의 융합을 억제하기에 유효한 양으로 투여하여 상기 환자에서 상기 HIV-1 관련된 장애의 개시 또는 진행을 억제함을 포함하는, 상기 환자에서 HIV-1 관련된 장애의 개시 또는 진행을 억제하는 방법을 제공하며, 상기의 억제는 상기 환자에서 CCR5+CD4+ 표적 세포에 대한 HIV-1의 융합을 억제함으로써 수행한다.
본 발명은 또한 환자에게 (a) (i) CD4+ 세포의 표면상의 CCR5 수용체에 결합하고 (ii) CCR5+CD4+ 세포에 대한 HIV-1의 융합을 억제하는 항체, 및 (b) CCR5 수용체의 비 항체 길항물질을, 상기 환자가 HIV-1 감염에 걸릴 가능성을 감소시키기에 유효한 양으로 투여함을 포함하는, 상기 환자가 HIV-1 감염에 걸릴 가능성을 감소시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 환자에게 HIV-1 억제 활성 증강량의 항-CCR5 수용체 단클론 항체를 HIV-1 억제 활성 증강량의 비 항체 CCR5 수용체 길항물질과 함께 투여함을 포함하는, 상기 환자에서 HIV-1 감염의 치료에서 (i) 항-CCR5 수용체 단클론 항체 또는 (ii) 비 항체 CCR5 수용체 길항물질의 HIV-1 억제 활성을 증강시키는 방법을 제공하며, 여기에서 상기 조합은 HIV-1 감염의 억제에 대해 상승작용 효과를 생성시키고, 이에 의해 상기 (i) 항-CCR5 수용체 단클론 항체 또는 (ii) 비 항체 CCR5 수용체 길항물질의 억제 활성을 증강시킨다. 하나의 실시태양에서, 상기 상승작용 효과로 인해, 상기 비 항체 CCR5 수용체 길항물질은 상기 항-CCR5 수용체 단클론 항체의 대략 4 내지 10배 용량 감소를 발생시키고 상기 항-CCR5 수용체 단클론 항체는 상기 비 항체 CCR5 수용체 길항물질의 대략 3 내지 16배의 용량 감소를 발생시킨다.
용어
본 발명에서 달리 나타낸 것을 제외하고, 본 출원에 사용된 하기의 용어들은 각각 아래에 나타낸 의미를 갖는다.
"투여"는 당업자들에게 공지된 다양한 방법 및 전달 시스템 중 임의의 것을 사용하여 수행하는 방식으로 전달함을 지칭한다. 투여는 예를 들어, 국소적으로, 정맥 내, 심장 주위, 경구, 비 경구로, 이식편을 통해, 점막을 통해, 경피, 피내, 근육 내, 피하, 복강 내, 경막 내, 림프 내, 병변 내, 경막 외로, 또는 생체 내 전기천공에 의해 수행할 수 있다. 작용제 또는 조성물을 또한 예를 들어 폐 및/또는 비 내 전달을 위해 에어로졸로 투여할 수 있다. 투여는 또한 예를 들어, 1회, 수 회, 및/또는 1회 이상 장기간에 걸쳐서 수행할 수 있다.
"항체"는 비 제한적으로, 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하고 항원을 인식하는 면역글로불린 분자를 포함할 것이다. 상기 면역글로불린 분자는 비 제한적으로 IgA, 분비성 IgA, IgG 및 IgM을 포함하여, 통상적으로 공지된 부류 중 임의의 것으로부터 유도될 수 있다. IgG 하위 부류가 또한 당업자들에게 널리 공지되어 있으며 여기에는 비 제한적으로 인간 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4가 포함된다. "항체"는 예로서 천연 및 비 천연 항체 모두; 단클론 및 다클론 항체; 키메릭 및 인간화 항체; 인간 또는 비인간 항체; 완전히 합성인 항체; 및 단쇄 항체를 포함한다. 비인간 항체를 재조합 방법에 의해 인간화시켜 인간에서 그의 면역원성을 감소시킬 수 있다. 항체의 인간화 방법은 당업자들에게 널리 공지되어 있다. "항체"는 또한 비 제한적으로 임의의 상기 언급한 면역글로불린 분자들의 단편 또는 일부를 포함하며, 1가 및 2가 단편 또는 부분을 포함한다. 항체 단편은 예를 들어 Fc 단편 및 항원 결합 단편(Fab)을 포함한다.
"항-케모카인 수용체 항체"는 케모카인 수용체 상의 에피토프를 인식하고 상기에 결합하는 항체를 지칭한다. 본 발명에 사용된 바와 같이, "항-CCR5 항체"는 CCR5 케모카인 수용체 상의 에피토프를 인식하고 상기에 결합하는 항체를 지칭한다.
"부착"은 HIV-1 피막 당단백질을 인간 CD4 수용체(융합 보조수용체가 아님)에 결합시킴으로써 매개되는 과정을 의미한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "CCR5"는 케모카인의 C-C 그룹의 구성원과 결합하고 겐뱅크(Genbank) 수탁 번호 제1705896호로 제공된 아미노산 서열 및 관련된 다형체성 변체를 포함하는 케모카인 수용체이다. 본 발명에 사용된 바와 같이, CCR5는 비 제한적으로 HIV-1 피막 단백질과 결합할 수 있는 CCR5의 세포 외 부분을 포함한다. "CCR5" 및 "CCR5 수용체"는 동의어로 사용된다.
"CD4"는 세포질 영역, 소수성 막통과 영역, 및 HIV-1 gp120 피막 당단백질에 결합하는 세포 외 영역을 포함하는 성숙한 고유의 막 결합된 CD4 단백질을 의미한다.
"CDR" 또는 상보성 결정 부위는 항체의 가변 영역 중의 고도의 가변성 아미노산 서열을 의미한다.
"세포"는 생물학적 세포, 예를 들어 HeLa 세포, 및 비 생물학적 세포, 예를 들어 인지질 소낭 또는 비리온을 포함한다. "HIV 감염에 민감한 세포"를 또한 "표적 세포"라 칭하며 HIV 또는 HIV-감염된 세포에 의해 감염되거나 또는 상기와 융합할 수 있는 세포를 포함한다.
"CXCR4"는 케모카인의 C-X-C 그룹의 구성원들과 결합하고 진뱅크 수탁 번호 제400654호로 제공되는 아미노산 서열 및 관련된 다형체성 변체를 포함하는 케모카인 수용체이다. 본 발명에 사용된 바와 같이, CXCR4는 HIV-1 피막 단백질과 결합할 수 있는 CXCR4의 세포 외 부분을 포함한다.
HIV-1에 "노출된"은 감염이 초래될 수 있도록 HIV-1과 접촉함을 지칭한다.
"완전한 인간" 항체는 아미노산이 모두 인간 면역글로불린 분자 중의 아미노산에 상응하는 항체를 지칭한다. "완전한 인간" 및 "인간"은 동의어로 사용된다.
"HIV"는 인간 면역결핍 바이러스를 지칭한다. HIV는 비 제한적으로 HIV-1을 포함할 것이다. HIV-1은 비 제한적으로 세포 외 바이러스 입자 및 HIV-1 감염된 세포와 관련된 HIV-1의 형태들을 포함한다. 인간 면역결핍 바이러스(HIV)는 2개의 공지된 HIV 유형(HIV-1 또는 HIV-2) 중 어느 하나일 수 있다. HIV-1 바이러스는 공지된 주요 서브유형들(부류 A, B, C, D, E, F, G 및 H) 또는 동떨어진 서브유형(그룹 O) 중 어느 하나를 나타낼 수 있다. HIV-1JR - FL은 AIDS 환자의 뇌 조직으로부터 부검 시 최초로 단리된 균주이다. 상기 바이러스는 클로닝되었고 그의 피막 당단백질의 DNA 서열은 공지되어 있다(진뱅크 수탁 번호 제U63632호). 바이러스 침입의 억제제에 대한 감수성과 관련하여, HIV-1JR - FL은 매우 전형적인 주요한 HIV-1 단리물을 나타낸다.
"인간화" 항체는 CDR 부위 밖에 있는 아미노산의 일부, 대부분 또는 전부가 인간 면역글로불린 분자로부터 유도된 상응하는 아미노산으로 대체된 항체를 지칭한다. 상기 항체의 인간화 형태의 하나의 실시태양에서, 상기 CDR 부위 밖에 있는 아미노산의 일부, 대부분 또는 전부가 인간 면역글로불린 분자로부터 유도된 상응하는 아미노산으로 대체된 반면, 하나 이상의 CDR 부위 내의 일부, 대부분 또는 전체 아미노산은 불변이다. 아미노산의 작은 첨가, 결실, 삽입, 치환 또는 변경은 이들이 주어진 항원에 결합하는 상기 항체의 능력을 파기시키지 않는 한 허용될 수 있다. 적합한 인간 면역글로불린 분자는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE 및 IgM 분자를 포함한다. "인간화" 항체는 원래 항체의 경우와 유사한 항원 특이성을 유지한다.
"단클론 항체"(또한 mAb로 나타냄)는 주요 서열이 필수적으로 동일하고 동일한 항원 특이성을 나타내는 항체 분자이다. 단클론 항체를 하이브리도마, 재조합체, 트랜스제닉 또는 당업자들에게 공지된 다른 기법에 의해 제조할 수 있다.
"CCR5 수용체의 비 항체 길항물질"은 항체를 포함하지 않고, CCR5 수용체에 결합하며 상기 수용체의 활성을 억제하는 작용제를 지칭한다. 상기와 같은 억제는 HIV-1의 CCR5 수용체에 대한 결합의 억제를 포함할 수 있다. 예로서, 비 항체 길항물질은 핵산, 탄수화물, 지질, 올리고펩타이드, 및 작은 유기 분자를 포함한다.
"환자가 바이러스 감염에 걸릴 가능성을 감소시킴"은 상기 환자가 상기 바이러스에 감염될 가능성을 2배 이상까지 감소시킴을 의미한다. 예를 들어, 환자가 바이러스에 감염되는 기회를 1% 갖는다면, 상기 환자가 바이러스 감염에 걸릴 가능성이 2배 감소하여 상기 환자가 상기 바이러스에 감염되는 기회를 0.5% 갖게 될 것이다. 본 발명의 바람직한 실시태양에서, 상기 환자가 바이러스 감염에 걸릴 가능성을 감소시키는 것은 상기 환자가 상기 바이러스에 감염될 가능성을 10배 이상까지 감소시킴을 의미한다.
"소 분자" CCR5 수용체 길항물질은 예를 들어 CCR5 수용체에 결합하고 상기 수용체의 활성을 억제하는 작은 유기 분자를 포함한다. 상기와 같은 억제는 예를 들어 HIV-1의 상기 수용체에의 결합을 억제함을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 작은 유기 분자는 1,500 달톤 미만의 분자량을 갖는다. 또 다른 실시태양에서, 상기 분자는 600 달톤 미만의 분자량을 갖는다.
"환자"는 HIV에 감염될 수 있는 임의의 동물 또는 인위적으로 변형시킨 동물을 포함한다. 동물은 비 제한적으로 인간, 비인간 영장류, 개, 고양이, 토끼, 흰족제비, 및 설치류, 예를 들어 마우스, 래트 및 기니 피그를 포함한다. 인위적으로 변형시킨 동물은 비 제한적으로 인간 면역 시스템을 갖는 SCID 마우스를 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 상기 환자는 인간이다.
2개 이상의 작용제들 간의 "상승작용"은 상기 작용제들의 부가적인 효과보다 더 큰 이들의 병용 효과를 지칭한다. 작용제들간의 상승작용적, 부가적 또는 길항적 효과를 병용 지수(CI) 방법을 사용하는 용량 반응 곡선의 분석에 의해 정량 분석할 수 있다. 1보다 큰 CI 값은 길항작용을 가리키고, 1과 같은 IC 값은 부가 효과를 가리키며; 1 미만의 CI 값은 상승작용적 효과를 가리킨다. 하나의 실시태양에서, 상승작용적 상호작용의 CI 값은 0.9 미만이다. 또 다른 실시태양에서, 상기 CI 값은 0.8 미만이다. 바람직한 실시태양에서, 상기 CI 값은 0.7 미만이다.
"환자에서 HIV-1 감염을 치료함"은 상기 환자에서 HIV-1 장애의 진행을 늦추거나, 정지시키거나 또는 역전시킴을 지칭한다. 바람직한 실시태양에서, "치료"는 상기 장애의 제거 시점까지 상기 진행을 역전시킴을 지칭한다. 본 발명에 사용된 바와 같이, "치료"는 또한 바이러스 감염의 수를 감소시키거나, 감염성 바이러스 입자의 수를 감소시키거나, 바이러스에 의해 감염된 세포의 수를 감소시키거나, 또는 HIV-1과 관련된 증상들을 개선시킴을 의미한다. 환자에서 바이러스 부하의 감소는 상기 환자의 치료에 대한 하나의 실시태양이다.
발명의 실시태양
본 방법은 환자에게 소정의 간격으로 유효한 HIV-1 바이러스 부하 감소 용량의 (a) PRO 140으로 나타내는 인간화 항체, 또는 (b) (i) 상기 환자에서 CD4+CCR5+ 세포에 결합하고 상기와 같은 세포와 HIV-1과의 융합을 억제하며, (ii) PRO 140의 효능과 같거나 그보다 큰 효능으로 CD4+CCR5+ 세포와 HIV-1과의 융합을 억제하고, (iii) 상기 환자에서 상기와 같은 세포의 수를 감소시키지 않으면서 상기 환자에서 CD4+CCR5+ 세포를 피복하고/하거나 (iv) 상기 환자의 순환하는 β-케모카인의 혈장 농도 증가를 유발시키지 않으면서 상기 환자의 CD4+CCR5+ 세포에 결합하는 항-CCR5 수용체 단클론 항체를 투여하여 상기 환자의 HIV-1 바이러스 부하를 감소시킴을 포함하는, HIV-1 감염된 인간 환자에서 HIV-1 바이러스 부하를 감소시키는 방법을 제공하며, 여기에서 PRO 140은 (i) pVK:HuPRO140-VK(ATCC 기탁 명칭 PTA-4097)로 나타내는 플라스미드의 발현 산물을 각각 포함하는 2개의 경쇄, 및 (ii) pVg4:HuPRO140 HG2-VH(ATCC 기탁 명칭 PTA-4098)로 나타내는 플라스미드 또는 pVg4:HuPRO140(mut B+D+I)-VH(ATCC 기탁 명칭 PTA-4099)로 나타내는 플라스미드의 발현 산물을 각각 포함하는 2개의 중쇄를 포함하고, 상기 유효한 HIV-1 바이러스 부하 감소 용량은 상기 환자의 체중 ㎏ 당 0.1 ㎎ 내지 10 ㎎을 포함한다.
하나의 실시태양에서, 상기 항-CCR5 수용체 단클론 항체는 PRO 140이 결합하는 것과 동일한 CCR5 에피토프에 결합한다. 상기 항-CCR5 수용체 단클론 항체는 예를 들어 인간화, 인간 또는 키메릭 항체일 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 상기 환자에게 투여되는 항체는 PRO 140으로 나타내는 항체이다.
하나의 실시태양에서, 유효한 바이러스 부하 감소 용량은 환자의 체중 ㎏ 당 0.25 ㎎ 내지 7.5 ㎎이다. 또 다른 실시태양에서, 상기 용량은 환자의 체중 ㎏ 당 0.5 ㎎ 내지 5 ㎎이다. 또 다른 실시태양에서, 상기 용량은 환자의 체중 ㎏ 당 1 ㎎ 내지 3 ㎎이다. 또 다른 실시태양에서, 상기 용량은 환자의 체중 ㎏ 당 2 ㎎이다.
또 다른 실시태양에서, 상기 유효한 바이러스 부하 감소 용량은 환자에서 400 ng/㎖ 이상의 혈청 중 항체 농도를 성취하기에 충분하다. 추가의 실시태양에서, 규칙적인 간격으로 투여되는 상기 용량은 상기 환자에서 1 ㎍/㎖ 이상의 혈청 중 항체 농도를 성취하고 유지하기에 충분하다. 추가의 실시태양에서, 상기 용량은 상기 환자에서 약 3 내지 약 12 ㎍/㎖의 혈청 중 항체 농도를 성취하고 유지하기에 충분하다. 추가의 실시태양에서, 상기 용량은 상기 환자에서 5 ㎍/㎖ 이상의 혈청 중 항체 농도를 성취하고 유지하기에 충분하다. 추가의 실시태양에서, 상기 용량은 상기 환자에서 10 ㎍/㎖ 이상의 혈청 중 항체 농도를 성취하고 유지하기에 충분하다. 추가의 실시태양에서, 상기 용량은 상기 환자에서 25 ㎍/㎖ 이상의 혈청 중 항체 농도를 성취하고 유지하기에 충분하다. 추가의 실시태양에서, 상기 용량은 상기 환자에서 50 ㎍/㎖ 이상의 혈청 중 항체 농도를 성취하고 유지하기에 충분하다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 상기 소정의 간격은 매주 1회 이상이다. 또 다른 실시태양에서, 상기 소정의 간격은 2 내지 4주마다이다. 추가의 실시태양에서, 상기 소정의 간격은 2주마다 또는 4주마다이다. 추가의 실시태양에서, 상기 소정의 간격은 매월 1회 이상, 6주마다 또는 8주마다이다. 본 발명의 또 다른 실시태양에서, 상기 환자의 HIV-1 바이러스 부하의 감소를 1주 이상 유지시킨다. 또 다른 실시태양에서, 상기 환자의 HIV-1 바이러스 부하의 감소를 2주 이상 유지시킨다. 또 다른 실시태양에서, 상기 환자의 HIV-1 바이러스 부하의 감소를 4주 이상 유지시킨다. 또 다른 실시태양에서, 상기 환자의 HIV-1 바이러스 부하의 감소를 3개월 이상 유지시킨다.
하나의 실시태양에서, 상기 항체를 정맥 내 주입을 통해 투여한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 항체를 피하 주사를 통해 투여한다. 하나의 실시태양에서, 상기 환자의 HIV-1 바이러스 부하는 상기 항체의 투여에 따라서 50% 이상까지 감소된다. 또 다른 실시태양에서, 상기 환자의 HIV-1 바이러스 부하는 상기 항체의 투여에 따라서 70% 이상까지 감소되며, 바람직하게는 상기 항체의 투여에 따라서 90% 이상까지 감소된다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 상기 방법은 상기 환자에게 하나 이상의 항-HIV-1 레트로바이러스 억제제를 투여함을 또한 포함한다. 상기 항-HIV-1 레트로바이러스 억제제는 예를 들어 비뉴클레오사이드 역 전사효소 억제제(nonnucleoside reverse transcriptase inhibitor, NNRTI), 뉴클레오사이드 역 전사효소 억제제(nucleoside reverse transcriptase inhibitor, NRTI), 프로테아제 억제제(protease inhibitor, PI), 융합 억제제, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 하나의 실시태양에서, 상기 환자는 치료를 받은 적이 없다. 바람직한 실시태양에서, 상기 환자는 치료 경험이 있다.
또 다른 실시태양에서, (a) 상기 단클론 항체를 상기 환자에게 투여하기 전에, 상기 환자에게 하나 이상의 항-HIV-1 레트로바이러스 억제제에 의한 치료를 제공하고, (b) 상기 단클론 항체를 투여함과 동시에, 상기 환자에서 HIV-1 바이러스 부하의 감소를 향상시키기 위해서 상기 환자에게 계속해서 상기 작용제 또는 작용제들에 의한 치료를 제공한다. 상기 항-HIV-1 레트로바이러스 억제제는 예를 들어 비뉴클레오사이드 역 전사효소 억제제(NNRTI), 뉴클레오사이드 역 전사효소 억제제(NRTI), 프로테아제 억제제(PI), 융합 억제제, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다.
본 발명은 또한 환자에게 소정의 간격으로 유효한 융합 억제 용량의, PRO 140으로 나타내는 인간화 항체, 또는 (i) 상기 환자에서 CD4+CCR5+ 세포에 결합하고 상기와 같은 세포와 HIV-1과의 융합을 억제하며, (ii) 10 ㎍/㎖ 이하의 IC90을 특징으로 하는 효능으로 상기 환자의 CD4+CCR5+ 세포와 HIV-1과의 융합을 억제하고, (iii) 상기 환자에서 상기와 같은 세포의 수를 감소시키지 않으면서 상기 환자의 CD4+CCR5+ 세포를 피복하고/하거나 (iv) 상기 환자의 순환하는 β-케모카인의 혈장 농도 증가를 유발시키지 않으면서 상기 환자의 CD4+CCR5+ 세포에 결합하는 항-CCR5 수용체 항체를 투여하여 상기 환자에서 HIV-1 관련된 장애의 개시 또는 진행을 억제함을 포함하는, 인간 환자에서 HIV-1 관련된 장애의 개시 또는 진행을 억제하는 방법을 제공하며, 상기 억제를 상기 환자에서 CCR5+CD4+ 표적 세포에 대한 HIV-1의 융합을 억제함으로써 수행하고, 여기에서 PRO 140은 (i) pVK:HuPRO140-VK(ATCC 기탁 명칭 PTA-4097)로 나타내는 플라스미드의 발현 산물을 각각 포함하는 2개의 경쇄, 및 (ii) pVg4:HuPRO140 HG2-VH(ATCC 기탁 명칭 PTA-4098)로 나타내는 플라스미드 또는 pVg4:HuPRO140(mut B+D+I)-VH(ATCC 기탁 명칭 PTA-4099)로 나타내는 플라스미드의 발현 산물을 각각 포함하는 2개의 중쇄를 포함하고, 상기 항체의 각 투여는 상기 환자에게 상기 환자의 체중 ㎏ 당 0.1 ㎎ 내지 10 ㎎을 전달한다.
본 발명은 또한 환자에게 소정의 간격으로 유효한 융합 억제 용량의, PRO 140으로 나타내는 인간화 항체, 또는 (i) 상기 환자에서 CD4+CCR5+ 세포에 결합하고 상기와 같은 세포와 HIV-1과의 융합을 억제하며, (ii) 10 ㎍/㎖ 이하의 IC90을 특징으로 하는 효능으로 상기 환자의 CD4+CCR5+ 세포와 HIV-1과의 융합을 억제하고, (iii) 상기 환자에서 상기와 같은 세포의 수를 감소시키지 않으면서 상기 환자의 CD4+CCR5+ 세포를 피복하고/하거나 (iv) 상기 환자의 순환하는 β-케모카인의 혈장 농도 증가를 유발시키지 않으면서 상기 환자의 CD4+CCR5+ 세포에 결합하는 항-CCR5 수용체 항체를 투여하여 상기 환자가 HIV-1 감염에 걸릴 가능성을 감소시킴을 포함하는, 인간 환자가 HIV-1 감염에 걸릴 가능성을 감소시키는 방법을 제공하며, 여기에서 PRO 140은 (i) pVK:HuPRO140-VK(ATCC 기탁 명칭 PTA-4097)로 나타내는 플라스미드의 발현 산물을 각각 포함하는 2개의 경쇄, 및 (ii) pVg4:HuPRO140 HG2-VH(ATCC 기탁 명칭 PTA-4098)로 나타내는 플라스미드 또는 pVg4:HuPRO140(mut B+D+I)-VH(ATCC 기탁 명칭 PTA-4099)로 나타내는 플라스미드의 발현 산물을 각각 포함하는 2개의 중쇄를 포함하고, 상기 항체의 각 투여는 상기 환자에게 상기 환자의 체중 ㎏ 당 0.1 ㎎ 내지 10 ㎎을 전달한다. 하나의 실시태양에서, 상기 환자를 HIV-1에 노출시켰다. 또 다른 실시태양에서, 상기 환자는 HIV-1에 노출될 위험이 있다.
본 발명은 또한 환자에게 소정의 간격으로 유효한 HIV-1 바이러스 부하 감소 용량의 (a) PRO 140으로 나타내는 인간화 항체, 또는 (b) (i) 상기 환자에서 CD4+CCR5+ 세포에 결합하고 상기와 같은 세포와 HIV-1과의 융합을 억제하며, (ii) PRO 140 이상의 효능으로 CD4+CCR5+ 세포와 HIV-1과의 융합을 억제하고, (iii) 상기 환자에서 상기와 같은 세포의 수를 감소시키지 않으면서 상기 환자에서 CD4+CCR5+ 세포를 피복하고/하거나 (iv) 상기 환자의 순환하는 β-케모카인의 혈장 농도 증가를 유발시키지 않으면서 상기 환자의 CD4+CCR5+ 세포에 결합하는 항-CCR5 수용체 단클론 항체를 투여하여 상기 환자의 HIV-1 바이러스 부하를 감소시킴을 포함하는, 항-HIV-1 요법의 형태에 내성을 나타낸 HIV-1 감염된 인간 환자에서 HIV-1 바이러스 부하를 감소시키는 방법을 제공하며, 여기에서 PRO 140은 (i) pVK:HuPRO140-VK(ATCC 기탁 명칭 PTA-4097)로 나타내는 플라스미드의 발현 산물을 각각 포함하는 2개의 경쇄, 및 (ii) pVg4:HuPRO140 HG2-VH(ATCC 기탁 명칭 PTA-4098)로 나타내는 플라스미드 또는 pVg4:HuPRO140(mut B+D+I)-VH(ATCC 기탁 명칭 PTA-4099)로 나타내는 플라스미드의 발현 산물을 각각 포함하는 2개의 중쇄를 포함하고, 상기 유효한 HIV-1 바이러스 부하 감소 용량은 상기 환자의 체중 ㎏ 당 0.1 ㎎ 내지 10 ㎎을 포함한다.
하나의 실시태양에서, 상기 항-HIV-1 요법의 형태는 비뉴클레오사이드 역 전사효소 억제제(NNRTI), 뉴클레오사이드 역 전사효소 억제제(NRTI), 프로테아제 억제제(PI), 융합 억제제, 또는 이들의 임의의 조합이다. 또 다른 실시태양에서, 상기 융합 억제제는 비 항체 CCR5 길항물질이다. 추가의 실시태양에서, 상기 비 항체 CCR5 길항물질은 소 분자 CCR5 길항물질이다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 소 분자 CCR5 길항물질을 경구 투여한다.
