CN101495145A - 用于减少受hiv-1感染的患者中病毒负荷的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供减少受HIV-1感染的人类受试者中HIV-1病毒负荷的方法,其包括以预定的时间间隔向受试者施用有效HIV-1病毒负荷减少剂量的(a)人源化抗体PRO 140,或(b)抗CCR5受体单克隆抗体。本发明还提供抑制人类受试者中HIV-1相关病症的发作或发展的方法,该抑制受到抑制HIV-1与受试者中CCR5+CD4+靶细胞的融合的影响。本发明还提供治疗受HIV-1感染的受试者的方法,其包括向受试者施用(a)单克隆抗体,所述单克隆抗体(i)与受试者的CD4+细胞表面上的CCR5受体结合,和(ii)抑制HIV-1与受试者的CCR5+CD4+细胞的融合,和(b)有效治疗受试者的量的非抗体CCR5受体拮抗剂。
Description
本申请要求了以下申请的权利:2005年7月22日提交的美国临时申请号60/702,064;2005年7月23日提交的美国临时申请号60/701,889;2005年8月26日提交的美国临时申请号60/711,528;和2005年9月9日提交的美国临时申请号60/715,619;在此将每篇的全部内容结合于本申请作为参考。
本发明在美国政府基金号AI046871和AI066329的支持下完成,该基金来自国家过敏症和传染病研究所(National Institute of Allergy andInfectious Diseases)。因此,美国政府在该主题发明中具有一定的权利。
贯穿本申请,在圆括号中,以作者姓名和日期,或以专利或专利公开号提及了多份出版物。在紧邻权利要求之前的说明书末尾可以找到这些出版物的完整引述。在此将这些出版物每一篇的全部公开内容结合于本申请作为参考,从而更加完整地描述本领域中技术人员所已知的技术在本申请时期的状态。
发明背景
1型人类免疫缺陷病毒(HIV-1)细胞感染是由病毒包膜(Env)糖蛋白gp120和gp41所介导的,gp120和gp41在病毒和病毒感染细胞的表面上表达为非共价寡聚复合物。病毒进入靶细胞是通过细胞表面上一连串事件进行的,所述事件包括(1)病毒表面糖蛋白gp120与细胞表面受体的结合,(2)与融合辅助受体(co-receptor)的Env结合,和(3)gp41中的多种构象改变。
病毒粒体与细胞表面之间的第一步高亲和力相互作用是gp120和细胞表面CD4的结合,其中CD4是HIV-1的第一受体(Dalgleish等;1984;Klatzmann等,1984;Maddon等,1986;McDougal等,1986)。该结合诱导gp120的构象变化,使之能够与几种趋化因子受体之一相互作用(Berger,1997;Bieniasz等,1998;Dragic等,1997;Littman,1998)。CC-趋化因子受体CCR5是巨噬细胞向性(R5)毒株的主要辅助受体,并且在HIV-1的传播中发挥关键作用(Berger,1997;Bieniasz等,1998;Dragic等,1997;Littman,1998)。T细胞系向性(X4)病毒利用CXCR4进入靶细胞,并且常常而非总是在疾病进展中较晚显现或者作为组织培养中病毒繁殖的结果。有些原代HIV-1分离株具有双重向性(R5X4),原因在于它们能够利用这两种辅助受体,尽管效率并非总是相同(Connor等,1997;Simmons等,1996)。Gp120与趋化因子受体的结合继而触发病毒横跨膜糖蛋白gp41中的构象改变,这介导病毒和细胞膜的融合。
利用适当的病毒或细胞蛋白的抑制剂可以阻断该多步骤过程的每个阶段,且gp120,gp41,CD4和辅助受体的抑制剂统称为侵入抑制剂。侵入抑制剂基于它们的分子目标和病毒耐受性确定因子代表至少4种不同的试剂类型(Olson和Maddon,2003)。表1列出了已知待临床开发或批准为临床应用的HIV-1侵入抑制剂。
PRO 542是四价的第三代CD4-IgG2融合蛋白,其包括CD4的D1D2结构域,所述CD4与人IgG2的重链和轻链恒定区遗传融合(Allaway等,1995;Zhu等,2001)。该试剂以纳摩尔亲和力与HIV-1包膜糖蛋白gp120结合,并且可以通过受体阻断和通过从病毒粒体表面分离gp120来抑制病毒的附着,从而不可逆转地钝化该病毒。
表1.HIV-1侵入抑制剂
化合物 | 分子种类 | 目标 | 侵入阶段 | 开发商 |
PRO542 | CD-4Ig融合蛋白 | gp120 | 附着 | Progenics |
BMS-488043 | 小分子 | gp120 | 附着 | Bristol-MyersSquibb |
TNX-355 | 人源化抗体 | CD4 | 附着后 | Tanox |
PRO 140 | 人源化抗体 | CCR5 | 辅助受体 | Progenics |
CCR5mAb004 | 人抗体 | CCR5 | 辅助受体 | 人基因组科学(Human Genome |
Sciences) | ||||
SCH-D(vicriviroc) | 小分子 | CCR5 | 辅助受体 | Schering-Plough |
UK-427,857(maraviroc) | 小分子 | CCR5 | 辅助受体 | 辉瑞(Pfizer) |
GW873140 | 小分子 | CCR5 | 辅助受体 | GlaxoSmithKline |
TAK-652 | 小分子 | CCR5 | 辅助受体 | Takeda |
AMD070 | 小分子 | CXCR4 | 辅助受体 | AnorMed |
T-20(enfuvirtide) | 肽 | gp41 | gp41融合 | Trimeris/Roche |
BMS-488043是BMS-378806(见PCT国际公开号WO 01/62255A1和WO 03/082289A1)的最佳类似物,其经多方面报道为阻断gp120与CD4的附着(Lin等,2002;2003)以及附着后的事件(Si等,2004)。
TNX-355是抗CD4单克隆抗体(mAb)5A8的人源化IgG4版本,其阻断发生在gp120与CD4附着后的融合事件(Burkly等,1992;Moore等,1992)。
以下讨论了PRO 140,即人源化抗CCR5mAb,和小分子CCR5拮抗剂,即SCH-D(现也命名为SCH 417670或vicriviroc),UK-427,857(也命名为maraviroc)和GW873140。
CCR5mAb004是利用Abgenix Xeno技术产生的完全人mAb,其特异性识别并结合于CCR5(Roschke等,2004)。已报道CCR5mAb004抑制HIV-1病毒向人类细胞的CCR5依赖性侵入,且近期进入第1阶段临床试验(HGS新闻稿(HGS Press Release),2005)。
鉴定为能够抑制HIV-1感染的第一小分子抗CCR5拮抗剂是TAK-779(Baba等,1999)。然而,TAK-779表现出很差的口服生物利用率(Baba等,2005)和局部注射位点刺激(Iizawa等,2003),并在临床开发中已经被TAK-779衍生物,即TAK-652所替代(Baba等,2005)。TAK-652是口服生物可利用的CCR5拮抗剂,其在体外具有纳摩尔范围内的有效抗HIV-1的活性,和有价值的体内药理学特征(Baba等,2005)。
AMD070是第二代CXCR4抑制剂;第一代CXCR4抑制剂AMD3100没有显示出用于HIV-1治疗的有利安全窗口(Schols等,2002)。
最后,在两个关键的第3阶段研究的每一个中认可了T-20按照有利的抗病毒和安全特征可以用于抢救治疗HIV-1感染(Lalezari等,2003;Lazzarin等,2003)。
CCR5作为抗HIV-1疗法的目标
如首次在1986年所证明的,HIV-1通过CD4受体与靶细胞结合,但需要额外的宿主细胞因子来介导侵入(Maddon等,1986)。在之后的十年中,设想了大量的候选辅助受体,但是没有一个在与CD4共表达在另外非许可的细胞时可再生地介导病毒侵入。然而,在1996年,显示出某些趋化因子受体,主要是CCR5和CXCR4,对HIV-1起到必需融合辅助受体的作用。
Cocchi等(1995)提供HIV-1和趋化因子间的第一连接,其为小(~8kDa)同源可溶性蛋白。趋化因子介导免疫细胞的补充和活化。基于四个保守的半胱氨酸中的前两个的数量和序列关系,将它们分类为CC-,CXC-,CX3C-和XC-趋化因子;大部分为CC-或CXC-趋化因子。CC-趋化因子RANTES,MIP-1α和MlP-1β表现出阻断HIV-1原代巨噬细胞向性毒株的复制(Cocchi等,1995)。利用表达克隆技术,Feng等(1996)发现趋化因子受体融蛋白(后来再命名为CXCR4)是适应于在T细胞系上生长的HIV-1毒株的融合辅助受体。其后不久,多个小组报告出CCR5的克隆,所述CCR5是对RANTES,MIP-1α和MlP-1β具有特异性的CC-趋化因子受体(Combadiere等,1996;Raport等,1996;Samson等,1997),并且随后其他小组证明了CCR5是原代巨噬细胞向性HIV-1分离株使用的主要侵入辅助因子(Alkhatib等,1996;Choe等,1996;Deng等,1996;Doranz等,1996;Dragic等,1996)。CCR5和CXCR4的表达模式帮助解决长期存在的关于不同HIV-1毒株向性的迷题。基于巨噬细胞向性,T细胞系向性和双重向性病毒为了侵入分别利用CCR5,CXCR4或这两种受体的能力,可将它们更加描述性地分为R5,X4和R5X4病毒。
多种其他趋化因子受体在体外过表达时可以起HIV-1辅助受体的功能。其列表包括CCR8,Apj,V28,US28,CCR2b,CCR3,gprl,Bonzo(STRL33,TYMSTR),和BOB(gpr15)。明显地,属于趋化因子受体家族的蛋白质具有促进HIV-1膜融合的生化性质。然而,大多数上述辅助受体不是非常高效的,通常不与CD4共表达,且仅与某些HIV-1,HIV-2或SIV毒株一起起作用。尚未建立起这些备选辅助受体的体内关联性。
若干因素使CCR5成为新型抗逆转录病毒疗法的有吸引力目标。CCR5在HIV-1的传播和发病中发挥关键作用,并且在CCR5中天然发生的突变赋予避免HIV-1感染和疾病发展的保护。最著名的CCR5多态性涉及在CCR5编码区内的32bp的缺失(A32)(Liu等,1996)。A32等位基因编码非功能受体,其无法到达细胞表面。拥有一个正常和一个突变CCR5基因的个体表达较低水平的CCR5,且它们的T细胞在体外不易受到R5病毒感染的影响(Liu等,1996;Wu等,1997)。A32杂合体经历较轻微的疾病过程,其特征为减少的病毒负荷和延迟发展为AIDS(Huang等,1996;Michael等,1997)。这些结果支持这样的观点,所述观点是减小CCR5的利用率可以降低病毒复制并减缓疾病发展。
具有两个突变CCR5基因的个体包括北欧血统人群中的显著部分;该人口统计暗示了利用CCR5病原体的优先传染性。所述个体表现为人CCR5的“敲除”,其中它们不表达功能性的CCR5蛋白。除了罕见的情形(Balotta等,1997;Biti等,1997;O′Brien等,1997),这些个体对HIV-1感染具有抗性(Huang等,1996;Liu等,1996;Michael等,1997;Samson等,1997),并且它们的T细胞在体外不受R5病毒的感染(Liu等,1996)。这些发现强调了CCR5在HIV-1传播中的重要作用。事实上,现已知R5病毒在几乎所有情形中介导传播,并在大多数情形中介导向AIDS的发展。
重要地,缺乏CCR5的个体享有正常的健康,并不展现出明显的免疫或其他缺陷。这可以反映趋化因子信号通路的丰余性和受到合适限制的CCR5表达模式。尽管已在其他组织,如平滑肌中报道了低水平的CCR5表达,CCR5的表达主要受活化的T细胞和巨噬细胞的限制,其代表体内HIV-1感染的原代目标(Schecter等,2000)。
产生CCR5敲除小鼠,并对废除CCR5功能的影响提供进一步的识别力。尽管随着特殊病原体的挑战可以观察到免疫应答中的微小改变,CCR5敲除小鼠发育正常且外表健康(Huffnagle等,1999;Schuh等,2002;Tran等,2000;Zhou等,1998)。相反,CXCR4敲除小鼠是小鼠中的致死表现型(Lapidot等,2001),且没有在人中观察到。
总之,这些遗传分析强烈地支持以作为药物目标的CCR5为基础的新型治疗方法。反转录酶易于出错的天性产生无限的遗传多样性,其促进抗药性分离株的发育,并且HIV-1的利用多种融合辅助受体的能力对抗性提供一条途径。对所有市场上的抗逆转录病毒分离了抗药性病毒,当以适当的组合使用时,其仍然提供重要的治疗益处。由此,尽管可能出现抗药性病毒,CCR5目标试剂可以用作HIV-1感染的新型治疗范例。
尽管CCR5明显的非本质天性暗示CCR5拮抗剂在体内可以受到良好的耐受,但是仍要求进一步的研究,以确定在个体中废除CCR5功能的长期作用,所述个体的免疫系统是在存在CCR5功能的条件下发育的。通过使用与CCR5结合并抑制其与HIV-1结合的试剂可以减轻该潜在的有害作用,而不削弱正常的CCR5功能。一种被证明具有该性质的试剂是人源化的抗CCR5mAb,即PRO 140,其在不抑制CCR5生理活性的浓度时有效地阻断HIV-1的复制(Olson等,1999)。PRO 140是通过利用荧光共振能量传递(RET)测定筛选抗HIV活性识别的。它有效地抗病毒,具有约4μg/ml的IC90(Olson等,1999;Trkola等,2001),且保护多样的原代靶细胞种类(Ketas等,2003;Olson和Maddon,2003)。在hu-PBL SCID小鼠模型中重复施用PRO 140可以在无病毒逃脱的条件下,引起对HIV-1复制延长的控制,且PRO 140目前处于第1阶段人类临床试验中。
识别了小分子CCR5拮抗剂TAK-779(Baba等,1999)后,识别多种其他小分子CCR5拮抗剂。这其中的四种(SCH-C,SCH-D,UK-427,857,GW873140)在HIV感染个体中具有完全相似设计的第1阶段研究(Reynes等,2002;Schurmann等,2004;Dorr等,2003;Lalezari等,2004)。这些试剂中每一种均在10-14天的治疗时期中介导剂量依赖性HIV-1RNA水平的~1log10平均降低。如所预料地,随着治疗的结束,病毒负荷弹回初始水平。最普遍的药物相关性副作用是神经性的(头痛,眩晕)和胃肠性的(恶心,腹泻,肠胃气胀),且这些不是剂量限制性的。除SCH-C外(Reyes等,2001),没有一种上述识别的试剂诱导QTc间隔的临床显著性变化。
还实施了双盲、受安慰剂控制的单次口服剂量研究,从而在健康男性志愿者中评估TAK-652的安全性、耐受力和药物动力学,其中TAK-652是TAK-779的后继化合物(Baba等,2005)。据报道TAK-652溶液的单次施药是安全且良好耐受的(Baba等,2005)。
总之,这些研究提供CCR5作为HIV-1治疗目标的初步确认。当小分子CCR5拮抗剂代表具有不同药物动力学和代谢性质的可获得专利的独特化学系列时,所述化合物在抑制CCR5的功能,CCR5上的结合位点,耐受特征和剂量方案中共同具有许多性质。这些相似性可以令人信服地限制由小分子CCR5拮抗剂所提供的真正治疗选项的数量。而且,尚待确定是否存在慢性阻断CCR5功能的不适当后果,且尚待通过证明第3阶段临床研究中适当的安全性和功效建立利用小分子CCR5拮抗剂的HIV-1治疗法。
单克隆抗体疗法
近年来,mAb产物提供了多种疾病环境中护理的新标准。目前,美国食品和药品局(U.S.Food and Drug Administration)(FDA)批准了18种用于指示包括癌症、自体免疫疾病、移植排斥和病毒感染的mAb。值得注意地,从2000年以来批准了14种mAb。在许多实例中,mAb提供安全性、功效和容易使用的特征,这些特征是小分子化合物无可匹敌的。实例包括Synagis(医学免疫公司(MedImmune,Inc.),Gaithersburg,MD),呼吸道合胞病毒(RSV)的人源化mAb,和Rituxan(Genentech,San Francisco,CA),即为非霍奇金淋巴瘤提供抗标准护理的抗CD20 mAb。
人源化抗CCR5 mAb,即PRO 140,在结构、功能和力学上区别于小分子CCR5拮抗剂,且因此代表独特的CCR5抑制剂种类。PRO 140是鼠科mAb,即PA14的人源化型式,PA14针对CD4+CCR5+细胞产生(Olson等,1999)。PRO 140与表达在细胞表面上的CCR5结合,并在体外不影响CCR5趋化因子受体活性的浓度和在HIV-1感染的hu-PBL-SCID小鼠模型中有效地抑制HIV-1的侵入和复制(Olson等,1999;Trkola等,2001)。发现后者为PRO140抗HIV-1治疗提供体内概念证明,并且PRO140目前经历着第1a阶段临床研究。
表2中总结了PRO140和小分子CCR5拮抗剂间的重要区别。由表2,明显地,尽管在发育中小分子CCR5拮抗剂共同具有许多性质,PRO140明显地区别于这些小分子抑制剂。这两个CCR5抑制剂种类间的区别揭示PRO140可以提供与小分子CCR5拮抗剂从根本上不同的,并在许多方面上互补的产物特征。实际上,PRO140代表了用于治疗HIV-1感染的新型治疗方法,并且无论小分子CCR5拮抗剂是否被最终临床批准,PRO140可以在HIV-1治疗中扮演重要角色。
通过不同种类抑制剂对HIV-1感染的协同抑制
先前利用某些抗Env抗体与其他抗Env抗体(Thali等,1992;Tilley等,1992;Laal等,1994;Vijh-Warrier等,1996;Li等,1997;Li等,1998),抗CD4抗体(Burkly等,1995)或基于CD4的蛋白质(Allaway等,1993)的组合,证明了对HIV-1侵入的协调抑制。相似地,利用抗CCR5抗体与其他抗CCR5抗体,CC-趋化因子或基于CD4的蛋白质的组合,观察到协同作用(Olson等,1999)。在2000年6月22日公开的PCT国际公开号WO 00/35409中所描述的先前研究检验了HIV-1附着抑制剂和CCR5辅助受体抑制剂的组合。在2001年8月2日公开的PCT国际公开号WO 01/55439中所描述的先前研究检验了gp41融合中间产物和HIV-1附着的组合。在2002年3月21日公开的PCT国际公开号WO 02/22077中所描述的先前研究检验了融合抑制剂和CCR5辅助受体抑制剂的组合,以及融合抑制剂、CCR5辅助受体抑制剂和HIV-1附着抑制剂的三重组合。然而,先前研究未检验不同种类CCR5辅助受体抑制剂,如抗CCR5mAb和非抗体CCR5拮抗剂的组合。