본 발명의 방법에서, 상기 항체를 상기 소 분자 CCR5 길항물질의 투여와 동시에, 이와 함께, 상기 투여 전에, 또는 상기 소 분자 CCR5 길항물질의 투여에 이어서 투여할 수 있다. 환자를 치료하기 위해서, 상기 환자에게 2개 이상의 작용제를 투여하는 것에 관하여, 각각의 작용제를 각각의 다른 작용제와 동일한 치료기간 내에 투여할 수 있다. 상기 작용제들을 함께, 동시에 및 동일하거나 상이한 조성물로 또는 동일하거나 상이한 투여 경로를 통해 투여할 수 있다. 한편으로, 각각의 작용제를 각각의 다른 작용제를 투여하는 경우와 상이한 투여 섭생(예를 들어 회수, 경로 및 양)을 통해 투여한다. 예를 들어, 2개의 투여 작용제(예를 들어 항체) 중 첫 번째 것을 1년의 치료 기간 동안 2주 간격으로 피하 주사를 통해 투여할 수 있는 반면, 상기 동일한 1년의 기간 동안, 두 번째 투여 작용제(예를 들어 소 분자)를 하루에 2회 경구 투여한다. 따라서, "동시 투여"는 하나의 치료 기간 내에 2개 이상의 작용제들을 투여함을 지칭한다.
본 발명은 또한 환자에게 (a) (i) 상기 환자의 CD4+ 세포의 표면상의 CCR5 수용체에 결합하고 (ii) 상기 환자의 CCR5+CD4+ 세포에 대한 HIV-1의 융합을 억제하는 항체, 및 (b) 비 항체 CCR5 수용체 길항물질을, 상기 환자를 치료하기에 유효한 양으로 투여함을 포함하는, HIV-1에 감염된 환자의 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 환자에게 (a) (i) 상기 환자의 CD4+ 세포의 표면상의 CCR5 수용체에 결합하고 (ii) 상기 환자의 CCR5+CD4+ 세포에 대한 HIV-1의 융합을 억제하는 항체, 및 (b) 비 항체 CCR5 수용체 길항물질을, 상기 환자에서 상기 HIV-1 관련된 장애의 개시 또는 진행을 억제하기에 유효한 양으로 투여함을 포함하는, 상기 환자에서 HIV-1 관련된 장애의 개시 또는 진행을 억제하는 방법을 제공하며, 상기의 억제는 상기 환자에서 CCR5+CD4+ 표적 세포에 대한 HIV-1의 융합을 억제함으로써 수행한다.
본 발명은 또한 환자에게 (a) (i) 상기 환자의 CD4+ 세포의 표면상의 CCR5 수용체에 결합하고 (ii) 상기 환자의 CCR5+CD4+ 세포에 대한 HIV-1의 융합을 억제하는 항체, 및 (b) 비 항체 CCR5 수용체 길항물질을, 상기 환자가 HIV-1 감염에 걸릴 가능성을 감소시키기에 유효한 양으로 투여함을 포함하는, 상기 환자가 HIV-1 감염에 걸릴 가능성을 감소시키는 방법을 제공한다. 하나의 실시태양에서, 상기 환자는 HIV-1에 노출되었다. 또 다른 실시태양에서, 상기 환자는 HIV-1에 노출될 위험이 있다.
본 발명은 또한 민감한 표적 세포에 대한 HIV-1 융합 및 상기 세포 내로의 침입에 대한, CCR5, 즉 항-CCR5 mAb 및 비 항체 CCR5 길항물질에 결합하는 독특한 화합물 부류의 병용 효과에 관한 것이다. 표적 세포의 HIV-1 감염의 상승작용적 억제는 이미 상이한 HIV-1 침입 억제제들의 병용을 사용하여 입증되었다. 그러나, 어떠한 선행 연구도 동일한 CCR5 보조수용체를 표적으로 하는 상이한 억제제 부류의 병용을 조사하지 않았다.
구체적으로, 본 발명은 또한 환자에게 (a) (i) 상기 환자의 CD4+ 세포의 표면상의 CCR5 수용체에 결합하고 (ii) 상기 환자의 CCR5+CD4+ 세포에 대한 HIV-1의 융합을 억제하는 항체, 및 (b) 비 항체 CCR5 수용체 길항물질을, 상기 환자를 치료하기에 유효한 양으로 투여함을 포함하는, HIV-1에 감염된 환자의 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 환자에게 (a) (i) 상기 환자의 CD4+ 세포의 표면상의 CCR5 수용체에 결합하고 (ii) 상기 환자의 CCR5+CD4+ 세포에 대한 HIV-1의 융합을 억제하는 항체, 및 (b) 비 항체 CCR5 수용체 길항물질을, 상기 환자에서 상기 HIV-1 관련된 장애의 개시 또는 진행을 억제하기에 유효한 양으로 투여함을 포함하는, 상기 환자에서 HIV-1 관련된 장애의 개시 또는 진행을 억제하는 방법을 제공하며, 상기의 억제는 상기 환자에서 CCR5+CD4+ 표적 세포에 대한 HIV-1의 융합을 억제함으로써 수행한다.
본 발명은 또한 환자에게 (a) (i) 상기 환자의 CD4+ 세포의 표면상의 CCR5 수용체에 결합하고 (ii) 상기 환자의 CCR5+CD4+ 세포에 대한 HIV-1의 융합을 억제하는 항체, 및 (b) 비 항체 CCR5 수용체 길항물질을, 상기 환자가 HIV-1 감염에 걸릴 가능성을 감소시키기에 유효한 양으로 투여함을 포함하는, 상기 환자가 HIV-1 감염에 걸릴 가능성을 감소시키는 방법을 제공한다. 하나의 실시태양에서, 상기 환자는 HIV-1에 노출되었다. 또 다른 실시태양에서, 상기 환자는 HIV-1에 노출될 위험이 있다.
본 발명은 또한 환자에게 HIV-1 억제 활성 증강량의 항-CCR5 수용체 단클론 항체를 HIV-1 억제 활성 증강량의 비 항체 CCR5 수용체 길항물질과 함께 투여함을 포함하는, 상기 환자에서 HIV-1 감염의 치료에서 상기 (i) 항-CCR5 수용체 단클론 항체 또는 (ii) 비 항체 CCR5 수용체 길항물질의 HIV-1 억제 활성을 증강시키는 방법을 제공하며, 여기에서 상기 조합은 HIV-1 감염의 억제에 대해 상승작용 효과를 생성시키고, 이에 의해 상기 (i) 항-CCR5 수용체 단클론 항체 또는 (ii) 비 항체 CCR5 수용체 길항물질의 억제 활성을 증강시킨다. 하나의 실시태양에서, 상기 상승작용 효과로 인해, 상기 비 항체 CCR5 수용체 길항물질은 상기 항-CCR5 수용체 단클론 항체의 대략 4 내지 10배 용량 감소를 발생시키며 상기 항-CCR5 수용체 단클론 항체는 상기 비 항체 CCR5 수용체 길항물질의 대략 3 내지 16배의 용량 감소를 발생시킨다.
또 다른 실시태양에서, 상기 방법은 HIV-1 억제 활성 증강량의 하나 이상의 비 항체 CCR5 수용체 길항물질을 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 방법은 HIV-1 억제 활성 증강량의 하나 이상의 항-CCR5 수용체 단클론 항체를 포함한다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 항-CCR5 수용체 단클론 항체 및 상기 비 항체 CCR5 수용체 길항물질을 상기 환자에게 동시 투여한다.
하나의 실시태양에서, 상기 단클론 항체는 PA14로 나타내는 하이브리도마 세포주(ATCC 수탁 번호 제HB-12610호)에 의해 생산된 PA14, 또는 상기 CCR5 수용체에 결합함에 있어서 단클론 항체 PA-14와 경쟁하는 항체이다. 또 다른 실시태양에서, 상기 단클론 항체는 PRO 140으로 나타내는 인간화 항체, 또는 상기 CCR5 수용체에 대한 결합에서 PRO 140과 경쟁하는 항체이며, 여기에서 PRO 140은 (i) pVK:HuPRO140-VK(ATCC 기탁 명칭 PTA-4097)로 나타내는 플라스미드의 발현 산물을 각각 포함하는 2개의 경쇄, 및 (ii) pVg4:HuPRO140 HG2-VH(ATCC 기탁 명칭 PTA-4098)로 나타내는 플라스미드 또는 pVg4:HuPRO140(mut B+D+I)-VH(ATCC 기탁 명칭 PTA-4099)로 나타내는 플라스미드의 발현 산물을 각각 포함하는 2개의 중쇄를 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 단클론 항체는 PRO 140으로 나타내는 인간화 항체가다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 단클론 항체는 CCR5mAb004 또는 2D7이다.
하나의 실시태양에서, 상기 비 항체 CCR5 수용체 길항물질은 SCH-D, TAK-779, TAK-652, UK-427,857, RANTES, GW873140, 또는 이들의 조합이다. 또 다른 실시태양에서, 상기 비 항체 CCR5 수용체 길항물질은 상기 CCR5 수용체에 대한 결합에서 SCH-D와 경쟁하는 작은 유기 분자이다. 또 다른 실시태양에서, 상기 비 항체 CCR5 수용체 길항물질은 상기 CCR5 수용체에 대한 결합에서 UK-427,857과 경쟁하는 작은 유기 분자이다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 비 항체 CCR5 수용체 길항물질은 상기 CCR5 수용체에 대한 결합에서 TAK-779와 경쟁하는 작은 유기 분자이다. 하나의 실시태양에서, 상기 비 항체 CCR5 수용체 길항물질은 상기 CCR5 수용체에 대한 결합에서 TAK-652와 경쟁하는 작은 유기 분자이다. 또 다른 실시태양에서, 상기 비 항체 CCR5 수용체 길항물질은 상기 CCR5 수용체에 대한 결합에서 GW873140과 경쟁하는 작은 유기 분자이다.
본 발명에 개시된 방법들 중 임의의 방법의 하나의 실시태양에서, 상기 항-CCR5 항체는 단클론 항체이다. 또 다른 실시태양에서, 상기 항체는 다클론 항체이다. 추가의 실시태양에서, 상기 항체는 인간화 항체가다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 항체는 인간 항체이다. 추가의 실시태양에서, 상기 항체는 키메릭 항체이다. 하나의 실시태양에서, 상기 항체는 휴먼 게놈 사이언스(Human Genome Sciences)에 의해 생산된, CCR5mAb004로 나타내는 항-CCR5 인간 항체이다.
단클론 항체 PA8, PA9, PA10, PA11, PA12 및 PA14를 분비하는 쥐 하이브리도마가, 특허 절차를 목적으로 미생물 기탁의 국제 승인에 대한 부다페스트 조약("부타페스트 조약")의 요구에 따라, 상기의 이행으로, 1998년 12월 2일자로 아메리칸 타입 컬처 콜렉션(American Type Culture Collection: ATCC)(10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209)에 하기의 수탁 번호로 기탁되었다: ATCC 수탁 번호 제HB-12605호(PA8), ATCC 수탁 번호 제HB-12606 호(PA9), ATCC 수탁 번호 제12607호(PA10), ATCC 수탁 번호 제HB-12608호(PA11), ATCC 수탁 번호 제HB-12609호(PA12) 및 ATCC 수탁 번호 제HB-12610호(PA14).
본 발명의 추가의 실시태양에서, 상기 단클론 항체는 PA14로 나타내는 하이브리도마 세포주(ATCC 수탁 번호 제 HB-12610호)에 의해 생산된 PA14, 또는 상기 CCR5 수용체에 대한 단클론 항체 PA-14의 결합과 경쟁하는 항체이다. 더욱 추가의 실시태양에서, 상기 단클론 항체는 단클론 항체 PA14가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체이다. 상기 동일한 에피토프에의 결합이 일어나는 경우, 경쟁적인 억제가 발생한다.
또 다른 실시태양에서, 상기 단클론 항체를 PA14로 나타내는 하이브리도마(ATCC 수탁 번호 제HB-12610호)에 의해 생산된 PA14, PA8로 나타내는 하이브리도마(ATCC 수탁 번호 제HB-12605호)에 의해 생산된 PA8, PA9로 나타내는 하이브리도마(ATCC 수탁 번호 제HB-12606호)에 의해 생산된 PA9, PA10로 나타내는 하이브리도마(ATCC 수탁 번호 제HB-12607호)에 의해 생산된 PA10, PA11로 나타내는 하이브리도마(ATCC 수탁 번호 제HB-12608호)에 의해 생산된 PA11, PA12로 나타내는 하이브리도마에 의해 생산된 PA12(ATCC 수탁 번호 제HB-12609호), 및 2D7(Wu et al., 1997)로 이루어진 그룹 중에서 선택된다. 추가의 실시태양에서, 상기 단클론 항체는 PA14이다.
당업자는 본 발명의 인간화 항체를 제조하는 방법을 알 것이다. 다양한 공보들(이들 중 다수는 본 출원에 참고로 반영된다)이 또한 인간화 항체의 제조 방법을 개시하고 있다. 예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호에 개시된 방법은 하나의 항체의 가변 부위 및 또 다른 항체의 불변 부위를 갖는 키메릭 항체의 생산을 포함한다.
미국 특허 제5,225,539호에는 인간화 항체의 생산을 위한 또 다른 접근법이 개시되어 있다. 상기 특허는 인간화 항체의 생산을 위한 재조합 DNA 기술의 용도를 개시하며, 여기에서 하나의 면역글로불린의 가변 영역의 CDR을, 상기 인간화 항체가 목적하는 표적은 인식하지만 상기 인간 환자의 면역계에 의해 중요한 방식으로 인식되지 않도록 상이한 특이성을 갖는 면역글로불린으로부터의 CDR로 대체시킨다. 구체적으로, 부위 지향된 돌연변이를 사용하여 상기 CDR을 상기 하부 틀(framework) 상에 이식한다.
항체를 인간화하기 위한 다른 접근법들이 미국 특허 제5,585,089호 및 제5,693,761호 및 PCT 국제 공보 제WO 90/07861호(인간화 면역글로불린의 제조 방법을 개시한다)에 개시되어 있다. 이들은 공여체 면역글로불린으로부터의 하나 이상의 CDR 및 가능한 추가의 아미노산 및 수용하는 인간 면역글로불린으로부터의 하부 틀 부위를 갖는다. 상기 특허들은 목적하는 항원에 대한 항체의 친화성을 증가시키는 방법을 개시한다. 상기 하부구조 중의 일부 아미노산들은 상기 수용체에서보다는 상기 공여체 중의 상기 위치들의 아미노산과 동일한 것으로 선택된다. 구체적으로, 상기 특허들은 마우스 단클론 항체의 CDR을 인간 면역글로불린 하부 틀 및 불변 부위들과 결합시킴으로써 수용체에 결합하는 인간화 항체를 제조함을 개시한다. 인간 하부 틀 부위를 상기 마우스 서열과의 상동성을 최대화하도록 선택할 수 있다. 컴퓨터 모델을 사용하여 상기 CDR 또는 특정 항원과 상호작용하는 듯한 상기 하부 틀 부위 중의 아미노산을 동정할 수 있으며 이어서 마우스 아미노산을 상기 위치에서 사용하여 인간화 항체를 생성시킬 수 있다. 상기 방법은 단지 당업자가 인간화 항체의 제조에 사용할 수 있는 방법들 중 일부를 예시한다.
완전한 인간 항체의 제조 방법들이 또한 당업자에게 널리 공지되어 있다. 예를 들어 완전한 인간 단클론 항체를 인간 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 유전자 좌의 큰 부분들에 대해 트랜스제닉인 동물들을 면역화시킴으로써 제조할 수 있다. 예를 들어 미국 특허 제5,591,669호, 제5,545,806호, 제5,545,807호, 제6,150,584호 및 상기 중에 인용된 참고문헌들을 참조하고, 이들의 내용은 본 발명에 참고로 인용된다. 이러한 트랜스제닉 동물들은 내생(예를 들어 쥐) 항체의 생산에서 기능 결실이 존재하도록 유전적으로 변경되었다. 상기 동물들을 그들의 면역화가 관심 항원에 대한 완전한 인간 항체를 생산하도록 인간 생식 계열 면역글로불린 유전자 좌의 전부 또는 일부를 함유하게 추가로 변형시킨다. 이들 동물의 면역화(예를 들어 XenoMouse(등록상표)(Abgenix), HuMAb-Mouse(등록상표)(Medarex/GenPharm))에 이어서, 단클론 항체를 표준 하이브리도마 기술에 따라 제조할 수 있다. 상기 단클론 항체들은 인간 면역글로불린 아미노산 서열을 가질 것이며 따라서 인간에게 투여 시 인간 항-마우스 항체(HAMA) 반응을 유발하지 않을 것이다.
생체 외 방법이 또한 인간 항체의 제조를 위해 존재한다. 상기는 파지 디스플레이 기술(미국 특허 제5,565,332호 및 제5,573,905호) 및 인간 B 세포의 생체 외 자극(미국 특허 제5,229,275호 및 제5,567,610호)을 포함한다. 상기 특허들의 내용은 본 발명에 참고로 인용된다.
인간화 PRO 140 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 핵산들이 ATCC에 기탁되어 있다. 구체적으로, 각각 pVK-HuPRO140, pVg4-HuPRO140(mut B+D+I) 및 pVg4-HuPRO140 HG2로 나타내는 플라스미드들이 각각 ATCC 수탁 번호 제PTA 4097호, 제PTA 4099호 및 제PTA 4098호로, 부다페스트 조약의 요구에 따라, 상기의 이행으로, 2002년 2월 22일자로 ATCC(Manassas, Virginia, 미국 20108)에 기탁되었다.
상기 방법들의 바람직한 실시태양에서, 상기 단클론 항체는 PRO 140으로 나타내는 인간화 항체 또는 CCR5 수용체에 대한 PRO 140의 결합과 경쟁하는 항체이며, 여기에서 PRO 140은 (i) 각각의 경쇄가 pVK:HuPRO140-VK(ATCC 기탁 명칭 PTA-4097)로 나타내는 플라스미드의 발현 산물을 포함하는 2개의 경쇄, 및 (ii) 각각의 중쇄가 pVg4:HuPRO140 HG2-VH(ATCC 기탁 명칭 PTA-4098)로 나타내는 플라스미드 또는 pVg4:HuPRO140(mut B+D+I)-VH(ATCC 기탁 명칭 PTA-4099)로 나타내는 플라스미드의 발현 산물을 포함하는 2개의 중쇄를 포함한다. 추가의 실시태양에서, 상기 단클론 항체는 항체 PRO 140이 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 인간화 또는 인간 항체이다. 또 다른 실시태양에서, 상기 단클론 항체는 PRO 140으로 나타내는 인간화 항체가다. 추가의 실시태양에서, 상기 단클론 항체는 CCR5mAb004로 나타내는 인간 항체이다(Roschke et al., 2004; HGS Press Release, 2004; 2005).
본 발명에 개시한 방법들의 하나의 실시태양에서, 상기 항체의 일부는 상기 항체의 경쇄를 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 항체의 상기 부분은 상기 항체의 중쇄를 포함한다. 추가의 실시태양에서, 상기 항체의 상기 부분은 상기 항체의 Fab 부분을 포함한다. 추가의 실시태양에서, 상기 항체의 상기 부분은 상기 항체의 F(ab')2 부분을 포함한다. 추가의 실시태양에서, 상기 항체의 상기 부분은 상기 항체의 Fd 부분을 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 항체의 상기 부분은 상기 항체의 Fv 부분을 포함한다. 추가의 실시태양에서, 상기 항체의 상기 부분은 상기 항체의 가변 영역을 포함한다. 더욱 추가의 실시태양에서, 상기 항체의 상기 부분은 상기 항체의 하나 이상의 CDR 영역을 포함한다. 더욱 추가의 실시태양에서, 상기 항체의 상기 부분은 상기 항체의 6개의 CDR 영역을 포함한다.
상기 방법들의 하나의 실시태양에서, 상기 항체를 환자에게 수 회 투여하며, 상기 항체의 각 투여는 상기 환자에게 체중 ㎏ 당 0.01 ㎎ 내지 50 ㎎의 항체를 전달한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 항체의 각 투여는 상기 환자에게 체중 ㎏ 당 0.05 ㎎ 내지 25 ㎎의 항체를 전달한다. 추가의 실시태양에서, 상기 항체의 각 투여는 상기 환자에게 체중 ㎏ 당 0.1 ㎎ 내지 10 ㎎의 항체를 전달한다. 더욱 추가의 실시태양에서, 상기 항체의 각 투여는 상기 환자에게 체중 ㎏ 당 0.5 ㎎ 내지 5 ㎎의 항체를 전달한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 항체의 각 투여는 상기 환자에게 체중 ㎏ 당 1 ㎎ 내지 3 ㎎의 항체를 전달한다. 바람직한 실시태양에서, 상기 항체의 각 투여는 상기 환자에게 체중 ㎏ 당 약 2 ㎎의 항체를 전달한다.
하나의 실시태양에서, 상기 항체를 수 회 투여하며, 상기 항체의 처음 투여는 1주 미만의 간격에 의해 상기 항체의 후속 투여와 분리된다. 또 다른 실시태양에서, 상기 항체의 처음 투여는 1주 이상의 간격에 의해 상기 항체의 후속 투여와 분리된다. 추가의 실시태양에서, 상기 항체의 처음 투여는 1주의 간격에 의해 상기 항체의 후속 투여와 분리된다. 또 다른 실시태양에서, 상기 항체의 처음 투여는 2 내지 4주 간격에 의해 상기 항체의 후속 투여와 분리된다. 바람직한 실시태양에서, 상기 항체의 처음 투여는 2주 간격에 의해 상기 항체의 후속 투여와 분리된다. 추가의 실시태양에서, 상기 항체의 처음 투여는 4주 간격에 의해 상기 항체의 후속 투여와 분리된다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 항체를 수 회 투여하며, 상기 항체의 처음 투여는 1개월 이상의 간격에 의해 상기 항체의 후속 투여와 분리된다.
추가의 실시태양에서, 상기 항체를 정맥 내 주입을 통해 환자에게 투여한다. 바람직한 실시태양에서, 상기 항체를 피하 주사에 의해 환자에게 투여한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 항체를 근육 내 주사를 통해 환자에게 투여한다.
본 방법들의 하나의 실시태양에서, 상기 비 항체 CCR5 수용체 길항물질은 작은 유기 분자이다. 또 다른 실시태양에서, 상기 CCR5 수용체 길항물질을 SCH-D, UK-427,857, TAK-779, TAK-652, GW873140 및 RANTES로 이루어진 그룹 중에서 선택한다. 추가의 실시태양에서, 상기 CCR5 수용체 길항물질은 상기 CCR5 수용체에 대한 SCH-D의 결합과 경쟁하는 작용제이다. 더욱 추가의 실시태양에서, 상기 CCR5 수용체 길항물질은 상기 CCR5 수용체에 대한 UK-427,857의 결합과 경쟁하는 작용제이다. 또 다른 실시태양에서, 상기 CCR5 수용체 길항물질은 상기 CCR5 수용체에 대한 TAK-779의 결합과 경쟁하는 작용제이다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 CCR5 수용체 길항물질은 상기 CCR5 수용체에 대한 TAK-652의 결합과 경쟁하는 작용제이다. 추가의 실시태양에서, 상기 CCR5 수용체 길항물질은 상기 CCR5 수용체에 대한 GW873140의 결합과 경쟁하는 작용제이다.
본 발명에 개시한 방법들의 추가의 실시태양에서, 상기 CCR5 수용체 길항물질을 수 회 투여하며 상기 CCR5 수용체 길항물질의 각 투여는 환자에게 0.5 ㎎ 내지 2,500 ㎎의 상기 길항물질을 전달한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 CCR5 수용체 길항물질의 각 투여는 환자에게 5 ㎎ 내지 1,250 ㎎의 상기 길항물질을 전달한다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 CCR5 수용체 길항물질의 각 투여는 환자에게 5 ㎎ 내지 15 ㎎의 상기 길항물질을 전달한다. 추가의 실시태양에서, 상기 CCR5 수용체 길항물질의 각 투여는 환자에게 50 ㎎ 내지 1,250 ㎎의 상기 길항물질을 전달한다. 더욱 추가의 실시태양에서, 상기 CCR5 수용체 길항물질의 각 투여는 환자에게 200 ㎎ 내지 800 ㎎의 상기 길항물질을 전달한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 CCR5 수용체 길항물질의 각 투여는 환자에게 300 ㎎ 내지 600 ㎎의 상기 길항물질을 전달한다.
소 분자 CCR5 수용체 길항물질은 그의 급속한 제거로 인해, 상기 바이러스에 대한 선택적인 압박을 유지시키기 위해서 적어도 매일 또는 매일 2회의 투여를 요한다. 표 3은 현재 임상 시험 중인 다양한 소 분자 CCR5 길항물질을 사용하는 투여 섭생을 요약한다. 본 방법들의 하나의 실시태양에서, 상기 CCR5 수용체 길항물질을 환자에게 하루에 1회 이상 경구 투여한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 CCR5 수용체 길항물질을 환자에게 하루에 1회 또는 2회 경구 투여한다. 추가의 실시태양에서, 상기 CCR5 수용체 길항물질을 하루에 3회 또는 그 이하로 경구 투여한다.
임상 시험 중인 소 분자 CCR5 수용체 길항물질의 투여 섭생
화합물 용량 임상 시험
SCH-D 매일 5 내지 15 ㎎ II 기
UK-427,857 매일 또는 매일 2회 300 ㎎ II 및 III 기
GW873140 매일 1회 50 내지 1200 ㎎, 또는 매일 또는 매일 2회 200 내지 800 ㎎ II 기
용량은 국립 알러지 및 감염 질병 학회(NIAID)가 후원하는 www.clinicaltrials.gov 웹 사이트에서 CCR5 길항물질에 대해 나타나있다. GW873140에 대한 용량 정보를 데마레스트 등(Demarest et al. 2004)으로부터 얻었다.
추가로, 본 방법들의 하나의 실시태양은 환자에게 하나 이상의 항-HIV-1, 레트로바이러스 억제제를 투여함을 또한 포함한다. 1987년, 상기 뉴클레오사이드 동족체 역 전사효소 억제제(NRTI) AZT(지도뷰딘)의 승인 이래로, 상기 HIV-1 의료 세트장비는 4개의 치료 부류를 나타내는 21개 이상의 약물 및 전구약물, 즉 8개의 NRTI, 3개의 비 뉴클레오사이드 역 전사효소 억제제(NNRTI), 9개의 프로테아제 억제제(PI) 및 하나의 융합 억제제(FI)로 성장하였다(표 4 참조). 또 다른 실시태양에서, 상기 레트로바이러스 억제제는 비 뉴클레오사이드 역 전사효소 억제제(NNRTI), 뉴클레오사이드 역 전사효소 억제제(NRTI), 프로테아제 억제제(PI), 융합 억제제, 또는 이들의 임의의 조합이다. 추가의 실시태양에서, 상기 하나 이상의 레트로바이러스 억제제는 표 4에 나타낸 작용제들 중 하나 또는 이들 작용제의 임의의 조합이다. 다양한 레트로바이러스 억제제들이 보다 강력한 요법을 위해 병행 시판된다(상기와 같은 병행 및 투여 섭생에 대해 표 5를 참조하시오). 본 방법들의 실시태양에서, 레트로바이러스 억제제를 환자에게 표 5에 나타낸 양으로 투여한다. 바람직한 실시태양에서, 상기 레트로바이러스 억제제는 NNRTI 또는 PI이다.