表2.发育中的PRO140和小分子CCR5拮抗剂的比较
小分子 | PRO 140 | |
识别筛选 | 趋化因子结合 | HIV-1侵入 |
阻断CCR5的天然活性 | 是 | 否 |
免疫抑制/调节异常的潜能 | 是 | 否 |
耐受力 | 对某些具有心脏,神经毒性 | 无毒性 |
CCR5上的结合位点 | 由CCR5穿膜区域定义的普遍疏水性囊 | 横跨多亲水结构域的细胞外表位 |
病毒的杂交抗性 | 显著的 | 受限的 |
体外抗性的发育 | 6-19周 | 没有一个在40周 |
药物-药物相互作用 | 显著的 | 不太可能的 |
食品相互作用 | 显著的 | 不太可能的 |
剂量 | 每日1次或2次 | 每两周-每月 |
发明概述
本方法提供用于减少受HIV-1感染的人类受试者中的HIV-1病毒负荷的方法,其包括以预定的时间间隔向所述受试者施用有效HIV-1病毒负荷减少剂量的(a)人源化抗体PRO140,或(b)抗CCR5受体单克隆抗体,所述人源化抗体PRO140或抗CCR5受体单克隆抗体(i)与所述受试者体内的CD4+CCR5+细胞结合,并抑制HIV-1和所述细胞的融合,(ii)抑制HIV-1和CD4+CCR5+细胞的融合,其具有等于或高于PRO140的效能,(iii)在不减少受试者体内CD4+CCR5+细胞数量的条件下,覆盖受试者体内的所述细胞,和/或(iv)在不诱导受试者循环β趋化因子的血浆浓度增高的条件下,与受试者的CD4+CCR5+细胞结合,其中PRO140包括(i)两条轻链,每条轻链包含质粒pVK:HuPRO140-VK(ATCC保藏编号PTA-4097)的表达产物,和(ii)两条重链,每条重链包含质粒pVg4:HuPRO140 HG2-VH(ATCC保藏编号PTA-4098)或质粒pVg4:HuPRO 140(mut B+D+I)-VH(ATCC保藏编号PTA-4099)的表达产物,其中所述有效HIV-1病毒负荷减少剂量包括0.1mg/kg-10mg/kg受试者体重,从而由此减少受试者的HIV-1病毒负荷。
本发明还提供用于在人类受试者中抑制HIV-1相关的病症的发作和发展的方法,所述发作和发展的抑制受抑制受试者中HIV-1与CCR5+CD4+靶细胞的融合的影响,所述方法包括以预定的时间间隔向所述受试者施用有效融合抑制剂量的人源化抗体PRO140或抗CCR5受体抗体,所述人源化抗体PRO140或抗CCR5受体抗体(i)与所述受试者体内的CD4+CCR5+细胞结合,并抑制HIV-1和所述细胞的融合,(ii)抑制HIV-1和受试者CD4+CCR5+细胞的融合,功效的特征在于10μg/ml或更低的IC90,(iii)在不减少受试者体内CD4+CCR5+细胞数量的条件下,覆盖受试者的所述细胞,和/或(iv)在不诱导受试者循环β趋化因子的血浆浓度增高的条件下,与受试者的CD4+CCR5+细胞结合,其中PRO140包括(i)两条轻链,每条轻链包含质粒pVK:HuPRO140-VK(ATCC保藏编号PTA-4097)的表达产物,和(ii)两条重链,每条重链包含质粒pVg4:HuPRO140HG2-VH(ATCC保藏编号PTA-4098)或质粒pVg4:HuPRO140(mut B+D+I)-VH(ATCC保藏编号PTA-4099)的表达产物,其中每次施用所述抗体向受试者递送0.1mg/kg-10mg/kg受试者体重的抗体,从而由此在人类受试者中抑制HIV-1相关病症的发作和发展。
本发明进一步提供用于降低人类受试者感染HIV-1感染可能性的方法,其包括以预定的时间间隔向受试者施用有效融合抑制剂量的人源化抗体PRO140或抗CCR5受体抗体,所述人源化抗体PRO140或抗CCR5受体抗体(i)与所述受试者体内的CD4+CCR5+细胞结合,并抑制HIV-1和所述细胞的融合,(ii)抑制HIV-1和受试者CD4+CCR5+细胞的融合,功效的特征为10μg/ml或更低的IC90,(iii)在不减少受试者体内CD4+CCR5+细胞数量的条件下,覆盖受试者的所述细胞,和/或(iv)在不诱导受试者循环β趋化因子的血浆浓度增高的条件下,与受试者的CD4+CCR5+细胞结合,其中PRO140包括(i)两条轻链,每条轻链包含质粒pVK:HuPRO140-VK(ATCC保藏编号PTA-4097)的表达产物,和(ii)两条重链,每条重链包含质粒pVg4:HuPRO140HG2-VH(ATCC保藏编号PTA-4098)或质粒pVg4:HuPRO140(mut B+D+I)-VH(ATCC保藏编号PTA-4099)的表达产物,其中每次施用所述抗体向受试者递送0.1mg/kg-10mg/kg受试者体重的抗体,从而由此降低受试者感染HIV-1感染的可能性。
本发明提供用于治疗感染了HIV-1的受试者的方法,其包括向受试者施用治疗受试者有效量的(a)抗体,所述抗体(i)与CD4+细胞表面上的CCR5受体结合,并(ii)抑制HIV-1与CCR5+CD4+细胞的融合,和(b)CCR5受体的非抗体拮抗剂。
本发明还提供用于在受试者中抑制HIV-1相关的病症的发作或发展的方法,所述发作或发展的抑制受抑制受试者中HIV-1与CCR5+CD4+靶细胞的融合的影响,所述方法包括向受试者施用抑制HIV-1与CCR5+CD4+靶细胞融合有效量的(a)抗体,所述抗体(i)与CD4+细胞表面上的CCR5受体结合,并(ii)抑制HIV-1与CCR5+CD4+细胞的融合,和(b)CCR5受体的非抗体拮抗剂,从而由此抑制受试者中的HIV-1相关病症的发作或发展。
本发明进一步提供用于降低受试者感染HIV-1感染可能性的方法,所述方法包括向受试者施用降低受试者感染HIV-1感染可能性有效量的(a)抗体,所述抗体(i)与CD4+细胞表面上的CCR5受体结合,并(ii)抑制HIV-1与CCR5+CD4+细胞的融合,和(b)CCR5受体的非抗体拮抗剂。
本发明还提供加强(i)抗CCR5受体单克隆抗体或(ii)非抗体CCR5受体拮抗剂在治疗受试者体内HIV-1感染中的HIV-1抑制活性的方法,所述方法包括向受试者施用HIV-1抑制活性加强量的抗CCR5受体单克隆抗体和HIV-1抑制活性加强量的非抗体CCR5受体拮抗剂的组合,其中所述组合对抑制HIV-1感染产生协同作用,由此加强(i)抗CCR5受体单克隆抗体或(ii)非抗体CCR5受体拮抗剂的抑制活性。在一个实施方案中,由于该协同作用,非抗体CCR5受体拮抗剂导致抗CCR5受体单克隆抗体约4-10倍的剂量减少,和抗CCR5受体单克隆抗体导致非抗体CCR5受体拮抗剂约3-16倍的剂量减少。
附图简述
图1.人源化PRO140是有效抗病毒的。利用全病毒复制测定,针对四种原代R5 HIV-1分离株测试鼠科和人源化PRO140的体外中和活性。该数据反映来自8个或更多独立测定的中值。圆括号中指出了病毒的遗传亚型。
图2.抗病毒活性独立于靶细胞。测试了对四种不同靶细胞的三种原代R5 HIV-1分离株的感染的抑制。
图3.利用PhenoSensTM侵入测定量化了体外HIV-1对PRO140的易感性。在ViroLogic公司(ViroLogic,Inc.)的PhenoSense HIV EntryTM测定中,测试了PRO140针对20种原代HIV-1分离株的活性。将药物易感性记录为IC50值,其代表抑制50%病毒感染力所需要的浓度。
图4.PRO140阻断HIV-1而非趋化因子信号。确定了PRO140对在L1.2-CCR5细胞中抑制RANTES诱导的钙活化和在PBMC培养物中抑制HIV-1JR-FL复制的作用。对MIP-1α和MIP-1β获得了相似的结果。
图5.PRO140在HIV-1感染的小鼠中提供对病毒复制延长的控制。用正常人外周血液单核细胞再造SCID小鼠,并在2周后用HIV-1IRCSF进行感染。在达到稳定状态病毒水平后施用了多剂量的PRO140。显示了注射之前和之后的血浆病毒负荷。
图6.PRO140覆盖但不减少CCR5淋巴细胞。用剂量水平2mg/kg的PRO140单次静脉内灌输对健康男性志愿者(n=4)进行处理。在处理后指定的时间,收集血液并分析其CCR5淋巴细胞水平。显示了组平均值和标准偏差。
图7.PRO140的血清浓度。如显示,用剂量水平0.1,0.5和2.0mg/kg的PRO140单次静脉内灌输对健康男性志愿者进行处理。在处理后指定的时间,收集、冷藏血清,并分析其PRO140水平。显示了每个患者的数据。
图8.RPO140的剂量不影响血浆趋化因子水平。用0.1mg/kg的PRO140(分组1),0.5mg/kg的PRO140(分组2)或匹配的安慰剂的单次静脉内灌输对健康男性志愿者(n=4)进行处理。在处理后指定的时间,收集、冷藏血浆,并分析其RANTES水平。该测定的量化下限是415pgRANTES/mL血浆。数据表示组平均值。
图9.化学合成SCH-D的图解。
图10.化学合成TAK-779的图解。该方法如Shiraishi等,2000中所描述。
图11.化学合成UK-427,857的图解。该方法如2001年11月29日公开的PCT国际公开号WO 01/90106A2中所描述。
图12.由PRO140表现出的HIV-1与不同化合物融合的协同抑制。利用RET测定,评估了的PRO140与小分子、肽、mAb和CCR5、CD4、gp120及gp41目标的嵌合CD4免疫球蛋白抑制剂的相互作用对HIV-1融合的抑制。对获得的数据利用以1∶1摩尔比例结合的化合物标绘了具有95%可信度间隔的平均组合指数(CI)值。CI值<1表示协同相互作用;CI值为1表示叠加相互作用;及CI值>1表示拮抗的相互作用。
图13.PRO140覆盖但不减少淋巴细胞。用剂量水平5mg/kg的PRO140单次静脉内灌输对健康男性志愿者(n=4)进行处理。在处理后指定的时间,收集血液并分析其CCR5淋巴细胞水平。显示了组平均值和标准偏差。
图14.PRO140对耐受小分子CCR5拮抗剂的HIV-1毒株具有活性。测试了耐受AD101(与SCH-C结构相关的小分子CCR5抑制剂)和SCH-D(Kuhmann等,2004;Maroznan等2005)的HIV-1变体对抗CCR5mAb,即PA14的敏感性。相对于在缺乏任何抑制剂的条件下p24抗原产生成(将其定义为100%)来表示原代CD4+T细胞中病毒复制的范围。各个数据点是来自4个分离试验数值的平均,每个试验均利用完全相同的两个孔进行。该数据显示尽管AD101-和SCH-D-耐受性HIV-1变体分别耐受SCH-C和SCH-D,这些变体的复制受到PA14的有效抑制(Maroznan等2005)。
图15.通过CCR5抑制剂的组合抑制HIV-1JR-FL包膜介导的膜融合的剂量-应答曲线。在完全相同的三个孔中分析了稀释液,并且数据点描述了平行测定的平均值和标准偏差。(A)单独测试了PRO140和UK-427,857,且其在所示浓度范围中处于1∶1的固定摩尔比。在所描述的试验中,PRO140的IC50和IC90值为2.9nM和11nM,UK-427,857的IC50和IC90值为5.0nM和21nM,及其组合的IC50和IC90值为2.1nM和4.6nM。CI50和CI90值分别为0.58和0.32。(B)单独测试了SCH-D和UK-427,857,且其在所示浓度范围中处于1∶1的固定摩尔比。在所描述的试验中,SCH-D的IC50和IC90值为5.5nM和34nM,UK-427,857的IC50和IC90值为9.7nM和59nM,及其组合的IC50和IC90值为6.1nM和31nM。CI50和CI90值分别为0.87 and 0.73。
图16.通过未标记的PRO140,UK-427,857和SCH-D抑制PRO 140-PE与CEM.NKR-CCR5细胞的结合。在添加5nM PRO 140-PE保持另外30分钟前,在室温和PBSA缓冲液中,用不同浓度的未标记PRO 140,UK-427,857或SCH-D培养CEM.NKR-CCR5细胞30分钟。洗涤细胞,然后利用流式细胞计分析该细胞的结合平均荧光密度(MFI)和选定为与PRO140-PE阳性结合的细胞百分数。在MFI(A)和被选定的细胞百分数(B)的基础上评估了抑制。
图17.未标记的UK-427,857,SCH-D和PRO 140对3H-UK-427,857的抑制。(A)添加2nM3H-UK-427,857保持另外30分钟前,在环境温度和PBSA缓冲液中,用不同浓度的未标记UK-427,857,SCH-D或PRO 140预培养CEM.NKR-CCR5细胞30分钟。洗涤细胞,然后利用闪烁计数器分析该细胞放射性。(B)通过在洗涤前用2nM3H-UK-427,857预培养CEM.NKR-CCR5细胞,添加未标记的化合物30分钟,以及如上述处理,检验了UK-427,857在测定条件下结合的稳定性。
发明详述
术语
用于本申请中使用时,除非在本文中另外明确规定,下列每个术语应该具有以下所阐明的意义。
“施用”指以这样的方式递送,所述方式是利用本领域中的那些技术人员已知的任意多样方法和递送系统实现或进行的。施用可以通过,例如局部,静脉内,心包,口服,肠胃外,通过移植,经黏膜,经皮,皮内,肌内,皮下,腹膜内,鞘内,淋巴内,病灶内,硬膜外,或通过体内电造孔法进行。试剂或组合物还可以以气雾剂的方式施用,如肺和/或鼻内递送。施用还可以进行例如一次,多次,和/或经过一个或多个长期的时期。
“抗体”应该无限制地包括免疫球蛋白分子,其包括两条重链和两条轻链并识别抗原。所述免疫球蛋白分子可以源自任何众所周知的种类,其包括但不仅限于IgA,分泌的IgA,IgG和IgM。IgG亚类也为本领域技术人员所熟知,其包括但不仅限于人IgG1,IgG2,IgG3和IgG4。“抗体”包括,作为实例,天然存在的和非天然存在的抗体;单克隆和多克隆抗体;嵌合和人源化抗体;人或非人抗体;全部合成的抗体;和单链抗体。通过重组法可以人源化非人抗体,从而降低其在人中的免疫原性。人源化抗体的方法为本领域中的技术人员所熟知。“抗体”还无限制地包括任意上述免疫球蛋白分子的片段或部分,并且包括单价和二价片段或部分。抗体片段包括,例如,Fc片段和抗原结合片段(Fab)。
“抗趋化因子受体抗体”指识别并结合于趋化因子受体上的表位的抗体。用于本文时,“抗CCR5抗体”指识别并结合于CCR5趋化因子受体上的表位的抗体。
“附着”意指由HIV-1包膜糖蛋白与人CD4受体的结合所介导的过程,所述人CD4受体不是融合辅助受体。
用于本文时,“CCR5”是趋化因子受体,其与趋化因子的C-C基团的成员结合,且其氨基酸序列包括Genbank编号1705896中所提供的序列以及相关的多态性变体。用于本文时,CCR5无限制地包括能够与HIV-1包膜蛋白结合的CCR5的细胞外部分。同义地使用“CCR5”和“CCR5受体”。
“CD4”意指成熟的,先天的,膜结合的CD4蛋白,其包含细胞质结构域,疏水性穿膜结构域,和与HIV-1gp120包膜糖蛋白结合的细胞外结构域。
“CDR”或互补决定区,意指抗体可变区中高度可变的氨基酸序列。
“细胞”包括生物细胞,例如HeLa细胞,和非生物细胞,例如磷脂小泡或病毒粒体。“易受HIV感染影响的细胞”还可以表示为“靶细胞”,并包括能够被HIV或HIV感染细胞感染或与之融合的细胞。
“CXCR4”是趋化因子受体,其与趋化因子的C-X-C基团成员结合,且其氨基酸序列包括Genbank编号400654中所提供的序列以及相关的多态性变体。用于本文时,CXCR4包括能够与HIV-1包膜蛋白结合的CXCR4的细胞外部分。
“暴露”于HIV-1指与HIV-1接触,以至于可以导致感染。
“完全人”抗体指这样的抗体,其中所有的氨基酸与人免疫球蛋白分子中的氨基酸相一致。同义地使用“完全人”和“人”。
“HIV”指人免疫缺陷病毒。HIV应该无限制地包括HIV-1。HIV-1包括但不仅限于细胞外病毒粒子和与HIV-1感染细胞联合的HIV-1形式。所述人免疫缺陷病毒(HIV)可以是两种已知HIV类型(HIV-1或HIV-2)中的任一种。HIV-1病毒可以代表任何已知的主要亚型(种类A,B,C,D,E,F,G和H)或无关的亚型(组O)。HIV-1JR-FL是最初在尸体解剖时从AIDS患者的脑组织中分离的毒株。已克隆了该病毒,并已知其包膜糖蛋白的DNA序列(GenBank编号U63632)。在对病毒侵入抑制剂的敏感性的方面,已知HIV-1JR-FL是高度典型的原代HIV-1分离株。
“人源化”抗体指这样的抗体,其中CDR区域外的一些、大多数或所有氨基酸被源自人免疫球蛋白分子的相应氨基酸所替代。在抗体的人源化形式的实施方案中,CDR区域外的一些、大多数或所有氨基酸被来自人免疫球蛋白分子的氨基酸所替代,反之一个或多个CDR区域内的一些、大多数或所有氨基酸不变。可以允许小的氨基酸的添加、缺失、插入、替换或修饰,只要它们不消除抗体结合所给抗原的能力。适合的人免疫球蛋白分子包括IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,IgA,IgE和IgM分子。“人源化”抗体保持与原始抗体相似的抗原特异性。
“单克隆抗体”,也叫做mAb,是这样的抗体分子,其原代序列在本质上相同,并表现出相同的抗原特异性。通过杂交瘤,重组,转基因或其他本领域技术人员已知的技术可以产生单克隆抗体。
“CCR5受体的非抗体拮抗剂”指这样的试剂,其不包含抗体,且与CCR5受体结合并抑制该受体的活性。所述抑制可以包括抑制HIV-1和CCR5受体的结合。作为实例,非抗体拮抗剂包括核酸、碳水化合物、脂质、寡肽和小有机分子。
“降低受试者感染病毒感染的可能性”意指降低受试者受病毒感染的可能性至少2倍。例如,如果受试者有1%的可能受病毒感染,则受试者感染病毒感染可能性的2倍降低导致受试者有0.5%的可能受病毒感染的机会。在本发明优选的实施方案中,降低受试者感染病毒感染的可能性意指降低受试者受病毒感染的可能性至少10倍。
“小分子”CCR5受体拮抗剂包括,例如,小有机分子,其与CCR5受体结合并抑制该受体的活性。所述抑制包括,例如,抑制HIV-1与所述受体的结合。在一个实施方案中,所述小有机分子具有低于1,500道而顿的分子量。在另一个实施方案中,所述分子具有低于600道尔顿的分子量。
“受试者”包括任何能够受HIV感染的动物或人工改良的动物。动物包括,但不仅限于,人、非人灵长类、狗、猫、兔、雪貂和啮齿类如小鼠、大鼠和豚鼠。人工改良的动物包括,但不仅限于,具有人免疫系统的SCID小鼠。在优选的实施方案中,所述受试者是人。