본 발명의 또 다른 실시태양에서, 상기 환자는 치료 경험이 없다, 즉 상기 환자는 이전에 어떠한 항-HIV-1, 레트로바이러스 억제제 치료를 받은 적이 없다. 바람직한 실시태양에서, 상기 환자는 치료 경험이 있다, 즉 상기 환자는 하나 이상의 항-HIV-1, 레트로바이러스 억제제, 예를 들어 표 4에 나타낸 하나 이상의 작용제로 치료를 받았고/받았거나 치료 중이다. 바람직한 실시태양에서, 본 방법들을 HIV-1 감염의 치료를 위한 병행 요법 프로그램에 사용하며, 여기에서 항-CCR5 mAb 및 비 항체 CCR5 길항물질을 상기와 같은 치료가 필요한 환자에게 하나 이상의 레트로바이러스 억제제와 함께 투여한다.
승인된 HIV-1 억제제
억제제 제조사
뉴클레오사이드 역 전사효소 억제제(NRTI)
레트로비어(등록상표)(AZT) 글락소스미스클라인(GlaxoSmithKline)
에피비어(등록상표)(3TC) 글락소스미스클라인
엠트리바(등록상표)(엠트리시타빈) 질리드 사이언스(Gilead Sciences)
히비드(등록상표)(ddC) 호프만-라 로슈(Hoffmann-La Roche)
비덱스(등록상표)(ddI) 브리스톨-마이어스 스큅(Bristol-Myers Squibb)
비리드(Viread)(등록상표)(테노포비어 DF) 질리드 사이언스
제리트(등록상표)(d4T) 브리스톨-마이어스 스큅
지아겐(등록상표)(아바카비어) 글락소스미스클라인
비 뉴클레오사이드 역 전사효소 억제제(NNRTI)
레스크립터(등록상표)(델라비르딘) 화이자
수스티바(등록상표)(에파비렌즈) 브리스톨 마이어스 스큅
비라뮨(등록상표)(네비라핀) 베링거 인겔하임(Boehringer Ingelheim)
프로테아제 억제제(PI)
아제네라제(등록상표)(암프레나비어) 글락소스미스클라인/베어텍스(Vertex)
압티부스(등록상표)(티프라니비어)a 베링거 인겔하임
크릭시반(등록상표)(인디나비어) 머크 앤드 캄파니(Merck & Co.)
인비라제(등록상표)(사퀴나비어) 호프만-라 로슈
렉시바(등록상표)(포삼프레나비어) 글락소스미스클라인/베어텍스
로피나비어b 애보트 레보라토리즈(Abbott Laboratories)
노르비어(등록상표)(리토나비어) 애보트 레보라토리즈
레이아타즈(등록상표)(아타자나비어) 브리스톨 마이어스 스큅
비라셉트(등록상표)(넬피나비어) 화이자
융합 억제제(Fis)
퓨제온(등록상표)(T-20) 트리메리스(Trimeris)/호프만-라 로슈
a압티부스(등록상표)의 치료 수준을 증대시키기 위해서 리토나비어와 함께 투여됨 b칼레트라(등록상표)라는 상표명으로 오직 리토나비어와 함께 판매됨
판매되는 HIV-1 바이러스 억제제의 투여 섭생
일반명 상표/다른명칭 용량* 제형 제조사 승인날짜
비 뉴클레오사이드 역 전사효소 억제제(NNRTI)
델라비르딘 레스크립터,DLV 400(4×100또는2×200)㎎ tid 정제 화이자 04/04/97
에파비렌즈 수스티바,EFV 600㎎ qd 정제 브리스톨 마이어스 스큅 09/17/98
네비라핀 비라뮨,NVP 200㎎ bid(qd first 2 wks of Rx) 정제 베링거 인겔하임 06/21/96
뉴클레오사이드 역 전사효소 억제제(NRTI)
아바카비어 지아겐,ABC 600(2×300)㎎ qd또는 300㎎ bid 정제 글락소스미스클라인 12/17/98
아바카비어, 라미뷰딘 에프지콤 **600/300㎎ qd 정제 글락소스미스클라인 08/02/04
아바카비어, 라미뷰딘, 지도뷰딘 트리지비어 **300/150/300㎎ qd 정제 글락소스미스클라인 11/14/00
디다노신 비덱스,ddi,비덱스 EC 400㎎ qd(≥60㎏)또는 250㎎ qd(<60㎏) 지연된 방출 캡슐 브리스톨 마이어스 스큅 10/09/91; 10/31/00(EC)
엠트리시타빈 엠트리바,FTC, 코비라실 200㎎ qd 캡슐 질리드 사이언스 07/02/03
엠트리시타빈T 에노포비어DF 트루바다 **200/300㎎ qd 정제 질리드 사이언스 08/02/04
라미뷰딘 에피비어,3TC 300㎎ qd 또는 150㎎ bid 정제 글락소스미스클라인 11/17/95
라미뷰딘, 지도뷰딘 콤비비어 **150/300㎎ bid 정제 글락소스미스클라인 09/27/97
스타뷰딘 제리트,d4T 40㎎ qd(≥60㎏)또는 30㎎ qd(<60㎏) 캡슐 브리스톨 마이어스 스큅 06/24/94
테노포비어 비리드,TDF 300㎎ qd 정제 질리드 사이언스 10/26/01
잘시타빈 히비드,ddC 0.750㎎ tid 정제 호프만-라 로슈 06/19/92
지도뷰딘 레트로비어,AZT, ZDV 300㎎ bid 또는 200(2×100)㎎ tid 정제 또는 캡슐 글락소스미스클라인 03/19/87
프로테아제 억제제(PI)
암프레나비어 아제네라제,APV 1200(8×150)㎎ bid 캡슐 GSK, 베어텍스 04/15/99
아타자나비어 레이아타즈,ATV 무투약pts:400(2×200)㎎ qd ------------------ 구조:300(2×150)㎎ qd w/리토나비어 100㎎ qd 캡슐 브리스톨 마이어스 스큅 06/20/03
포삼프레나비어 렉시바,FPV 1400(2×700)㎎ bid 정제 GSK, 베어텍스 10/20/03
인디나비어 크릭시반,IDV 800(2×400)㎎ tid 캡슐 머크 03/13/96
로피나비어, 리토나비어 칼레트라,LPV/r **400/100(3×133.3/33.3)㎎ bid 캡슐 애보트 레보라토리즈 09/15/00
넬피나비어 비라셉트,NFV 1250㎎(5×250또는 2×625) bid 또는 750㎎ (3×250)tid 정제 아구론 03/14/97
리토나비어 노르비어,FTV 600(6×100)㎎ bid 캡슐 애보트 레보라토리즈 03/01/96
사퀴나비어 포르토바제,SQV 1200(6×200)㎎ tid 캡슐 호프만-라 로슈 11/07/97
인비라제 1000(5×200)㎎ bid w/리토나비어 100㎎ bid 캡슐 호프만-라 로슈 12/06/95
티프라니비어 압티부스 1000(2×250)㎎ bid w/리토나비어(2×100)㎎ bid 캡슐 베링거 인겔하임 06/23/05
융합 억제제(FI)
엔푸비르타이드 퓨제온 T-20 sc:90㎎(1㎖)bid 재조성 용액 호프만-라 로슈,트리메리스 03/13/03
*병행 요법에 대해 조절되지 않은 성인 용량; 투여 경로: 달리 나타내지 않는 한 po **단일 제형으로 투여되는 병행 요법 범례: qd = 매일 1회 bid = 매일 2회 tid = 매일 3회 po = 경구투여 sc = 피하 투여
본 발명은 또한 (a) (i) CCR5 수용체에 결합하고 (ii) HIV-1의 CCR5+CD4+ 세포에의 융합을 억제하는 단클론 항체(예를 들어 PRO 140) 및 (b) 비 항체 CCR5 수용체 길항물질(예를 들어 SCH-D, UK-427,857, TAK-779, TAK-652, GW873140 및 RANTES 중 어느 하나)을 포함하는 물질의 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명은 또한 (i) CCR5 수용체에 결합하고 (ii) HIV-1의 CCR5+CD4+ 세포에의 융합을 억제하는 단클론 항체(예를 들어 PRO 140)가 HIV-1의 CCR5+CD4+ 세포에의 융합을 억제하는 것에 대해서 비 항체 CCR5 수용체 길항물질과 상승작용적으로 반응하는지의 여부를 결정하는 방법을 제공하며, 이때 상기 방법은 하기 상세히 나타내는 실험 방법들에 따라 상기와 같은 상승작용의 존재 또는 부재를 결정함을 포함한다. 최종적으로, 본 발명은 별도로 구획 및 바람직하게는 쉽게 투여 가능한 형태로, (a) (i) CCR5 수용체에 결합하고 (ii) HIV-1의 CCR5+CD4+ 세포에의 융합을 억제하는 단클론 항체(예를 들어 PRO 140) 및 (b) 비 항체 CCR5 수용체 길항물질(예를 들어 SCH-D, UK-427,857, TAK-779, TAK-652, GW873140 및 RANTES 중 어느 하나)을 포함하는, 상기 방법들을 수행하기 위한 키트를 제공한다. 상기 항체 및 길항물질을 각각 바람직하게는 약학적으로 허용 가능한 담체와 혼합한다.
도 1
인간화 PRO 140은 바이러스를 강력하게 억제한다. 쥐 및 인간화 PRO 140의 생체 외 중화 활성을 완전 바이러스 복제 분석을 사용하여 4개의 주요 R5 HIV-1 단리물에 대해 시험하였다. 상기 데이터는 8개 이상의 독립적인 분석으로부터의 중간값을 반영한다. 상기 바이러스의 유전자 서브유형을 괄호 안에 나타낸다.
도 2
바이러스 억제 활성은 표적 세포와 독립적이다. 3개의 주요 R5 HIV-1 단리 물에 의한 4개의 상이한 표적 세포의 감염 억제를 시험하였다.
도 3
PRO 140에 대한 생체 외 HIV-1 민감성을 페노센스(PhenoSense)TM 침입 분석을 사용하여 정량분석하였다. PRO 140을 바이로로직 인코포레이티드(ViroLogic, Inc.)에서 페노센스 HIV 엔트리TM 분석으로 20개의 주요 HIV-1 단리물에 대한 활성에 대해 시험하였다. 약물 민감성을 IC50 값으로서 보고하며, 상기 값은 바이러스 감염성을 50% 억제하는데 필요한 농도를 나타낸다.
도 4
PRO 140은 HIV-1을 차단하지만 케모카인 신호전달은 차단하지 않는다. L1.2-CCR5 세포에서 RANTES-유도된 칼슘 이동의 억제 및 PBMC 배양물에서 HIV-1JR -FL 복제의 억제에 대한 PRO 140의 효과를 측정하였다. 유사한 결과가 MIP-1α 및 MIP-1β에 대해 획득되었다.
도 5
PRO 140은 HIV-1 감염된 마우스에서 바이러스 복제의 장기적인 관리를 제공한다. SCID 마우스를 정상적인 인간 말초 혈액 단핵구로 복원시키고 2주 후에 HIV-1JR-CSF로 감염시켰다. PRO 140의 수회 용량을 정상 상태의 바이러스 수준의 달성에 이어서 투여하였다. 주사 전 및 후의 혈장 바이러스 부하를 나타낸다.
도 6
PRO 140은 CCR5 림프구를 피복하지만 고갈시키지 않는다. 건강한 남성 지원자(n=4)를 2 ㎎/㎏ 용량 수준으로 PRO 140의 1회 정맥 내 주입에 의해 처리하였다. 상기 처리 후 지시된 시간에서 채혈하여 CCR5 림프구 수준에 대해 분석하였다. 상기 그룹 평균값과 표준 편차를 나타낸다.
도 7
PRO 140의 혈청 농도를 나타낸다. 건강한 남성 지원자를 지시된 바와 같이, 0.1, 0.5 및 2.0 ㎎/㎏의 용량 수준으로 PRO 140의 1회 정맥 내 주입에 의해 처리하였다. 상기 처리 후 지시된 시간에서 혈청을 수거하고, 저온보존하고, PRO 140 수준에 대해 분석하였다. 개별적인 환자들에 대한 데이터를 나타낸다.
도 8
PRO 140은 혈장 케모카인 수준에 영향을 미치지 않는다. 건강한 남성 지원자를 0.1 ㎎/㎏의 PRO 140(코호트 1), 0.5 ㎎/㎏의 PRO 140(코호트 2) 또는 부합되는 위약을 1회 정맥 내 주입하여 처리하였다. 상기 처리 후 지시된 시간에서 혈장을 수거하고, 저온 보존하고, RANTES의 수준에 대해 분석하였다. 상기 분석의 정량화에 대한 하한은 415 pg RANTES/㎖ 혈장이었다. 데이터는 그룹 평균값을 나타낸다.
도 9
SCH-D의 화학 합성에 대한 반응식
도 10
TAK-779의 화학 합성에 대한 반응식을 나타낸다. 상기 방법은 문 헌[Shiraishi et al., 2000]에 개시된 바와 같다.
도 11
UK-427,857의 화학 합성에 대한 반응식을 나타낸다. 상기 방법은 2001년 11월 29일에 공개된 PCT 국제 공보 제WO 01/90106 A2호에 개시된 바와 같다.
도 12
HIV-1 융합의 상승작용적 억제는 상이한 화합물들과 함께 PRO 140에 의해 나타났다. PRO 140과 소 분자, 펩타이드, mAb, 및 HIV-1 융합의 억제를 위한 CCR5, CD4, gp120 및 gp41 표적의 키메릭 CD4-면역글로불린 억제제 간의 상호작용을 RET 분석을 사용하여 평가하였다. 95% 신뢰도 구간의 평균 병용 지수(Combination Index; CI) 값을 1:1 몰 비로 병용된 화합물들을 사용하여 획득한 데이터에 대해 플롯팅한다. <1의 CI 값은 상승작용적 상호작용을 가리키고; 1의 CI 값은 부가적인 상호작용을 가리키며; >1의 CI 값은 길항적인 상호작용을 가리킨다.
도 13
PRO 140은 림프구를 피복하지만 고갈시키지 않는다. 건강한 남성 지원자(n=4)를 5 ㎎/㎏의 용량 수준으로 PRO 140의 1회 정맥 내 주입에 의해 처리하였다. 상기 처리 후 지시된 시간에서 채혈하여 CCR5 림프구 수준에 대해 분석하였다. 상기 그룹 평균값과 표준 편차를 나타낸다.
도 14
PRO 140은 소 분자 CCR5 길항물질에 내성인 HIV-1 균주에 대해 활성이다. AD101(SCH-C와 구조적으로 관련된 소 분자 CCR5 억제제) 및 SCH-D(Kuhmann et al., 2004; Maroznan et al., 2005)에 대해 내성인 HIV-1의 변체들을 항-CCR5 mAb, PA14에 대한 감수성에 대해 시험하였다. 주요 CD4+ T-세포에서 바이러스 복제 정도를 임의의 억제제의 부재 하에서 p24 항원 생산에 대해 나타낸다(100%로서 정의된다). 개별적인 데이터 점은 4개의 개별 실험들로부터 유도된 값들의 평균이었으며, 이들을 각각 중복 웰을 사용하여 수행하였다. 상기 데이터는 AD101 및 SCH-D 내성 HIV-1 변체들이 각각 SCH-C 및 SCH-D에 대해 내성인 반면, 이들 변체들의 복제는 PA14에 의해 강력하게 억제됨을 보인다(Maroznan et al. 2005).
도 15
CCR5 억제제들의 병용에 의한 HIV-1JR - FL 피막-매개된 막 융합의 억제에 대한 용량 반응 곡선을 나타낸다. 희석물들을 삼중 웰에서 분석하였으며, 데이터 점들은 복제물의 평균 및 표준 편차를 나타낸다. (A) PRO 140 및 UK-427,857을 지시된 농도 범위에 걸쳐 1:1의 고정된 몰 비에서 개별적으로 시험하였다. 묘사된 실험에서, IC50 및 IC90 값은 PRO 140에 대해 2.9 nM 및 11 nM이고, UK-427,857에 대해 5.0 nM 및 21 nM이며, 병용의 경우 2.1 nM 및 4.6 nM이었다. CI50 및 CI90 값은 각각 0.58 및 0.32이었다. (B) SCH-D 및 UK-427,857을 지시된 농도 범위에 걸쳐 1:1의 고정된 몰 비에서 개별적으로 시험하였다. 묘사된 실험에서, IC50 및 IC90 값은 SCH-D에 대해 5.5 nM 및 34 nM이고, UK-427,857에 대해 9.7 nM 및 59 nM이며, 병용의 경우 6.1 nM 및 31 nM이었다. CI50 및 CI90 값은 각각 0.87 및 0.73이었다.
도 16
비표식 PRO 140, UK-427,857 및 SCH-D에 의한 PRO 140-PE의 CEM.NKR-CCR5 세포에 대한 결합 억제를 나타낸다. CEM.NKR-CCR5 세포를 다양한 농도의 비표식 PRO 140, UK-427,857 또는 SCH-D와 함께 PBSA 완충제 중에서 실온에서 30분간 배양한 후에 추가로 30분간 5 nM PRO 140-PE를 첨가하였다. 세포를 세척하고, 이어서 PRO 140-PE의 양(+)의 결합이 허용된(gated) 세포의 퍼센트와 결합의 평균 형광 강도(MFI) 모두에 대해 유식 세포측정에 의해 분석하였다. 억제를 MFI(A) 및 허용된 세포 퍼센트(B) 모두를 근거로 평가하였다.
도 17
비표식 UK-427,857, SCH-D 및 PRO 140에 의한 3H-UK-427,857 결합의 억제를 나타낸다. (A) CEM.NKR-CCR5 세포를 다양한 농도의 비표식 UK-427,857, SCH-D 또는 PRO 140과 함께 PBSA 완충제 중에서 주변 온도에서 30분간 예비 배양한 후에 추가로 30분간 2 nM 3H-UK-427,857을 첨가하였다. 세포를 세척하고, 이어서 섬광 계수측정에 의해 방사능에 대해 분석하였다. (B) 상기 분석 조건 하에서 UK-427,857의 안정성을, CEM.NKR-CCR5 세포를 2 nM 3H-UK-427,857과 함께 예비 배양한 후에 세척하고, 비표식 화합물들을 30분간 첨가하고 상술한 바와 같이 처리함으로써 조사하였다.
하기의 상세한 실험 내용들을 본 내용의 주제의 이해를 돕기 위해 나타내지 만, 그 후에 이어지는 청구의 범위를 어떠한 식으로도 제한하고자 하지 않으며 제한하는 것으로 해석해서도 안 된다.
상세한 실험 내용
파트 I
물질 및 방법
화합물 및 mAb
PRO 140을 2 mM L-글루타민(Invitrogen, carlsbad, CA)이 보충된 하이브리도마 혈청 비 함유 배지를 사용하여 Sp2/0 세포에서의 발현에 의해 제조하였다. 벌크 mAb를 5.0 ㎛ 깊이 필터(Sartorius, Goettingen, Germany)를 사용하여 등명하게 한 다음 0.2 ㎛ 멸균 등급 필터(Sartorius) 상에 통과시켰다. 상기 mAb를 먼저 친화성 컬럼(MabSelect Protein A 컬럼, Amersham, Piscataway, NJ) 상에 통과시키고 이어서 이온 교환 크로마토그래피(SP 세파로스 양이온 교환 수지, Amersham)에 의해 정제하였다. PRO 140을 바이레솔브(Viresolv)TM 10 옵티캡(Opticap) NFP 캡슐(Millipore, Bilerica, MA)에 이어서 0.2 ㎛ 필터를 사용하여 나노여과하고 일회용 TFF 카트리지(Millipore) 상에서 농축/여과하였다. 이어서 상기 mAb를 하이드록시아파타이트 컬럼(Bio-Rad, Hercules, CA) 상에서 연마하고, 포스페이트 완충된 염수 중에서 10 ㎎/㎖로 농축시키고 사용 전에 -70℃ 이하에서 보관하였다.
RANTES를 R&D 시스템스(Minneapolis, MN)로부터 구입하였다. 상기 항-CCR5 mAb 2D7을 BD 바이오사이언스(목록 번호 #555993)로부터 구입하고, 상기 항-CCR5 mAb CTC5를 R&D 시스템스(목록 번호 #FAB 1802P)로부터 구입하였다.
RET 분석
HIV-1 RET 분석은 앞서 상세히 개시되었다(Litwin et al., 1996). 간단히, 플루오레세인 옥타데실 에스터(F18; Molecular Probes, Eugene, OR; 에탄올 중의 5 ㎎/㎖)를 10% 소 태아 혈청(FBS; HyClone, Logan, UT)이 있는 DMEM 표식 배지(DMEM; Invitrogen, Carlsbad, CA)에서 1:800으로 희석하고, 0.34±10%의 A506으로 조절하였다. 옥타데실 로다민 B 클로라이드(R18; Molecular Probes; 에탄올 중의 10 ㎎/㎖)를 표식 배지에서 1:2050으로 희석하고 0.52±10%의 A565로 조절하였다. 상기 두 염료를 모두 T75-㎠ 플라스크에서 세포에 첨가하여 2배 추가 희석하였다. HeLa-EnvJRFL 및 CEM NKR-CCR5 세포를 각각 F18- 및 R18-함유 배양 배지에서 밤새 배양하였다. 그 다음날, HeLa-EnvJRFL 세포로부터 배지를 제거하고 10 ㎖의 0.5 mM EDTA를 가하고 37℃에서 5분간 배양하였다. EDTA를 제거하고 상기 플라스크를 추가로 5분간 상기 배양기로 복귀시킨 다음 상기 플라스크를 스트리킹하여 세포를 제거하였다. 15% FBS가 있는 10 ㎖의 PBS를 상기 플라스크에 가하고 내용물을 50 ㎖ 원추형 원심분리기 튜브로 옮겼다. CEM NKR-CCR5 세포 현탁액을 별도의 50 ㎖ 원추형 원심분리기 튜브에 직접 가하였다. 상기 두 세포주를 모두 300 × g에서 5분간 원심분리시켰다. 상등액은 버리고 세포를 10 ㎖의 PBS-/15% FBS에 재 현탁시켰다. 상기 원심분리/세척 단계를 2회 반복하고, 그 후에 상기 세포를 카운 트하고 농도를 1.5 × 106 세포/㎖로 조절하였다. 각 세포 유형 10 ㎕(15,000 세포)를 384-웰 플레이트의 웰에 시딩하였다. 억제제 화합물을 그 후에 바로 가하여 최종 웰 부피를 40 ㎕로 만들고, 상기 플레이트를 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. 화합물들을 일련의 희석비에 걸쳐 고정된 몰 비 또는 질량 비에서 개별적으로 및 병행하여 시험하였다. 이어서 상기 플레이트를 표 6에 나타낸 여기/방출 필터 조합을 사용하여 형광 플레이트 판독기(Victor2, Perkin Elmer, Boston, MA) 상에서 판독하였다.
RET 분석을 위한 여기/방출 필터 조합
스캔 번호 여기 파장 방출 파장
1 450 ㎚/50 ㎚ 530 ㎚/25 ㎚
2 530 ㎚/25 ㎚ 590 ㎚/35 ㎚
3 450 ㎚/50 ㎚ 590 ㎚/35 ㎚
"RET %"를 하기 식에 따라 배경(블랭크) 판독치를 감한 후에 계산하였다:
RET% = 100 × [(A3-(A1 × Fspill)-(A2 × Rspill)/A2]
상기 식에서,
Fspill = HeLa 세포 단독, 스캔 3/스캔 1;
Rspill = CEM 세포 단독, 스캔 3/스캔 2;
A1 = HeLa 및 CEM 세포 병행 시 스캔 1;
A2 = HeLa 및 CEM 세포 병행 시 스캔 2; 및
A3 = HeLa 및 CEM 세포 병행 시 스캔 3.
"억제%"는 하기 식에 따라 계산하였다:
억제% = 100 × [(Max RET% - 샘플 웰에 대한 RET%)/(Max RET% - Min RET%)]
상기 식에서,
Max RET% = 억제제의 첨가 없이 HeLa 및 CEM 세포 조합에 대한 RET% 값의 평균%; 및
Min RET% = Leu-3a mAb(CD4를 표적화하고 상기 RET 분석에서 하기 농도에서 융합을 완전히 차단하는 항체) 500 ng/㎖의 존재 하에서 HeLa 및 CEM 세포 조합에 대한 RET% 값의 평균%.
50% 억제(IC50) 값을, 상기 억제 데이터를 비-선형, 4개 매개변수, 가변 기울기 식(GraphPad Prism, ver.4.02; GraphPad Software, San Diego, CA)에 대입시켜 측정하였다. 상한 및 하한 억제 값을 각각 곡선 대입에 대해 100% 및 0%로 제한하였다.
PBMC 의 제조
확실한 HIV-1의 복제를 상기 연구를 위해 단핵구/대식세포-향성 HIV-1 클론, JRFL(HIV-1JRFL)을 사용하여 활성화된 말초 혈액 단핵구(PBMC)에서 측정한다.
PBMC를 피콜(Ficoll) 구배로 원심분리에 의해 4개의 개별 공여체(Leukopacks)로부터 단리한다. CD8 세포를 RosetteSep CD8 고갈 칵테일(#15663, StemCell Research, Vancouver, BC)을 사용하여 고갈시킨다. 세포를 4 × 106/㎖로 희석하고 동 분량으로 3개의 T175-㎠ 플라스크에 가하고 이어서 하기의 배지들 중 하나를 첨가하여 자극한다: IL-2 배지[RPMI 1640(#10-040-CV, Cellgro, Herndon, VA), 10% FBS(#35-010-CV), 2 mM L-글루타민(#25-005-CI), 100 U/㎖의 IL-2(Sigma, St. Louis, MO)]; PHA 5 배지: [5 ug/㎖의 피토헤마글루틴 PHA-P(PHA)가 있는 IL-2 배지(#L8754, Sigma, St. Louis, MO), 여과된 것]; 또는 PHA 0.5 배지: [0.5 ug/㎖의 PHA가 있는 IL-2 배지, 여과된 것]. 각각의 플라스크는 총 50 내지 150 ㎖의 배지를 수용한다. 플라스크를 37℃에서 3일간 배양한 다음 감염 분석에 사용하기 전에 내용물들을 모은다.