两个或多个试剂间的“协同作用”指高于其叠加作用的试剂的组合作用。通过利用组合索引(CI)法分析剂量-应答曲线量化试剂间的协同、叠加或拮抗作用。高于1的CI值表示拮抗作用;等于1的CI值表示叠加作用;和低于1的CI值表示协同作用。在一个实施方案中,协同相互作用的CI值低于0.9。在另一个实施方案中,CI值低于0.8。在优选的实施方案中,CI值低于0.7。
“治疗受试者中的HIV-1感染”指减缓、终止或逆转受试者中HIV-1病症的发展。在优选的实施方案中,“治疗”指将该发展逆转到消除病症的点。用于本文时,“治疗”还意指减少病毒感染的数量,减少感染性病毒粒子的数量,减少受病毒感染细胞的数量,或改善与HIV-1相关的症状。减少受试者中的病毒负荷是治疗受试者的一个实施方案。
发明的实施方案
本发明提供用于减少受HIV-1感染的人类受试者中的HIV-1病毒负荷的方法,其包括以预定的时间间隔向所述受试者施用有效HIV-1病毒负荷减少剂量的(a)人源化抗体PRO 140,或(b)抗CCR5受体单克隆抗体,所述人源化抗体PRO 140或抗CCR5受体单克隆抗体(i)与所述受试者体内的CD4+CCR5+细胞结合,并抑制HIV-1和所述细胞的融合,(ii)抑制HIV-1和CD4+CCR5+细胞的融合,功效等于或高于PRO140的功效,(iii)在不减少受试者体内CD4+CCR5+细胞数量的条件下,覆盖受试者中的CD4+CCR5+细胞,和/或(iv)在不诱导受试者循环β趋化因子的血浆浓度增高的条件下,与受试者的CD4+CCR5+细胞结合,其中PRO140包括(i)两条轻链,每条轻链包含质粒pVK:HuPRO140-VK(ATCC保藏编号PTA-4097)的表达产物,和(ii)两条重链,每条重链包含质粒pVg4:HuPRO140 HG2-VH(ATCC保藏编号PTA-4098)或质粒pVg4:HuPRO140(mut B+D+I)-VH(ATCC保藏编号PTA-4099)的表达产物,其中有效HIV-1病毒负荷减少剂量包括0.1mg/kg-10mg/kg受试者体重,从而由此减少受试者HIV-1的病毒负荷。
在一个实施方案中,抗CCR5受体单克隆抗体与CCR5表位结合,所述CCR5表位和与PRO 140结合的表位相同。所述抗CCR5受体单克隆抗体可以是,例如,人源化、人或嵌合抗体。在优选的实施方案中,施用于受试者的抗体是称为PRO 140的抗体。
在一个实施方案中,有效病毒负荷减少剂量是0.25mg/kg-7.5mg/kg受试者体重。在另一个实施方案中,所述剂量是0.5mg/kg-5mg/kg受试者体重。在另一个实施方案中,所述剂量是1mg/kg-3mg/kg受试者体重。在另一个实施方案中,所述剂量是2mg/kg受试者体重。
在另一个实施方案中,有效病毒负荷减少剂量足以在受试者体内获得至少400ng/ml的抗体血清浓度。在另一个实施方案中,以常规时间间隔施用的剂量足以在受试者体内获得和维持至少1μg/ml的抗体血清浓度。在另一个实施方案中,所述剂量足以在受试者体内获得和维持约3μg/ml-约12μg/ml的抗体血清浓度。在另一个实施方案中,所述剂量足以在受试者体内获得和维持至少5μg/ml的抗体血清浓度。在另一个实施方案中,所述剂量足以在受试者体内获得和维持至少10μg/ml的抗体血清浓度。在另一个实施方案中,所述剂量足以在受试者体内获得和维持至少25μg/ml的抗体血清浓度。在另一个实施方案中,所述剂量足以在受试者体内获得和维持至少50μg/ml的抗体血清浓度。
在本发明的一个实施方案中,所述预定的时间间隔是至少每周一次。在另一个实施方案中,所述预定的时间间隔是每2-4周一次。在另一个实施方案中,所述预定的时间间隔是每2周一次,或每4周一次。在另一个实施方案中,所述预定的时间间隔是至少每月一次,每6周一次或每8周一次。在本发明的另一个实施方案中,所述受试者HIV-1病毒负荷的减少维持至少1周。在另一个实施方案中,所述受试者HIV-1病毒的负荷维持至少2周。在另一个实施方案中,所述受试者HIV-1病毒负荷的减少维持至少4周。在另一个实施方案中,所述受试者HIV-1病毒负荷的减少维持至少3个月。
在一个实施方案中,抗体是通过静脉内灌输施用的。在另一个实施方案中,抗体是通过皮下注射施用的。在一个实施方案中,抗体施用后,受试者HIV-1病毒负荷减少了至少50%。在另一个实施方案中,抗体施用后,受试者HIV-1病毒负荷减少了至少70%,且优选地,抗体施用后,减少了至少90%。
在本发明的一个实施方案中,方法还包括向受试者施用至少一种抗HIV-1抗逆转录病毒试剂。所述抗HIV-1抗逆转录病毒试剂可以是,例如,非核苷反转录酶抑制剂(NNRTI),核苷反转录酶抑制剂(NRTI),蛋白酶抑制剂(PI),融合抑制剂,或其任意组合。在一个实施方案中,受试者是首次用于治疗的。在优选的实施方案中,受试者是经历过治疗的。
在另一个实施方案中,(a)在向受试者施用单克隆抗体前,该受试者接受至少一种抗HIV-1抗逆转录病毒试剂的治疗,和(b)在向受试者施用单克隆抗体的同时,该受试者继续接受一种或多种所述试剂的治疗,从而增强该受试者体内HIV-1病毒负荷的减少。所述抗HIV-1抗逆转录病毒试剂可以是,例如,非核苷反转录酶抑制剂(NNRTI),核苷反转录酶抑制剂(NRTI),蛋白酶抑制剂(PI),融合抑制剂,或其任意组合。
本发明还提供用于在人类受试者中抑制HIV-1相关的病症的发作或发展的方法,所述发作或发展的抑制受抑制受试者中HIV-1与CCR5+CD4+靶细胞的融合的影响,所述方法包括以预定的时间间隔向所述受试者施用有效融合抑制剂量的人源化抗体PRO140或抗CCR5受体抗体,所述人源化抗体PRO 140或抗CCR5受体抗体(i)与所述受试者体内的CD4+CCR5+细胞结合,并抑制HIV-1和所述细胞的融合,(ii)抑制HIV-1和受试者的CD4+CCR5+细胞的融合,功效的特征为10μg/ml或更低的IC90,(iii)在不减少受试者体内CD4+CCR5+细胞数量的条件下,覆盖受试者的所述细胞,和/或(iv)在不诱导受试者循环β趋化因子的血浆浓度增高的条件下,与受试者的CD4+CCR5+细胞结合,其中PRO140包括(i)两条轻链,每条轻链包含质粒pVK:HuPRO140-VK(ATCC保藏编号PTA-4097)的表达产物,和(ii)两条重链,每条重链包含质粒pVg4:HuPRO140 HG2-VH(ATCC保藏编号PTA-4098)或质粒pVg4:HuPRO140(mut B+D+I)-VH(ATCC保藏编号PTA-4099)的表达产物,其中每次施用所述抗体向受试者递送0.1mg/kg-10mg/kg受试者体重的抗体,从而由此在人类受试者中抑制HIV-1相关病症的发作或发展。
本发明进一步提供用于降低人类受试者感染HIV-1感染可能性的方法,其包括以预定的时间间隔向受试者施用有效融合抑制剂量的人源化抗体PRO140或抗CCR5受体抗体,所述人源化抗体PRO 140或抗CCR5受体抗体(i)与所述受试者体内的CD4+CCR5+细胞结合,并抑制HIV-1和所述细胞的融合,(ii)抑制HIV-1和受试者CD4+CCR5+细胞的融合,效能的特征为10μg/ml或更低的IC90,(iii)在不减少受试者体内CD4+CCR5+细胞数量的条件下,覆盖受试者的所述细胞,和/或(iv)在不诱导受试者循环β趋化因子的血浆浓度增高的条件下,与受试者的CD4+CCR5+细胞结合,其中PRO140包括(i)两条轻链,每条轻链包含质粒pVK:HuPRO140-VK(ATCC保藏编号PTA-4097)的表达产物,和(ii)两条重链,每条重链包含质粒pVg4:HuPRO140 HG2-VH(ATCC保藏编号PTA-4098)或质粒pVg4:HuPRO140(mut B+D+I)-VH(ATCC保藏编号PTA-4099)的表达产物,其中每次施用所述抗体向受试者递送0.1mg/kg-10mg/kg受试者体重的抗体,从而由此降低受试者感染HIV-1感染的可能性。在一个实施方案中,将受试者暴露于HIV-1。在另一个实施方案中,受试者处于暴露于HIV-1的危险中。
本发明还提供用于减少受HIV-1感染的人类受试者中HIV-1病毒负荷的方法,所述人类受试者产生了针对抗HIV-1治疗形式的抗性,所述方法包括以预定的时间间隔向所述受试者施用有效HIV-1病毒负荷减少剂量的(a)人源化抗体PRO140或(b)抗CCR5受体抗体,所述人源化抗体PRO140或抗CCR5受体抗体(i)与所述受试者体内的CD4+CCR5+细胞结合,并抑制HIV-1和所述细胞的融合,(ii)抑制HIV-1和CD4+CCR5+细胞的融合,效能等于或高于PRO140的效能,(iii)在不减少受试者体内CD4+CCR5+细胞数量的条件下,覆盖受试者的所述细胞,和/或(iv)在不诱导受试者循环β趋化因子的血浆浓度增高的条件下,与受试者的CD4+CCR5+细胞结合,其中PRO140包括(i)两条轻链,每条轻链包含质粒pVK:HuPRO140-VK(ATCC保藏编号PTA-4097)的表达产物,和(ii)两条重链,每条重链包含质粒pVg4:HuPRO140 HG2-VH(ATCC保藏编号PTA-4098)或质粒pVg4:HuPRO140(mut B+D+I)-VH(ATCC保藏编号PTA-4099)的表达产物,其中所述有效HIV-1病毒负荷减少剂量包括0.1mg/kg-10mg/kg受试者体重,从而由此减少受试者HIV-1的病毒负荷。
在一个实施方案中,所述抗HIV-1治疗形式是非核苷反转录酶抑制剂(NNRTI),核苷反转录酶抑制剂(NRTI),蛋白酶抑制剂(PI),融合抑制剂,或其任意组合。在另一个实施方案中,所述融合抑制剂是非抗体CCR5拮抗剂。在另一个实施方案中,所述非抗体CCR5拮抗剂是小分子CCR5拮抗剂。在另一个实施方案中,所述小分子CCR5拮抗剂是口服施用的。
在本发明的方法中,可以在施用小分子CCR5拮抗剂之前或施用小分子CCR5拮抗剂之后,同时并行施用抗体。关于向受试者施用两种或多种试剂以治疗受试者,每种试剂可以在与每种其他试剂相同的治疗时期内施用给受试者。可以同时地,在相同或不同的组合物中或通过相同或不同的施药途径,共同施用所述试剂。备选地,每种试剂是通过与施用每种其他试剂不同的给药方案(例如,频率、途径和用量)进行施用的。例如,可以通过以两周为时间间隔的皮下注射,在一年的治疗时间周期内施用两种施用试剂中的第一种(例如,抗体),而在相同的一年周期内通过每次2次口服施用第二种施用试剂(例如,小分子)。因此,“并行施用”指在一个治疗周期内施用至少2种试剂。
本发明还提供用于治疗感染了HIV-1的受试者的方法,其包括向受试者施用治疗受试者有效量的(a)抗体,所述抗体(i)与受试者CD4+细胞表面上的CCR5受体结合,并(ii)抑制HIV-1与受试者的CCR5+CD4+细胞的融合,和(b)非抗体CCR5受体拮抗剂。
本发明还提供用于在受试者中抑制HIV-1相关的病症的发作或发展的方法,所述发作或发展的抑制受抑制受试者中HIV-1与CCR5+CD4+靶细胞的融合的影响,所述方法包括向受试者施用抑制受试者中HIV-1相关病症的发作或发展的有效量的(a)抗体,所述抗体(i)与受试者CD4+细胞表面上的CCR5受体结合,并(ii)抑制HIV-1与受试者的CCR5+CD4+细胞的融合,和(b)非抗体CCR5受体拮抗剂。
本发明进一步提供用于降低受试者感染HIV-1感染可能性的方法,所述方法包括向受试者施用降低受试者感染HIV-1感染可能性有效量的(a)抗体,所述抗体(i)与受试者CD4+细胞表面上的CCR5受体结合,并(ii)抑制HIV-1与受试者的CCR5+CD4+细胞的融合,和(b)非抗体CCR5受体拮抗剂。在一个实施方案中,将受试者暴露于HIV-1。在另一个实施方案中,受试者处于暴露于HIV-1的危险中。
本发明还涉及不同种类的与CCR5结合的化合物的组合对HIV-1融合于和侵入易感靶细胞的作用,所述化合物是抗CCR5mAb和非抗体CCR5拮抗剂。先前,利用不同HIV-1侵入抑制剂的组合证明了对靶细胞HIV-1感染的协同抑制。然而,现有研究未检验不同种类的靶向相同CCR5辅助受体抑制剂的组合。
特别地,本发明还提供用于治疗感染了HIV-1的受试者的方法,其包括向受试者施用治疗受试者有效量的(a)抗体,所述抗体(i)与受试者CD4+细胞表面上的CCR5受体结合,并(ii)抑制HIV-1与受试者的CCR5+CD4+细胞的融合,和(b)非抗体CCR5受体拮抗剂。
本发明进一步提供用于在受试者中抑制HIV-1相关的病症的发作或发展的方法,所述发作或发展的抑制受抑制受试者中HIV-1与CCR5+CD4+靶细胞的融合的影响,所述方法包括向受试者施用抑制受试者中HIV-1相关病症的发作或发展的有效量的(a)抗体,所述抗体(i)与受试者CD4+细胞表面上的CCR5受体结合,并(ii)抑制HIV-1与受试者的CCR5+CD4+细胞的融合,和(b)非抗体CCR5受体拮抗剂。
本发明进一步提供用于降低受试者感染HIV-1感染可能性的方法,所述方法包括向受试者施用降低受试者感染HIV-1感染可能性的有效量的(a)抗体,所述抗体(i)与受试者CD4+细胞表面上的CCR5受体结合,并(ii)抑制HIV-1与受试者的CCR5+CD4+细胞的融合,和(b)非抗体CCR5受体拮抗剂。一个实施方案中,将受试者暴露于HIV-1。在另一个实施方案中,受试者处于暴露于HIV-1的危险中。
本发明还提供加强(i)抗CCR5受体单克隆抗体或(ii)非抗体CCR5受体拮抗剂在治疗受试者体内HIV-1感染中的HIV-1抑制活性的方法,所述方法包括向受试者施用HIV-1抑制活性增强量的抗CCR5受体单克隆抗体和HIV-1抑制活性增强量的非抗体CCR5受体拮抗剂的组合,其中所述组合对抑制HIV-1感染产生协同作用,由此加强(i)抗CCR5受体单克隆抗体或(ii)非抗体CCR5受体拮抗剂的抑制活性。在一个实施方案中,由于该协同作用,非抗体CCR5受体拮抗剂导致抗CCR5受体单克隆抗体约4-10倍的剂量减少,且抗CCR5受体单克隆抗体导致非抗体CCR5受体拮抗剂约3-16倍的剂量减少。
在另一个实施方案中,所述方法包括HIV-1抑制活性加强量的一种或多种非抗体CCR5受体拮抗剂。在另一个实施方案中,所述方法包括HIV-1抑制活性加强量的一种或多种抗CCR5受体单克隆抗体。在又一个实施方案中,所述抗CCR5受体单克隆抗体和非抗体CCR5受体拮抗剂是并行施用于受试者的。
在一个实施方案中,所述单克隆抗体是由杂交瘤细胞系PA14(ATCC编号HB-12610)产生的PA14,或在与CCR5受体的结合中与单克隆抗体PA14竞争的抗体。在另一个实施方案中,所述单克隆抗体是人源化抗体PRO 140,或在与CCR5受体的结合中与PRO 140竞争的抗体,其中PRO140包括(i)两条轻链,每条轻链包含质粒pVK:HuPRO140-VK(ATCC保藏编号PTA-4097)的表达产物,和(ii)两条重链,每条重链包含质粒pVg4:HuPRO140HG2-VH(ATCC保藏编号PTA-4098)或质粒pVg4:HuPRO140(mut B+D+I)-VH(ATCC保藏编号PTA-4099)的表达产物。在另一个实施方案中,所述单克隆抗体是人源化抗体PRO 140。在又一个实施方案中,所述单克隆抗体是CCR5mAb004或2D7。
在一个实施方案中,非抗体CCR5受体拮抗剂是SCH-D,TAK-779,TAK-652,UK-427,857,RANTES,GW873140,或其组合。在另一个实施方案中,非抗体CCR5受体拮抗剂是在与CCR5受体的结合中与SCH-D竞争的小有机分子。在另一个实施方案中,非抗体CCR5受体拮抗剂是在与CCR5受体的结合中与UK-427,857竞争的小有机分子。在又一个实施方案中,非抗体CCR5受体拮抗剂是在与CCR5受体的结合中与TAK-779竞争的小有机分子。在一个实施方案中,非抗体CCR5受体拮抗剂是在与CCR5受体的结合中与TAK-652竞争的小有机分子。在另一个实施方案中,非抗体CCR5受体拮抗剂是在与CCR5受体的结合中与GW873140竞争的小有机分子。
在本文所述任意方法的实施方案中,抗CCR5抗体是单克隆抗体。在另一个实施方案中,所述抗体是多克隆抗体。在另一个实施方案中,所述抗体是人源化抗体。在另一个实施方案中,所述抗体是人抗体。在另外的实施方案中,所述抗体是嵌合抗体。在一个实施方案中,所述抗体是由人类基因组科学(Human Genome Sciences)产生的抗CCR5人抗体CCR5mAb004。
鼠杂交瘤分泌的单克隆抗体PA8、PA9、PA10、PA11、PA12和PA14于1998年12月2日保藏于美国弗吉尼亚州马纳萨斯大学大道10801号(20110-2209)的美国典型培养物收藏中心(American Type CultureCollection),ATCC编号分别为:ATCC编号HB-12605(PA8)、ATCC编号HB-12606(PA9)、ATCC编号HB-12607(PA10)、ATCC编号HB-12608(P11)、ATCC编号HB-12609(PA12)和ATCC编号HB-12610(PA14),保藏遵循且满足布达佩斯条约(Budapest Treaty)关于出于专利程序目的的微生物保藏物的国际公认的要求。
在本发明另一个实施方案中,所述单克隆抗体是由杂交瘤细胞系PA14(ATCC编号HB-12610)产生的PA14,或与单克隆抗体PA14和CCR5受体的结合相竞争的抗体。在另一个实施方案中,所述单克隆抗体是与表位相结合的抗体,所述表位与单克隆抗体PA14所结合的表位相同。当与相同表位的结合发生时,引起竞争性抑制。
在另一个实施方案中,所述单克隆抗体选自由下列各项组成的组:由杂交瘤PA14(ATCC编号HB-12610)产生的PA14,由杂交瘤PA8(ATCC编号HB-12605)产生的PA8,由杂交瘤PA9(ATCC编号HB-12606)产生的PA9,由杂交瘤PA10(ATCC编号HB-12607)产生的PA10,由杂交瘤PA11(ATCC编号HB-12608)产生的PA11,由杂交瘤PA12(ATCC编号HB-12609)产生的PA12,和2D7(Wu等,1997)。在另一个实施方案中,所述单克隆抗体是PA14。
本领域中的技术人员应该了解如何制造本主题发明的人源化抗体。多种出版物也描述了如何制造人源化抗体,将其中的多个出版物在此并入本申请作为参考。例如,美国专利号4,816,567所述的方法包括嵌合抗体的生产,所述嵌合抗体具有一个抗体的可变区和另一个抗体的恒定区。
美国专利号5,225,539描述了另一种生产人源化抗体的方法。该专利描述了应用重组DNA技术,从而生产人源化抗体,其中一个免疫球蛋白可变区的CDR被来自具有不同特异性的免疫球蛋白的CDR替代,由此该人源化抗体会识别所需的目标,但不会显著地被人类受试者的免疫系统识别。特别地,使用位点定向的诱变,将CDR嫁接到构架上。
在美国专利号5,585,089和5,693,761,以及PCT国际公开号WO90/07861中描述了人源化抗体的其他方法,该文献描述了用于生产人源化免疫球蛋白的方法。这些人源化的免疫球蛋白具有一个或多个CDR和来自供体免疫球蛋白的可能附加的氨基酸和来自接受的人免疫球蛋白的构架区。这些专利描述了用于增加抗体对所需抗原的亲和力的方法。将所述构架中一些氨基酸选择为与供体中,而非接受体中那些位置的氨基酸相同。特别地,这些专利描述人源化抗体的制备,所述人源化抗体通过将小鼠单克隆抗体的CDR结合于人免疫球蛋白构架和恒定区,与受体结合。可以选择人构架区,从而最大化与小鼠序列的同源性。可以使用计算机模型来识别构架区中的氨基酸,其很可能与CDR或特异性抗原相互作用,并且然后可以在这些位置使用小鼠氨基酸,从而创建人源化的抗体。以上方法仅仅举例说明了一些本领域中技术人员可以使用的制造人源化抗体的方法。
本领域中的技术人员还熟知用于制造完全人抗体的方法。例如,可以通过免疫动物制备完全人单克隆抗体,所述动物经大部分人免疫球蛋白重和轻链基因座转基因。见例如美国专利号5,591,669,5,545,806,5,545,807,6,150,584,及其中引用的参考文献,将其内容并入本文作为参考。这些转基因动物已经被遗传改良了,因此在生产内源(例如,鼠科)抗体中存在着功能缺失。进一步改良这些动物,以使其包含全部或部分人种系免疫球蛋白基因座,由此这些动物的免疫化将导致针对兴趣抗原的完全人抗体的产生。这些动物(例如,Xeno(Abgenix),HuMAb-(Medarex/GenPharm))免疫化后,可以按照标准杂交瘤技术制备单克隆抗体。这些单克隆抗体将具有人免疫球蛋白氨基酸序列,且因此当向人进行施用时,不会激发人抗小鼠抗体(HAMA)的应答。
还存在用于生产人抗体的体外方法。这些包括噬菌体显示技术(美国专利号5,565,332和5,573,905)和人B细胞的体外刺激(美国专利号5,229,275和5,567,610)。将这些专利的内容并入本文作为参考。
将编码人源化PRO 140抗体的重链和轻链的核酸保藏在ATCC。特别地,按照并满足布达佩斯条约的要求,在2002年2月22日将质粒pVK-HuPRO140,pVg4-HuPRO140(mut B+D+I)和pVg4-HuPRO140 HG2分别保藏在ATCC,ATCC编号分别为:PTA 4097,PTA 4099和PTA 4098,其中ATCC位于美国VA的马纳萨斯,20108。
在本方法优选的实施方案中,所述单克隆抗体是人源化抗体PRO 140或与PRO 140竞争结合于CCR5受体的抗体,其中PRO 140包括(i)两条轻链,每条轻链包含质粒pVK:HuPRO 140-VK(ATCC保藏编号PTA-4097)的表达产物,和(ii)两条重链,每条重链包含质粒pVg4:HuPRO140 HG2-VH(ATCC保藏编号PTA-4098)或质粒pVg4:HuPRO140(mut B+D+I)-VH(ATCC保藏编号PTA-4099)的表达产物。在另一个实施方案中,所述单克隆抗体是人源化或人抗体,其结合的表位与抗体PRO 140结合的表位相同。在另一个实施方案中,所述单克隆抗体是人源化抗体RPO 140。在另一个实施方案中,所述单克隆抗体是人抗体CCR5mAb004(Roschke等,2004;HGS新闻稿,2004;2005)。
在本文所述方法的一个实施方案中,所述抗体部分包括抗体的轻链。在另一个实施方案中,所述抗体部分包括抗体的重链。在另一个实施方案中,所述抗体部分包括抗体的Fab部分。在另一个实施方案中,所述抗体部分包括抗体的F(ab′)2部分。在另外的实施方案中,所述抗体部分包括抗体的Fd部分。在另一个实施方案中,所述抗体部分包括抗体的Fv部分。在另一个实施方案中,所述抗体部分包括抗体的可变区。在另一个实施方案中,所述抗体部分包括一个或多个抗体的CDR结构域。在又一个实施方案中,所述抗体部分包括6个抗体的CDR结构域。
在本方法的一个实施方案中,向受试者多次施用所述抗体,且每次施用抗体向受试者递送0.01mg/kg体重-50mg/kg体重的抗体。在另一个实施方案中,每次施用抗体向受试者递送0.05mg/kg体重-25mg/kg体重的抗体。在另一个实施方案中,每次施用抗体向受试者递送0.1mg/kg体重-10mg/kg体重的抗体。在另一个实施方案中,每次施用抗体向受试者递送0.5mg/kg体重-5mg/kg体重的抗体。在另一个实施方案中,每次施用抗体向受试者递送1mg/kg体重-3mg/kg体重的抗体。在优选的实施方案中,每次施用抗体向受试者递送约2mg/kg体重的抗体。
在一个实施方案中,多次施用所述抗体,且通过小于1周的时间间隔将抗体的首次施用与抗体的后继施用分开。在另一个实施方案中,通过至少1周的时间间隔将抗体的首次施用与抗体的后继施用分开。在另一个实施方案中,通过1周的时间间隔将抗体的首次施用与抗体的后继施用分开。在另一个实施方案中,通过2周-4周的时间间隔将抗体的首次施用与抗体的后继施用分开。在优选的实施方案中,通过2周的时间间隔将抗体的首次施用与抗体的后继施用分开。在另一个实施方案中,通过4周的时间间隔将抗体的首次施用与抗体的后继施用分开。在又一个实施方案中,多次施用所述抗体,且通过至少一个月的时间间隔将抗体的首次施用与抗体的后继施用分开。
在另一个实施方案中,通过静脉内灌输向受试者施用所述抗体。在优选的实施方案中,通过皮下注射向受试者施用所述抗体。在另一个实施方案中,通过肌肉内注射向受试者施用所述抗体。
在本方法的一个实施方案中,所述非抗体CCR5受体拮抗剂是小有机分子。在另一个实施方案中,所述CCR5受体拮抗剂选自由下列各项组成的组:SCH-D,UK-427,857,TAK-779,TAK-652,GW873140和RANTES。在另一个实施方案中,所述CCR5受体拮抗剂是与SCH-D竞争同CCR5受体结合的试剂。在另一个实施方案中,所述CCR5受体拮抗剂是与UK-427,857竞争同CCR5受体结合的试剂。在另一个实施方案中,所述CCR5受体拮抗剂是与TAK-779竞争同CCR5受体结合的试剂。在又一个实施方案中,所述CCR5受体拮抗剂是与TAK-652竞争同CCR5受体的结合的试剂。在另一个实施方案中,所述CCR5受体拮抗剂是与GW873140竞争同CCR5受体结合的试剂。
在本文所述方法的另外实施方案中,多次施用所述CCR5受体拮抗剂,且每次施用CCR5受体拮抗剂向受试者递送0.5mg-2,500mg的所述拮抗剂。在另一个实施方案中,每次施用CCR5受体拮抗剂向受试者递送5mg-1,250mg的所述拮抗剂。在又一个实施方案中,每次施用CCR5受体拮抗剂向受试者递送5mg-15mg的所述拮抗剂。在另一个实施方案中,每次施用CCR5受体拮抗剂向受试者递送50mg-1,250mg的所述拮抗剂。在另一个实施方案中,每次施用CCR5受体拮抗剂向受试者递送200mg-800mg的所述拮抗剂。在另一个实施方案中,每次施用CCR5受体拮抗剂递送300mg-600mg的所述拮抗剂。
由于它们的快速清除,小分子CCR5受体拮抗剂需要至少每日或每日2次给药,从而维持对病毒的选择压力。表3总结了对目前经历临床试验的多种小分子CCR5拮抗剂使用的给药方案。在本方法的一个实施方案中,至少每日1次向受试者口服施用CCR5受体拮抗剂。在另一个实施方案中,每日1次或2次向受试者口服施用CCR5受体拮抗剂。在另一个实施方案中,每日3次或较少次(fewer times)向受试者口服施用CCR5受体拮抗剂。
表3.经历临床试验的小分子CCR5受体拮抗剂的给药方案
化合物 | 剂量a | 临床试验 |
SCH-D | 每日5-15mg | 阶段II |
UK-427,857 | 每日或每日2次300mg | 阶段II和III |
GW873140 | 每日1次50-1200mg,或每日或每日2次200-800mg | 阶段II |
在www.clinicaltrials.gov网站指出了CCR5拮抗剂的剂量,该网站由国家过敏症和传染病研究所(NIAID)主办。GW873140的剂量信息获自Demarest等(2004)。
另外,本方法的一个实施方案进一步包括向受试者施用至少一种抗HIV-1,抗逆转录病毒试剂。由于在1987年批准了核苷类似物反转录酶抑制剂(NRTI)AZT(齐多夫定),HIV-1医疗设备发展为至少21种药物和前药,其代表了4种治疗种类:8种NRTI,3种非核苷反转录酶抑制剂(NNRTIs),9种蛋白酶抑制剂(PIs)和1种融合抑制剂(FI)(见表4)。在另一个实施方案中,抗逆转录病毒试剂是非核苷反转录酶抑制剂(NNRTI),核苷反转录酶抑制剂(NRTI),蛋白酶抑制剂(PI),融合抑制剂,或其任意组合。在另一个实施方案中,所述至少一种抗逆转录病毒试剂是表4中所列的试剂中的一种或这些试剂的任意组合。为了更有效的治疗,以组合的形式(所述组合及给药方案见表5)销售多种抗逆转录病毒试剂。在本方法的实施方案中,以表5中所示的量向受试者施用抗逆转录病毒试剂。在优选的实施方案中,抗逆转录病毒试剂是NNRTI或PI。
在本发明的另一个实施方案中,受试者是首次用于治疗的(treatment-naive),即,受试者以前没经历过任何抗HIV-1、抗逆转录病毒试剂的治疗。在优选的实施方案中,受试者是经历过治疗的(treatment-experienced),即,受试者经历过和/或正在经历一种或多种抗HIV-1、抗逆转录病毒试剂,如一种或多种表4中所列试剂的治疗。在优选的实施方案中,本方法用于治疗HIV-1感染的组合治疗程序中,其中将抗CCR5mAb和非抗体CCR5拮抗剂与一种或多种抗逆转录病毒试剂的组合施用于需要该治疗的受试者。
表4.批准的HIV-1抑制剂
表5.销售的HIV-1抗病毒试剂的给药方案
*未调节用于组合治疗法的成人剂量;施药途径:除另外指明外,均为po
**在单一制剂中施用的组合治疗法
图例:
qd=每日一次
bid=每日2次
tid=每日3次
po=口服施药
sc=皮下施药
本发明进一步提供一种物质组合物,其包括(a)单克隆抗体(例如,PRO140),其(i)与CCR5受体结合并(ii)抑制HIV-1与CCR5+CD4+细胞的融合,和(b)非抗体CCR5受体拮抗剂(例如,SCH-D,UK-427,857,TAK-779,TAK-652,GW873140和RANTES中的任一项)。所述组合物可以进一步包括药用载体。本发明还提供用于确定就抑制HIV-1与CCR5+CD4+细胞的融合而言,单克隆抗体(例如,PRO 140)是否与非抗体CCR5受体拮抗剂协同作用的方法,其中所述单克隆抗体(例如,PRO 140)(i)与CCR5受体结合并(ii)抑制HIV-1与CCR5+CD4+细胞的融合,所述方法包括按照以下具体的试验方法确定存在或缺乏所述协同作用。最后,本发明提供用于实施本方法的试剂盒,其在分离的隔室中且优选地以容易施用的形式包括(a)单克隆抗体(例如,PRO 140),其(i)与CCR5受体结合并(ii)抑制HIV-1与CCR5+CD4+细胞的融合,和(b)非抗体CCR5受体拮抗剂(例如,SCH-D,UK-427,857,TAK-779,TAK-652,GW873140和RANTES中的任一项)。所述抗体和拮抗剂各自优选地与药用载体混和。
阐明以下实验细节以帮助理解本公开内容的主题,但不意欲且不应该解释为以任何方式限制其后的权利要求。
实验细节
部分I
材料和方法
化合物和mAbs
通过利用增补了2mM L-谷氨酰胺的杂交瘤无血清培养基(Invitrogen,Carlsbad,CA)在Sp2/0细胞中表达来制备PRO 140。利用5.0μm Depth过滤器(Sartorius,Goettingen,德国)净化大量mAb,随后经过0.2μm消毒等级的过滤器(Sartorius)。通过先经过亲和柱(MabSelect蛋白质A柱,Amersham,Piscataway,NJ),再通过离子交换色谱法(SP琼脂糖阳离子交换树脂,Amersham)纯化mAb。利用ViresolveTM 10 Opticap NFP胶囊(Millipore,Billerica,MA)和随后的0.2μm过滤器纳滤PRO 140,并经过一次性TFF盒(Millipore)浓缩/diafilteredPRO 140。然后,经过羟磷灰石柱(Bio-Rad,Hercules,CA)精制该mAb,并在磷酸盐缓冲液中浓缩到10mg/ml,并且在使用前储存于-70℃或更低的温度。
RANTES购自R&D系统(R&D Systems)(Minneapolis,MN)。抗CCR5mAb 2D7购自BD生物科技(BD Biosciences)(Cat.#555993),且抗CCR5mAb CTC5购自R&D系统(Cat.#FAB 1802P)。
RET测定
先前已经详细地描述了HIV-1RET测定(Litwin等,1996)。简要地,在含有10%胎牛血清(FBS;HyClone,Logan,UT)的DMEM标记培养基(DMEM;Invitrogen,Carlsbad,CA)中将荧光素十八烷酯(F18;分子探针(Molecular Probes),Eugene,OR;5mg/ml乙醇中)稀释为1∶800,并将其调节到A506为0.34±10%。在标记的培养基中将十八烷若丹明B氯化物(R18;分子探针(Molecular Probes);10mg/ml乙醇中)稀释为1∶2050,并调节到A565为0.52±10%。通过加入细胞将两种染料在T75-cm2烧瓶中进一步稀释2倍。在含有F18和R18的培养基中分别过夜培养HeLa-EnvJRFL和CEMNKR-CCR5细胞。下一天,从HeLa-EnvJRFL细胞移除培养基,添加10ml0.5mM EDTA,并且在37℃培养5分钟。移除EDTA,将烧瓶放回培养箱中再放置5分钟,随后敲击烧瓶从而移除细胞。将10ml含有15%FBS的PBS加入到该烧瓶中,并将其内容物转移到50ml的圆锥离心管中。将混悬CEM NKR-CCR5细胞直接加入到单独的50ml圆锥离心管中。将两个细胞系在300Xg离心5分钟。丢弃上清液,并将细胞重新悬浮在10mlPBS-/15%FBS中。重复离心/洗涤步骤两次,其后计数细胞并将浓度调节为1.5×106细胞/ml。将10μl每种细胞类型(15,000个细胞)接种到384孔板的孔中。其后立即加入抑制剂化合物,从而使最终孔体积达到40μl,并且在37℃下培养该板4小时。在连续稀释的范围内单独地和以固定摩尔比或质量比的组合形式测试化合物。然后在荧光素板读出器(Victor2,PerkinElmer,波士顿,MA)上利用表6中所示的激发/放射过滤组合对该板进行读数。
表6.用于RET测定的激发/放射过滤组合
在减去背景(空白)读数后,按照以下公式计算“%RET”:
%RET=100×[(A3-(A1×F溢出)-(A2×R溢出))/A2]
其中,F溢出=单独的HeLa细胞,扫描3/扫描1;
R溢出=单独的CEM细胞,扫描3/扫描2;
A1=HeLa和CEM细胞组合的扫描1值;
A2=HeLa和CEM细胞组合的扫描2值;和
A3=HeLa和CEM细胞组合的扫描3值。
按照以下公式计算“%抑制”:
%抑制=100×[(最大%RET-样品孔%RET)/(最大%RET-最小%RET)]
其中:最大%RET=不加入抑制剂的条件下,HeLa和CEM细胞组合的平均%RET值;和
最小%RET=500ng/ml的Leu-3a mAb(抗体,其靶向CD4并在RET测定中及该浓度下完全阻断融合)存在下,HeLa和CEM细胞组合的平均%RET值。
通过将抑制数据和非线性、四参数、可变斜率方程相匹配,确定50%抑制(IC50)值(GraphPad Prism,4.02;GraphPad软件,圣地亚哥,CA)。为了曲线匹配,将上限和下限抑制值分别限制为100%和0%。
PBMCs的制备
为了这些研究,利用单核细胞/巨噬细胞向性HIV-1克隆JRFL(HIV-1JRFL),在活化的外周血液单核细胞(PBMCs)中测量真正HIV-1复制。
通过在Ficoll剃度上的离心从4个单独的供体(Leukopacks)中分离PBMC。利用RosetteSep CD8消除混合物(#15663,干细胞研究(StemCellResearch),温哥华,BC)消除CD8细胞。将细胞稀释到4×106/ml,并将其等分地加入到3个T175-cm2烧瓶中,然后通过添加以下一种培养基进行刺激:IL-2培养基[RPMI 1640(#10-040-CV,Cellgro,Herndon,VA),10%FBS(#35-010-CV),2mM L-谷氨酰胺(#25-005-CI),100U/ml IL-2(Sigma,St.Louis,MO)];PHA 5培养基:[含有5ug/ml植物血球凝集素PHA-P(PHA)的IL-2培养基(#L8754,Sigma,St.Louis,MO),经过滤的];或PHA0.5培养基:[含有0.5ug/ml PHA的IL-2培养基,经过滤的]。每个烧瓶接受总共50-150ml的培养基。将烧瓶在37℃培养3天,随后在用于感染测定前汇集该内容物。
病毒滴定
在活化的PBMC(1.4×105PBMC/孔)上,一式四份地测试病毒的连续稀释液。为了病毒滴定,利用了滴定培养基[含有100IU/ml青霉素/链霉素的IL-2培养基(#30-002-CI,Cellgro)]。将50μl稀释的病毒加入到100μlPBMC中,所述PBMC装于平底的、经组织培养基处理的96孔板(VWR#29442-054,Corning,Corning,NY)中,并将该板培养于37℃、湿润的、含5%CO2的培养箱中。7天后,从每个孔中移出50μl,并利用p24抗原ELISA(Perkin Elmer,波士顿,MA)测试其病毒水平。利用Reed和Muench的方法确定病毒滴定度(表11,见下)。
中和测定
将被刺激的PBMC以1.4×105细胞/孔的密度接种到96孔平底板的孔中。将病毒稀释到2,000TCID50/ml,并在加入到细胞板前,在37℃与化合物的连续0.5log10稀释液混和1小时。最终添加的病毒量/孔是100TCID50。只要是在测试小分子抑制剂时,本测定中的最终DMSO浓度总是0.5%。在37℃培养该板5天,在那时移出上清液的等分试剂以进行p24抗原ELISA。如果对照孔(无抑制剂的病毒)表现出低p24抗原水平,则用滴定培养基将该板恢复到完整体积,并另外培养24小时。