바이러스 적정
일련의 바이러스 희석물을 활성화된 PBMC(1.4 × 105 PBMC/웰) 상에서 4회 중복해서 시험한다. 적정 배지[100 IU/㎖의 페니실린/스트렙토마이신이 있는 IL-2 배지(#30-002-CI, Cellgro]를 바이러스 적정에 사용한다. 50 ㎕의 희석된 바이러스를 편평 바닥의 조직 배양물 처리된 96-웰 플레이트(VWR# 29442-054, Corning, Corning, NY) 중의 PBMC 100 ㎕에 가하고 상기 플레이트를 가습한 5% CO2 배양기에서 37℃에서 배양한다. 7일 후에, 50 ㎕를 각 웰로부터 제거하고 p24 항원 ELISA(Perkin Elmer, Boston, MA)에 의해 바이러스 수준에 대해 시험한다. 바이러스 역가를 리드와 뮤엔치(Reed and Muench)의 방법에 의해 측정한다(표 11, 하기 참조).
중화 분석
자극된 PBMC를 1.4 × 105 세포/웰의 밀도로 96-웰 편평 바닥 플레이트의 웰에 시딩한다. 바이러스를 2,000 TCID50/㎖로 희석하고 상기 세포 플레이트에 가하기 전에 37℃에서 1시간 동안 일련의 0.5 log10 화합물 희석물과 혼합한다. 웰 당 첨가된 바이러스의 최종 양은 100 TCID50이다. 상기 분석에서 최종 DMSO 농도는 소 분자 억제제를 시험할 때마다 항상 0.5%이다. 플레이트를 37℃에서 5일간 배양하고, 이때 상등액의 분액을 p24 항원 ELISA를 위해 제거한다. 대조용 웰(억제제가 없는 바이러스)이 낮은 p24 항원 수준을 나타내는 경우, 상기 플레이트를 다시 적정 배지로 충분한 부피로 만들고 추가로 24시간 동안 배양한다.
데이터 분석
중화 활성을, p24 항원 생산의 억제 퍼센트(배경 값을 모든 데이터 점들로부터 감한 후) 대 log10 약물 농도를 플롯팅하여 나타낸다. 상기 억제 퍼센트는 하기와 같이 유도된다: [1 - (약물 존재 하의 p24 수준/약물 부재 하의 p24 수준)] × 100. IC50 값은, 상기 억제 데이터를 비-선형, 4개 매개변수, 가변 기울기 식(GraphPad Prism, ver.4.02; GraphPad Software, San Diego, CA)에 대입시켜 측정하였다. 상한 및 하한 억제 값을 각각 곡선 대입에 대해 100% 및 0%로 제한하였다.
1a기 임상 연구
5 명의 환자(4명 활성 및 1명 위약)를 각각 개별적으로 연속적인 용량 상승 코홀트로 처리하고 처리 후 120일까지 평가하였다. 신체 검사, 병력 및 ECG 검사 시 이상이 발견되지 않은, 19 내지 50 세의 건강한, 즉 HIV-1 감염되지 않은 남성 지원자 집단에게 PRO 140을 1회 정맥 내 주입 투여하였다(0.1, 0.5, 2.0 및 5.0 ㎎/체중 ㎏). 안전성 평가는 하기의 모니터링으로 이루어졌다: 생명 징후(혈압, 맥박, 체온 등; 혈액학(헤모글로빈, 적혈구 용적률, 백혈구, 혈소판 등); 혈청 화학(AST/ALT, 알칼리성 포스페이트, BUN, 크레아티닌 등); 소변검사(pH, 비중, 단백질, 글루코스, 백혈구 등); 및 ECG(12-리드).
PRO 140에 의한 CCR5 세포의 코팅의 측정
전혈 시편을 지시된 피코에리쓰린-표식 항-CCR5 항체 또는 적합한 아이소타입 대조용 항체와 별도로 합하였다. 적혈구를 용혈시키고 백혈구를 임뮤노프렙(ImmunoPrep) 리에이전트 시스템(Beckman Coulter)을 사용하여 안정화시키고, 상기 세포들을 TQ 프렙TM 유식 세포측정 워크스테이션(Beckmann Coulter) 상에서 분석하였다. 데이터를 상기 분석에 들어간 모든 세포들에 대한 CCR5 세포의 퍼센트로서 나타내었다. CTC5는 PRO 140과 경쟁하지 않는 항-CCR5 항체이다. 2D7은 PRO 140과 경쟁하는 항-CCR5 항체이다.
PRO 140의 혈청 농도 측정
혈청을 적합하게 희석하고 L1.2-CCR5 세포(인간 CCR5를 안정하게 발현하도록 공학 처리된 마우스 예비-B 림프종 세포이다)와 합하였다. 표준 곡선을 생성시키기 위해서, PRO 140 표준을 10% 정상 인간 혈청(NHS) 중의 0.062 내지 4.0 ㎍/㎖ 범위의 농도로 병행 시험하였다. PRO 140을 함유하지 않는 10% NHS를 음성 대조군으로서 분석하였다. 시험 샘플들과 배양한 후에, 세포를 세척하고 인간 IgG4에 대한 FITC-표식 양 항체(The Binding Site Limited, 목록 번호 #AF009)와 합하였다. 세포를 다시 세척하고 유식 세포측정에 의해 분석하였다. 상기 PRO 140의 농도를 상기 시험 샘플의 중간 형광 강도(MFI)와 상기 표준 곡선의 MFI 값을 비교하여 측정하였다.
혈장 RANTES 농도의 측정
상기 분석은 콴티카인(Quantikine)(등록상표) 인간 RANTES 면역분석 키트(R&D Systems, Minneapolis, MN)를 사용하였다. 간단히, 혈소판 불량 혈장을 CTAD/EDTA 튜브에 모으고 -20℃에서 보관하였다. 시험 샘플 및 RANTES 표준을 RANTES에 대한 마우스 단클론 항체로 예비 코팅한 미세적정 플레이트에 가하였다. 배양에 이어서, 플레이트를 세척하고 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)에 접합된 항-RNATES 다클론 항체와 접촉시켰다. 플레이트를 다시 세척한 후에 비색측정 검출을 위해 테트라메틸벤지딘 기질을 첨가하였다. 상기 분석의 정량분석에 대한 하한은 415 pg RANTES/혈장 ㎖이었다.
결과 및 논의
PRO 140은 HIV-1 요법을 위해 개발된 인간화 IgG4, κ 항-CCR5 mAb이다. 상기 항체는 생체 외에서 세포를 표적화하기 위해 HIV-1의 CCR5-매개된 융합을 광범위하고 강력하게 억제하는 것으로 나타났다. PRO 140은 또한 치료학적 hu-PBL-SCID 마우스 모델에서 매우 활성이며, 예비 데이터는 현재 건강한 인간 환자에서 1a기 임상 연구로부터 입수할 수 있다.
PRO 140의 생체 외 바이러스 억제 활성
쥐 및 인간화 PRO 140을 상기 방법에 개시된 바와 같이 4개의 주요 R5 HIV-1 단리물에 대해 시험하였다. 도 1은 PRO 140이 생체 외에서 강력한 바이러스 억제 활성을 가지며, 이는 다양한 주요 R5 균주들을 3 내지 4 ㎍/㎖의 IC90으로 중화시킴을 보인다. PRO 140은 PRO 140이 유도된 쥐 mAb, PA14에 대해 유사한 바이러스 억제 활성을 나타내었다.
1a기 임상 연구로부터의 예비 데이터
상기 1a기 연구의 주요 목적은 건강한 남성 환자에서 상승하는 용량 코호트 섭생에서 1회 용량으로서 제공된 PRO 140의 안전성 및 허용성을 평가하는 것이었다. 2 차 목적은 (1) 정맥 내로 투여된 PRO 140의 약동학에 관한 정보를 얻고, (2) CCR5+ 세포 및 케모카인의 혈액 수준에 대한 PRO 140의 효과에 대한 정보를 얻는 것이었다.
PRO 140의 약동학
건강한 남성 지원자들을 0.1, 0.5, 2.0 및 5.0 ㎎/㎏의 용량 수준으로 PRO 140의 1회 정맥 내 주입으로 처리하였다. PRO 140 및 위약은 일반적으로는 ECG에서 현저한 변화 없이 잘 허용되었으며 용량 제한 독성은 없었다.
혈청을 처리 후 수거하고, 저온보존하고, PRO 140 수준에 대해 분석하였다. 피크 혈청 농도 범위는 0.1 ㎎/㎏에서 3 ㎎/㎖ 및 0.5 ㎎/㎏에서 12 ㎎/㎖이었다. 혈청 농도는 검출 가능하게 남아있었다(0.1 ㎎/㎏에서 5일, 0.5 ㎎/㎏에서 21일까지, 및 1회 2 ㎎/㎏ 주사에 이어서 60일 이상 동안 >400 ng/㎖)(도 7). PRO 140의 혈청 농도는 용량 수준과 비례하여 증가하였으며, 제거속도는 다른 인간화 mAb의 경우와 유사하였다. 약동학(PK) 계량을 비구획 모델을 사용하는 WinNonLin(PharSight Corporation, Mountain View, CA)을 사용하여 측정하였으며, PRO 140의 말단 혈청 반감기는 10 내지 12일인 것으로 측정되었다. 예상한 바와 같이, 어떤 환자도 상기 인간화 PRO 140에 대해 항체를 나타내지 않았다.
PRO 140에 의한 CCR5 림프구의 코팅 및 비 고갈
건강한 남성 지원자(n=4)를 2 ㎎/㎏의 용량 수준으로 PRO 140을 1회 정맥 내 주입하여 처리하였다. 처리 후 60일까지, 도 6에 나타낸 시점에서 혈액을 수거하고 CCR5 림프구 수준에 대해 분석하였다.
PRO 140으로 처리한 후에, CTC5 결합에 의해 측정 시 CCR5 림프구의 전체 수의 감소는 없었지만; 항체 2D7의 결합은 현저하게 감소하였다(도 6). 아이소타입 대조용 항체의 배경 결합은 변하지 않았다. CTC5의 결합이 PRO 140의 존재에 의해 감소하지 않으므로, 상기 CTC5-PE 값은 순환하는 CCR5 림프구의 전체 수의 척도이다. 2D7은 PRO 140과 경쟁하기 때문에, 상기 2D7-PE 값은 PRO 140으로 코팅되지 않은 CCR5 림프구의 수를 반영한다.
상기 데이터는 PRO 140의 1회 2 ㎎/㎏ 용량이 2주간 세포 고갈 없이 CCR5 림프구를 유효하게 피복하고, 세포는 >4주간 부분적으로 피복된 채로 남아있음을 가리킨다. 또한, CCR5 피복은 5 ㎎/㎏의 PRO 140으로 처리된 환자에서 더 이상 연장되지 않았다. 상기 데이터는 PRO 140의 1회 5 ㎎/㎏ 용량이 세포 고갈 없이 CCR5 림프구를 유효하게 피복하고, 세포는 >60일간 부분적으로 피복된 채로 남아있음을 가리킨다(도 13). CCR5 피복은 PRO 140이 HIV를 억제하는 기전이므로, HIV-감염된 개인에서 바이러스 부하는 유사한 일시적인 방식으로 감소함을 예상할 수 있었다.
혈장 케모카인 수준에 대한 PRO 140의 효과
건강한 남성 지원자를 0.1 ㎎/㎏의 PRO 140(코홀트 1), 0.5 ㎎/㎏의 PRO 140(코홀트 2) 또는 부합된 위약을 1회 정맥 내 주입하여 처리하였다. 혈장을 지시된 시점에서 처리 후 수거하고, 저온보존하고, CCR5에 대한 천연 리간드로서 작용하는 CC-케모카인인 RANTES의 수준에 대해 분석하였다. RANTES 수준을 혈소판 고갈된 혈장 예비 용량으로, 투여 후 28일까지 ELISA에 의해 측정하였다. 도 8에 나타낸 바와 같이, PRO 140 처리 후에 RANTES 수준의 현저한 변화는 없었다(P >0.14 모든 시점에서). 상기 데이터는 PRO 140이 CCR5 기능을 길항하지 않는다는 생체 외 발견과 일치한다. 상기 발견은 PRO 140이 처리된 환자에서 CCR5-매개된 면역 기능에 대해 성가신 효과를 갖지 않음을 암시한다.
본 발명에 개시된 결과들은 PRO 140이 예비 임상 시험에서 CCR5 길항작용 또는 다른 면역학적 부작용 없이 CCR5-매개된 HIV-1 침입을 광범위하고 강력하게 억제하는 것 이외에, 건강한 지원자에서 진행중인 1a기 연구로부터의 예비 결과에서 유리한 허용성, PK 및 면역학 프로파일을 입증하였음을 가리킨다. 따라서, 많은 점에서, PRO 140은 항-HIV-1 요법에 대해 신규의 매력적인 생성물 프로파일을 제공한다.
더욱이, 항-CCR5 mAb의 활성은 근본적으로 소 분자 CCR5 길항물질(또한 현재 인간 임상 시험 중이다)의 활성(표 2 참조)과 상이하지만 상기에 상보적이다. PRO 140은 최근에 CCR5-매개된 HIV-1의 표적 세포에의 융합을 억제함에 있어서 비 항체 CCR5 길항물질과 상승작용적으로 작용하는 것으로 나타났다. 따라서, 항-CCR5 mAb와 비-항체 CCR5 길항물질의 투여를 포함하는 병행 요법은 HIV-1 감염의 예방 및 치료에 대한 강력하고 유효한 신규의 접근법을 제공할 수 있다.
파트 II
실시예 1: 형광 RET 분석에서 PRO 140 및 HIV -1 침입 억제제의 병용 시험
물질 및 방법
화합물 및 mAb
PRO 140을 2 mM L-글루타민(Invitrogen, carlsbad, CA)이 보충된 하이브리도마 혈청 비 함유 배지를 사용하여 Sp2/0 세포에서의 발현에 의해 제조하였다. 벌크 mAb를 5.0 ㎛ 깊이 필터(Sartorius, Goettingen, Germany)를 사용하여 등명하게 한 다음 0.2 ㎛ 멸균 등급 필터(Sartorius) 상에 통과시켰다. 상기 mAb를 먼저 친화성 컬럼(MabSelect Protein A 컬럼, Amersham, Piscataway, NJ) 상에 통과시키고 이어서 이온 교환 크로마토그래피(SP 세파로스 양이온 교환 수지, Amersham)에 의해 정제하였다. PRO 140을 바이레솔브TM 10 옵티캡 NFP 캡슐(Millipore, Bilerica, MA)에 이어서 0.2 ㎛ 필터를 사용하여 나노여과하고 일회용 TFF 카트리지(Millipore) 상에서 농축/여과하였다. 이어서 상기 mAb를 하이드록시아파타이트 컬럼(Bio-Rad, Hercules, CA) 상에서 연마하고, 포스페이트 완충된 염수 중에서 10 ㎎/㎖로 농축시키고 사용 전에 -70℃ 이하에서 보관하였다.
SCH-D(Schering Plough; Tagat et al., 2004), TAK-779(Takeda Pharmaceuticals; Shiraishi et al., 2000), UK-427,857(Pfizer; Wood and Armour, 2005) 및 BMS378806(Bristol-Myers Squipp; Lin et al., 2003)을 상업적인 출처에 의해 제조하였다.
SCH-D는 하기의 구조를 갖는다:
Figure 112008013328212-PCT00001
SCH-D(SCH-417690으로도 나타냄): 1-[(4,6-디메틸-5-피리미디닐)카보닐]-4-[4-[2-메톡시-1(R)-4-(트라이플루오로메틸)페닐]에틸-3(S)-메틸-1-피페라지닐]-4-메틸피페리딘(Schering-Plough).
SCH-D를 문헌[Tagat et al.(2004)]에 개시되고 도 1에 나타낸 과정에 따라 합성하였다.
TAK-779는 하기의 구조를 갖는다:
Figure 112008013328212-PCT00002
TAK-779를 문헌[Shiraishi et al.(2000)]에 개시되고 도 2에 나타낸 과정에 따라 합성하였다.
TAK-652는 하기의 구조를 갖는다:
Figure 112008013328212-PCT00003
UK-427,857은 하기의 구조를 갖는다:
Figure 112008013328212-PCT00004
UK-427,857을 PCT 국제 공보 제WO 01/90106호에 개시되고 도 3에 나타낸 과정에 따라 합성하였다.
BMS378806은 하기의 구조를 갖는다:
Figure 112008013328212-PCT00005
BMS378806: (R)-N-(벤조일)-3-메틸-N'-[(4-메톡시-7-아자인돌-3-일)-옥소아세틸]-피페라진(브리스톨-마이어스 스큅)
상기를 미국 특허 제6,476,034호(화합물 17a)에 개시된 과정에 따라 합성하였다.
네비라핀(베링거 인겔하임; Merluzzi et al., 1990) 및 아타자나비어(브리스톨-마이어스 스큅; Robinson et al., 2000)를 상업적인 출처로부터 구입하였다. PRO 542를 중국 햄스터 난소 세포에서 발현하였으며 앞서 개시된 바와 같이 정제하였다(Allaway et al., 1995). T-20(Fuzeon(등록상표))을 고상 플루오레닐메톡시카보닐 화학에 의해 합성하였으며, 역상 크로마토그래피에 의해 정제하고 앞서 개시한 바와 같이 HPLC 및 질량 분광학에 의해 순도 및 크기에 대해 분석하였다(Nagashima et al., 2001). AZT를 시그마 케미칼스(Sigma Chemicals, St. Louis, Mo)로부터 구입하였다. RANTES를 R&D 시스템스(Minneapolis, MN)로부터 구입하였다. 항-CCR5 mAb 2D7을 파밍겐(Pharmingen, San Diego, CA)으로부터 구입하였고, 항-CD4 mAb Leu-3A를 벡톤 디킨슨(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)으로부터 구입하였다.
시험을 위해서, 소 분자 화합물을 디메틸설폭사이드(DMSO)에 10 mM로 희 석하고 DMSO에 200X의 최종 농도로 희석하여 바이러스 억제 분석에 사용하였다. 소 분자의 일련의 희석을 DMSO 중에서 수행하였다. 후속의 희석을 배지에서 수행하여 분석 시 0.5%의 최종 DMSO 농도를 성취하였다. 펩타이드 및 mAb를 DMSO의 부재 하에서 PBS에서 희석하였다. 전형적으로, RET 분석에서 억제제 농도는 200 nM 내지 3.0 pM 범위의 11개의 3배 희석을 포함하였다.
세포 제조
HeLa 세포를 개시된 바와 같이 대식세포-향성 주요 단리물 JRFL로부터 HIV-1 gp120/gp41을 발현하도록 공학 처리하였다(HeLa-EnvJRFL; Litwin et al., 1996). 간단히, 상기 HIV-1JRFL Env 유전자를 플라스미드 pMA243(Dragic et al., 1992)으로부터 절제하고 상기 HIV-1JRFL Env 유전자를 삽입하였다. 상기 HIV-1LAI Env 유전자를 플라스미드 pUCFL112-1(Koyanagi et al.., 1987)로부터 증폭시켰다. 생성된 플라스미드(JR-FL-pMA243으로 나타낸다)를 표준 방법에 의해 서열화하고 리포펙틴(Gibco BRL/Invitrogen, Carlsbad, CA)을 사용하여 HeLa 세포 내에 형질감염시켰다. HeLa-EnvJRFL 형질감염체를 메토트렉세이트(Sigma, St. Louis, MO)에서 선택하고 제한 희석에 의해 2회 클로닝하였다. 상기 형질도입된 인간 T 세포 백혈병 주 CEM NKR-CCR5 세포를 NIH AIDS 리써치 앤드 레퍼런스 프로그램(Research and Reference Program, 목록 번호 458)으로부터 획득하였다.
RET 분석
HIV-1 RET 분석은 앞서 상세히 개시되었다(Litwin et al., 1996). 간단히, 플루오레세인 옥타데실 에스터(F18; Molecular Probes, Eugene, OR; 에탄올 중의 5 ㎎/㎖)를 10% 소 태아 혈청(FBS; HyClone, Logan, UT)이 있는 DMEM 표식 배지(DMEM; Invitrogen, Carlsbad, CA)에서 1:800으로 희석하고, 0.34±10%의 A506으로 조절하였다. 옥타데실 로다민 B 클로라이드(R18; Molecular Probes; 에탄올 중의 10 ㎎/㎖)를 표식 배지에서 1:2050으로 희석하고 0.52±10%의 A565로 조절하였다. 상기 두 염료를 모두 T75-㎠ 플라스크에서 세포에 첨가하여 2배 추가 희석하였다. HeLa-EnvJRFL 및 CEM NKR-CCR5 세포를 각각 F18- 및 R18-함유 배양 배지에서 밤새 배양하였다. 그 다음날, HeLa-EnvJRFL 세포로부터 배지를 제거하고 10 ㎖의 0.5 mM EDTA를 가하고 37℃에서 5분간 배양하였다. EDTA를 제거하고 상기 플라스크를 추가로 5분간 상기 배양기로 복귀시킨 다음 상기 플라스크를 스트리킹하여 세포를 제거하였다. 15% FBS가 있는 10 ㎖의 PBS를 상기 플라스크에 가하고 내용물을 50 ㎖ 원추형 원심분리기 튜브로 옮겼다. CEM NKR-CCR5 세포 현탁액을 별도의 50 ㎖ 원추형 원심분리기 튜브에 직접 가하였다. 상기 두 세포주를 모두 300 × g에서 5분간 원심분리시켰다. 상등액은 버리고 세포를 10 ㎖의 PBS-/15% FBS에 재 현탁시켰다. 상기 원심분리/세척 단계를 2회 반복하고, 그 후에 상기 세포를 카운트하고 농도를 1.5 × 106 세포/㎖로 조절하였다. 각 세포 유형 10 ㎕(15,000 세포)를 384-웰 플레이트의 웰에 시딩하였다. 억제제 화합물을 그 후에 바로 가하여 최종 웰 부피를 40 ㎕로 만들고, 상기 플레이트를 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. 화합물들을 일련의 희석비에 걸쳐 고정된 몰 비 또는 질량 비에서 개별적으로 및 병행하여 시험하였다. 이어서 상기 플레이트를 표 7에 나타낸 여기/방출 필터 조합을 사용하여 형광 플레이트 판독기(Victor2, Perkin Elmer, Boston, MA) 상에서 판독하였다.
RET 분석을 위한 여기/방출 필터 조합
스캔 번호 여기 파장 방출 파장
1 450 ㎚/50 ㎚ 530 ㎚/25 ㎚
2 530 ㎚/25 ㎚ 590 ㎚/35 ㎚
3 450 ㎚/50 ㎚ 590 ㎚/35 ㎚
"RET %"를 하기 식에 따라 배경(블랭크) 판독치를 감한 후에 계산하였다:
RET% = 100 × [(A3-(A1 × Fspill)-(A2 × Rspill)/A2]
상기 식에서,
Fspill = HeLa 세포 단독, 주사 3/주사 1;
Rspill = CEM 세포 단독, 주사 3/주사 2;
A1 = HeLa 및 CEM 세포 병행 시 주사 1;
A2 = HeLa 및 CEM 세포 병행 시 주사 2; 및
A3 = HeLa 및 CEM 세포 병행 시 주사 3.
"억제%"는 하기 식에 따라 계산하였다:
억제% = 100 × [(Max RET% - 샘플 웰에 대한 RET%)/(Max RET% - Min RET%)]
상기 식에서,
Max RET% = 억제제의 첨가 없이 HeLa 및 CEM 세포 조합에 대한 RET% 값의 평균%; 및
Min RET% = Leu-3a mAb(CD4를 표적화하고 상기 RET 분석에서 하기 농도에서 융합을 완전히 차단하는 항체) 500 ng/㎖의 존재 하에서 HeLa 및 CEM 세포 조합에 대한 RET% 값의 평균%.
50% 억제(IC50) 값을, 상기 억제 데이터를 비-선형, 4개 매개변수, 가변 기울기 식(GraphPad Prism, ver.4.02; GraphPad Software, San Diego, CA)에 대입시켜 측정하였다. 상한 및 하한 억제 값을 각각 곡선 대입에 대해 100% 및 0%로 제한하였다.
상승작용 측정
약물 조합들의 협동 억제 효과를 쵸우 앤드 탈랄레이(Chou and Talalay)(1984)의 방법에 의해 측정하였다. IC50 값을 상술한 바와 같은 모든 조합들로부터 생성시켰다. 병행 지수(CI) 및 용량 감소(DR) 값을 하기 식에 따라 계산하였다:
Figure 112008013328212-PCT00006
DR(화합물 1의 경우) = (IC50 Dsolo1/IC50 Dcomb1)
DR(화합물 2의 경우) = (IC50 Dsolo2/IC50 Dcomb2)
상기에서,
"IC50 Dcomb1" = 약물 2와 병용된 약물 1의 IC50
"IC50 Dsolo1" = 단독 시험 시 약물 1의 IC50
"IC50 Dcomb2" = 약물 1과 병용된 약물 2의 IC50
"IC50 Dsolo2" = 단독 시험 시 약물 2의 IC50
α = 2개 약물의 효과가 상호 배타적인 경우 0
α = 2개 약물의 효과가 상호 배타적이지 않은 경우 1
CI < 1을 갖는 조합은 상승작용적인 것으로 측정되는 반면, CI > 1을 갖는 조합은 길항적인 것으로 측정된다. 부가성은 CI = 1인 경우의 조합에서 초래된다.
95% 신뢰도 구간을 하기 식을 사용하여 마이크로소프트 엑셀에서 계산하였다:
= 신뢰도(alpha,stdev,n)
상기에서,
alpha = 0.05(95% 신뢰도);
stdev = 데이터세트 평균의 표준 편차; 및
n = 복제물의 수
결과
소 분자 융합 억제제의 제조
SCH-D, TAK-779, UK-427,857 및 BMS378806을 상업적인 출처에 의해 제조하였다. 상기 화합물들의 목적하는 양 및 HPLC 순도를 실현시켰다. 상기 화합물들의 순도는 원소 분석으로부터 획득한 결과에 의해 지지되었으며, 상기 생성물들의 정체를 양성자 NMR(양성자 및 탄소-13) 및/또는 질량 스펙트럼 데이터에 의해 확인하였다.
RET 분석에 의해 밝혀진 상승작용적 상호작용
상승작용 실험을 세포-세포 RET 융합 분석을 사용하여 수행하여 처음에 PRO 140과 소 분자 및 CCR5, CD4, HIV-1 gp120 및 HIV-1 gp41의 펩타이드 기재 억제제 간의 협동 상호작용에 대한 가능성을 평가하였다. 이어서 상기 실험을 CCR5-특이적인 쥐 단클론 항체, 2D7으로 확장시켰다(Wu et al., 1997).