数据分析
通过绘制p24抗原产量的百分比抑制(从所有数据点减去背景值后)对应于log10药物浓度,显示出中和活性。按照[1-(药物存在时的p24水平/药物缺乏时的p24水平)]×100获得百分比抑制。通过将抑制数据和非线性、四参数、可变斜率方程相匹配,确定IC50值(GraphPad Prism,4.02;GraphPad软件,圣地亚哥,CA)。为了曲线匹配,将上限和下限抑制值分别限制为100%和0%。
阶段1a临床研究
将个体在5个对象(4个活性的和1个安慰剂)的各个连续、剂量上升组中进行治疗,并在治疗后被评估长达120天。向一群健康的,即未感染HIV-1的男性志愿者施用PRO 140的单次静脉内灌输(0.1,0.5,2.0和5.0mg/kg体重),所述志愿者在体检、病史和ECG上无异常发现且年龄为19-50岁。安全评估由监测以下各项组成:生命标志(血压,脉搏,体温,等);血液学(血红蛋白,血细胞比容,白细胞,血小板,等);血清化学(AST/ALT,碱性磷酸酶,BUN,肌酸酐,等);尿分析(pH,特殊重力,蛋白质,葡萄糖,白细胞,等);和ECGs(12导程)。
测量PRO 140对CCR5细胞的包被
将全血液样本分别与指出的藻红蛋白标记的抗CCR5抗体或适当的同种型对照抗体组合。利用ImmunoPrep试剂系统(Beckman Coulter)溶解红细胞并稳定白细胞,在TQ PrepTM流式细胞仪工作站(Beckman Coulter)上分析该细胞。将数据表达为CCR5细胞相对于该分析中所选定的所有细胞的百分比。CTC5是不与PRO 140竞争的抗CCR5抗体。2D7是与PRO 140竞争的抗CCR5抗体。
测量PRO 140的血清浓度
适当地稀释血清,并与L1.2-CCR5细胞组合,所述L1.2-CCR5细胞是经改造从而稳定表达人CCR5的小鼠前B淋巴瘤细胞。为了生成标准曲线,在10%正常人血清(NHS)中的浓度范围0.062-4.0μg/ml内,平行地测试了PRO 140标准物。将不含PRO 140的10%NHS作为阴性对照进行分析。培养测试样品后,洗涤细胞,并将其与对抗人IgG4的FITC标记绵羊抗体(The Binding Site Limited,Cat.#AF009)组合。再次洗涤并利用流式细胞仪分析细胞。通过比较测试样品的培养基荧光强度(MFI)和标准曲线的MFI值,确定了PRO 140的浓度。
确定血浆RANTES浓度
该测定使用了QuantikineTM人RANTES免疫测定试剂盒(R&D系统(R&D Systems),明尼阿波利斯,MN)。简要地,将血小板不足的血浆收集在CTAD/EDTA管中,并储存在-20℃。将测试样品和RANTES标准物加入到微滴定板中,向所述微滴定板预涂了对抗RANTES的小鼠单克隆抗体。培养后,洗涤该板,并使其与抗RANTES的多克隆抗体接触,所述多克隆抗体是与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的。在为了进行比色检测添加四甲基联苯胺底物前,再次洗涤该板。该测定量化的下限是415pgRANTES/ml血浆。
结果和讨论
PRO 140是为HIV-1治疗而开发的人源化IgG4,κ抗CCR5mAb。已经显示出该抗体在体外广泛有效地抑制CCR5介导的HIV-1和靶细胞的融合。PRO 140还高度活跃于治疗性hu-PBL-SCID小鼠模型中,且可以从健康人类受试者的阶段1a临床研究中获得初步数据。
PRO 140的体外抗病毒活性
如本方法所述,针对4种原代R5 HIV-1分离株对鼠科和人源化PRO140进行了测试。图1显示PRO 140具有有效的体外抗病毒活性,从而中和多种具有IC90为3-4μg/ml的原代R5毒株。来源于鼠科mAb,即PA14的PRO 140表现出与该鼠科mAb,即PA14相似的抗病毒活性。
来自阶段1a临床研究的初步数据
阶段1a研究的首要目的是评估以单一剂量给药的PRO 140在健康男性受试者的上升剂量组方案中的安全性和耐受力。其次要目的是(1)为了获得关于静脉内施用的PRO 140的药物动力学信息,和(2)为了获得PRO140对CCR5+细胞血液水平和趋化因子的作用的信息。
PRO140的药物动力学
用剂量水平为0.1,0.5,2.0和5.0mg/kg的单次静脉内灌输PRO 140对健康男性志愿者进行治疗。PRO 140和安慰剂通常可以得到良好的耐受,表现为不具有ECG的显著变化且没有剂量限制性毒性。
治疗后收集、冷藏并分析血清的PRO 140水平。峰血清浓度在0.1mg/kg时为3mg/ml;在0.5mg/kg时为12mg/ml。血清浓度在0.1mg/kg时保持可检测到(>400ng/ml)的时间为长达5天,在0.5mg/kg时为21天,在单次2mg/kg注射后为超过60天(图7)。PRO 140的血清浓度与剂量水平按比例地增高,且清除率与其他人源化mAb的清除率相似。利用非间隔模型,使用WinNonLin(PharSight Corporation,Mountain View,CA)确定药物动力学(PK)度量标准,且确定了PRO 140的最终血清半衰期为10-12天。正如所预料地,没有受试者将抗体发育为人源化PRO 140。CCR5淋巴细胞通过PRO 140的包被和非衰竭状态
用单次静脉内灌输剂量水平为2mg/kg的PRO 140治疗健康男性志愿者(n=4)。治疗后长达60天的时期内,在图6中所指出的时间收集血液,并分析其CCR5淋巴细胞水平。
用PRO 140治疗后,在通过CTC5结合测量时,不存在CCR5淋巴细胞总数的减少;然而,抗体2D7的结合显著减少了(图6)。同种型对照抗体的背景结合没有改变。由于PRO 140的存在没有减少CTC5的结合,CTC5-PE值是循环CCR5淋巴细胞总数的量度标准。由于2D7与PRO 140竞争,2D7-PE值反映没有包被PRO 140的CCR5淋巴细胞的数量。
数据显示在细胞不减少的条件下,单一2mg/kg剂量的PRO 140在两周内有效地包被CCR5淋巴细胞,且细胞在>4周内保持部分包被。另外,在用5mg/kg PRO 140治疗的患者中,CCR5的包被持续得更久。该数据显示单一5mg/kg剂量的PRO 140在细胞不减少的条件下有效地包被CCR5淋巴细胞,且该细胞在>60天内维持部分的包被(图13)。由于CCR5的包被是PRO 140抑制HIV的机制,可以预料受HIV感染的个体中的病毒负荷以相似的时间方式减少。
PRO 140对血浆趋化因子水平的作用
用单一静脉内灌输0.1mg/kg PRO 140(组1),0.5mg/kg PRO 140(组2)或匹配的安慰剂治疗健康男性志愿者。治疗后,在指出的时间收集血浆,对其进行冷藏,并分析其RANTES水平,所述RANTES是用作CCR5天然配体的CC趋化因子。在给药前和给药后长达28天时,利用ELISA测量血小板减少的血浆中的RANTES水平。如图8中所示,PRO 140治疗后,不存在RANTES水平的显著变化(所有时刻P>0.14)。这些数据与PRO 140不拮抗CCR5功能的体外发现相一致。该发现说明PRO 140对被治疗患者中CCR5介导的免疫功能没有不适当的作用。
本文所述结果显示除了在预临床测试中PRO 140在不引起CCR5拮抗或其他免疫副作用的条件下广泛有效地抑制CCR5介导的HIV-1侵入以外,还说明了在初步结果中的有利的耐受力、PK和免疫特征,所述初步结果来自健康志愿者中正在进行的阶段1a研究。因此,在许多方面,PRO140为抗HIV-1治疗提供新型且有吸引力的产物特征。
而且,抗CCR5mAb的活性从根本上区别于小分子CCR5拮抗剂的活性,但又与之互补(见表2),所述小分子CCR5拮抗剂目前也正在经历人临床试验。近期,PRO 140在抑制CCR5介导的HIV-1与靶细胞的融合中显示出与非抗体CCR5拮抗剂的协同作用。因此,包括施用抗CCR5mAb和非抗体CCR5拮抗剂的组合治疗可以提供用于预防和治疗HIV-1感染的强有效的新方法。
部分II
实施例1:在荧光RET测定中组合测试PRO 140和HIV-1侵入抑制剂
材料和方法
化合物和mAb
通过利用增补了2mM L-谷氨酰胺的杂交瘤无血清培养基(Invitrogen,Carlsbad,CA)在Sp2/0细胞中表达来制备PRO 140。利用5.0μm Depth过滤器(Sartorius,Goettingen,德国)净化大量mAb,随后经过0.2μm消毒等级的过滤器(Sartorius)。通过先经过亲和柱(MabSelect蛋白质A柱,Amersham,Piscataway,NJ),再通过离子交换色谱法(SP琼脂糖阳离子交换树脂,Amersham)纯化mAb。利用ViresolveTM 10 Opticap NFP胶囊(Millipore,Billerica,MA)和随后的0.2μm过滤器纳滤PRO 140,并经过一次性TFF盒(Millipore)浓缩/diafiltered PRO 140。然后,经过羟磷灰石柱(Bio-Rad,Hercules,CA)精制该mAb,并在磷酸盐缓冲液中浓缩到10mg/ml,且于使用前储存在-70℃或更低的温度。
通过商业来源制备了SCH-D(Schering Plough;Tagat等,2004),TAK-779(Takeda制药;Shiraishi等,2000),UK-427,857(辉瑞;Wood和Armour,2005),和BMS378806(百时美施贵宝(Bristol-Myers Squibb);Lin等,2003)。
SCH-D具有以下结构:
SCH-D(也称为SCH-417690):1-[(4,6-二甲基-5-嘧啶基)羰基]-4-[4-[2-甲氧基-1(R)-4-(三氟甲基)苯基]乙基-3(S)-甲基-1-哌嗪基]-4-甲基哌啶嗪(Schering-Plough)。
按照Tagat等(2004)中所述程序合成SCH-D,并表示在图1中。
TAK-779具有以下结构:
按照Shiraishi等(2000)中所述程序合成TAK-779,并表示在图2中。
TAK-652具有以下结构:
UK-427,857具有以下结构:
UK-427,857:(辉瑞)
按照PCT国际公开号中WO 01/90106所述程序合成UK-427,857,并表示在图3中。
BMS378806具有以下结构:
BMS378806:(R)-N-(苯甲酰)-3-甲基-N′-[(4-甲氧基-7-吖吲哚-3-基)-氧乙酰基]-哌嗪(百时美施贵宝)
按照美国专利号6,476,034中所述程序合成它(化合物17a)。
从商业来源购买奈韦拉平(勃林格殷格翰(Boehringer Ingelheim;Merluzzi等,1990)和atazanavir(百时美施贵宝;Robinson等,2000)。在中国仓鼠卵巢细胞中表达PRO 542,并如前所述对其进行纯化(Allaway等,1995)。通过固相芴基甲氧羰基化学合成,通过反相色谱法纯化T-20并通过如前所述的HPLC和质谱法(Nagashima等,2001)分析其纯度和尺寸。AZT购自Sigma化学品(Sigma Chemicals)(St.Louis,Mo)。RANTES购自R&D系统(R&D Systems)(Minneapolis,MN)。抗CCR5 mAb 2D7购自Pharmingen(圣地亚哥,CA),及抗CD4 mAb Leu-3A购自Becton Dickinson(Franklin Lakes,NJ)。
为了测试,将小分子化合物溶解于二甲亚砜(DMSO)中,以达到10mM,然后在DMSO中稀释为200X最终浓度,从而在抗病毒的测定中使用。在DMSO中实施小分子的连续稀释。在培养基中实施后继稀释,从而获得测定中的最终DMSO浓度为0.5%。在缺乏DMSO的条件下,将肽和mAb稀释于PBS中。典型地,RET测定中的抑制剂浓度包括11种3倍稀释液,所述3倍稀释液在200nM-3.0pM的范围内变化。
细胞制备
如所述,改造HeLa细胞,从而表达来自巨噬细胞向性原代分离株JRFL的HIV-1 gp120/gp41(HeLa-EnvJRFL;Litwin等,1996)。简要地,从质粒pMA243中切离HIV-1LAI Env基因(Dragic等,1992),并插入HIV-1JRFL Env基因。从质粒pUCFL112-1扩增HIV-1JRFL Env基因(Koyanagi等,1987)。通过标准方法测序所产生的质粒JR-FL-pMA243,并利用脂转染法(GibcoBRL/Invitrogen,Carlsbad,CA)将其转染到HeLa细胞中。将HeLa-En vJRFL转染子在氨甲蝶呤(Sigma,St.Louis,MO)中选择,并通过限制稀释克隆两次。转导的人T细胞白血病品系CEM NKR-CCR5细胞获自NIHAIDS研究和参考程序(NIH AIDS Research and Reference Program)(Cat.No.458)。
RET测定
先前已经详细描述了HIV-1RET测定(Litwin等,1996)。简要地,在含有10%胎牛血清(FBS;HyClone,Logan,UT)的DMEM标记培养基(DMEM;Invitrogen,Carlsbad,CA)中将荧光素十八烷酯(F18;分子探针(Molecular Probes),Eugene,OR;5mg/ml乙醇中)稀释为1∶800,并将其调节到A506为0.34±10%。在标记的培养基中将十八烷若丹明B氯化物(R18;分子探针(Molecular Probes);10mg/ml乙醇中)稀释为1∶2050,并调节到A565为0.52±10%。通过加入细胞,将两种染料在T75-cm2烧瓶中进一步稀释2倍。在含有F18和R18的培养基中分别过夜培养HeLa-EnvJRFL和CEMNKR-CCR5细胞。下一天,从HeLa-EnvJRFL细胞移除培养基,添加10ml0.5mM EDTA,并且在37℃培养5分钟。移除EDTA,将该烧瓶放回培养箱中再放置5分钟,随后敲击烧瓶从而移除细胞。将10ml含有15%FBS的PBS加入到该烧瓶中,并将其内容物转移到50ml的圆锥离心管中。将混悬CEM NKR-CCR5细胞直接加入到单独的50ml圆锥离心管中。将两个细胞系在300xg下离心5分钟。丢弃上清液,并将细胞重新悬浮在10mlPBS-/15%FBS中。重复离心/洗涤步骤两次,其后计数细胞并将浓度调节为1.5×106细胞/ml。将10μl每种细胞类型(15,000个细胞)接种到384孔板的孔中。其后立即加入抑制剂化合物,从而使最终孔体积达到40μl,并且在37℃下培养该板4小时。在连续稀释的范围内单独地和以固定摩尔比或质量比的组合形式测试化合物。然后在荧光素板读出器(Victor2,PerkinElmer,波士顿,MA)上利用表6中所示的激发/放射过滤组合对该板进行读数。
表6.用于RET测定的激发/放射过滤组合
在减去背景(空白)读数后,按照以下公式计算“%RET”:
%RET=100×[(A3-(A1×F溢出)-(A2×R溢出))/A2]
其中,F溢出=单独的HeLa细胞,扫描3/扫描1;
R溢出=单独的CEM细胞,扫描3/扫描2;
A1=HeLa和CEM细胞组合的扫描1值;
A2=HeLa和CEM细胞组合的扫描2值;和
A3=HeLa和CEM细胞组合的扫描3值。
按照以下公式计算“%抑制”:
%抑制=100×[(最大%RET-样品孔%RET)/(最大%RET-最小%RET)]
其中:最大%RET=不加入抑制剂的条件下,HeLa和CEM细胞组合的平均%RET值;和
最小%RET=500ng/ml的Leu-3a mAb(抗体,其靶向CD4并在RET测定中在该浓度下完全阻断融合)存在下,HeLa和CEM细胞组合的平均%RET值。
通过将抑制数据和非线性、四参数、可变斜率方程相匹配,确定50%的抑制(IC50)值(GraphPad Prism,4.02;GraphPad软件,圣地亚哥,CA)。为了曲线匹配,将上限和下限抑制值分别限制为100%和0%。
协同确定
通过Chou和Talalay(1984)的方法确定药物组合的协同抑制作用。对上述所有的组合生成IC50值。按照以下公式计算了组合指数(CI)和剂量减少(DR)值:
DR(对化合物1)=(IC50D单独1/IC50D组合1)
DR(对化合物2)=(IC50D单独2/IC50D组合2)
其中,“IC50D组合1”=与药物2的组合的药物1的IC50;
“IC50D单独1”=当单独测试时药物1的IC50;
“IC50D组合2”=与药物1的组合的药物2的IC50;
“IC50D单独2”=当单独测试时药物2的IC50;
α=0,如果两种药物的作用相互排斥;和
α=1,如果两种药物的作用相互不排斥。
确定具有CI<1的组合是协同的,而确定具有CI>1的组合是拮抗的。叠加性表现在CI=1的组合中。
在微软表格处理软件(Microsoft Excel)中,利用以下公式计算95%置信区间:
=置信度(α,stdev,n)
其中,α=0.05(95%置信度);
stdev=数据组平均值的标准偏差;和
n=重复试验次数
结果
制备小分子融合抑制剂
通过商业来源制备SCH-D,TAK-779,UK-427,857和BMS378806。获得了所需的化合物的量和HPLC纯度。化合物的纯度受到获自元素分析的结果的支持,且通过质子NMR(质子和碳-13)和/或质谱数据证明了产物的特征。
通过RET测定揭示的协同相互作用
利用细胞-细胞RET融合测定实施了协同试验,从而最初评估PRO140与CCR5,CD4,HIV-1 gp120及HIV-1gp41的小分子和基于肽的抑制剂之间协同相互作用的能力。然后将该实验扩展到CCR5特异性鼠科单克隆抗体2D7(Wu等,1997)。
首先,利用PRO 140分别与以下各项的组合实施了测量抑制HIV-1Env介导的融合的实验,所述各项包括:PRO 140自身,3种小分子CCR5拮抗剂(SCH-D,TAK-779,UK427857),CCR5的天然肽配体(RANTES),和抗CCR5mAb(2D7),基于肽的gp41抑制剂(T-20),基于蛋白质的gp120抑制剂(PRO 542),gp120的小分子抑制剂(BMS378806),和抗CD4mAb(Leu3A)。PRO 140与其他侵入抑制剂的质量比在0.75-364间变化。该结果显示在表7中。
表7.对HIV-1Env介导的与PRO 140和侵入抑制剂的组合融合的抑制作用的组合指数和剂量减少值
a在1∶1的摩尔比时测试化合物