HIV-1 Env-매개된 융합의 억제를 측정하는 실험을 먼저 PRO 140과, 각각 PRO 140 자체, 3개의 소 분자 CCR5 길항물질(SCH-D, TAK-779, UK427857), CCR5의 천연 펩타이드 리간드(RANTES) 및 항-CCR5 mAb(2D7), gp41의 펩타이드 기재 억제제(T-20), gp120의 단백질 기재 억제제(PRO 542), gp120의 소 분자 억제제(BMS378806), 및 항-CD4 mAb(Leu3A)와의 조합을 사용하여 수행하였다. PRO 140 대 다른 침입 억제제의 질량 비는 0.75 내지 364의 범위였다. 결과를 표 8에 나타낸다.
Figure 112008013328212-PCT00007
2개의 소 분자 CCR5 길항물질, SCH-D 및 TAK-779를 함께 분석하였다. 인간 IgG2의 중쇄 및 경쇄 가변 영역이 인간 CD4의 D1D2 도메인으로 치환된 재조합 항체 유사 융합 단백질인 PRO 542를 또한 항-CD4 mAb, Leu-3A와 함께 시험하였다. 상기 분석들에 대한 결과를 표 9에 나타낸다.
협동성에 대해 RET 분석에서 시험된 다른 약물 조합
약물1 약물2 몰 비 (약물 1 대 2) N 평균 CI± stdeva 평균 DR (약물 1) 평균 DR (약물 2)
SCH-D PRO 542 TAK-779 Leu-3A 1:1 22.9:1 4b 2 1.12±0.32 16.9±0.3 1.48±0.96 0.7±0 4.31±1.82 0.16±0
aCI 값을 SCH-D 대 TAK-779의 경우 상호 배타적인 식(즉, 이 경우 α = 0)을 사용하여 계산하였고 PRO 542 대 Leu-3A의 경우에는 상호 배타적이지 않은 식(즉, 이 경우 α = 1; 방법 참조)을 사용하여 계산하였다. b하나의 일탈 데이터 점을 평균 CI 및 평균 DR의 계산으로부터 가려냈다.
협동성 수준에 대한 병용 화합물들의 상대적인 양의 변화 효과를 또한 측정하였다. 5:1 및 1:5 PRO 140의 몰 비를 사용하였다. 결과를 표 10에 목록으로 나타냈으며, 95% 신뢰도 구간을 갖는 평균 CI 값을 1:1 몰 비 데이터에 대해 도 4에 플롯팅한다. PRO 140 이외에, CCR5-특이적 쥐 항체(Wu et al., 1997)인 mAb 2D7의 억제 활성을 또한 형광 RET 분석을 사용하여 소 분자 CCR5 길항물질 및 RANTES와 함께 시험하였다. 결과를 표 11에 나타낸다.
Figure 112008013328212-PCT00008
2D7 및 침입 억제제의 조합에 의한 HIV-1 Env-매개된 융합의 억제에 대한 병용 지수 및 용량 감소 값
2D7과 병용된 화합물a 화합물 질량 비 억제제 표적 평균 병용 지수b 평균 용량 감소(2D7) 평균 용량 감소 (화합물 병용)
세포-세포 융합 분석
TAK-779 SCH-D UK427857 RANTES PRO 140 282 279 292 19 1 CCR5 CCR5 CCR5 CCR5 CCR5 0.15±0.03 0.57±0.10 0.58±0.03 0.62±0.04 0.93±0.04 17.20±3.23 3.25±0.56 2.45±0.12 1.94±0.08 2.54±0.13 11.95±4.94 4.04±0.78 5.73±0.54 10.18±1.86 1.87±0.07
a화합물들을 1:1의 몰 비로 시험하였다(모든 데이터는 2D7 및 PRO 140(이 경우 n = 2)을 제외하고 n = 3이다). bIC50 값에서 병용 지수. 상호 배타적인 CI 식(α = 0)을 2D7이 CCR5와 결합하는 분자와 병용되는 경우 사용하였다(Chou and Rideout, 1991) c2D7의 질량/병용 시험된 다른 HIV-1 침입 억제제의 질량. 억제제의 분자량은 2D7 ~ 150,000 g/몰; SCH-D = 538 g/몰; TAK-779 = 531 g/몰(하이드로클로라이드 염); UK-427,857 = 514 g/몰; RANTES ~ 7,800 g/몰.)
실시예 2: HIV -1 슈도바이러스 입자( HIV -1 PP ) 분석에서 PRO 140과 소 분자, 펩타이 드 및 단백질 억제제, 및 HIV -1과의 병용 시험
물질 및 방법
HIV -1 슈도입자의 제조
HIV-1 슈도입자(HIV-1pp)를 HIV-1-기재 NL4/3luc+env-플라스미드 및 HIV-1JRFL Env를 암호화하는 구조물의 일시적인 공 발현에 의해 293T 세포에서 생성시킨다. 상기 NL4/3luc+env-플라스미드를 NIH AIDS 리써치 앤드 레퍼런스 리에이전트 프로그램(목록 번호 3418)으로부터 획득하고, 상기 HIV-1JRFL Env를 pcDNA3.1 벡터(Invitrogen) 내에 삽입하였다. 간단히, 293T 세포를 Hepes 완충액(Profection Mammalian Transfection Kit, Promega) 중의 1:1 비의 NL4/3luc+env-정보제공 인자 벡터 및 Env발현 벡터로 칼슘 포스페이트 형질감염시켰다. 16시간 후에, 상기 형질감염 배지를 흡출하고 새로운 세포 배양 배지(10% FBS, 글루타민 및 항생제가 있는 DMEM)를 가하고 37℃에서 추가로 24 내지 32시간 동안 배양을 계속한다. 세포 배양 상등액을 형질감염 후 48시간째에 수거하고 1,400 rpm에서 10분간 원심분리하여 세포 찌꺼기를 펠릿화한다. 상기 바이러스 상등액을 5% 슈크로스의 최종 농도로 만들고 -80℃에서 분액화하여 보관한다.
세포
U87-CD4-CCR5 세포를 NIH AIDS 리써치 앤드 레퍼런스 프로그램(목록 번호 4035)으로부터 획득하였다. 상기 세포를 0.3 ㎎/㎖의 G418 및 0.5 ㎎/㎖의 퓨로마이신을 함유하는 배양 배지(10% FBS, 항생제 및 글루타민이 있는 DMEM)에서 유지시킨다. 세포를 37℃에서 T175-㎠ 플라스크에서 증식시키고 매 3 내지 4일마다 1:5로 희석한다. 분석 플레이트 제조를 위해서, 세포를 트립신 처리하고 96-웰의 조직 배양물 처리된 편평 바닥의 불투명한 폴리스타이렌 플레이트(Perkin Elmer, Boston, MA)의 웰에 3 × 103 세포/웰의 밀도로 시딩한다. 플레이트를 상기 HIV-1pp 민감성 분석에 사용하기 전에 가습된 5% CO2 배양기에서 37℃에서 4시간 이하 동안 배양한다.
화합물 제조
50 ㎕의, 4X 목적하는 최종 농도로 희석된 화합물을 웰 당 가한다. DMSO 중에 용해된 화합물들에 대해서 상기 4X 모액은 2% DMSO를 함유할 것이다(상기 분석에서 최종 DMSO 농도가 소 분자에 대해 항상 0.5%이도록). 화합물이 제공되지 않은 대조용 웰을 각 플레이트에 포함시킨다. 또한, AZT 억제 대조군을 각 분석에 포함시킨다. 화합물들을 개별적으로 및 광범위한 농도 범위에 걸쳐 고정된 질량 또는 몰 비로 시험한다.
바이러스 첨가
냉동 분액된 HIV-1pp의 바이알을 37℃ 수욕에서 해동시키고 이어서 젖은 얼음 상에 놓는다. 바이러스를 경우에 따라 저온 세포 배양 배지에서 희석하여 상기 HIV-1pp 분석에 목적하는 최종 바이러스 농도를 성취한다(약 10,000의 비교적 가벼운 단위(rlu)/웰). 50 ㎕의 희석된 바이러스를 웰 당 가하며, 이는 최종 웰 부피를 200 ㎕로 만든다. 바이러스가 없는 대조군(최소 또는 배경 발광) 및 화합물이 없는 대조군(최대 발광)을 각 플레이트 상에 포함시킨다. 상기 플레이트를 37℃에서 72시간 동안 가습된 5% CO2 배양기에서 배양시킨 다음 루시페라제 신호를 위해 처리한다(하기 참조).
루시페라제 분석을 위한 플레이트 처리
분석 배지를 흡출하고 200 ㎕의 PBS를 각 웰에 가한다. 상기 PBS를 흡출하고 50 ㎕의 1X 세포 용해 시약(Promega-목록 번호 E1531)을 각 웰에 가한다. 이어서 분석 플레이트를 -80℃에서 2시간 이상 냉동시킨 다음 실온에서 해동시키고 전자 피펫터를 사용하여 격렬히 혼합한다. 각 웰로부터 25 ㎕를 불투명한 96-웰 플레이트(Costar #3922)로 옮긴다. 4개의 복제물을 상기 불투명한 플레이트 상의 동일한 웰에 모은다. 100 ㎕의 새로 해동하고 재조성한 루시페라제 기질(루시페라제 분석 시스템, Promega-목록 번호 E1501)을 상기 플레이트의 각 웰에 상기 전자 피펫터를 사용하여 가하고, 발광을 다이넥스(Dynex) MLX 플레이트 판독기 세트 상에서 배지 증가에 대해 직접 검출한다.
데이터 분석
중화 활성을, 루시페라제 활성의 억제 퍼센트(배경 rlu 값을 모든 데이터 점들로부터 감한 후) 대 log10 약물 농도를 플롯팅하여 나타낸다. 상기 억제 퍼센트는 하기와 같이 유도된다: [1 - (약물 존재 하의 루시페라제 활성/약물 부재 하의 루시페라제 활성)] × 100. IC50 값을, 상기 억제 데이터를 비-선형, 4개 매개변수, 가변 기울기 식(GraphPad Prism, ver.4.02; GraphPad Software, San Diego, CA)에 대입시켜 측정하였다. 상한 및 하한 억제 값을 각각 곡선 대입에 대해 100% 및 0%로 제한하였다.
상승작용 측정
PRO 140과 소 분자 및 CCR5, CD4, HIV-1 gp120, HIV-1 gp41 및 HIV-1 역 전사효소(표 4 및 임상용으로 승인된 HIV-1 억제제의 목록 참조)의 펩타이드 기재 억제제 간의 협동 상호작용을 실시예 1에 개시된 바와 같이 측정한다. 약물 조합들의 협동적인 억제 효과를 쵸우 앤드 탈랄레이(Chou and Talalay)(1984)의 방법에 의해 측정하였다. IC50 값을 상술한 바와 같은 모든 조합들로부터 생성시켰다. 병용 지수(CI) 및 용량 감소(DR) 값을 하기 식에 따라 계산하였다:
Figure 112008013328212-PCT00009
DR(화합물 1의 경우) = (IC50 Dsolo1/IC50 Dcomb1)
DR(화합물 2의 경우) = (IC50 Dsolo2/IC50 Dcomb2)
상기에서,
"IC50 Dcomb1" = 약물 2와 병용된 약물 1의 IC50
"IC50 Dsolo1" = 단독 시험 시 약물 1의 IC50
"IC50 Dcomb2" = 약물 1과 병용된 약물 2의 IC50
"IC50 Dsolo2" = 단독 시험 시 약물 2의 IC50
α = 2개 약물의 효과가 상호 배타적인 경우 0
α = 2개 약물의 효과가 상호 배타적이지 않은 경우 1
CI < 1을 갖는 조합은 상승작용적인 것으로 측정되는 반면, CI > 1을 갖는 조합은 길항적인 것으로 측정된다. 부가성은 CI = 1인 경우의 조합에서 초래된다.
실시예 3: HIV -1 진정한 바이러스 복제 분석에서 PRO 140과 소 분자, 펩타이드 및 단백질 억제제의 병용 시험
물질 및 방법
PBMC 의 제조
진정한 HIV-1의 복제를 상기 연구를 위해 단핵구/대식세포-향성 HIV-1 클론, JRFL(HIV-1JRFL)을 사용하여 활성화된 말초 혈액 단핵구(PBMC)에서 측정한다.
PBMC를 피콜 구배로 원심분리에 의해 4개의 개별 공여체(Leukopacks)로부터 단리한다. CD8 세포를 RosetteSep CD8 고갈 칵테일(#15663, StemCell Research, Vancouver, BC)을 사용하여 고갈시킨다. 세포를 4 × 106/㎖로 희석하고 동 분량으로 3개의 T175-㎠ 플라스크에 가하고 이어서 하기의 배지들 중 하나를 첨가하여 자극한다: IL-2 배지[RPMI 1640(#10-040-CV, Cellgro, Herndon, VA), 10% FBS(#35-010-CV), 2 mM L-글루타민(#25-005-CI), 100 U/㎖의 IL-2(Sigma, St. Louis, MO)]; PHA 5 배지: [5 ug/㎖의 피토헤마글루틴 PHA-P(PHA)가 있는 IL-2 배지(#L8754, Sigma, St. Louis, MO), 여과된 것]; 또는 PHA 0.5 배지: [0.5 ug/㎖의 PHA가 있는 IL-2 배지, 여과된 것]. 각각의 플라스크는 총 50 내지 150 ㎖의 배지를 수용한다. 플라스크를 37℃에서 3일간 배양한 다음 감염 분석에 사용하기 전에 내용물들을 모은다.
바이러스 적정
일련의 바이러스 희석물을 활성화된 PBMC(1.4 × 105 PBMC/웰) 상에서 4회 중복해서 시험한다. 적정 배지[100 IU/㎖의 페니실린/스트렙토마이신이 있는 IL-2 배지(#30-002-CI, Cellgro]를 바이러스 적정에 사용한다. 50 ㎕의 바이러스를 편평 바닥의 조직 배양물 처리된 96-웰 플레이트(VWR# 29442-054, Corning, Corning, NY) 중의 PBMC 100 ㎕에 가하고 상기 플레이트를 가습한 5% CO2 배양기에서 37℃에서 배양한다. 7일 후에, 50 ㎕를 각 웰로부터 제거하고 p24 항원 ELISA(Perkin Elmer, Boston, MA)에 의해 바이러스 수준에 대해 시험한다. 바이러스 역가를 리드와 뮤엔치(Reed and Muench)의 방법에 의해 측정한다(표 12).
중화 분석
자극된 PBMC를 1.4 × 105 세포/웰의 밀도로 96-웰 편평 바닥 플레이트의 웰에 시딩한다. 바이러스를 2,000 TCID50/㎖로 희석하고 상기 세포 플레이트에 가하기 전에 37℃에서 1시간 동안 일련의 0.5 log10 화합물 희석물과 혼합한다. 웰 당 첨가된 바이러스의 최종 양은 100 TCID50이다. 상기 분석에서 최종 DMSO 농도는 소 분자 억제제를 시험할 때마다 항상 0.5%이다. 플레이트를 37℃에서 5일간 배양하고, 이때 상등액의 분액을 p24 항원 ELISA를 위해 제거한다. 대조용 웰(억제제가 없는 바이러스)이 낮은 p24 항원 수준을 나타내는 경우, 상기 플레이트를 다시 적정 배지로 충분한 부피로 만들고 추가로 24시간 동안 배양한다.
Figure 112008013328212-PCT00010
데이터 분석
중화 활성을, p24 항원 생산의 억제 퍼센트(배경 값을 모든 데이터 점들로부터 감한 후) 대 log10 약물 농도를 플롯팅하여 나타낸다. 상기 억제 퍼센트는 하기와 같이 유도된다: [1 - (약물 존재 하의 p24 수준/약물 부재 하의 p24 수준)] × 100. IC50 값을, 상기 억제 데이터를 비-선형, 4개 매개변수, 가변 기울기 식(GraphPad Prism, ver.4.02; GraphPad Software, San Diego, CA)에 대입시켜 측정하였다. 상한 및 하한 억제 값을 각각 곡선 대입에 대해 100% 및 0%로 제한하였다.
상승작용 측정
PRO 140과 소 분자 및 CCR5, CD4, HIV-1 gp120, HIV-1 gp41, HIV-1 역 전사효소 및 HIV-1 프로테아제(표 9)의 펩타이드 기재 억제제 간의 협동적인 상호작용을 실시예 1에 개시된 바와 같이 측정한다. 약물 조합들의 협동적인 억제 효과를 쵸우 앤드 탈랄레이(Chou and Talalay)(1984)의 방법에 의해 측정하였다. IC50 값을 상술한 바와 같은 모든 조합들로부터 생성시켰다. 병용 지수(CI) 및 용량 감소(DR) 값을 하기 식에 따라 계산하였다:
Figure 112008013328212-PCT00011
DR(화합물 1의 경우) = (IC50 Dsolo1/IC50 Dcomb1)
DR(화합물 2의 경우) = (IC50 Dsolo2/IC50 Dcomb2)
상기에서,
"IC50 Dcomb1" = 약물 2와 병용된 약물 1의 IC50
"IC50 Dsolo1" = 단독 시험 시 약물 1의 IC50
"IC50 Dcomb2" = 약물 1과 병용된 약물 2의 IC50
"IC50 Dsolo2" = 단독 시험 시 약물 2의 IC50
α = 2개 약물의 효과가 상호 배타적인 경우 0
α = 2개 약물의 효과가 상호 배타적이지 않은 경우 1
CI < 1을 갖는 조합은 상승작용적인 것으로 측정되는 반면, CI > 1을 갖는 조합은 길항적인 것으로 측정된다. 부가는 CI = 1인 경우의 조합에서 초래된다.
논의
PRO 140은 HIV-1 요법을 위해 개발된 CCR5-특이적인 mAb이다. 상기는 쥐 항체의 인간화 IgG4,κ 버전(2003년 9월 4일자로 공개된 PCT 국제 공보 제WO 03/072766호 참조), PA14이며(Olson et al., 1999; 2000년 6월 20일자로 공개된 PCT 국제 공보 제WO 00/35409호), 이는 세포 표면상에서 CCR5 수용체에 결합하고 HIV-1의 상기 세포에의 CCR5-매개된 융합을 억제한다. 본 발명에 개시된 연구는 소 분자 및 HIV-1 감염의 펩타이드 억제제와 병용된 PRO 140의 바이러스 억제 활성을 시험하는 것에 관한 것이다. 상기 시험으로부터 생성된 데이터를 HIV-1 감염의 억제에 대한 가능한 협동 효과에 대해 분석하였다.
하나의 일련의 실험에서, HIV-1 감염의 억제를 형광 공명 에너지 전달(RET) 분석을 사용하여 분석하였으며, 상기 분석은 CD4 및 CCR5를 발현하는 표적 세포(CEM NKR-CCR5)에 대한 재조합 HIV-1 균주 JRFL 피막 당단백질(Env)을 발현하는 효과기 세포(HeLa-EnvJRFL)의 융합을 측정한다(Litwin et al., 1996). 이 분석에서, 효과기 세포를 F18 염료로 표식하고 표적 세포를 상기 R18 염료로 표식한다. 효과기 및 표적 세포의 HIV-1 Env-매개된 융합의 결과 상기 세포막에 근접하여 상기 두 염료가 배치된다. F18이 그의 최적 파장(450 ㎚)에서 여기될 때, 상기 두 염료가 동일한 세포막 중에 함께 배치되는 경우 R18을 여기시키는 파장(530 ㎚)에서 빛을 방출하여, 590 ㎚에서 R18-특이적인 방출을 생성시킨다. 약물 민감성을 일련의 농도의 약물을 효과기 세포에 가하기 전에 표적 세포에 가하여 측정한다. HIV-1 Env-매개된 융합의 억제는 용량 의존적인 방식으로 R18로 인한 형광 방출의 감소를 초래하여 약물 활성의 정량적인 측정을 제공한다.
협동적인 상호작용을 정량화하기 위한 분석의 확고함을 입증하기 위해서 HIV-1 Env-매개된 융합의 억제를 측정하는 초기 실험을 수행하였다. 상기 실험에서, PRO 140을 부가적인 상호작용을 가리키는 병용 지수(CI)를 생성시키는 조합인 그 자체와의 조합으로 실험하였다. 쵸우 앤드 탈랄레이(1984)의 방법을 사용하여, <1.0, = 1.0 및 >1.0의 CI 값들을 각각 상승작용적, 부가적 및 길항작용적 상호작용을 가리키도록 취한다. 실제로, PRO 140을 그 자체와 병용 실험하여 0.97±0.08(n=9; 표 8)의 CI 값으로 복귀하였으며, 이는 상기 분석 시스템이 상기 상호작용을 정확하게 나타냄을 가리킨다.
이어서 상승작용 실험을 PRO 140과 3개의 소 분자(SCH-D, TAK-779, UK427857), 하나의 펩타이드(RANTES) 및 CCR5의 하나의 mAb(2D7) 길항물질 간에 수행하였다. 또한, 협동적 상호작용을 PRO 140과 T-20(gp41의 펩타이드 기재 억제제), PRO 542(gp120의 단백질 기재 억제제), BMS378806(gp120의 소 분자 억제제) 및 Leu-3A(항-CD4 mAb) 사이에서 측정하였다.
상기 결과(표 7 참조)는 PRO 140과 3개의 모든 소 분자 CCR5 길항물질뿐만 아니라 RNATES 간의 강력한 상승작용을 밝혀냈다. PRO 140과 상기 CCR5 길항물질 간의 CI 값은 0.36 ± 0.10 내지 0.59 ± 0.08의 범위였다. 용량 감소 값은 상기 병용 화합물이 PRO 140 활성에 대해 대략 4배의 효과를 발휘한 반면, 상기 병용 화합물에 대한 PRO 140의 효과는 약 3 내지 약 16배의 범위임을 나타내었다(표 8). PRO 140과 T-20, PRO 542, BMS-378806 및 2D7 사이에서 적당한 상승작용 대 부가성이 관찰되었다(각각 CI = 0.84 ± 0.16, 0.96 ± 0.17, 1.21 ± 0.21, 및 0.93 ± 0.04).
CCR5 병용 실험의 소 분자 길항물질(SCH-D 및 TAK-779)은 1.12 ± 0.32의 평균 CI 값을 복귀하였으며, 이는 약간의 부가적인 상호작용을 가리킨다(표 8). 환원하면, 상기 재조합 항체 유사 융합 단백질 PRO 542와 항-CD4 mAb, Leu-3A와의 병용은 16.9 ± 0.3의 평균 CI 값을 생성시켰으며, 이는 상기 2개의 HIV-1 억제제들 간의 강력한 길항작용을 가리킨다(표 9).
화합물들의 다양한 몰 비는 유사한 협동 패턴을 나타내었다. 5:1 및 1:5 몰 비의 PRO 140 대 SCH-D, TAK-779, UK-427,857 및 RANTES 모두에서, HIV-1-Env-매개된 침입의 강력한 상승작용적 억제가 관찰되었다(표 10). 이는 0.15의 낮은 값에서부터 1,820의 높은 값까지 광범위한 억제제 질량 비를 나타낸다. PRO 140과 CCR5 길항물질 간의 CI 값은 0.52 ± 0.20 내지 0.84 ± 0.14의 범위였다. PRO 140과 T-20, PRO 542 또는 BMS-378806의 조합에 대해 보다 적당한 상승작용 대 부가성이 관찰되었다. 이러한 조사의 결과는 PRO 140과 CCR5 길항물질과의 강력한 상승작용 활성뿐만 아니라, PRO 140과 T-20 간의 보다 적당한 상승작용을 분명히 확인시킨다(도 4 참조).
상기 CCR5-특이적 쥐 mAb, 2D7의, 소 분자 CCR5 길항물질 및 RANTES와 병용된 HIV-1 억제 활성을 또한 형광 RET 분석에서 시험하였다. 2D7은 상기 CCR5 길항물질 및 RANTES와 상승작용적으로 작용하는 것으로 밝혀졌다(표 11). 2D7과 상기 CCR5 길항물질 간의 CI 값의 범위는 0.15 ± 0.03 내지 0.62 ± 0.04이었다. 용량 감소 값은 상기 병용 화합물이 TAK-779(이는 2D7 활성에 대해 대략 17배의 효과를 가졌다)를 제외하고 2D7 활성에 대해 2 내지 3배 효과를 발휘하였다. 상기 병용 화합물에 대한 2D7의 효과 범위는 약 2 내지 약 12배이었다(표 11). 앞서 관찰된 바와 같이, PRO 140 및 2D7은 함께 필수적으로 부가적이거나 적당히 상승작용적이었다(CI = 0.93 ± 0.04).
상기 결과는 HIV-1 Env-매개된 세포-세포 융합의 상승작용적 억제가 다수의 mAb와 CCR5에 결합하는 소 분자 사이에서 관찰된다. 상기 성질을 CCR5를 표적화하는 mAb, 예를 들어 CCR5에 결합하고 이를 길항하며 세포-세포 융합 분석에서 HIV-1 침입을 차단하는 것으로 나타난 mAb CCR5mAb004에 광범위하게 적용할 수 있다(Roschke et al., 2004). 많은 증가하는 수의 소 분자들이 CCR5 길항물질로서 동정되었다(표 13 참조). 이들 소 분자 CCR5 길항물질들 중 몇몇은 또한 PRO 140 및 다른 항-CCR5 mAb와 함께 HIV-1 Env-매개된 융합의 상승작용적 억제를 생성시킬 수 있다.
상승작용적 상호작용을 조사하기 위한 또 다른 접근법은 앞서 개시한 바와 같이 바이러스-세포 융합 분석을 사용한다(Nagashima et al., 2001; Trkola et al., 1998). 상기 분석에서 루시페라제 정보제공 인자 유전자를 함유하는 HIV 게놈 벡터(pNLluc+Env-)를 HIV-1JRFL로부터의 Env로 의사유형화(pseudotype)한다. 재조합 의사유형화된 바이러스 입자를 사용하여 CD4 및 CCR5를 발현하는 U87 세포(U87-CD4-CCR5)를 감염시킨다. 표적 세포 중의 루시페라제의 생산은 바이러스 침입 및 바이러스 복제의 1 순회의 완료에 따라 변한다. 약물 민감성을, 일련의 농도의 약물을 의사유형화된 바이러스 입자의 첨가 전에 표적 세포에 가하여 측정한다. 바이러스 침입의 억제는 루시페라제 활성의 감소를 용량 의존적인 방식으로 초래하며, 이는 약물 민감성의 정량적인 척도를 제공한다. 상기 HIV 게놈 벡터는 루시페라제 발현을 구동하기 위해서 작용적인 HIV-1 역전사효소(RT)의 발현을 요하기 때문에, 상기 슈도바이러스 분석은 또한 뉴클레오타이드/뉴클레오사이드 역 전사효소 억제제(NRTI) 및 비 뉴클레오사이드 역 전사효소 억제제(NNRTI)에 의한 억제에 민감하다. 그 자체로서, 상기 HIV-1pp 분석은 PRO 140과 소 분자, 펩타이드 및 CCR5, CD4, HIV-1, gp120, HIV-1 gp41 및 HIV-1 역 전사효소의 단백질 억제제 간의 협동적인 상호작용을 조사하는데 적합하다.
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3-(피롤리딘-1-일)프로피온산 동족체 Lynch et al., 2003c
[2-(R)-[N-메틸-N-(1-(R)-3-(S)-((4-(3-벤질-1-에틸-(1H)-피라졸-5-일)피페리딘-1-일)메틸)-4-(S)-(3-플루오로페닐)사이클로펜트-1-일)아미노]-3-메틸부탄산(MRK-1)] Kumar et al., 2003
4-아미노헤테로사이클 치환된 피페리딘 측쇄를 갖는 1,3,4-삼치환된 피롤리딘 Willoughby et al., 2003; Lynch et al., 2003a; Lynch et al., 2003b; Hale et al., 2002
바이사이클릭 아이속사졸리딘 Lynch et al., 2002
CCR5 길항물질의 조합 합성 Willoughby et al., 2001
헤테로사이클 함유 화합물 Kim et al., 2001b
하이단토인을 함유하는 길항물질 Kim et al., 2001a
1,3,4 삼치환된 피롤리딘 Hale et al., 2001
1-[N-(메틸)-N-(페닐설포닐)아미노]-2-(페닐)-4-(4-(N-(알킬)-N-(벤질옥시카보닐)아미노)피페리딘-1-일)부탄 Finke et al., 2001
리피아 알바(Lippia alva) 식물로부터의 화합물 Hedge et al., 2004
피페라진 기재 CCR5 길항물질 Tagat et al., 2004
옥스이미노-피페리디노-피페리딘 기재 CCR5 길항물질 Palani et al., 2003b
SCH 351125의 로타머 Palani et al., 2003a
피페라진-기재 대칭적인 헤테로아릴 카복스아미드 McCombie et al., 2003
옥스이미노-피페리디노-피페리딘 아미드 Palani et al., 2002
Sch-351125 및 Sch-350634 Este, 2002
SCH-C Strizki et al., 2001
1-[(2,4-디메틸-3-피리디닐)카보닐]-4-메틸-4-[3(S)-메틸-4-[1(S)-[4-(트라이플루오로메틸)페닐]에틸]-1-피페라지닐]-피페리딘 N1-옥사이드(Sch-350634) Tagat et al., 2001a
4-[(Z)-(4-브로모페닐)-(에톡시이미노)메틸]-1'-[(2,4-디메틸-3-피리디닐)카보닐]-4'-메틸-1,4'-바이피페리딘 N-옥사이드(SCH351125) Palani et al., 2001
2(S)-메틸 피페라진 Tagat et al., 2001b
피페리딘-4-카복스아미드 유도체 Imamura et al., 2005
설폭사이드 잔기를 함유하는 1-벤즈아제핀 유도체 Seto et al., 2005
피리딘 N-옥사이드 잔기를 함유하는 아닐리드 유도체 Seto et al., 2004a
3급 아민 잔기를 함유하는 1-벤조티에핀 1,1-다이옥사이드 및 1-벤즈아제핀 유도체 Seto et al., 2004b
N-[3-(4-벤질피페리딘-1-일)프로필]-N,N'-다이페닐우레아 Imamura et al., 2004a
5-옥소피롤리딘-3-카복스아미드 유도체 Imamura et al., 2004b
4급 암모늄 잔기를 갖는 아닐리드 유도체 Shiraishi et al., 2000
AK602/ONO4128/GW873140 Nakata et al., 2005
스피로다이케토피페라진 유도체 Maeda et al., 2001; Maeda et al., 2004
선택적인 CCR5 길항물질 Thoma et al., 2004
바이러스 억제 상승작용을 조사하기 위한 세 번째 접근법은 전체 바이러스 분석을 사용한다. 모든 부류의 억제제 분자들 간의 협동성을 상기 분석 포맷으로 조사할 수 있다.
상기 바이러스-세포 융합 루시페라제 분석 및 전체 바이러스 분석 모두에서, IC50 값은 상기 RET 분석에 대해 본 발명에서 개시한 바와 같이 모든 조합에 대해 생성된다. 약물 조합의 협동적인 억제 효과를 쵸우 앤드 탈랄레이(Chou and Talalay)(1984)의 방법에 의해 측정한다.
PRO 140은 임상 전 시험에서 CCR5 길항작용 또는 다른 면역학적 부작용 없이 CCR5-매개된 HIV-1 침입을 광범위하고 강력하게 억제하였다. 보다 최근에, PRO 140은 건강한 지원자에서 진행중인 1a기 연구로부터의 예비 결과에서 유리한 허용성, PK 및 면역학적 프로파일을 입증하였다. 따라서, 많은 점에서, PRO 140은 항-HIV-1 요법에 대해 신규의 매력적인 생성물 프로파일을 제공한다. 더욱이, 항-CCR5 mAb의 활성은 소 분자 CCR5 길항물질의 활성과 근본적으로는 상이하지만 상기에 상보적이다(표 2 참조).
항-CCR5 mAb와 비-항체 CCR5 길항물질의 조합이, 상기 두 부류의 작용제들이 동일한 표적 분자에 결합하므로, CD4+CCR5+ 표적 세포에 대한 HIV-1의 융합을 억제하는데 부가적인 효과를 생성시킬 것임을 예상할 수 있었을 지도 모른다. 그러나, 놀랍게도, 본 발명에 제공된 데이터는 PRO 140 및 2D7으로 예시되는 항-CCR5 mAb가 HIV-1 Env-매개된 세포-세포 융합을 억제함에 있어서 SCH-D, TAK-779, UK-427,857 및 RANTES로 예시되는 비-항체 CCR5 길항물질과 강력하고 재현적으로 상승작용을 나타냄을 밝혀내었다. 상승작용은 통상적으로 4 내지 10배 용량 감소로 다시 표현되는데, 이는 상기 약물 조합들에 대한 억제 효능의 현저한 개선을 암시한다. 대조적으로, 순수한 부가 효과는 비-항체 CCR5 길항물질의 조합의 경우 관찰되었다. 이러한 발견은 상기 분자의 상이한 CCR5 인식 패턴을 반영하는 듯하다: 소 분자 CCR5 길항물질이 CCR5의 막통과 영역 내에서 공통의 소수성 포켓과 결합하는 반면, PRO 140은 CCR5의 친수성, 세포 외 에피토프를 인식한다. 종합적으로, 상기 데이터는 PRO 140의 비-항체 HIV-1 침입 억제제와의 병용을 지지하고, PRO 140이 CCR5 억제제의 명백한 하위 부류를 나타냄을 암시한다.
더욱이, 상기 입수할 수 있는 데이터는 상기 관찰된 상승작용을 또한 PRO 140 이외의 항-CCR5 mAb, 예를 들어 비 제한적으로 mAb CCR5mAb004(Roschke et al., 2004)뿐만 아니라 SCH-D, TAK-779, UK-427,857 및 RANTES 이외의 비 항체 CCR5 길항물질을 포함하는 조합들에 의해 나타날 수도 있음을 시사한다. 따라서, 상기 항체들은 GW873140(Lalezari et al., 2004), TAK-652(Baba et al., 2005), 및 표 13에 나타낸 소 분자 CCR5 길항물질의 적어도 몇몇과 함께 상승작용적 효과를 생성하는 듯하다. 따라서, 항-CCR5 mAb 및 비-항체 CCR5 길항물질의 투여를 포함하는 병행 요법은 HIV-1 감염의 예방 및 치료에 강력하고 유효한 신규의 접근방법을 제공할 수 있다. 상기와 같은 요법은 보다 강력하고 보다 영속적인 항-HIV-1 치료를 생성시킬 것으로 예상된다. 또한, 본 발명에 개시된 상승작용적 효과는 환자에게 투여된 약물의 용량 감소뿐만 아니라 투여 회수의 감소도 가능하게 할 수 있다.
실시예 4: 부하 및 유지 용량 섭생
예를 들어 유지 섭생보다 더 용량 집중적일 수 있는 부하 섭생은 예를 들어 하기의 특징들을 가질 수 있다:
투여용량 수: 1회 이상(약 5 회 이하 용량)
용량 수준: 유지 용량 섭생보다 약 25%, 50%, 75%, 100%, 150% 또는 200% 초과.
투여 회수: 상기 유지 용량 섭생보다 약 1.5배, 2배, 3배 또는 4배 더 빈번함.
예로서, 상기 유지 용량 섭생이 매 2주마다 2 ㎎/㎏인 경우, 상기 부하 용량 섭생은 매주 2 ㎎/㎏ 용량을 포함할 수 있다. 한편으로, 상기 부하 용량 섭생은 매주 또는 2주 간격으로 1회 4 ㎎/㎏ 용량 또는 수 회 4 ㎎/㎏ 용량을 포함할 수 있다.
상기 부하 용량 섭생을 예를 들어 용량 간의 균일한 고점 및 저점 혈 중 약물 농도에 의해 정의되는 바와 같이, 환자에서 약동학적 정상 상태의 성취를 가속화하도록 디자인할 수 있다. 바람직한 부하 용량 섭생은 상기 약물을 부하 및 유지 섭생을 다양하게 하여 상기 환자에게 투여하고, 약물의 혈액 수준을 측정하는 통상적인 실험에 의해 측정할 수 있다.
또한 또 다른 실시태양에서, PRO 140을 고정된 용량 섭생에 따라, 예를 들어 투여 당 75 ㎎, 150 ㎎, 300 ㎎ 및 600 ㎎으로 투여한다.
파트 III
물질 및 방법
억제제
PRO 140을 포유동물 세포에서 발현시키고, 단백질 A, 이온 교환 및 하이드록시아파타이트 크로마토그래피에 의해 정제하였다. UK-427,857(Dorr et al., 2005), SHC-D(Tagat et al. 2004), TAK-779(Baba et al., 1999), 엔푸비르타이드(T-20(Wild et al., 1991); BMS-378806(Lin et al. 2003)) 및 PRO 542(CD4-IgG2, (Allaway et al. 1995))를 공개된 방법에 따라 제조하였다. 지도뷰딘(아지도티미딘, AZT), RANTES, CCR5 mAb 2D7 및 CD4 mAb Leu-3A를 각각 시그마 케미칼스(St. Louis, MO), R&D 시스템스(Minneapolis, MN), 파밍겐(Pharmingen)(San Diego, CA), 및 벡톤 디킨슨(Becton Dickinson)(Franklin Lakes, NJ)으로부터 구입하였다. UK-427,857 및 SCH-D를 GE 헬쓰케어(Piscataway, NJ)에 의해 3중 수소로 방사성 표식하였으며, PRO 140을 서던 바이오테크 인코포레이티드(Southern Biotech, Inc.)(Birmingham, AL)에 의해 피코에리트린(PE)에 접합시켰다.
HIV -1 막 융합 분석
HIV-1 피막-매개된 막 융합을 변경된 형광 공명 에너지 전달(RET) 분석(Litwin et al., 1996)을 사용하여 조사하였다. 간단히, HIV-1JR - FL gp120/gp41(Litwin et al. 1996) 및 CEM.NKR-CCR5 세포(NIH AIDS 리써치 앤드 레퍼런스 리에이젼트 프로그램, (Spenlehauer et al. 2001; Trkola et al. 1999))를 안정하게 발현하는 HeLa 세포를 각각 플루오레세인 옥타데실 에스터(F18; Molecular Probes, Eugene, OR) 및 로다민 옥타데실 에스터(R18; Molecular Probes)를 사용하여 별도로 밤새 표식하였다. 세포를 15% 소 태아 혈청(PBSF)을 함유하는 포스페이트 완충 염수에서 세척하고 15,000 세포/웰로 384-웰 플레이트에 함께 시딩하였다. 억제제들을 가하고, 상기 플레이트를 앞서 개시한 바와 같이(Litwin et al. 1996) 빅터(Victor)2 플레이트 판독기(Perkin-Elmer, Boston, MA)를 사용하여 RET를 측정하기 전에 37℃에서 4시간 동안 PBSF + 0.5% 디메틸설폭사이드(DMSO) 중에서 배양하였다. 상기 CD4 mAb Leu3a를 대조용 억제제로 사용하였으며, 억제 퍼센트를 하기와 같이 계산하였다: (억제제 부재 하의 RET - 억제제 존재 하의 RET)/(억제제 부재 하의 RET - Leu3a 존재 하의 RET) × 100.
HIV -1 슈도바이러스 분석
자가-불활성화(self-inactivation, SIN) 벡터를, TATA 박스 및 전사 인자 결합 부위를 제거하기 위해서 3' 긴 말단 반복부(long terminal repeat, LTR)의 U3 부위에서 507 염기쌍을 결실시킴으로써 pNL4-3ΔEnv-루시페라제 벡터(Dragic et al. 1996)로부터 유도하였다. 상기 인간 거대세포바이러스 프로모터를 통합에 따른 루시페라제의 발현이 가능하도록 상기 루시페라제(luc) 유전자의 상부에 삽입하였다.
HIV-1JR - FL 또는 HIV-1SF162 피막에 의해 의사유형화된 정보제공 인자 바이러스를 앞서 개시한 바와 같이(Dragic et al. 1996) 293T 세포를 SIN 벡터 및 적합한 pcDNA env-발현 벡터와 함께 형질감염시킴으로써 생성시켰다. U87-CD4-CCR5 세포(8,000/웰; NIH AID 리써치 앤드 레퍼런스 리에이전트 프로그램)를 억제제(들)의 존재 또는 부재 하에 384-웰 플레이트에서 HIV-1 슈도바이러스로 감염시켰다. 배양물을 10% 소 태아 혈청, 1 ㎎/㎖의 퓨로마이신, 0.3 ㎎/㎖의 제네티신, 항생제, 및 0.5% DMSO를 함유하는 DMEM 중에서 37℃에서 72시간 동안 배양하였다. 루시페라제 활성(비교적 가벼운 단위 또는 RLU)을 제조사의 지시에 따라 BrightGlo 시약(Promega, Madison, WI)을 사용하여 측정하였다. 억제 퍼센트를 하기와 같이 계산하였다: (1 - 억제제 존재 하의 RLU/억제제 부재 하의 RLU) × 100. IC50 및 IC90을 사용하여 HIV-1의 50% 및 90% 억제에 필요한 각각의 농도를 나타내었다.
상승작용 측정
실험 디자인 및 데이터 분석은 병용 지수(CI) 방법(Chou et al. 1991; Chou et al. 1984)을 근거로 하였다. 화합물들을 일련의 희석 범위에 걸쳐 고정된 몰 비에서 개별적으로 및 병용 시험하였다. 침입 억제제를 동 몰 량으로 병용한 반면, 1:10의 몰 비를 PRO 140과 아지도티미딘 및 네비라핀과의 병용에 사용하였다. 용량 반응 곡선은 50%(IC50) 및 90%(IC90) 억제에 필요한 농도를 계산하기 위해서 각각 100% 및 0%로 제한된 상한 및 하한 억제 값으로 4개의 매개변수 S자 식을 사용하여 맞추었다(GraphPad Prism, GraphPad Software, San Diego, CA). 50%(CI50) 및 90%(CI90) 억제에 대한 CI 값들을 앞서 개시한 바와 같이 계산하였다(Chou et al. 1991; Chou et al. 1984). 상호 배타적인 CI 식을 CCR5 억제제들의 조합에 사용한 반면, 상호 배타적이지 않은 식은 별도의 표적들에 대한 억제제들의 조합에 사용하였다(Chou et al. 1991). 각 시험을 4 내지 12회 수행하였다. 상승작용, 부가성 및 길항작용을 각각 CI<1, CI=1 및 CI>1로 나타낸다.
경쟁 결합 분석
PRO 140 결합의 억제를 조사하기 위해서, CEM.NKR-CCR5 세포를 0.1% 나트륨 아지드(PBSA)가 있는 포스페이트 완충 염수에 현탁시키고 주변 온도에서 30 분 동안 다양한 농도의 표식되지 않은 CCR5 길항물질과 함께 배양하였다. 아지드를 가하여 상기 분석 동안 CCR5의 내면화를 차단하였다. 세포를 PBSA에서 세척하고 추가로 30분 동안 5 nM PRO 140-PE와 함께 배양한 후에 세척하고 FACSCalibur 장비(Becton Dickinson)를 사용하여 유식 세포측정(flow cytometry)에 의해 분석하였다. PRO 140-PE 결합의 정도를 평균 형광 강도(MFI) 및 양의 염색을 허용하는 세포 퍼센트 모두에 대하여 측정하였다.
UK-427,857 결합의 억제를 조사하기 위해서, CEM.NKR-CCR5 세포를 2 nM 3H-UK-427,857의 첨가 전에 추가로 30 분 동안 상술한 바와 같이 표식되지 않은 CCR5 억제제와 함께 예비 배양하였다. 상기 세포를 PBSA에서 세척하고 Wallac 1410 장비를 사용하여 섬광 카운트하기 전에 0.5N HCl로 용해시켰다. 추가의 연구는 상기 분석 과정에 걸쳐 UK-427,857 결합의 안정성을 조사하기 위해서 첨가 순서를 역전시켰다. 세포를 30분간 2 nM 3H-UK-427,857과 함께 예비 배양한 후에 세척하고, 표식되지 않은 억제제를 가하고, 상술한 바와 같이 처리하였다. EC50 및 EC90 을 사용하여 표식 화합물의 결합을 각각 50% 및 90%까지 억제하는데 필요한 표식되지 않은 화합물의 농도를 나타내었다.
통계적 분석
2-테일드 t-시험을 사용하여 0의 가설 H0: CI = 1(부가성)에 대한 평균 CI50 및 CI90 값을 그래프패드 프리즘 소프트웨어를 이용해서 시험하였다;. P 값을, 분석 대조군으로서 포함시킨 PRO 140/PRO 140 모의 조합을 제외하고, 본페로니 방법(Bonferroni method)(Cudeck and O'Dell 1994)에 따라 α=0.05로부터 수 회의 비교에 대해 보정하였다. 상기 본페로니 보정에서, P = α/n(이때 n은 비교 회수이다). 22회의 상승작용 비교(11 화합물 × 2 CI 값)를 상기 막 융합 분석에서 생성된 데이터를 근거로 수행하였으며, 그 결과 0.0023의 보정된 P 값이 생성되었다. 슈도바이러스 분석에서, 32회의 상승작용 비교(8 화합물 × 2 바이러스 × 2 CI 값)는 0.0016의 보정된 P 값을 생성시켰다.
결과
HIV -1 막 융합의 억제
PRO 140 및 UK-427,857을 상기 RET 세포-세포 융합 분석에서 HIV-1JR - FL 피막-매개된 막 융합을 억제하기 위해 개별적으로 및 함께 사용하였으며, 상기 개별적인 작용제 및 조합에 대한 전형적인 용량 반응 곡선을 도 15A에 예시한다. PRO 140과 UK-427,857은 모두 낮은 나노 몰 효능으로 HIV-1 융합을 개별적으로 차단하지만, 그 조합은 현저하게 더 효능이 있었다. 상기 분석에서, 50% 억제는 2.9 nM PRO 140 단독, 5.0 nM UK-427,857 단독, 또는 2.1 nM의 조합(1.05 nM PRO 140 + 1.05 nM UK-427,857)을 사용하여 획득되었다. 상기 초월의 부가 효과는 상기 두 작용제들 간의 바이러스 억제 상승작용을 가리킨다. 대조적으로, SCH-D와 UK-427,857의 조합은 개별적인 작용제들보다 더 효능이 있지는 않았다(도 15B). 이 실시예에서, 상기 개별적인 억제제 및 조합에 대한 용량 반응 곡선은 중복되었으며, 이때 50% 억제는 9.7 nM의 UK-427,857, 5.5 nM의 SCH-D 및 6.1 nM의 조합을 필요로 하였다. 상기 데이터는 상기 억제제들에 대한 순수한 부가 효과를 암시한다.
상기 연구를 추가적인 CCR5(TAK-779, RANTES 및 2D7), gp120(BMS-378806 및 PRO 542) 및 gp41(엔푸비르타이드) 억제제로 확장하였으며, 각 조건에 대해 4 회 이상 반복하였다. CI50 및 CI90 값을 각 조건에 대해 계산하고 독립적인 분석들에 대해 평균하였다. CI50 및 CI90 값이 하나와 현저히 다른 지를 측정하기 위해 t-시험을 사용하여 협동성을 평가하였다. 상기 방법들의 시험으로서, PRO 140/PRO 140 모의 조합을, PRO 140을 상기 분석 웰에 2개로 별도 첨가하여 조사하였다. 상기 PRO 140/PRO 140 조합에 대한 CI50 및 CI90 값은 각각 0.96 및 0.97이었으며(표 14); 따라서, 예상한 바와 같이, 순수하게 부가적인 효과가 상기 모의 조합에 대해 관찰되었다.
HIV-1JR - FL 피막-매개된 막 융합의 억제에 대한 CI 값
제 1억제제 표적 IC50 nM IC90 nM 제 2억제 제 CI50 P 값 CI90 P 값
PRO 140 CCR5 2.5 8.6 PRO 140 0.97±0.07 0.13 0.96±0.14 0.37
UK-427,857 CCR5 5.3 27 PRO 140 0.61±0.05 <0.0001 0.40±0.06 <0.0001
SCH-D CCR5 3.2 16 PRO 140 0.51±0.05 <0.0001 0.36±0.06 <0.0001
TAK-779 CCR5 11 >200 PRO 140 0.38±0.08 <0.0001 N/A N/A
RANTES CCR5 2.4 38 PRO 140 0.59±0.08 0.0022 0.43±0.05 0.0022
RANTES CCR5 2.4 38 UK-427,857 0.48±0.03 0.0017 0.18±0.01 <0.0001
SCH-D CCR5 3.2 16 UK-427,857 0.86±0.03 0.016 0.75±0.02 0.0033
SCH-D CCR5 3.2 16 TAK-779 1.3±0.18 0.12 N/A N/A
2D7 CCR5 3.7 58 PRO 140 1.0±0.14 0.61 1.9±0.61 0.024
엔푸비르타이드 gp41 8.6 66 PRO 140 0.84±0.16 0.040 0.89±0.20 0.19
PRO 542 gp120 8.9 91 PRO 140 0.96±0.17 0.56 0.94±0.19 0.46
BMS-378806 gp120 5.2 20 PRO 140 1.3±0.19 0.0015 1.1±0.22 0.19
a통계학적으로 의미 있는 결과(수 회의 비교를 위해 본페로니 보정을 적용한 후에 P<0.0023)는 이탤릭체의 굵은 문자로 나타낸다. IC50 및 IC90은 상기 제 1억제제에 대한 값을 나타낸다. N/A = 적용할 수 없음; TAK-779는 상기 분석에서 90% 억제를 일관적으로 성취하지 못했다. CI 값은 4 내지 12의 독립적인 분석의 평균 및 표준 편차를 나타낸다).
PRO 140을 3개의 소 분자 CCR5 길항물질(UK-427,857, SCH-D 및 TAK-779) 각각과 병용 시 강력한 상승작용이 관찰되었으며, 상기 발견은 상기 데이터를 본페로니 방법을 통해 수회 비교에 대해 보정한 경우에조차도 통계학적으로 유의수준이었다(표 14). CI 값의 범위는 0.36 내지 0.61이었으며, 이러한 상승작용은 상이한 조건들 전체에 걸쳐 3 내지 8배 범위의 용량 감소로 해석되었다. 상승작용은 50% 억제에서보다 90% 억제에서 더 컸다. PRO 140과 소 분자 CCR5 길항물질 간의 상승작용은 상기가 모든 경우에 50% 및 90% 억제 모두에서 관찰되었다는 점에서 확고하였다. TAK-779는 예외였는데, 상기는 개별적으로 사용 시 90% 억제를 매개하지 못했으며, 따라서 CI90을 측정하지 못했다. 유사하게 강력한 상승작용이, RNATES를 PRO 140이나 UK-427,857과 함께 사용했을 때 관찰되었다(표 14). 추가의 시험은 2개의 소 분자 CCR5 길항물질(SCH-D/UK-427,857 및 SCH-D/TAK-779) 또는 2개의 CCR5 mAb(PRO 140/2D7)의 조합을 조사하였다. 이들 조합에 대해서 현저한 상승작용은 관찰되지 않았지만, 상기 SCH-D/UK-427,857 CI90 값은 유의수준으로 기운다. 상기 발견은 PRO 140과 2D7(Olson et al. 1999) 및 SCH-D와 TAK-779(Seibert et al. 2006)에 대한 선행의 중복 결합 부위의 관찰과 일치한다. PRO 140을 또한 gp41 융합 억제제 엔푸비르타이드 및 gp120 부착 억제제 PRO 542 및 BMS-378806과 함께 시험하였다(표 14). CI 값의 범위는 0.84 내지 1.28이었으며, 이들 조합 중 어느 것도 통계학적 유의수준에 대한 기준을 만족하는 상승작용을 입증하지 못했다. 상기 PRO 140/BMS-378806 조합의 경우, 50%에서는 적당한 길항작용이 관찰되었지만 90% 억제에서는 관찰되지 않았다. 상기 결과의 생물학적 중요성은 불분명하다.
HIV -1 슈도바이러스의 억제
단일 주기 HIV-1 정보제공 인자 바이러스를 사용하여 상기 상승작용 효과가 세포-세포 융합으로 제한되었는지 혹은 상기가 HIV-1 침입의 다른 모드로 연장되었는지를 조사하였다. 상기 분석에서 신호는 바이러스 침입과 역 전사를 모두 필요로 하며, 따라서 NRTI 및 NNRTI 모두를 상기 분석에 포함시킬 수 있다. 각각의 조합을 바이러스 당 4개 이상의 독립적인 분석에서 HIV-1JR - FL 및 HIV-1SF162로부터의 피막으로 의사유형화한 정보제공 인자 바이러스에 대해 시험하였다. PRO 140/PRO 140 모의 조합을 다시 분석 대조용으로서 포함시켰으며, 이는 예상한 바와 같이 HIV-1JR-FL 및 HIV-1SF162 슈도바이러스 모두에 대해 부가적인 효과를 나타내었다(표 15).
PRO 140은 바이러스-세포 융합을 차단함에 있어서 UK-427,857 및 SCH-D 모두와 강력하게 상승작용하였으며, 그 결과는 통계학적 유의수준에 대한 기준을 만족하였다. 필적할만한 수준의 상승작용이 50% 및 90% 억제에서 HIV-1JR - FL 및 HIV-1SF162 슈도바이러스 모두에 대해 관찰되었으며(표 15), 이때 CI 값의 범위는 0.18 내지 0.64이었다. 이러한 상승작용은 14배 범위의 용량 감소로 해석되었다. 이러한 결과는 세포-세포 융합 분석(표 14)에서 획득된 결과와 잘 일치한다. TAK-779나 RANTES 중 어느 것도 HIV-1 슈도바이러스 침입의 일관적인 높은 수준의 억제를 전달하지 못했으며, 따라서 이들 화합물을 본 분석에 포함시키지 않았다(데이터 도시 안됨).