bPRO 140的质量/组合中所测试的其他HIV-1侵入抑制剂的质量。抑制剂的分子量是:PRO 140≈150,000g/摩尔;SCH-D=538g/摩尔;TAK-779=531g/摩尔(盐酸盐);UK-427,857=514g/摩尔;RANTES≈7,800g/摩尔;2D7≈150,000g/摩尔;T-20=4,492g/摩尔;PRO 542≈200,000g/摩尔;BMS-378806=412g/摩尔。
cIC50值处的组合指数。相互排斥CI公式(α=0)用于PRO处于与结合CCR5的分子的组合中,且相互不排斥公式(α=1)用于PRO 140处于与结合于其他目标的分子的组合中(Chou和Rideout,1991)。
在组合中测定了两种小分子CCR5拮抗剂SCH-D和TAK-779。在与抗CD4mAb,即Leu-3A的组合中还测试了PRO 542,即重组抗体状融合蛋白,其中人IgG2的重链和轻链可变结构域被人CD4的D1D2结构域替代。这些测定的结果显示在表8中。
表8:在RET测定中测试其他药物的组合协同性
a利用相互排斥公式计算了SCH-D相对TAK-779的CI值(即,当α=0时),并利用相互不排斥公式计算了PRO 542相对Leu-3A的CI值(即,当α=1时;见方法)。
b从平均CI和平均DR的计算中挑选的一个异常数据点。
还测量了改变化合物在组合中的相对含量对协同性水平的作用。使用了摩尔比5∶1和1∶5的PRO 140。将结果制于表9中,并且对于1∶1摩尔比的数据,将具有95%置信区间的平均CI值绘图于图4中。除PRO 140外,还利用荧光RET测定测试了处于与小分子CCR5拮抗剂和与RANTES的组合中的mAb 2D7,即CCR5特异性鼠科抗体(Wu等,1997)的抑制活性。将结果显示在表10中。
表9.PRO 140和侵入抑制剂的组合对由HIV-1Env介导的融合的抑制作用
的组合指数和剂量减少值
a在组合中测试的PRO140对其他侵入抑制剂的摩尔比(对所有实验结果n=3)
bPRO 140的质量/在组合中测试的其他HIV-1侵入抑制剂的质量。抑制剂的分子量是:PRO 140≈150,000g/mole;SCH-D=538g/mole;TAK-779=531g/mole(盐酸盐);UK-427,857=514g/mole;RANTES≈7,800g/mole;T-20=4,492g/mole;PRO 542≈200,000g/mole;BMS-378806=412g/mole。
cIC50处的组合指数。对处于与CCR5结合的分子的组合中的PRO 140使用了相互排斥CI公式(α=0),且对处于与其他目标的分子的组合中的PRO
140使用了相互不排斥CI公式(α=1)(Chou和Rideout,1991)。
表10.2D7和侵入抑制剂的组合对HIV-1Env介导的融合的抑制作用的组
合指数和剂量减少值
a以1∶1的摩尔比测试化合物(除2D7和PRO 140的n=2外,所有数据n=3)
bIC50值的组合指数。对处于与CCR5结合的分子的组合中的2D7使用了相互排斥CI公式(α=0)(Chou和Rideout,1991)。
c2D7的质量/在组合中测试的其他HIV-1侵入抑制剂的质量。抑制剂的分子量是:2D7≈150,000g/mole;SCH-D=538g/mole;TAK-779=531g/mole(盐酸盐);UK-427,857=514g/mole;RANTES≈7,800g/mole。
实施例2:在HIV-1假病毒粒子(HIV-1PP)测定中PRO 140与小分子、肽和
蛋白质抑制剂,和HIV-1的组合测试
材料和方法
HIV-1假粒子的制备
通过基于HIV-1的NL4/3luc+env-质粒和编码HIV-1JRFL Env的构建体的瞬时共表达,在293T细胞中产生HIV-1假粒子(HIV-1pp)。NL4/3luc+env-质粒获自NIH AIDS研究和参考试剂程序(Cat.No.3418),并将HIV-1JRFL Env插入到pcDNA3.1载体(Invitrogen)中。简要地,用Hepes缓冲液中比例为1∶1的NL4/3luc+env-受体载体和Env表达载体(Profection哺乳动物转染试剂盒,Promega)磷酸钙转染293T细胞。转染16小时后,抽吸培养基,并加入新鲜细胞培养基(含有10%FBS,谷氨酰胺和抗生素的DMEM),继续在37℃再培养24-32小时。转染后48小时收集细胞培养上清液,并在1,400rpm离心10分钟,从而沉淀细胞碎片。使病毒上清液形成5%蔗糖的最终浓度,并将其分装储存在-80℃。
细胞
U87-CD4-CCR5细胞获自NIH AIDS研究和参考试剂程序(Cat.No.4035)。将这些细胞维持在含有0.3mg/ml G418和0.5mg/ml嘌呤霉素的培养基(含有10%FBS,抗生素和谷氨酰胺的DMEM)中。细胞在37℃,T175-cm2烧瓶中生长,并且每3-4天将其稀释为1∶5。为了测定板的制备,胰蛋白酶消化细胞,并以3×103个细胞/孔的密度将细胞接种到经组织培养基处理的96孔平底不透明聚苯乙烯板(Perkin Elmer,波士顿,MA)的孔中。在用于HIV-1pp易感性测定前,在37℃,湿润的5%CO2的培养箱中培养该板不超过4小时。
化合物的制备
将50μl稀释的化合物加入到每个孔中,其中所述稀释的化合物的浓度是所需最终浓度的4倍。对于溶解于DMSO中的化合物,该4X储液将含有2%的DMSO(因此,该测定中的最终DMSO浓度对于小分子总是0.5%)。每个板包括没有接受化合物的对照孔。另外,每个测定中包括AZT抑制对照。单独地,并以广泛浓度范围内固定的质量和摩尔比测试化合物。
病毒的添加
在37℃水浴中融化一管冰冻的HIV-1pp等分试样,并再将其置于湿冰上。如所需,将病毒稀释在冷细胞培养基中,从而获得HIV-1pp测定中所需的最终病毒浓度(约10,000相对光单位(rlu)/孔)。向每个孔中加入50μl的稀释病毒,这使得最终孔体积为200μl。每个板上包括非病毒对照(最小或背景发光)和非化合物对照(最大发光)。在37℃,湿润的5%CO2的培养箱中培养该板72小时,随后处理荧光素酶信号(见下)。
关于荧光素酶测定进行板处理
抽吸测定培养基,并将200μl的PBS加入到每个孔中。抽吸PBS,并将50μl的1X细胞溶解试剂(Promega-Cat.No.E1531)加入到每个孔中。然后在-80℃冷冻测定板至少2小时,随后在室温下将其融化,并利用电子吸移管有力地混和。将来自每个孔的25μl转移到不透明的96孔板(Costar#3922)。将4个重复试验组汇集到该不透明板上相同的孔中。利用电子吸移管将100μl新近融化的再造荧光素酶底物(荧光酶测定系统(Luciferasea Assay System),Promega-Cat.No.E1501)加入到该板的每个孔中,并且立即在Dynex MLX板读数器上检测发光,所述Dynex MLX板读数器被设置为中等放大(medium gain)。
数据分析
通过绘制荧光素酶活性的百分比抑制(从所有数据点减去背景rlu值后)相对于log10药物浓度,显示出中和活性。按照[1-(药物存在时荧光素酶活性/药物缺乏时的荧光素酶活性)]×100获得百分比抑制。通过将抑制数据和非线性、四参数、可变斜率方程相匹配,确定IC50值(GraphPadPrism,4.02版本;GraphPad软件,圣地亚哥,CA)。为了曲线匹配,将上限和下限抑制值分别限制为100%和0%。
协同确定
如实施例1中所述,确定了PRO140与CCR5,CD4,HIV-1 gp120,HIV-1gp41和HIV-1反转录酶的小分子和基于肽的抑制剂的协同相互作用(参见表4,和批准用于临床应用的HIV-1抑制剂的列表)。通过Chou和Talalay(1984)的方法确定药物组合的协同抑制作用。如上所述,对上述所有的组合生成IC50值。按照以下公式计算了组合指数(CI)和剂量减少(DR)值:
DR(对化合物1)=(IC50D单独1/IC50D组合1)
DR(对化合物2)=(IC50D单独2/IC50D组合2)
其中,“IC50D组合1”=与药物2的组合的药物1的IC50;
“IC50D单独1”=当单独测试时药物1的IC50;
“IC50D组合2”=与药物1的组合的药物2的IC50;
“IC50D单独2”=当单独测试时药物2的IC50;
α=0,如果两种药物的作用相互排斥;
α=1,如果两种药物的作用相互不排斥。
确定具有CI<1的组合是协同的,而确定具有CI>1的组合是拮抗的。叠加性表现在CI=1的组合中。
实施例3:在HIV-1真正病毒复制测定中PRO 140与小分子、肽和蛋白抑
制剂之间的组合测试
材料和方法
PBMC的制备
为了这些研究,利用单核细胞/巨噬细胞向性HIV-1克隆,即JRFL(HIV-1JRFL),在活化的外周血液单核细胞(PBMCs)中测量了真正的HIV-1的复制。
通过在Ficoll剃度上离心从4个单独的供体(Leukopacks)中分离PBMC。利用RosetteSep CD8消除混合物(#15663,干细胞研究(StemCellResearch),温哥华,BC)消除CD8细胞。将细胞稀释到4×106/ml,并将其等分地加入到3个T175-cm2烧瓶中,然后通过添加以下一种培养基进行刺激:IL-2培养基[RPMI 1640(#10-040-CV,Cellgro,Herndon,VA),10%FBS(#35-010-CV),2mM L-谷氨酰胺(#25-005-CI),100U/ml IL-2(Sigma,St.Louis,MO)];PHA 5培养基:[含有5ug/ml植物血球凝集素PHA-P(PHA)的IL-2培养基(#L8754,Sigma,St.Louis,MO),经过滤的];或PHA0.5培养基:[含有0.5ug/ml PHA的IL-2培养基,经过滤的]。每个烧瓶接受总共50-150ml的培养基。将烧瓶在37℃培养3天,随后在用于感染测定前汇集该内容物。
病毒滴定
在活化的PBMC(1.4×105PBMC/孔)上,一式四份地测试病毒的连续稀释液。为了病毒滴定,利用了滴定培养基[含有100IU/ml青霉素/链霉素的IL-2培养基(#30-002-CI,Cellgro)]。将50μl稀释的病毒加入到100μlPBMC中,所述PBMC装在平底的、经组织培养基处理的96孔板(VWR#29442-054,Corning,Corning,NY)中,并将该板在37℃培养在湿润的、含5%CO2的培养箱中。7天后,从每个孔中移出50μl,并利用p24抗原ELISA(Perkin Elmer,波士顿,MA)测试其病毒水平。利用Reed和Muench的方法确定病毒滴定度(表11)。
中和测定
将被刺激的PBMC以1.4×105细胞/孔的密度接种到96孔平底板的孔中。将病毒稀释到2,000TCID50/ml,并在加入到细胞板前,在37℃与化合物的连续0.5log10稀释液混和1小时。最终添加的病毒量/孔是100TCID50。只要是在测试小分子抑制剂时,本测定中的最终DMSO浓度总是0.5%。在37℃培养该板5天,在那时移出上清液的等分试样以进行p24抗原ELISA。如果对照孔(无抑制剂的病毒)表现出低p24抗原水平,则用滴定培养基将该板恢复到完整体积,并另外培养24小时。
表11.用于计算病毒滴定的Reed和Muench公式
a
a为了计算病毒滴定,首先将阳性孔的总数乘2(将该图表设计为与8个重复试验组一起使用),然后查寻相应的TCID50/mL滴度,并加上0.7(该公式要求添加log稀释因子)。
数据分析
通过绘制p24抗原产量的百分比抑制(从所有数据点减去背景值后)相对于log10药物浓度,显示出中和活性。按照[1-(药物存在时的p24水平/药物缺乏时的p24水平)]×100获得百分比抑制。通过将抑制数据和非线性、四参数、可变斜率方程相匹配,确定IC50值(GraphPad Prism,4.02版本;GraphPad软件,圣地亚哥,CA)。为了曲线匹配,将上限和下限抑制值分别限制为100%和0%。
协同确定
如实施例1中所述,确定了PRO140与CCR5,CD4,HIV-1 gp120,HIV-1gp41,HIV-1反转录酶和HIV-1蛋白酶(表8)的小分子和基于肽的抑制剂的协同相互作用。通过Chou和Talalay(1984)的方法确定药物组合的协同抑制作用。对上述所有的组合生成IC50值。按照以下公式计算了组合指数(CI)和剂量减少(DR)值:
DR(对化合物1)=(IC50D单独1/IC50D组合1)
DR(对化合物2)=(IC50D单独2/IC50D组合2)
其中,“IC50D组合1”=与药物2的组合的药物1的IC50;
“IC50D单独1”=当单独测试时药物1的IC50;
“IC50D组合2”=与药物1的组合的药物2的IC50;
“IC50D单独2”=当单独测试时药物2的IC50;
α=0,如果两种药物的作用相互排斥;
α=1,如果两种药物的作用相互不排斥。
确定具有CI<1的组合是协同的,而确定具有CI>1的组合是拮抗的。叠加性表现在CI=1的组合中。
讨论
PRO 140是为了HIV-1治疗而开发的CCR5特异性mAb。它是鼠科抗体即PA14(Olson等,1999;2000年6月20日公开的PCT国际公开号WO 00/35409)的人源化IgG4,κ型式(见2003年9月4日公开的PCT国际公开号WO 03/072766),其与细胞表面上CCR5受体结合,并抑制CCR5介导的HIV-1与细胞的融合。在此所述的研究涉及测试与HIV-1感染的小分子和肽抑制剂结合的PRO 140的抗病毒活性。为获得对HIV-1感染抑制的潜在协同作用,分析了从该测试产生的数据。
在一系列试验中,利用荧光共振能量传递(RET)测定检验了HIV-1感染的抑制作用,所述RET测定测量表达重组HIV-1毒株JRFL包膜糖蛋白(Env)的效应子细胞(HeLa-EnvJRFL)与表达CD4和CCR5的靶细胞(CEM NKR-CCR5)的融合(Litwin等,1996)。在该测定中,用F18染料标记效应子细胞,并用R18染料标记靶细胞。HIV-1Env介导的效应子和靶细胞的融合导致这两种染料在细胞膜中近程内的分布。当在其最佳波长(450nm)处激发F18时,它放射出530nm波长的光,所述光在当这两种染料共同位于相同的膜中时激发R18,这导致在590nm处的R18特异性放射。通过在添加效应子细胞前向靶细胞加入连续浓度的药物,测量药物的易感性。对HIV-1Env介导的融合的抑制作用体现在荧光放射的减少,其原因在于R18处于剂量依赖的方式,由此提供了药物活性的定量测量。
进行测量对HIV-1Env介导的融合的抑制作用的最初实验,从而证明用于定量协同相互作用的测定系统的耐用性。在这些实验中,PRO 140在与其自身的组合中运行,所述组合应该导致组合指数(CI)值指示叠加相互作用。利用Chou和Talalay(1984)的方法学,取<1.0,=1.0和>1.0的CI值分别表示协同、叠加和拮抗相互作用。实际上,在与其自身的组合中运行PRO 140恢复CI值为0.97±0.08(n=9;表7),这显示该测定系统精确地代表这种相互作用。
然后在PRO 140和3种小分子(SCH-D,TAK-779,UK427857),CCR5的1个肽(RANTES)和1个mAb(2D7)拮抗剂之间的协同实验。另外,测量了PRO 140与T-20(基于肽的gp41抑制剂),PRO 542(基于蛋白质的gp120抑制剂),BMS378806(gp120的小分子抑制剂)和Leu-3A(抗CD4mAb)之间的协同相互作用。
该结果(见表7)揭示了PRO 140与所有3种小分子CCR5拮抗剂以及RANTES之间的有效协同作用。PRO 140与这些CCR5拮抗剂间的CI值在0.36±0.10-0.59±0.08间变化。剂量减少值显示组合中的化合物对PRO 140的活性发挥了约4倍的作用,而PRO 140对组合中的化合物的作用在约3-约16倍间变化(表7)。在PRO 140与T-20,PRO 542,BMS-378806和2D7之间观察到适度的协同到叠加作用(分别地,CI=0.84±0.16,0.96±0.17,1.21±0.21,和0.93±0.04)。
在组合中运行的CCR5的小分子拮抗剂(SCH-D和TAK-779)恢复平均CI值为1.12±0.32,这显示了微小的叠加相互作用(表8)。相反地,重组抗体状融合蛋白PRO 542与抗CD4mAb,即Leu-3A间的组合导致平均CI值为16.9±0.3,这显示了这两种HIV-1抑制剂间的有效对抗(表8)。
改变化合物的摩尔比证明了协同性的相似模式。在PRO 140对SCH-D,TAK-779,UK-427,857和RANTES的摩尔比为5∶1和1∶5时,观察到对HIV-1-Env介导的侵入的有效协同抑制(表9)。这显示了抑制剂质量比的广泛范围,从最低0.15到最高1,820。PRO 14与CCR5拮抗剂间的CI值在0.52±0.20到0.84±0.14间变化。对PRO 140与T-20,PRO 542或BMS-378806的组合,观察到更适度的协同到叠加作用。这些研究的结果明确地确定了PRO 140与CCR5拮抗剂的有效协同活性,以及PRO140与T-20间更适度的协同作用(见图4)。
利用荧光RET测定也测试了与小分子CCR5拮抗剂和与RANTES组合的CCR5特异性鼠mAb,即2D7的HIV-1抑制活性。发现2D7与这些CCR5拮抗剂和与RANTES协同作用(表10)。2D7和这些CCR5拮抗剂之间的CI值在0.15±0.03到0.62±0.04间变化。剂量减少值显示除TAK-779对2D7的活性发挥约17倍的作用外,组合中的化合物对2D7的活性发挥约2-3倍的作用。2D7对组合中的化合物的作用在约2-约12倍间变化(表10)。如先前所观察到地,组合中的PRO 140和2D7是基本叠加或适度协同的(CI=0.93±0.04)。
这些结果显示在多mAb和与CCR5结合的小分子之间观察到HIV-1Env介导的细胞-细胞融合的协同抑制作用。该特征可以广泛地应用于靶向CCR5的mAb,其包括,例如mAb CCR5mAb004,已显示所述mAbCCR5mAb004在细胞-细胞融合测定中结合于并拮抗CCR5,且阻断HIV-1的侵入(Roschke等,2004)。已经鉴定了大量和数量增加的小分子作为CCR5拮抗剂(见表12)。这些小分子CCR5拮抗剂中的某些还可以在PRO 140和其他抗CCR5mAb的组合中产生对HIV-1Env介导的融合的协同抑制。