HIV-1JR - FL 및 HIV-1SF162로부터의 피막으로 의사유형화된 HIV-1 정보제공인자 바이러스의 억제에 대한 CI 값
제 1억제제 표적 HIV-1 피막 IC50nM IC90nM 제 2억제제 CI50 P 값 CI90 P 값
PRO 140 CCR5 JRFL SF162 2.2 1.3 28 20 PRO 140 PRO 140 1.2±0.32 1.0±0.27 0.16 1.0 0.90±0.15 0.86±0.33 0.047 0.21
SCH-D CCR5 JRFL SF162 2.4 0.34 44 14 PRO 140 PRO 140 0.47±0.15 0.60±0.17 <0.001 <0.001 0.18±0.04 0.28±0.11 <0.001 <0.001
UK-427,857 CCR5 JRFL SF162 7.4 0.87 46 13 PRO 140 PRO 140 0.44±0.06 0.64±0.07 <0.001 <0.001 0.24±0.11 0.31±0.11 <0.001 <0.001
UK-427,857 CCR5 JRFL SF162 7.4 0.87 46 13 SCH-D SCH-D 0.71±0.11 0.87±0.06 0.16 0.19 1.2±0.15 0.86±0.28 0.32 0.61
2D7 CCR5 JRFL SF162 8.8 2.2 >200 74 PRO 140 PRO 140 1.5±0.25 1.1±0.47 0.024 0.61 N/A 1.0±0.16 N/A 0.65
PRO 542 gp120 JRFL SF162 0.19 0.36 2.9 7.1 PRO 140 PRO 140 1.2±0.32 0.98±0.28 0.22 0.84 1.0±0.18 0.64±0.26 0.92 0.010
BMS-378806 gp120 JRFL SF162 1.2 0.03 11 0.42 PRO 140 PRO 140 1.2±0.38 1.1±0.28 0.43 0.36 0.74±0.23 0.82±0.21 0.059 0.068
네비라핀 RT JRFL SF162 30 42 310 280 PRO 140 PRO 140 1.2±0.38 1.2±0.34 0.36 0.30 0.73±0.28 0.63±0.19 0.068 0.033
지도뷰딘 RT JRFL SF162 140 86 1900 2100 PRO 140 PRO 140 1.1±0.38 0.99±0.27 0.37 0.91 0.85±0.26 1.0±0.38 0.21 1.0
a통계학적으로 의미 있는 결과(수 회의 비교를 위해 본페로니 보정을 적용한 후에 P<0.0016)는 이탤릭체의 굵은 문자로 나타낸다. IC50 및 IC90은 상기 제 1억제제에 대한 값을 나타낸다. N/A = 적용할 수 없음; 2D7은 상기 분석에서 90% 억제를 일관적으로 성취하지 못했다. CI 값은 4 개 이상의 독립적인 분석의 평균 및 표준 편차를 나타낸다).
부가적인 효과가 상기 UK-427,587/SCH-D 및 PRO 140/2D7 조합 모두에 대해 관찰되었다(표 15). 유사하게, 부가성이 gp120 억제제 PRO 542 및 BMS-378806과 함께 사용된 PRO 140에 대해 관찰되었다. 상기 PRO 140/BMS-378806 조합의 경우 상기 중 어느 한 바이러스에 대한 길항작용도 관찰되지 않았다. 전체적으로, 이러한 발견은 세포-세포 융합에 대해 관찰된 발견과 일치한다. 결국, 부가적인 효과는 지도뷰딘(NRTI)이나 네비라핀(NNRTI)과 병용된 PRO 140에 대해서 관찰되었다.
경쟁 결합 연구
상술한 바와 같이, 부가적인 바이러스 억제 효과는 CCR5 결합에 대해 경쟁하는 것으로 공지되거나(PRO 140 및 2D7) 또는 추론된(UK-427,857 및 SCH-D) 억제제들에 대해서 관찰되었으나; 상승작용적 화합물들(예를 들어 PRO 140/UK-427,587 및 PRO 140/SCH-D)의 경쟁적인 결합에 대해서는 거의 알려지지 않고 있다. 비 경쟁적인 결합은 CCR5 억제제들 간의 상승작용에 대해 가능한 기전을 제공하기 때문에, 이러한 쟁점을 UK-427,857 및 PRO 140의 표식 형태를 사용하여 조사하였다.
유식 세포측정을 사용하여 표식되지 않은 PRO 140, UK-427,857 및 SCH-D에 의한 CEM.NRK.CCR5 세포에의 PRO 140-PE 결합의 억제를 조사하였다. PRO 140-PE 결합은 예상한 바와 같이, 표식되지 않은 PRO 140에 의해 효율적으로 억제되었다. 완전한 억제는 MFI 값(도 16A) 및 양성 결합을 허용하는 세포의 퍼센트(도 16B) 모두에 관하여 관찰되었다. MFI 데이터에 근거한 EC50은 2.5 nM(도 16A)이었으며, 상기 값은 PRO 140의 바이러스 억제 IC50에 유리하게 비교된다(표 14 및 15). 허용된 세포 퍼센트는 결합의 필수적으로 완전한 억제에 대한 정보이므로, EC90 값을 17 nM로서 계산하였으며, 상기 값은 PRO 140에 대해 관찰된 바이러스 억제 IC90 값과 유사하다(표 14 및 표 15). 2D7은 또한 PRO 140-PE의 CEM.NKR-CCR5에의 결합을 완전하게 억제하였다. PRO 140-PE의 CCR5 특이성은 또한 모 CEM.NKR 세포와의 결합에 대한 그의 불능에 의해 입증되었다.
명확한 대조로, UK-427,857 및 SCH-D에 대해 적당한 수준의 억제가 관찰되었다(도 16). 나노 몰 농도의 UK-427,857 및 SCH-D는 PRO 140-PE MFI 값을 50% 이하까지 감소시켰다(도 16A). 보다 극적으로, UK-427,857 및 SCH-D는 PRO 140-PE의 양의 결합을 허용하는 세포의 퍼센트에 거의 영향을 미치지 않았다(도 16B). 상기 발견은 UK-427,857 및 SCH-D가 세포당 결합된 PRO 140 PE 분자의 수를 부분적으로 감소시킴을 암시하나; 이들 화합물은 무시할 수 없는 양의 PRO 140-PE와 결합하는 세포의 수를 감소시키지 않는다. 따라서, UK-427,857 및 SCH-D는 PRO 140 결합의 부분적인 길항물질을 나타내며, 이러한 발견은 PRO 140과 상기 소 분자 CCR5 길항물질 사이에 관찰된 바이러스 억제 상승작용에 대한 기전을 제공한다.
이어서 표식되지 않은 UK-427,857, SCH-D 및 PRO 140에 의한 3H-UK-427,857 결합의 억제를 조사하였다. 3H-UK-427,857의 CEM.NKR-CCR5에의 결합은 표식되지 않은 UK-427,857에 의해 효율적으로 억제되었다(도 17A). 결합에 대한 EC50은 4.3 nM이었으며 이는 UK-427,857에 대해 관찰된 바이러스 억제 IC50 값과 유사하다(표 14 및 표 15).
SCH-D는 또한 배경 수준에 대한 3H-UK-427,857 결합을 차단하였다(도 17A). 그러나, 상기 화합물들의 바이러스 억제 효능과 그들의 3H-UK-427,857 결합 차단 효능 간에는 상관성이 없었다. 예를 들어, SCH-D는 UK-427,857과 같거나 이보다 약간 더 큰 바이러스 억제 효능을 나타낸 반면(표 14 및 15), SCH-D는 3H-UK-427,857 결합의 차단에 효능이 적었다(EC50 = 17 nM, 도 17A). 상기 결과는 상기 화합물들의 CCR5 결합 부위에서 작은 차이로 일치한다.
놀랍게도, PRO 140은 배경 수준에 대한 3H-UK-427,857 결합을 또한 차단하였으며(도 17A), 이러한 결과는 UK-427,857에 의한 PRO 140-PE 결합의 적당한 억제와 대조적이다(도 16). PRO 140은 14 nM의 EC50으로 3H-UK-427,857 결합을 억제하였으며, 이는 PRO 140의 바이러스 억제 IC50보다 5 내지 10배 더 크다(표 14 및 표 15).
최종 실험은 상기 경쟁 분석의 조건 하에서 CEM.NKR-CCR5 세포에 대한 UK-427,857 결합의 안정성을 조사하였다. 이를 위해서, 세포를 3H-UK-427,857과 예비 배양하고 이어서 해리를 표식되지 않은 UK-427,857, SCH-D 및 PRO 140의 존재 하에서 조사하였다. 도 17B에 나타낸 바와 같이, 주변 온도에서 30분에 걸쳐 3H-UK-427,857의 최소 해리가 있었으며, UK-427,857은 PRO 140이나 SCH-D에 의해 대체되지 않았다. 따라서, CCR5에 대한 PRO 140 결합과 효율적으로 경쟁하지 못하는 UK-427,857의 불능(도 16)은 상기 분석 과정 동안 CCR5로부터의 UK-427,857의 급속한 해리에 기인하지 않는다. 집합적으로, 상기 데이터는 PRO 140이 예비 결합된 UK-427,857의 존재 하에서 CCR5와 결합할 수 있음을 가리킨다.
논의
본 연구는 mAb와 소 분자 CCR5 억제제들 간의 상호작용을 연구하며 현재 HIV-1 요법에 대해 개발 중인 CCR5 약물들의 조합을 조사한다. 놀랍게도, 상기 CCR5 mAb PRO 140과 3개의 구조적으로 다른 소 분자 CCR5 길항물질들 각각과의 강력한 바이러스 억제 상승작용이 관찰되었다. 다양한 분석 시스템, 바이러스 단리물, 표적 세포 및 억제 수준에 걸쳐 일관되고 높은 수준의 상승작용이 관찰되었다. PRO 140 및 소 분자 CCR5 길항물질은 함께 사용될 때, HIV-1 침입의 다른 단계들을 차단하는 억제제들과 병용시보다 더 강력하게 상승작용하였다. 대조적으로, 부가적인 효과는 2개의 소 분자 CCR5 길항물질들의 병용에 대해서 관찰되었다. 경쟁 결합 연구는 mAb와 소 분자 CCR5 억제제에 의한 CCR5 결합의 복잡하고 비 상호적인 패턴을 밝혀내었으며, 상기 상승작용적 상호작용은 수용체 결합 수준에서 발생함을 암시한다.
mAb와 소 분자 CCR5 억제제들 간의 강한 상승작용이 본 연구에서 관찰되었다. 세포-세포 및 바이러스-세포 융합 모두에 대해서 강력한 상승작용이 관찰되었으며, 이들 2개의 잘 확립된 분석 시스템에서의 발견들은 잘 일치하였다. 필적할만한 수준의 상승작용이 PRO 140과, 관련되지 않은 화학 시리즈로부터의 3개의 소 분자 CCR5 길항물질들 각각과의 조합에 대해 관찰되었다. 또한, 2개의 잘 특성화된 HIV-1 피막과 2개의 CCR5 표적 세포 각각에 대해 일관된 상승작용이 관찰되었다. 상승작용은 바이러스 억제 수준의 증가에 따라 증가하였으며 14배까지의 생체 외 용량 감소로 해석되었다. 또 다른 개념으로, 이러한 정도의 상승작용은 주어진 약물 농도에서 바이러스 억제 압력의 상응하는 증가를 제공하며, 이에 의해 바이러스 억제가 개선되고 약물 내성 바이러스의 출현을 강력하게 지연시킨다. 이는 상기 mAb 및 소 분자 CCR5 억제제가 상보적인 바이러스 내성 패턴을 갖는다는 예비 연구에 의해 뒷바침된다(Kuhmann et al. 2004 and Marozsan et al. 2005). 본 발견은 mAb와 소 분자 CCR5 억제제를 병용하는 섭생의 임상적인 연구에 대한 근본적 이유를 제공한다.
강력한 상승작용이 또한 UK-427,857 또는 PRO 140과 병용된 RNATES에 대해서 관찰되었다. 내생적인 수준의 RNATES는 자연적인 감염 중에 HIV-1 질병 진행에 대해 약간의 보호를 제공할 수 있으며(Garzino-Demo et al. 1999; Lui et al. 1999), 따라서 이러한 상승작용의 발견은 중요하고 HIV-1의 CCR-5 표적화된 요법에 긍정적인 영향을 갖는다. RNATES와 PRO 140 간의 바이러스 억제 상승작용은 RNATEX 신호전달이 쥐 PRO 140(PA14)의 바이러스 억제 농도에 의해 차단되지 않는다는 선행 관찰(Olson et al. 1999)에 근거하여 보면 놀랍지 않다. RNATES와 UK-427,857 간의 상승작용은 UK-427,857이 강력한 CCR5 길항물질임을 가정할 때 쉽게 설명되지 않는다. 그러나, 이러한 발견은 소 분자 CCR5 길항물질 SCH-C와, 잠재적인 국소 살미생물제로서 평가된 RNATES 유도체인 아미노옥시펜탄-RNATES(AOP-RANTES)(Tremblay et al. 2002) 간의 상승작용의 선행 관찰과 일치한다(Kawamura et al. 2000).
상기 mAb와 소 분자 CCR5 길항물질 간에 관찰된 강한 상승작용과 대조적으로, 소 분자 CCR5 길항물질들의 조합에 대해 부가적인 효과가 관찰되었다. 협동성의 부족은 이들 분자가 CCR5 상의 통상적인 포켓에 대한 결합에 대해 경쟁한다는 관점과 일치한다(Dragic et al. 2000; Nishikawa et al. 2005; Tsamis et al. 2003; Watson et al. 2005). 상기 생체 외 연구는 야생형 바이러스의 억제만을 기본으로 하는 임상에서 소 분자 CCR5 길항물질들의 병용에 기초를 제공하지 못한다.
유사하게, 강력한 상승작용은 PRO 140과 HIV-부착 억제제(PRO 542 및 BMS-378806), 융합(엔푸비르타이드) 또는 역 전사효소(지도뷰딘 및 네비라핀) 사이에서는 관찰되지 않았으며, 이러한 발견은 PRO 140과 소 분자 CCR5 길항물질에 대해 관찰된 상승작용의 중요성을 뒷받침한다. 다수의 선행 연구들이 다양한 소 분자 CCR5 길항물질들(UK-427,857, SCH-C, TAK-220, TAK-652 및 E913)과 기존의 HIV-1 치료부류 각각으로부터의 약물들 간의 상호작용을 조사하였다. 전부는 아니지만(Dorr et al. 2005; Maeda et al. 2001) 대부분(Tremblay et al. 2005 Antivir. Ther.; Tremblay et al. 2005 Antimicrob. Agents Chemother; Tremblay et al. 2002)의 연구들은 CCR5 억제제와 다른 HIV-1 치료부류 간의 광범위한 상승작용을 보고하였으며, 다양한 결과들은 바이러스 억제 시험에 사용된 화합물 및 방법의 차이뿐만 아니라 데이터 분석에 사용된 방법의 차이를 반영할 수 있다. UK-427,857을 20개의 승인된 레트로바이러스 억제제에 대해 시험하는 경우, 적당한 상승작용이 보고된(Dorr et al. 2005) 3 가지 경우를 제외하고 모두에서 부가적인 효과가 관찰되었다. 이 결과는 PRO 140, 및 CCR5를 표적화하지 않는 HIV-1 억제제들의 병용에 대한 본 발명의 발견과 일치한다.
이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 항-HIV-1 약물들 간의 상승작용은 다양한 기전들로부터 유래할 수 있다. 혼합된 바이러스 배양물에서, 하나의 화합물은 제 2 화합물에 대해 내성인 바이러스를 억제할 수 있으며(Johnson et al. 1991), NRTI/NNRTI 조합은 특정한 RT-매개된 내성 기전을 극복할 수 있다(Basavapathruni et al. 2004; Borkow et al. 1999). 억제제들 간의 대사적 상호작용은 이들의 유효한 세포 내 약물 농도를 증가시킬 수 있으며(Molla et al. 2002), 상승작용적 침입 억제제들은 상기 침입 연쇄반응에서 서로 의존하는 단계들을 붕괴시킬 수 있다(Nagashima et al. 2001; Tremblay et al. 2000). 본 연구는 혼합된 집단보다는 클론성 바이러스 피막을 조사하였으며, 상기 표적의 세포 외 성질은 대사적 상호작용에 대해서 상반된 결론을 보인다. gp120의 다수 영역들은 CCR5 결합에 기여하지만(Cormier et al. 2002), 이들 상호작용이 감염 중에 별도의 또는 분리된 사건들을 나타내는 지의 여부는 현재 불분명하다.
본 발견들은 mAb와 소 분자 CCR5 억제제들 간의 바이러스 억제 상승작용이 수용체의 수준에서 발생할 수 있음을 가리킨다. 상기 논의된 바와 같이, mAb 및 소 분자는 CCR5 상의 별개의 유전자좌와 결합한다(Dragic et al. 2000; Nishikawa et al. 2005; Tsamis et al. 2003; Olson et al. 1999; Watson et al. 2005). 본 연구에서 CCR5 세포와 예비 배양 시 PRO 140은 수용체에 대한 UK-427,857의 후속 결합을 완전히 차단하였지만; 상기 PRO 140 농도는 동일한 세포 내로의 HIV-1의 침입을 차단하는데 필요한 경우보다 더 컸다. 대조적으로, CCR5 세포의, 과포화 농도의 UK-427,857 또는 SCH-D와의 예비 배양은 PRO 140 결합을 50% 이하로 감소시켰다. 하나의 가능한 설명으로서, PRO 140은 UK-427,857 또는 SCH-D에 의해 결합되지 않은 CCR5 컨포머를 인식할 수 있다. 세포-표면 CCR5가 다수의 형태들로 존재하지만(Lee et al. 1999), 상기 소 분자 길항물질이 세포-표면 CCR5의 중요한 분획에 결합하지 못할 때 강력한 바이러스 억제 활성을 나타내지는 못하는 듯하다. 이 점에 관해서는 통상적인 세포 배경(CEM.NKR-CCR5 세포)이 경쟁 결합 및 바이러스 억제 연구에 사용되었으며, 따라서 상기 발견들이 CCR5 발현에서 세포-특이적 차이와 관련이 없음을 아는 것이 중요하다.
이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 본 발견에 대한 또 다른 그럴듯한 설명은 PRO 140이 UK-427,857-결합된 CCR5와 3원 복합체를 형성할 수 있으며, 상기 3원 복합체가 HIV-1 침입에 증가된 장벽을 제공한다는 것이다. 상기 모델의 상황 내에서, PRO 140은 UK-427,857의 존재 하에서 PRO 140 결합의 적당한 감소에 의해 입증되는 바와 같이, 자유로운 CCR5보다는 다소 덜 효율적으로 UK-427,857-결합된 CCR5와 결합할 수 있다.
상기 병용 지수 방법은 약물-약물 상호작용을 평가하는데 널리 사용된다. 이 방법에서, 협동성은 종종 분석 간 변화성과 관계없이 실험상 CI 값(예를 들어 상승작용의 경우 <0.9 및 길항작용의 경우 >1.1)을 근거로 한정된다. 통계학적 분석을 드물게 수행하며, 수 회 비교에 대해 수행된 조절은 훨씬 더 드물다. 상기와 같은 분석의 부재 하에서, 상승작용적 조합의 수를 과대평가할 가능성이 증가하게 된다.
상승작용적 효과를 확인하기 위해서 엄격하고 신중한 접근방법을 사용하였다. CI 값을 부가성의 영의 가설(CI = 1)에 대한 통계학적 유의수준에 대해서 시험하였다. 또한, 이들 연구는 상승작용 연구에서 흔하듯이, 실험당 20 내지 30개의 상이한 CI 값을 측정하였다(표 14 및 표 15). 의사 양성 결과의 가능성을 감소시키기 위해서, 상기 유의수준을 본페로니 보정을 사용하여 감소시켰다. 모의 조합을 또한 바이러스 억제 시험 및 데이터 분석에 대한 상기 방법들의 시험으로서 평가하였다. 따라서 다수의 명백한 상승작용들(CI < 0.9)이 입수할 수 있는 데이터를 근거로 분석 간 변화와 구분될 수 없다는 결론을 내렸다. 그러나, 이들 방법의 엄격한 성질에도 불구하고, PRO 140 및 소 분자 억제제들은 모든 시험 조건 하에서 현저한 상승작용을 나타내었으며, 이는 상기 발견에 신뢰를 부여하였다. 본 조사에서 중요한 경향을 보이는 CI 값들의 조합을 차후의 연구에서 조사할 수 있었다. 예를 들어, PRO 140/엔푸비르타이드 조합에 대한 데이터는 중요한 경향을 보이는 적당한 상승작용을 암시하였으며; 따라서 상기 조합은 HIV-1 감염을 치료하는데도 또한 유용할 수 있다.
증가하고 있는 데이터는 mAb 및 소 분자 CCR5 길항물질이 CCR5 억제제의 뚜렷한 하위 부류를 나타내며, 중요한 유사물들의 수는 한편으로는 NRTI와 NNRTI 사이에서 다른 한편으로는 mAb와 소 분자 CCR5 사이에서 끌어낼 수 있음을 가리킨다. 각각의 경우에, 상기 표적 단백질 상의 억제제들(역 전사효소 또는 CCR5)에 대해 명백한 결합 유전자좌들이 존재한다. 하나의 억제제 세트(NNRTI 또는 소 분자 CCR5 길항물질)는 알로스테릭한 기전을 통해 작용하는 반면, 다른 세트(NRTI 또는 CCR5 mAb)는 경쟁적인 억제제로서 작용한다. NRTI 및 NNRTI처럼, mAb와 소 분자 CCR5 억제제는 상승작용적이며 예비 시험에서 상보적인 생체 외 바이러스 내성 패턴을 갖는다(Kuhmann et al. 2004; Marozsan et al. 2005). NRTI 및 NNRTI는 비록 이들이 동일한 단백질을 표적화한다 하더라도 중요하고 독특한 치료 부류를 나타내며, mAb 및 소 분자 CCR5 억제제는 유사하게 독특한 HIV-1 치료 양상을 제공할 수 있다.
파트 IV
물질 및 방법
PRO 140 및 소 분자 CCR5 길항물질을 상기 본 발명에 개시한 바와 같이 제조하고/하거나 수득하였다. 주요 R5 HIV-1 단리물 JR-FL 및 사례 C1/85(CCl/85)를 점차적으로 증가하는 농도의 PRO 140 또는 SCH-D의 존재 또는 부재 하에 말초 혈액 단핵구(PBMCC) 상에서 생체 외에서 매주 계대배양하였으며, 바이러스 배양물을 상기 및 다른 CCR5 억제제에 대한 민감성에 대해서 조사하였다. 민감성 시험을 위해서, 바이러스를 자극된 PBMC 상에서 생체 외에서 배양하였다. 순차적으로 희석된 약물의 존재 및 부재 하에서, 바이러스 복제의 정도를 p24 ELISA에 의해 측정하였다.
결과
JR-FL 및 CCl/85 모두에 대해서, 약물 내성 변체들을 PRO 140 및 SCH-D의 존재 하에서 생성시켰다. 12회 계대배양 시, 상기 이탈 변이체들은 선택에 사용된 약물에 대해 대략 10 내지 100배 덜 민감하였다. 각각의 경우에, 상기 이탈 변이체들은 계속해서 PBMC 상에서의 복제를 위해 CCR5를 요구하였다. 상보적인 내성 패턴이 관찰되었다: SCH-D 이탈 변이체들은 PRO 140에 의해 효율적으로 억제되었으며, PRO 140 이탈 변이체들은 SCH-D에 의해 효율적으로 억제되었다.
논의
PRO 140 이탈 변이체들은 계속해서 침입을 위해 CCR5를 요구하며 여전히 소 분자 CCR5 길항물질들에 민감한 채로 있다. 또한, PRO 140은 소 분자 CCR5 길항물질들에 대해 내성인 바이러스들에 대해 활성이다. 이러한 발견은 PRO 140 및 소 분자 CCR5 길항물질들이 CCR5 억제제의 독특한 하위 부류들을 나타낼 수 있음을 가리킨다.
참고문헌
Figure 112008013328212-PCT00012
Figure 112008013328212-PCT00013
Figure 112008013328212-PCT00014
Figure 112008013328212-PCT00015
Figure 112008013328212-PCT00016
Figure 112008013328212-PCT00017
본 발명에 의하면, 환자에게 소정의 간격으로 유효한 HIV-I 바이러스 부하 감소 용량의 (a) PRO 140으로 나타내는 인간화 항체, 또는 (b) 항-CCR5 수용체 단클론 항체를 투여함을 포함하는, HIV-1 감염된 인간 환자에서 HIV-I 바이러스 부하를 감소시키는 방법이 제공된다.

Claims (104)

  1. 환자에게 소정의 간격으로 유효한 HIV-1 바이러스 부하 감소 용량의 (a) PRO 140으로 나타내는 인간화 항체, 또는 (b) (i) 상기 환자에서 CD4+CCR5+ 세포에 결합하고 상기와 같은 세포와 HIV-1과의 융합을 억제하며, (ii) PRO 140의 효능과 같거나 그보다 큰 효능으로 CD4+CCR5+ 세포와 HIV-1과의 융합을 억제하고, (iii) 상기 환자에서 상기와 같은 세포의 수를 감소시키지 않으면서 상기 환자에서 CD4+CCR5+ 세포를 피복하고/하거나 (iv) 상기 환자의 순환하는 β-케모카인의 혈장 농도 증가를 유발시키지 않으면서 상기 환자의 CD4+CCR5+ 세포에 결합하는 항-CCR5 수용체 단클론 항체를 투여하여 상기 환자의 HIV-1 바이러스 부하를 감소시키는 단계를 포함하되,
    상기 PRO 140은 (i) pVK:HuPRO140-VK(ATCC 기탁 명칭 PTA-4097)로 나타내는 플라스미드의 발현 산물을 각각 포함하는 2개의 경쇄, 및 (ii) pVg4:HuPRO140 HG2-VH(ATCC 기탁 명칭 PTA-4098)로 나타내는 플라스미드 또는 pVg4:HuPRO140(mut B+D+I)-VH(ATCC 기탁 명칭 PTA-4099)로 나타내는 플라스미드의 발현 산물을 각각 포함하는 2개의 중쇄를 포함하고,
    상기 유효한 HIV-1 바이러스 부하 감소 용량은 상기 환자의 체중 ㎏ 당 0.1 ㎎ 내지 10 ㎎을 포함하는 것인, HIV-1 감염 환자에서 HIV-1 바이러스 부하를 감소시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항-CCR5 수용체 단클론 항체는 PRO 140이 결합하는 것과 동일한 CCR5 에피토프에 결합하는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 항-CCR5 수용체 단클론 항체는 인간화, 인간 또는 키메릭(chimeric) 항체인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 환자에게 투여된 항체는 PRO 140으로 나타내는 항체인 방법.