用于检验协同相互作用的备选方法利用如前所述的病毒-细胞融合测定(Nagashima等,2001;Trkola等,1998)。在该测定中,用来自HIV-1JRFL的Env假型包装(pseudotype)含有荧光素酶报道基因的HIV基因组载体(pNLluc+Env-)。被病毒粒子假型包装的重组体用于感染表达CD4和CCR5的U87细胞(U87-CD4-CCR5)。荧光素酶在靶细胞中的产生依赖于病毒的侵入和一轮病毒复制的完成。通过在添加假型包装的病毒粒子前,向靶细胞中加入连续浓度的药物,测量药物的易感性。病毒侵入的抑制体现在荧光素酶活性以剂量依赖方式的减少,从而提供了药物易感性的定量测量。由于HIV基因组载体要求功能性HIV-1反转录酶(RT)的表达,从而推动荧光素酶的表达,该假病毒测定也对由核苷酸/核苷反转录酶抑制剂(NRTIs)和非核苷反转录酶抑制剂(NNRTIs)引起的抑制作用很灵敏。同样地,HIV-1pp测定适合于检验PRO 140与CCR5,CD4,HIV-1gp120,HIV-1gp4l和HIV-1反转录酶的小分子、肽和蛋白抑制剂之间的协同相互作用。
表12.小分子CCR5拮抗剂
小分子CCR5拮抗剂 | 参考文献 |
1,3,4-三代吡咯烷 | Kim等,2005 |
修饰的4-哌啶基-2-苯基-(苯磺酰氨基)-丁烷 | Shah等,2005 |
Anibamine.TFA,蛇孢菌素C,和19,20-环氧松胞菌素Q | Jayasuriya等,2004 |
5-(哌啶-1基)-3-苯基-戊砜 | Shankaran等,2004a |
4-(杂芳基哌啶-1基-甲基)-吡咯烷-1基-乙酸拮抗剂 | Shankaran等,2004b |
含有4-(吡唑基)哌啶侧链的试剂 | Shu等,2004 |
含有4-(吡唑基)哌啶侧链的试剂 | Shu等,2004a;2004b |
3-(吡咯烷-1-基)丙酸类似物 | Lynch等,2003c |
[2-(R)-[N-甲基-N-(1-(R)-3-(S)-((4-(3-苯甲基-1-乙基-(1H)-吡唑-5-基)哌啶-1-基)甲基)-4-(S)-(3-氟苯基)环戊-1-基)氨基]-3-甲基丁酸(MRK-1)] | Kumar等,2003 |
具有4-氨基杂环取代的哌啶侧链的1,3,4-三代吡咯烷 | Willoughby等,2003;Lynch等,2003a;Lynch等,2003b;Hale等,2002 |
二环异噁唑烷 | Lynch等,2002 |
CCR5拮抗剂的组合合成 | Willoughby等,2001 |
含有杂环的化合物 | Kim等,2001b |
含有乙内酰脲的拮抗剂 | Kim等,2001a |
1,3,4-三代吡咯烷 | Hale等,2001 |
1-[N-(甲基)-N-(苯磺酰基)氨基]-2-(苯基)-4-(4-(N-(烷基)-N-(苄氧基羰基)氨基)哌啶-1基)丁烷 | Finke等,2001 |
来自植物Lippia alva的化合物 | Hedge等,2004 |
基于哌嗪的CCR5拮抗剂 | Tagat等,2004 |
基于肟基-哌啶子基-哌啶的CCR5拮抗剂 | Palani等,2003b |
SCH 351125的旋转异构体 | Palani等,2003a |
小分子CCR5拮抗剂 | 参考文献 |
基于哌嗪的对称杂芳基甲酰胺 | McCombie等,2003 |
肟基-哌啶子基-哌啶酰胺 | Palani等,2002 |
Sch-351125和Sch-350634 | Este等,2002 |
SCH-C | Strizki等,2001 |
1-[(2,4-二甲基-3-吡啶基)羰基]-4-甲基-4-[3(S)-甲基-4-[1(S)-[4-(三氟甲基)苯基]乙基]-1-哌嗪基]-哌啶N1-氧化物(Sch-350634) | Tagat等,2001a |
4-[(Z)-(4-溴苯基)-(乙氧基亚氨基)甲基]-1’-[2,4-二甲基-3-吡啶基)羰基]-4’-甲基-1,4’-二哌啶N-氧化物(Sch-351125) | Palani等,2001 |
2(S)-甲基哌嗪 | Tagat等,2001b |
哌啶-4-甲酰胺衍生物 | Imamura等,2005 |
含有亚砜部分的1-苯并氮杂衍生物 | Seto等,2005 |
含有吡啶N氧化物部分的N-酰苯胺衍生物 | Seto等,2004a |
1-benzothiepine 1,1-二氧化物和含有叔胺部分的1-苯并氮杂衍生物 | Seto等,2004b |
N-[3-(4-苯甲基哌啶-1基)丙基]-N,N’-二苯基脲 | Imamura等,2004a |
5-氧代吡咯烷-3-甲酰胺衍生物 | Imamura等,2004b |
具有季铵部分的N-酰苯胺 | Shiraishi等,2000 |
AK602/ONO4128/GW873140 | Nakata等,2005 |
螺二酮哌嗪衍生物 | Maeda等,2001;Maeda等,2004 |
选择性CCR5拮抗剂 | Thoma等,2004 |
第三种检验抗病毒协同作用的方法利用完全病毒测定。可以以该测定格式检验所有种类抑制剂分子之间的协同性。
在病毒-细胞融合荧光素酶测定和完全病毒测定中,如本文对RET测定所描述地,对所有组合产生IC50值。通过Chou和Talalay(1984)的方法确定药物组合的协同抑制作用。
在临床前测试中,在无CCR5拮抗或其他免疫副作用的条件下,PRO140广泛有效地抑制CCR5介导的HIV-1侵入。更近期,在来自对健康志愿者正在进行的阶段1a研究的初步结果中证明了PRO 140具有有利的耐受力、PK和免疫特征。因此,在许多方面,PRO 140为抗HIV-1的治疗提供新型且有吸引力的产品特征。而且,抗CCR5mAb的活性从根本上区别于,而又互补于那些小分子CCR5拮抗剂(见表2)。
可能已预料抗CCR5mAb和非抗体CCR5拮抗剂间的组合会在抑制HIV-1与CD4+CCR5+靶细胞的融合中产生相叠加作用,其原因在于这两类试剂均结合于相同的靶分子。令人震惊地,然而,此处所显示的数据揭示抗CCR5mAb,以PRO 140和2D7为例,表现出在抑制HIV-1Env介导的细胞-细胞融合中,与非抗体CCR5拮抗剂有效且可再生的协同作用,所述非抗体CCR5拮抗剂以SCH-D,TAK-779,UK-427,857和RANTES为例。协同作用常规地转化为4-10倍的剂量减少,这说明了药物组合的抑制效力的显著改善。相反,对非抗体CCR5拮抗剂的组合观察到纯叠加作用。这些发现很可能体现了CCR5识别这些分子的不同模式:尽管小分子CCR5拮抗剂在CCR5穿膜结构域中与共同疏水囊结合,PRO 140识别亲水的CCR5细胞外表位。总之,该数据支持PRO 140在与非抗体HIV-1侵入抑制剂的组合中的应用,并认为PRO 140代表CCR5抑制剂的不同亚类。
而且,现有的数据显示观察到的协同作用还可以通过涉及除PRO 140外的抗CCR5mAb与除SCH-D,TAK-779,UK-427,857和RANTES外的非抗体CCR5拮抗剂的组合来体现,其中所述抗CCR5mAb包括,但不仅限于mAb CCR5mAb004(Roschke等,2004)。因此,这些抗体很可能在与GW873140(Lalezari等,2004),TAK-652(Baba等,2005),和至少某些表12中所列出的小分子CCR5拮抗剂的组合中产生协同作用。因此,组合治疗法可以提供预防和治疗HIV-1感染的强有效的新型方法,其中所述组合治疗法包括施用抗CCR5mAb和非抗体CCR5拮抗剂。预料所述治疗法会导致更有效且更持久的抗HIV-1治疗。而且,此处所述的协同作用可以允许减少向受试者所施用的药物剂量,以及减少给药频率。
实施例4:负载和维持给药方案
负载方案,其可以,例如比维持方案更加给药密集,可以,例如具有以下特征:
给药数量:1次或更多次(多达约5次给药)
给药水平:约25%,50%,75%,100%,150%或200%地高于维持给药方案。
给药频率:比维持给药方案更加频繁约1.5X,2X,3X或4X。
作为实例,如果维持给药方案是每两周2mg/kg,则负载给药方案可以包括每周2mg/kg给药。备选地,负载给药方案可以包括每周或两周间隔的单次4mg/kg给药或多次4mg/kg给药。
可以设计负载给药方案,例如从而在受试者中加快药物动力学稳定状态的获得,其通过给药间药物的一致的峰值和凹点(trough)血液浓度定义。优选的负载给药方案可以通过常规实验确定,其中通过不同的负载和维持方案向受试者施用药物,并测量药物的血液水平。
而且,在其他实施方案中,按照固定给药方案,诸如例如75mg,150mg,300mg和600mg/施药,施用PRO 140。
部分III
材料和方法
抑制剂
将PRO 140表达在哺乳动物细胞中,并利用蛋白质A、离子交换和羟磷灰石层析法进行纯化。按照公开的方法制备了UK-427,857(Dorr等2005),SCH-D(Tagat等2004),TAK-779(Baba等1999),enfuvirtide(T-20(Wild等1992);BMS-378806(Lin等2003)和PRO 542(CD4-IgG2,(Allaway等1995))。齐多夫定(叠氮胸腺嘧啶核苷,AZT),RANTES,所述CCR5 mAb 2D7和所述CD4 mAb Leu-3A分别购自Sigma Chemicals(St.Louis,MO),R&D系统(Minneapolis,MN),Pharmingen(San Diego,CA),和Becton Dickinson(Franklin Lakes,NJ)。由GE Healthcare(Piscataway,NJ)用氚放射标记UK-427,857和SCH-D,并且由南方生物技术公司(SouthernBiotech,Inc.)(Birmingham,AL)将PRO 140缀合于藻红蛋白(PE)。
HIV-1膜融合测定
利用改良的荧光共振能量传递(RET)测定(Litwin等1996)检验了HIV-1包膜介导的膜融合。简要地,分别用荧光素十八烷酯(F18;分子探针(Molecular Probes),Eugene,OR)和若丹明十八烷酯(R18;分子探针)独立地过夜标记稳定表达HIV-1JR-FL gp120/gp41的HeLa细胞(Litwin等,1996)和CEM.NKR-CCR5细胞(NIH AIDS研究和参考试剂程序,(Spenlehauer等2001;Trkola等1999))。在含有15%胎牛血清(PBSF)的磷酸盐缓冲液中洗涤细胞,并以15,000细胞/孔共接种到384孔板中。加入抑制剂,并且在如前述利用Victor2板计数器(Perkin-Elmer,Boston,MA)进行RET测量前,在37℃,添加了0.5%二甲基亚砜(DMSO)的PBSF中培养该板4小时(Litwin等1996)。CD4 mAb Leu3a用作对照抑制剂,并如下计算百分比抑制:(缺乏抑制剂时的RET-存在抑制剂时的RET)/(缺乏抑制剂时的RET-存在Leu3a时的RET)X100。
HIV-1假病毒测定
通过缺失3’长末端重复序列(LTR)U3区域中的507个碱基,以去除TATA盒和转录因子结合位点,由pNL4-3ΔEnv荧光素酶载体(Dragic等1996)获得自钝化(SIN)载体。将人类细胞巨化病毒启动子插入到荧光素酶(luc)基因的上游,从而允许整合后荧光素酶的表达。
如前所述,通过用SIN载体和适当的pcDNA env表达载体共转染293T细胞,生成由HIV-1JR-FL或HIV-1SF162包膜假型包装的报道病毒(Dragic等1996)。在存在或缺乏抑制剂的条件下,在384孔板中用125-375pg的HIV-1假病毒感染U87-CD4-CCR5细胞(8,000/孔;NIH AIDS研究和参考试剂程序)。将培养物在37℃,含有10%胎牛血清、1mg/mL嘌呤霉素、0.3mg/mL遗传霉素,抗生素和0.5%DMSO的DMEM中培养72小时。按照制造商的说明利用BrightGlo试剂(Promega,Madison,WI)测量荧光素酶活性(相对光单位或RLU)。如下计算百分比抑制:(1-存在抑制剂时的RLU/缺乏抑制剂时的RLU)X100。IC50和IC90用于指示50%和90%的HIV-1抑制相应所需的浓度。
协同确定
实验设计和数据分析基于组合指数(CI)方法(Chou等1991;Chou等1984)。单独并以连续稀释液范围内固定摩尔比的组合测试化合物。侵入抑制剂以相同的摩尔含量组合,而对PRO 140与叠氮胸腺嘧啶核苷和奈韦拉平的组合使用1∶10的摩尔比。利用四参数S形方程匹配剂量应答曲线,所述方程具有分别限定为100%和0%的上限和下限抑制值,从而计算50%(IC50)和90%(IC90)抑制所需的浓度(GraphPad Prism,GraphPad软件,圣地亚哥,CA)。如前述计算50%(CI50)和90%(CI90)抑制的CI值(Chou等1991;Chou等1984)。相互排斥CI公式用于CCR5抑制剂的组合,而相互不排斥公式用于抑制剂与不同目标的组合(Chou等1991)。每个测试进行了4-12次。协同、叠加和拮抗分别通过CI<1,CI=1和CI>1表示。
竞争结合测定
为了检验PRO 140结合的抑制,将CEM.NKR-CCR5细胞混悬在含有0.1%叠氧化纳的磷酸盐缓冲液(PBSA)中,并与不同浓度未标记的CCR5拮抗剂一起在环境温度下培养30分钟。在测定过程中,加入叠氧化物,从而阻断CCR5内在化。在PBSA中洗涤细胞,并且在洗涤和利用FACSCalibur仪器(Becton Dickinson)通过流式细胞计数器进行分析前,与5nM PRO 140-PE一起再培养30分钟。根据平均荧光强度(MFI)和选择为阳性染色的细胞百分比计算PRO 140-PE结合的范围。
为了检验UK-427,857结合的抑制,如上所述在添加2nM3H-UK-427,857前,用未标记的CCR5抑制剂预培养CEM.NKR-CCR5细胞额外的30分钟。在PBSA中洗涤细胞,并在利用Wallac1410仪器闪烁计数前用0.5N HCl溶解细胞。另外的研究反转了添加的顺序,从而在该测定的过程中检验UK-427,857结合的稳定性。如上所述在洗涤,添加未标记的抑制剂和处理前,用2nM3H-UK-427,857预培养细胞30分钟。EC50和EC90用于指出50%和90%地抑制标记化合物的结合所分别需要的未标记的化合物的浓度。
统计学分析
利用GraphPad Prism软件,使用二尾t检验测试关于无效假设Ho:CI=1(叠加)的平均CI50和CI90值。除作为测定对照而包括的PRO140/PRO140模拟品的组合外,按照Bonferroni方法对来自α=0.05的多重比较校正P值(Cudeck和O′Dell 1994)。在Bonferroni校正中,P=α/n,其中n是比较的个数。基于在膜融合测定中产生的数据,进行22个协同比较(11个化合物×2CI值),从而导致被校正的P值为0.0023。在假病毒测定中,32个协同比较(8个化合物×2病毒×2CI值)导致被校正的P值为0.0016。
结果
HTV-1膜融合的抑制
在RET细胞-细胞融合测定中,单独和共同使用PRO 140和UK-427,857来抑制HIV-1JR-FL包膜介导的膜融合,并且在图15A中举例说明了每种单独试剂和组合相应的剂量应答曲线。尽管PRO 140和UK-427,857以低纳摩尔效能单独地阻断HTV-1融合,但是其组合明显地更加有效。在该测定中,单独利用2.9nM PRO 140,单独利用5.0nM UK-427,857,或利用2.1nM该组合(1.05nM PRO 140加1.05nM UK-427,857)获得50%的抑制。该上述叠加作用是两种试剂间抗病毒协同作用的指示。相反,SCH-D和UK-427,857的组合不比单独的试剂更加有效(图15B)。在该实例中,单独抑制剂和及组合的剂量-应答曲线相互重叠,其中50%的抑制需要9.7nM UK-427,857,5.5nM SCH-D以及6.1nM的组合。该数据说明了这些抑制剂的纯叠加作用。
将这些研究扩展到另外的CCR5(TAK-779,RANTES和2D7),gp120(BMS-378806和PRO 542)和gp41(enfuvirtide)抑制剂,并且对每种条件重复4次或更多次。对每种条件计算了CI50和CI90值,并在独立的测定中进行平均。利用t检验评估协同性,从而确定CI50和CI90是否显著地区别于1。作为这些方法的检验,通过以两次单独地添加向测定孔中加入PRO 140来检验PRO 140/PRO 140模拟品的组合。PRO 140/PRO 140组合的CI50和CI90值分别为0.96和0.97(表13);因此,如所预料地,观察到该模拟品组合的纯叠加作用。
对PRO 140与三种小分子CCR5拮抗剂(UK-427,857,SCH-D和TAK-779)中的每种的组合观察到有效协同作用,并且甚至在通过Bonferroni方法对多重比较校正数据时,该发现是统计学显著的(表13)。CI值在0.36-0.61间变化,并将这些协同作用转化为剂量减少,其在不同的条件下在3-8倍间变化。协同作用在90%抑制时高于在50%抑制时。PRO 140和小分子CCR5拮抗剂间的协同作用是稳定的,原因在于在每个实例中均观察到50%和90%的抑制水平。例外的是TAK-779,其在单独使用时不介导90%的抑制,且因此没有确定CI90。当RANTES与PRO140或UK-427,857组合使用时,观察到相似的有效协同作用(表13)。另外的测试检验了两种小分子CCR5拮抗剂(SCH-D/UK-427,857和SCH-D/TAK-779)或两种CCR5mAb(PRO 140/2D7)的组合。尽管SCH-D/UK-427,857的CI90值倾向于具有显著性,但是对这些组合没有观察到显著的协同作用。该发现与以前对PRO 140和2D7(Olson等1999)以及对SCH-D和TAK-779(Seibert等2006)观察到的重叠结合位点相一致。还在与gp41融合抑制剂enfuvirtide和与gp120附着抑制剂PRO 542和BMS-378806的组合中测试PRO 140(表13)。CI值在0.84-1.28间变化,且这些组合中没有一个证明了达到统计学显著性标准的协同作用。对于PRO 140/BMS-378806的组合,在50%,而非90%抑制时观察到适当的拮抗。该结果的生物学显著性还不清楚。
HIV-1假病毒的抑制
单周期HIV-1报告病毒用于检验是否协同作用被限制于细胞-细胞融合或它们扩展到HIV-1侵入的其他模式。该测定中的信号要求病毒侵入和反转录,由此NRTI和NNRTI均可以包括在该分析中。在至少4个独立测定/病毒中,针对用来自HIV-1JR-FL和HIV-1SF162包膜假型包装的报告病毒测试了每种组合。再一次作为测定对照包括PRO 140/PRO 140模拟品组合,并如所预料地,证明了针对HIV-1JR-FL和HIV-1SF162假病毒的叠加作用(表14)。