  5. 제1항 또는 제4항에 있어서, 상기 유효한 바이러스 부하 감소 용량은 상기 환자의 체중 ㎏ 당 0.25 ㎎ 내지 7.5 ㎎인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 용량은 상기 환자의 체중 ㎏ 당 0.5 ㎎ 내지 5 ㎎인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 용량은 상기 환자의 체중 ㎏ 당 1 ㎎ 내지 3 ㎎인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 용량은 상기 환자의 체중 ㎏ 당 2 ㎎인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 유효한 바이러스 부하 감소 용량은 상기 환자에서 400 ng/㎖ 이상의 혈청 중 항체 농도를 성취하기에 충분한 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 규칙적인 간격으로 투여되는 용량은 상기 환자에서 1 ㎍/㎖ 이상의 혈청 중 항체 농도를 성취하고 유지하기에 충분한 것인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 용량은 상기 환자에서 약 3 내지 약 12 ㎍/㎖의 혈청 중 항체 농도를 성취하고 유지하기에 충분한 것인 방법.
  12. 제10항에 있어서, 상기 용량은 상기 환자에서 5 ㎍/㎖ 이상의 혈청 중 항체 농도를 성취하고 유지하기에 충분한 것인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 용량은 상기 환자에서 10 ㎍/㎖ 이상의 혈청 중 항체 농도를 성취하고 유지하기에 충분한 것인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 용량은 상기 환자에서 25 ㎍/㎖ 이상의 혈청 중 항체 농도를 성취하고 유지하기에 충분한 것인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 용량은 상기 환자에서 50 ㎍/㎖ 이상의 혈청 중 항체 농도를 성취하고 유지하기에 충분한 것인 방법.
  16. 제1항 또는 제4항에 있어서, 상기 소정의 간격은 매주 1회 이상인 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 소정의 간격은 2 내지 4주 마다인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 소정의 간격은 2주마다인 방법.
  19. 제17항에 있어서, 상기 소정의 간격은 4주마다인 방법.
  20. 제16항에 있어서, 상기 소정의 간격은 매월 1회 이상인 방법.
  21. 제16항에 있어서, 상기 소정의 간격은 6주마다인 방법.
  22. 제16항에 있어서, 상기 소정의 간격은 8주마다인 방법.
  23. 제1항 또는 제4항에 있어서, 상기 환자의 HIV-1 바이러스 부하의 감소를 1주 이상 유지시키는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 환자의 HIV-1 바이러스 부하의 감소를 2주 이상 유지시키는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 환자의 HIV-1 바이러스 부하의 감소를 4주 이상 유지시키는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 환자의 HIV-1 바이러스 부하의 감소를 3개월 이상 유지시키는 방법.
  27. 제1항 또는 제4항에 있어서, 상기 항체를 정맥 내 주입을 통해 투여하는 방법.
  28. 제1항 또는 제4항에 있어서, 상기 항체를 피하 주사를 통해 투여하는 방법.
  29. 제1항 또는 제4항에 있어서, 상기 환자의 HIV-1 바이러스 부하를 상기 항체의 투여에 따라 50% 이상까지 감소시키는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 환자의 HIV-1 바이러스 부하를 상기 항체의 투여에 따라 70% 이상까지 감소시키는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 환자의 HIV-1 바이러스 부하를 상기 항체의 투여에 따라 90% 이상까지 감소시키는 방법.
  32. 제1항 또는 제4항에 있어서, 상기 환자에게 하나 이상의 항-HIV-1 레트로바이러스 억제제를 투여하는 단계를 더 포함하는 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 항-HIV-1 레트로바이러스 억제제는 비 뉴클레오사이드 역 전사효소 억제제(NNRTI), 뉴클레오사이드 역 전사효소 억제제(NRTI), 프로테아제 억제제(PI), 융합 억제제, 또는 이들의 임의의 조합인 방법.
  34. 제1항 또는 제4항에 있어서, 상기 환자는 치료 경험이 없는 것인 방법.
  35. 제1항 또는 제4항에 있어서, 상기 환자는 치료 경험이 있는 것인 방법.
  36. 제1항 또는 제4항에 있어서, (a) 상기 단클론 항체를 상기 환자에게 투여하기 전에, 상기 환자에게 하나 이상의 항-HIV-1 레트로바이러스 억제제에 의한 치료를 제공하고, (b) 상기 단클론 항체를 투여함과 동시에, 상기 환자에서 HIV-1 바이러스 부하의 감소를 향상시키기 위해서 상기 환자에게 계속해서 상기 작용제 또는 작용제들에 의한 치료를 제공하는 것인 방법.
  37. 제36항에 있어서, 상기 항-HIV-1 레트로바이러스 억제제는 비 뉴클레오사이드 역 전사효소 억제제(NNRTI), 뉴클레오사이드 역 전사효소 억제제(NRTI), 프로테 아제 억제제(PI), 융합 억제제, 또는 이들의 임의의 조합인 방법.
  38. 환자에게 소정의 간격으로 유효한 융합 억제 용량의, PRO 140으로 나타내는 인간화 항체, 또는 (i) 상기 환자에서 CD4+CCR5+ 세포에 결합하고 상기와 같은 세포와 HIV-1과의 융합을 억제하며, (ii) 10 ㎍/㎖ 이하의 IC90을 특징으로 하는 효능으로 상기 환자의 CD4+CCR5+ 세포와 HIV-1과의 융합을 억제하고, (iii) 상기 환자에서 상기와 같은 세포의 수를 감소시키지 않으면서 상기 환자의 CD4+CCR5+ 세포를 피복하고/하거나 (iv) 상기 환자의 순환하는 β-케모카인의 혈장 농도 증가를 유발시키지 않으면서 상기 환자의 CD4+CCR5+ 세포에 결합하는 항-CCR5 수용체 항체를 투여하여 상기 환자에서 HIV-1 관련된 장애의 개시 또는 진행을 억제하는 단계를 포함하되,
    상기 억제는 상기 환자에서 CCR5+CD4+ 표적 세포에 대한 HIV-1의 융합을 억제함으로써 수행되고,
    상기 PRO 140은 (i) pVK:HuPRO140-VK(ATCC 기탁 명칭 PTA-4097)로 나타내는 플라스미드의 발현 산물을 각각 포함하는 2개의 경쇄, 및 (ii) pVg4:HuPRO140 HG2-VH(ATCC 기탁 명칭 PTA-4098)로 나타내는 플라스미드 또는 pVg4:HuPRO140(mut B+D+I)-VH(ATCC 기탁 명칭 PTA-4099)로 나타내는 플라스미드의 발현 산물을 각각 포함하는 2개의 중쇄를 포함하며,
    상기 항체의 각 투여는 상기 환자에게 상기 환자의 체중 ㎏ 당 0.1 ㎎ 내지 10 ㎎을 전달하는 것인, 인간 환자에서 HIV-1 관련된 장애의 개시 또는 진행을 억제하는 방법.
  39. 환자에게 소정의 간격으로 유효한 융합 억제 용량의, PRO 140으로 나타내는 인간화 항체, 또는 (i) 상기 환자에서 CD4+CCR5+ 세포에 결합하고 상기와 같은 세포와 HIV-1과의 융합을 억제하며, (ii) 10 ㎍/㎖ 이하의 IC90을 특징으로 하는 효능으로 상기 환자의 CD4+CCR5+ 세포와 HIV-1과의 융합을 억제하고, (iii) 상기 환자에서 상기와 같은 세포의 수를 감소시키지 않으면서 상기 환자의 CD4+CCR5+ 세포를 피복하고/하거나 (iv) 상기 환자의 순환하는 β-케모카인의 혈장 농도 증가를 유발시키지 않으면서 상기 환자의 CD4+CCR5+ 세포에 결합하는 항-CCR5 수용체 항체를 투여하여 환자가 HIV-1 감염에 걸릴 가능성을 감소시키는 단계를 포함하되,
    상기 PRO 140은 (i) pVK:HuPRO140-VK(ATCC 기탁 명칭 PTA-4097)로 나타내는 플라스미드의 발현 산물을 각각 포함하는 2개의 경쇄, 및 (ii) pVg4:HuPRO140 HG2-VH(ATCC 기탁 명칭 PTA-4098)로 나타내는 플라스미드 또는 pVg4:HuPRO140(mut B+D+I)-VH(ATCC 기탁 명칭 PTA-4099)로 나타내는 플라스미드의 발현 산물을 각각 포함하는 2개의 중쇄를 포함하고,
    상기 항체의 각 투여는 상기 환자에게 상기 환자의 체중 ㎏ 당 0.1 ㎎ 내지 10 ㎎을 전달하는 것인, 인간 환자가 HIV-1 감염에 걸릴 가능성을 감소시키는 방법.
  40. 제39항에 있어서, 상기 환자는 HIV-1에 노출된 것인 방법.
  41. 제39항에 있어서, 상기 환자는 HIV-1에 노출될 위험이 있는 것인 방법.
  42. 항-HIV-1 요법의 형태에 내성을 나타낸 HIV-1 감염 인간 환자에서 HIV-1 바이러스 부하를 감소시키는 방법으로서,
    환자에게 소정의 간격으로 유효한 HIV-1 바이러스 부하 감소 용량의 (a) PRO 140으로 나타내는 인간화 항체, 또는 (b) (i) 상기 환자에서 CD4+CCR5+ 세포에 결합하고 상기와 같은 세포와 HIV-1과의 융합을 억제하며, (ii) PRO 140의 효능과 같거나 그보다 큰 효능으로 CD4+CCR5+ 세포와 HIV-1과의 융합을 억제하고, (iii) 상기 환자에서 상기와 같은 세포의 수를 감소시키지 않으면서 상기 환자에서 CD4+CCR5+ 세포를 피복하고/하거나 (iv) 상기 환자의 순환하는 β-케모카인의 혈장 농도 증가를 유발시키지 않으면서 상기 환자의 CD4+CCR5+ 세포에 결합하는 항-CCR5 수용체 단클론 항체를 투여하여 상기 환자의 HIV-1 바이러스 부하를 감소시키는 단계를 포함하되,
    상기 PRO 140은 (i) pVK:HuPRO140-VK(ATCC 기탁 명칭 PTA-4097)로 나타내는 플라스미드의 발현 산물을 각각 포함하는 2개의 경쇄, 및 (ii) pVg4:HuPRO140 HG2-VH(ATCC 기탁 명칭 PTA-4098)로 나타내는 플라스미드 또는 pVg4:HuPRO140(mut B+D+I)-VH(ATCC 기탁 명칭 PTA-4099)로 나타내는 플라스미드의 발현 산물을 각각 포함하는 2개의 중쇄를 포함하고,
    상기 유효한 HIV-1 바이러스 부하 감소 용량은 상기 환자의 체중 ㎏ 당 0.1 ㎎ 내지 10 ㎎을 포함하는 것인, 항-HIV-1 요법의 형태에 내성을 나타낸 HIV-1 감염 인간 환자에서의 HIV-1 바이러스 부하의 감소 방법.
  43. 제42항에 있어서, 상기 항-HIV-1 요법의 형태는 비 뉴클레오사이드 역 전사효소 억제제(NNRTI), 뉴클레오사이드 역 전사효소 억제제(NRTI), 프로테아제 억제제(PI), 융합 억제제 또는 이들의 임의의 조합을 투여함을 포함하는 것인 방법.
  44. 제43항에 있어서, 상기 융합 억제제는 비 항체 CCR5 길항물질인 방법.
  45. 제44항에 있어서, 상기 비 항체 CCR5 길항물질은 소 분자 CCR5 길항물질인 방법.
  46. 제45항에 있어서, 상기 소 분자 CCR5 길항물질은 경구 투여되는 것인 방법.
  47. 환자에게 (a) (i) 상기 환자의 CD4+ 세포의 표면상의 CCR5 수용체에 결합하고 (ii) 상기 환자의 CCR5+CD4+ 세포에 대한 HIV-1의 융합을 억제하는 단클론 항체, 및 (b) 비 항체 CCR5 수용체 길항물질을, 환자를 치료하기에 유효한 양으로 투여하 는 단계를 포함하는, HIV-1 감염 환자의 치료 방법.
  48. 제47항에 있어서, 상기 (a)와 (b)를 동시에 투여하는 것인, HIV-1 감염 환자의 치료 방법.
  49. 제47항에 있어서, 상기 단클론 항체는 PA14로 나타내는 하이브리도마 세포주(ATCC 수탁 번호 제HB-12610호)에 의해 생산된 PA14 또는 상기 CCR5 수용체에 대한 단클론 항체 PA-14의 결합과 경쟁하는 항체인, HIV-1 감염 환자의 치료 방법.
  50. 제47항에 있어서, 상기 단클론 항체는 인간, 인간화 또는 키메릭 항체인, HIV-1 감염 환자의 치료 방법.
  51. 제50항에 있어서, 상기 단클론 항체는 인간화 항체인, HIV-1 감염 환자의 치료 방법.
  52. 제50항에 있어서, 상기 단클론 항체는 PRO 140으로 나타내는 인간화 항체, 또는 상기 CCR5 수용체에 대한 PRO 140의 결합과 경쟁하는 항체이며, PRO 140은 (i) pVK:HuPRO140-VK(ATCC 기탁 명칭 PTA-4097)로 나타내는 플라스미드의 발현 산물을 각각 포함하는 2개의 경쇄 및 (ii) pVg4:HuPRO140 HG2-VH(ATCC 기탁 명칭 PTA-4098)로 나타내는 플라스미드 또는 pVg4:HuPRO140(mut B+D+I)-VH(ATCC 기탁 명 칭 PTA-4099)로 나타내는 플라스미드의 발현 산물을 각각 포함하는 2개의 중쇄를 포함하는 것인, HIV-1 감염 환자의 치료 방법.
  53. 제52항에 있어서, 상기 단클론 항체는 PRO 140으로 나타내는 인간화 항체인, HIV-1 감염 환자의 치료 방법.
  54. 제47항 또는 제53항에 있어서, 상기 항체를 수 회 투여하고 상기 투여 당 유효량은 상기 환자의 체중 ㎏ 당 0.01 ㎎ 내지 50 ㎎을 포함하는 것인, HIV-1 감염 환자의 치료 방법.
  55. 제54항에 있어서, 상기 양은 상기 환자의 체중 ㎏ 당 0.05 ㎎ 내지 25 ㎎인, HIV-1 감염 환자의 치료 방법.
  56. 제55항에 있어서, 상기 양은 상기 환자의 체중 ㎏ 당 0.1 ㎎ 내지 10 ㎎인, HIV-1 감염 환자의 치료 방법.
  57. 제56항에 있어서, 상기 양은 상기 환자의 체중 ㎏ 당 0.5 ㎎ 내지 5 ㎎인, HIV-1 감염 환자의 치료 방법.
  58. 제57항에 있어서, 상기 양은 상기 환자의 체중 ㎏ 당 1 ㎎ 내지 3 ㎎인, HIV-1 감염 환자의 치료 방법.
  59. 제58항에 있어서, 상기 양은 상기 환자의 체중 ㎏ 당 약 2 ㎎인, HIV-1 감염 환자의 치료 방법.
  60. 제47항 또는 제53항에 있어서, 상기 항체를 소정의 간격으로 투여하고, 상기 소정의 간격은 매주 1회 이상인, HIV-1 감염 환자의 치료 방법.
  61. 제60항에 있어서, 상기 소정의 간격은 2 내지 4주 마다인, HIV-1 감염 환자의 치료 방법.
  62. 제61항에 있어서, 상기 소정의 간격은 2주마다인, HIV-1 감염 환자의 치료 방법.
  63. 제61항에 있어서, 상기 소정의 간격은 4주마다인, HIV-1 감염 환자의 치료 방법.
  64. 제47항 또는 제53항에 있어서, 상기 항체를 소정의 간격으로 투여하고, 상기 소정의 간격은 매월 1회 이상인, HIV-1 감염 환자의 치료 방법.
  65. 제47항 또는 제53항에 있어서, 상기 항체를 정맥 내 주입을 통해 투여하는 것인, HIV-1 감염 환자의 치료 방법.
  66. 제47항 또는 제53항에 있어서, 상기 항체를 피하 주사를 통해 투여하는 것인, HIV-1 감염 환자의 치료 방법.
  67. 제47항 또는 제53항에 있어서, 상기 비 항체 CCR5 수용체 길항물질은 작은 유기 분자인, HIV-1 감염 환자의 치료 방법.
  68. 제67항에 있어서, 상기 CCR5 수용체 길항물질은 SCH-D, UK-427,857, TAK-779, TAK-652 또는 GW873140인, HIV-1 감염 환자의 치료 방법.
  69. 제47항 또는 제53항에 있어서, 상기 CCR5 수용체 길항물질은 상기 CCR5 수용체에 대한 SCH-D의 결합과 경쟁하는 작용제인, HIV-1 감염 환자의 치료 방법.
  70. 제47항 또는 제53항에 있어서, 상기 CCR5 수용체 길항물질은 상기 CCR5 수용체에 대한 UK-427,857의 결합과 경쟁하는 작용제인, HIV-1 감염 환자의 치료 방법.
  71. 제47항 또는 제53항에 있어서, 상기 CCR5 수용체 길항물질은 상기 CCR5 수용체에 대한 TAK-779의 결합과 경쟁하는 작용제인, HIV-1 감염 환자의 치료 방법.
  72. 제47항 또는 제53항에 있어서, 상기 CCR5 수용체 길항물질은 상기 CCR5 수용체에 대한 TAK-652의 결합과 경쟁하는 작용제인, HIV-1 감염 환자의 치료 방법.
  73. 제47항 또는 제53항에 있어서, 상기 CCR5 수용체 길항물질은 상기 CCR5 수용체에 대한 GW873140의 결합과 경쟁하는 작용제인, HIV-1 감염 환자의 치료 방법.
  74. 제67항에 있어서, 상기 CCR5 수용체 길항물질을 수 회 투여하고 상기 투여 당 유효 량이 0.5 ㎎ 내지 2,500 ㎎을 포함하는 것인, HIV-1 감염 환자의 치료 방법법.
  75. 제74항에 있어서, 상기 양은 5 ㎎ 내지 1,250 ㎎인, HIV-1 감염 환자의 치료 방법.
  76. 제74항에 있어서, 상기 양은 상기 환자에 대해 길항물질 5 ㎎ 내지 15 ㎎인, HIV-1 감염 환자의 치료 방법.
  77. 제76항에 있어서, 상기 양은 상기 환자에 대해 길항물질 50 ㎎ 내지 1,250 ㎎인, HIV-1 감염 환자의 치료 방법.
  78. 제77항에 있어서, 상기 양은 상기 환자에 대해 길항물질 200 ㎎ 내지 800 ㎎인, HIV-1 감염 환자의 치료 방법.
  79. 제78항에 있어서, 상기 양은 길항물질 300 ㎎ 내지 600 ㎎인, HIV-1 감염 환자의 치료 방법.
  80. 제67항에 있어서, 상기 CCR5 수용체 길항물질을 하루에 1회 또는 2회 경구로 투여하는 것인, HIV-1 감염 환자의 치료 방법.
  81. 제68항에 있어서, 상기 CCR5 수용체 길항물질을 하루에 3회 이하 경구로 투여하는 방법.
  82. 제47항 또는 제53항에 있어서, 상기 환자에게 하나 이상의 추가적인 레트로바이러스 억제제를 투여하는 단계를 더 포함하는, HIV-1 감염 환자의 치료 방법.
  83. 제82항에 있어서, 상기 레트로바이러스 억제제는 비 뉴클레오사이드 역 전사효소 억제제(NNRTI), 뉴클레오사이드 역 전사효소 억제제(NRTI), 프로테아제 억제제(PI), 융합 억제제 또는 이들의 임의의 조합인, HIV-1 감염 환자의 치료 방법.
  84. 제47항 또는 제53항에 있어서, 상기 환자는 치료 경험이 없는 것인, HIV-1 감염 환자의 치료 방법.
  85. 제47항 또는 제53항에 있어서, 상기 환자는 치료 경험이 있는 것인, HIV-1 감염 환자의 치료 방법.
  86. 환자에서 CCR5+CD4+ 표적 세포에 대한 HIV-1의 융합을 억제함으로써 수행되는 상기 환자에서의 HIV-1 관련된 장애의 개시 또는 진행을 억제하는 방법으로서,
    환자에게 (a) (i) 상기 환자의 CD4+ 세포의 표면상의 CCR5 수용체에 결합하고 (ii) 상기 환자의 CCR5+CD4+ 세포에 대한 HIV-1과의 융합을 억제하는 단클론 항체, 및 (b) 비 항체 CCR5 수용체 길항물질을, 상기 환자에서 상기 HIV-1 관련된 장애의 개시 또는 진행을 억제하기에 유효한 양으로 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서의 HIV-1 관련된 장애의 개시 또는 진행을 억제하는 방법.
  87. 환자에게 (a) (i) 상기 환자의 CD4+ 세포의 표면상의 CCR5 수용체에 결합하고 (ii) 상기 환자의 CCR5+CD4+ 세포에 대한 HIV-1의 융합을 억제하는 단클론 항체, 및 (b) 비 항체 CCR5 수용체 길항물질을, 상기 환자는 HIV-1 감염에 걸릴 가능성을 감소시키기에 유효한 양으로 투여하는 단계 포함하는, 환자가 HIV-1 감염에 걸릴 가능성을 감소시키는 방법.
  88. 제87항에 있어서, 상기 환자는 HIV-1에 노출된 것인 방법.
  89. 제87항에 있어서, 상기 환자는 HIV-1에 노출될 위험이 있는 것인 방법.
  90. 상기 환자의 HIV-1 감염의 치료에서 (i) 항-CCR5 수용체 단클론 항체 또는 (ii) 비 항체 CCR5 수용체 길항물질의 HIV-1 억제 활성을 증강시키는 방법에 있어서,
    환자에게 HIV-1 억제 활성 증강량의 항-CCR5 수용체 단클론 항체를 HIV-1 억제 활성 증강량의 비 항체 CCR5 수용체 길항물질과 병용해서 투여하는 단계를 포함하되,
    상기 병용은 HIV-1 감염의 억제에 대해 상승작용 효과를 생성시키고, 이에 의해 상기 (i) 항-CCR5 수용체 단클론 항체 또는 (ii) 비 항체 CCR5 수용체 길항물질의 억제 활성을 증강시키는 것인, HIV-1 억제 활성 증강 방법.
  91. 제90항에 있어서, 상기 상승작용 효과로 인해, 상기 비 항체 CCR5 수용체 길항물질은 상기 항-CCR5 수용체 단클론 항체의 대략 4 내지 10배 용량 감소를 발생시키며, 상기 항-CCR5 수용체 단클론 항체는 상기 비 항체 CCR5 수용체 길항물질의 대략 3 내지 16배의 용량 감소를 발생시키는 것인, HIV-1 억제 활성 증강 방법.
  92. 제90항에 있어서, HIV-1 억제 활성 증강량의 하나 이상의 비 항체 CCR5 수용체 길항물질을 포함하는 것인, HIV-1 억제 활성 증강 방법.
  93. 제90항에 있어서, HIV-1 억제 활성 증강량의 하나 이상의 항-CCR5 수용체 단클론 항체를 포함하는 것인, HIV-1 억제 활성 증강 방법.
  94. 제90항에 있어서, 상기 항-CCR5 수용체 단클론 항체 및 상기 비 항체 CCR5 수용체 길항물질을 상기 환자에게 동시 투여하는 것인, HIV-1 억제 활성 증강 방법.
  95. 제88항 또는 제90항에 있어서, 상기 단클론 항체는 PA14로 나타내는 하이브리도마 세포주(ATCC 수탁 번호 제HB-12610호)에 의해 생산된 PA14, 또는 상기 CCR5 수용체에 결합함에 있어서 단클론 항체 PA-14와 경쟁하는 항체인, HIV-1 억제 활성 증강 방법.
  96. 제88항 또는 제90항에 있어서, 상기 단클론 항체는 PRO 140으로 나타내는 인간화 항체, 또는 상기 CCR5 수용체에 대한 결합에서 PRO 140과 경쟁하는 항체이며, PRO 140은 (i) pVK:HuPRO140-VK(ATCC 기탁 명칭 PTA-4097)로 나타내는 플라스미드의 발현 산물을 각각 포함하는 2개의 경쇄, 및 (ii) pVg4:HuPRO140 HG2-VH(ATCC 기탁 명칭 PTA-4098)로 나타내는 플라스미드 또는 pVg4:HuPRO140(mut B+D+I)-VH(ATCC 기탁 명칭 PTA-4099)로 나타내는 플라스미드의 발현 산물을 각각 포함하는 2개의 중쇄를 포함하는 것인, HIV-1 억제 활성 증강 방법.
  97. 제96항에 있어서, 상기 단클론 항체는 PRO 140으로 나타내는 인간화 항체인, HIV-1 억제 활성 증강 방법.
  98. 제88항 또는 제90항에 있어서, 상기 단클론 항체는 CCR5mAb004 또는 2D7인, HIV-1 억제 활성 증강 방법.
  99. 제88항, 제89항 및 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비 항체 CCR5 수용체 길항물질은 SCH-D, TAK-779, TAK-652, UK-427,857, RANTES, GW873140 또는 이들의 조합인, HIV-1 억제 활성 증강 방법.
  100. 제99항에 있어서, 상기 비 항체 CCR5 수용체 길항물질은 상기 CCR5 수용체에 대한 결합에서 SCH-D와 경쟁하는 작은 유기 분자인, HIV-1 억제 활성 증강 방법.
  101. 제99항에 있어서, 상기 비 항체 CCR5 수용체 길항물질은 상기 CCR5 수용체에 대한 결합에서 UK-427,857과 경쟁하는 작은 유기 분자인, HIV-1 억제 활성 증강 방법.
  102. 제99항에 있어서, 상기 비 항체 CCR5 수용체 길항물질은 상기 CCR5 수용체에 대한 결합에서 TAK-779와 경쟁하는 작은 유기 분자인, HIV-1 억제 활성 증강 방법.
  103. 제99항에 있어서, 상기 비 항체 CCR5 수용체 길항물질은 상기 CCR5 수용체에 대한 결합에서 TAK-652와 경쟁하는 작은 유기 분자인, HIV-1 억제 활성 증강 방법.
  104. 제99항에 있어서, 상기 비 항체 CCR5 수용체 길항물질은 상기 CCR5 수용체에 대한 결합에서 GW873140과 경쟁하는 작은 유기 분자인, HIV-1 억제 활성 증강 방법.
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