PRO 140在阻断病毒-细胞融合中,与UK-427,857和SCH-D有效地协同,且该结果达到统计学显著性标准。针对HIV-1JR-FL和HIV-1SF162假病毒在50%和90%抑制时观察到相似水平的协同作用(表14),其CI值在0.18-0.64间变化。这些协同性转化为变化为14倍的剂量减少。这些结果良好地符合于在细胞-细胞融合测定中所获得的那些结果(表13)。TAK-779和RANTES均不介导对HIV-1假病毒侵入的一致的高水平抑制,且因此这些化合物不包括在该测定中(数据未显示)。
对UK-427,857/SCH-D和PRO 140/2D7组合均观察到叠加作用(表14)。相似地,对在与gp120抑制剂PRO 542和与BMS-378806的组合中使用的PRO 140观察到叠加性。对于PRO 140/BMS-378806组合,没有观察到针对任意病毒拮抗作用。总之,这些发现与见于细胞-细胞融合中的那些结果相一致。最后,对于与齐多夫定(NRTI)或奈韦拉平(NNRTI)组合的PRO 140观察到叠加作用。
竞争结合研究
如上所述,对已知(PRO 140和2D7)或猜想(UK-427,857和SCH-D)为与CCR5结合竞争的抑制剂观察到叠加的抗病毒作用;然而,关于协同性化合物的竞争结合几乎不了解。(例如,PRO 140/UK-427,857和PRO140/SCH-D)。由于非竞争结合提供CCR5抑制剂间协同的可能机制,所以利用UK-427,857和PRO 140的标记形式研究这个问题。
通过未标记的PRO 140,UK-427,857和SCH-D,使用流式细胞计数器检验对PRO 140-PE结合于CEM.NRK.CCR5细胞的抑制。如所预料地,PRO 140-PE的结合有效地受到未标记的PRO 140的抑制。在MFI值(图16A)和选择为阳性结合的细胞百分比(图16B)方面,均观察到完全的抑制作用。基于MFI数据的EC50是2.5nM(图16A),且该数值满意地与PRO 140的抗病毒IC50相比较(表13和14)。由于所选择的百分比细胞对于结合的基本完全抑制的读数,计算EC90值为17nM,且该值相似于对PRO 140观察到的抗病毒IC90值(表13和14)。2D7也完全抑制PRO 140-PE与CEM.NKR-CCR5的结合。PRO 140-PE的CCR5特异性也通过其不能与亲代CEM.NKR细胞结合证明。
完全相反地,对UK-427,857和SCH-D观察到适当水平的抑制(图16)。UK-427,857和SCH-D的微摩尔浓度将PRO 140-PE的MFI值减少为50%或更低(图16A)。更引人注目地,UK-427,857和SCH-D对选择为PRO 140-PE阳性结合的细胞百分比几乎没有影响(图16B)。该发现显示UK-427,857和SCH-D部分地减少与每个细胞结合的PRO 140-PE分子数量;然而,这些化合物不减少与可测量量的PRO 140-PE结合的细胞的数量。因此,UK-427,857和SCH-D代表PRO 140结合的部分拮抗剂,且该发现为PRO 140和这些小分子CCR5拮抗剂间观察到抗病毒协同作用提供机制。
接着,检验了由未标记的UK-427,857,SCH-D和PRO 140引起的对3H-UK-427,857的抑制。3H-UK-427,85与CEM.NKR-CCR5细胞的结合受到未标记UK-427,857的有效抑制(图17A)。结合的EC50为4.3nM,且与对UK-427,857观察到的抗病毒IC50相似(表13和14)。
SCH-D还阻断3H-UK-427,857与背景水平的结合(图17A)。然而,化合物的抗病毒功效和它们阻断3H-UK-427,857结合的功效间不存在相互关系。例如,尽管SCH-D证明了与UK-427,857相等或比之稍高的抗病毒功效(表13和14),SCH-D在阻断3H-UK-427,857的结合中具有较低功效(EC50=17nM,图17A)。该结果与这些化合物的CCR5结合位点中的微小差别相一致。
令人震惊地,PRO 140也阻断3H-UK-427,857与背景水平的结合(图17A),且该结果与UK-427,857对PRO 140-PE的适度抑制相反(图16)。PRO 140抑制3H-UK-427,857结合,其具有14nM的EC50,其高于PRO140的抗病毒IC50的5-10倍(表13和14)。
最后的试验检验了UK-427,857与CEM.NKR-CCR5细胞在竞争测定的条件下结合的稳定性。为此,用3H-UK-427,857预培养细胞,且然后在未标记的UK-427,857,SCH-D和PRO 140的存在下检验解离。如图17B所示,在环境温度下,存在3H-UK-427,857的最小解离超过30分钟,且UK-427,857既没有被PRO 140也没有被SCH-D替代。因此,UK-427,857不能有效地竞争PRO 140与CCR5的结合(图16)不是因为测定过程中从CCR5的UK-427,857的快速解离。总之,该数据显示PRO140可以在有预结合的UK-427,857的存在下与CCR5结合。
讨论
该研究探究mAb与小分子CCR5抑制剂间的相互关系,并检验CCR5药物的组合,所述CCR5药物目前处于为了HIV-1治疗法的开发中。令人震惊地,在CCR5mAb PRO 140和3种结构不同的小分子CCR5拮抗剂中的每种间观察到了有效的抗病毒协同作用。在不同的测定系统、病毒分离株、靶细胞和抑制水平间观察到一致、高水平的协同作用。PRO 140和小分子CCR5拮抗剂在共同使用时比与阻断其他HIV-1侵入阶段的抑制剂组合时更有效地协同。相反,对两种小分子CCR5拮抗剂的组合观察到叠加作用。竞争结合研究揭示由mAb和小分子CCR5抑制剂引起的CCR5结合的复杂且非互惠模式,并认为协同相互作用发生在受体结合水平。
在该研究中观察到mAb和小分子CCR5抑制剂间加强的协同。对细胞-细胞和病毒-细胞融合观察到有效的协同作用,且在这两种确立已久的测定系统中存在着良好的一致的发现。对于PRO 140与来自不相关化学系列的3种小分子CCR5拮抗剂中的每种的组合,观察到相似的协同水平。另外,对两种充分表征化的HIV-1包膜和两种CCR5靶细胞观察到一致的协同作用。协同作用随着增高病毒抑制的水平而增高,并翻译为高达14倍的体外剂量减少。从另一个角度看,该协同作用的程度在给定药物浓度时提供抗病毒压力的相应增加,由此改进病毒抑制并可能延缓耐药性病毒的出现。这受到初步研究的支持,从而显示mAb和小分子CCR5抑制剂具有病毒耐受的互补模式(Kuhmann等2004和Marozsan等2005)。本发现为临床探究结合mAb和小分子CCR5抑制剂的方案提供基本原理。
还对用于与UK-427,857或PRO 140组合的RANTES观察到了有效的协同作用。RANTES的内源化水平可以在天然感染过程中,对HIV-1疾病的进展提供一些保护(Garzino-Demo等1999;Lui等1999),且因此该协同作用的发现对靶向CCR5的HIV-1治疗法具有重要且积极的蕴涵。基于先前的观察,RANTES和PRO 140间的抗病毒协同作用并不意外,所述先前的观察是鼠PRO 140(PA14)的抗病毒浓度不阻断RANTES信号(Olson等1999)。只要UK-427,857是有效的CCR5拮抗剂,较难解释RANTES和UK-427,857间的协同作用。然而,这些发现与先前对小分子CCR5拮抗剂SCH-C和氨基氧基戊烷-RANTES(AOP-RANTES)间的协同作用的观察相一致(Tremblay等2002),所述氨氧戊烷-RANTES为一种RANTES衍生物,其被评估为潜在的局部杀菌剂(Kawamura等2000)。
与mAb和小分子CCR5拮抗剂间观察到的加强的协同作用相反,对小分子CCR5拮抗剂的组合观察到叠加作用。合作性的缺乏与这样的观点一致,所述观点是这些分子竞争结合于CCR5上的公共囊(Dragic等2000;Nishikawa等2005;Tsamis等2003;Watson等2005)。该体外研究不为组合临床学中的小分子CCR5拮抗剂提供基础,所述临床学仅基于野生型病毒的抑制。
相似地,在PRO 140和HIV-1附着抑制剂(PRO 542和BMS-378806),融合抑制剂(enfuvirtide)或反转录酶抑制剂(齐多夫定和奈韦拉平)间未观察到有效的协同作用,且这些发现强调了对PRO 140和小分子CCR5拮抗剂间观察到的协同作用的显著性。大量先前的研究已检验了多种小分子CCR5拮抗剂(UK-427,857,SCH-C,TAK-220,TAK-652和E913)和来自每种现存HIV-1治疗种类的药物间的相互作用。大多数(Tremblay等2005Antivir.Ther.;Tremblay等2005 Antimicrob.Agents Chemother;Tremblay等2002)但非全部(Dorr等2005;Maeda等2001)研究报道了CCR5抑制剂和其他HIV-1治疗种类间的广泛协同作用,且这些具有分歧的结果可以体现用于抗病毒测试中的化合物和方法的不同,以及用于数据分析中的方法的不同。当针对20种许可的抗逆转录病毒试剂测试UK-427,857时,在除3个案例中报道了适度的协同作用外,在所有的情形中都观察到叠加作用(Dorr等2005)。该结果与目前对PRO 140和HIV-1抑制剂的组合不靶向CCR5的发现相一致。
在不意欲受理论的限制的条件下,抗HIV-1药物间的协同作用可以源于多种机制。在混合病毒培养中,一种化合物可以抑制耐受第二种化合物的病毒(Johnson等1991),且NRTI/NNRTI组合可以克服特异性RT介导耐受机制(Basavapathruni等2004;Borkow等1999)。抑制剂间代谢的相互作用可以增高它们有效的细胞内药物浓度(Molla等2002),且协同侵入抑制剂可以干扰侵入级联中的相互依赖步骤(Nagashima等2001;Tremblay等2000)。本研究检验了克隆的病毒包膜而非混合种群,以及所述目标针对代谢相互作用指出的细胞外特征。Gp120的多个结构域有助于CCR5的结合(Cormier等2002),但是目前尚不清楚这些相互作用在感染过程中是否代表分离或离散的事件。
本发现显示mAb与小分子CCR5抑制剂间的抗病毒协同作用可以发生在受体水平。如上所讨论地,mAb和小分子结合CCR5上不同的基因座(Dragic等2000;Nishikawa等2005;Tsamis等2003;Olson等1999;Watson等2005)。当在本研究中与CCR5细胞一起预培养时,PRO 140完全阻断UK-427,857与受体的后继结合;尽管PRO 140的浓度高于阻断HIV-1侵入相同细胞所需的浓度。相反,与过饱和浓度的UK-427,857或SCH-D一起预培养CCR5细胞将PRO 140的结合减少为50%或更低。作为一种可能的解释,PRO 140可以识别CCR5构象异构体,所述CCR5构象异构体不与UK-427,857或SCH-D结合。尽管细胞-表面CCR5存在于多种构象中(Lee等1999),小分子拮抗剂可以证明有效的抗病毒活性却不能结合细胞-表面CCR5的显著的部分似乎是不可能的。在这一点上,注意到对竞争结合和抗病毒研究使用公共细胞背景(CEM.NKR-CCR5细胞)是很重要的,且因此该发现与CCR5表达中的细胞特异性区别无关。
在不意欲受理论的限制的条件下,对本发现另一个似乎真实的解释是PRO 140能够与结合了UK-427,857的CCR5形成三元复合物,且该三元复合物为HIV-1的侵入提供增强的障碍。在该模型范围内,PRO 140可以比与自由CCR5稍微低效地结合于与UK-427,857结合的CCR5,这通过在UK-427,857的存在下,PRO 140结合的适度减少证明。
组合指数方法广泛地用于评估药物-药物相互作用。在该方法中,合作性通常基于经验CI值(例如,<0.9为协同作用和>1.1是对抗作用)定义,而不考虑测定间的可变性。偶尔进行统计学分析,甚至更少有地对多重比较进行调整。在缺乏所述分析下,存在着对过高估计协同组合数量增高的可能性。
使用了严格且保守的确定协同作用的方法。测试了CI值针对叠加性(CI=1)的无效假说的统计学显著性。另外,这些研究确定了20-30个不同的CI值/试验(表13和14),这在协同作用的研究中是常见的。为了降低假阳性结果的可能性,利用Bonferroni校正降低显著性水平。作为对这些抗病毒测试和数据分析的方法的测试,还评估了模拟组合。由此推断许多明显的协同性(CI<0.9)不能与基于现有数据的测定间可变性区别开。然而,尽管这些方法的严格特征,PRO 140和小分子抑制剂在各种测试条件下均证明了显著的协同性,从而对该发现提供凭证。可以在将来的研究中探究在本调查中趋向显著性的CI值的组合。例如,PRO140/enfuvirtide组合的数据显示趋向显著性的适度协同性;因此该组合还可以对治疗HIV-1感染有效。
不断增多的数据显示mAb和小分子CCR5拮抗剂代表不同CCR5抑制剂的子集,并且一方面在NRTI和NNRTI间,及另一方面mAb和小分子CCR5拮抗剂间可以找出大量重要的相似之处。在每种情形中,在靶蛋白(反转录酶或CCR5)上对抑制剂存在着不同的结合基因座。一组抑制剂(NNRTI或小分子CCR5拮抗剂)通过变构机制作用,而另一组(NRTI或CCR5 mAbs)作为竞争抑制剂作用。如NRTI和NNRTI,mAb和小分子CCR5抑制剂在初步测试中是协同的并具有体外病毒耐受性的互补模式(Kuhmann等2004;Marozsan等2005)。尽管NRTI和NNRTI靶向相同的蛋白质,它们代表重要且不同的治疗种类,且mAb和小分子CCR5抑制剂可以相似地提供不同的HIV-1治疗形式。
部分IV
材料和方法
如本文上述制备和/或获得PRO 140和小分子CCR5拮抗剂。在存在或缺乏逐渐增加浓度的PRO 140或SCH-D的条件下,在外周血单核细胞(PBMCC)上每周体外传代原代R5HIV-1分离株JR-FL和案例C1/85(CC1/85),并检验病毒培养物对这些和其他CCR5抑制剂的易感性。为了易感性测试,在激活的PBMC上体外培养病毒。在存在和缺乏连续稀释药物的条件下,通过p24ELISA确定病毒复制的范围。
结果
对于JR-FL和CC1/85,在存在PRO 140和SCH-D的条件下产生了耐药性变体。在第12代,逃脱的突变体约10-100倍不易于受用于选择的药物影响。在各种情形中,逃脱的突变体为PBMC上的复制继续需要CCR5。观察到耐受性的互补模式:SCH-D逃脱突变体受到PRO 140的有效抑制,且PRO 140逃脱突变体受到SCH-D的有效抑制。
讨论
PRO 140逃脱突变体为了侵入继续需要CCR5,且维持对小分子CCR5拮抗剂的易感性。另外,PRO 140对耐受小分子CCR5拮抗剂的病毒具有活性。这些发现显示PRO 140和小分子CCR5拮抗剂可以代表CCR5抑制剂的不同子集。
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Claims (104)
1.减少受HIV-1感染的人类受试者中HIV-1病毒负荷的方法,其包括以预定的间隔向所述受试者施用有效HIV-1病毒负荷减少剂量的(a)人源化抗体,称为PRO140,或(b)抗CCR5受体单克隆抗体,其(i)与所述受试者体内的CD4+CCR5+细胞结合并抑制HIV-1与所述细胞的融合,(ii)以等于或高于PRO140的功效抑制HIV-1与CD4+CCR5+细胞的融合,(iii)在不减少所述受试者体内CD4+CCR5+细胞数量的条件下,包被所述受试者中的该细胞,和/或(iv)在不诱导循环β趋化因子的受试者血浆浓度增高的条件下,与所述受试者的CD4+CCR5+细胞结合,其中PRO140包括(i)两条轻链,每条轻链包括质粒pVK:HuPRO140-VK(ATCC保藏编号PTA-4097)的表达产物,和(ii)两条重链,每条重链包括质粒pVg4:HuPRO140HG2-VH(ATCC保藏编号PTA-4098)或质粒pVg4:HuPRO140(mut B+D+I)-VH(ATCC保藏编号PTA-4099)的表达产物,其中所述有效HIV-1病毒负荷减少剂量包括0.1mg/kg-10m/kg受试者体重,从而由此减少所述受试者的HIV-1病毒负荷。
2.权利要求1的方法,其中所述抗CCR5受体单克隆抗体结合CCR5表位,所述CCR5表位与PRO140结合的表位相同。
3.权利要求1的方法,其中所述抗CCR5受体单克隆抗体是人源化抗体、人抗体、或嵌合抗体。
4.权利要求1的方法,其中施用于所述受试者的抗体是抗体PRO140。
5.权利要求1或4的方法,其中所述有效病毒负荷减少剂量是0.25mg/kg-7.5mg/kg所述受试者体重。
6.权利要求5的方法,其中所述剂量是0.5mg/kg-5mg/kg所述受试者体重。
7.权利要求6的方法,其中所述剂量是1mg/kg-3mg/kg所述受试者体重。
8.权利要求7的方法,其中所述剂量是2mg/kg所述受试者体重。
9.权利要求1的方法,所述有效病毒负荷减少剂量足以在受试者体内获得至少400ng/ml的抗体血清浓度。
10.权利要求9的方法,其中所述以规定间隔施用的剂量足以在受试者体内获得并维持至少1μg/ml的抗体血清浓度。
11.权利要求10的方法,其中所述剂量足以在受试者体内获得并维持约3-约12μg/ml的抗体血清浓度。
12.权利要求10的方法,其中所述剂量足以在受试者体内获得并维持至少5μg/ml的抗体血清浓度。
13.权利要求12的方法,其中所述剂量足以在受试者体内获得并维持至少10μg/ml的抗体血清浓度。
14.权利要求13的方法,其中所述剂量足以在受试者体内获得并维持至少25μg/ml的抗体血清浓度。
15.权利要求14的方法,其中所述剂量足以在受试者体内获得并维持至少50μg/ml的抗体血清浓度。
16.权利要求1或4的方法,其中所述预定的间隔是至少每周一次。
17.权利要求16的方法,其中所述预定的间隔是每隔2-4周。
18.权利要求17的方法,其中所述预定的间隔是每隔2周。
19.权利要求17的方法,其中所述预定的间隔是每隔4周。
20.权利要求16的方法,其中所述预定的间隔是至少每月一次。
21.权利要求16的方法,其中所述预定的间隔是每隔6周。
22.权利要求16的方法,其中所述预定的间隔是每隔8周。
23.权利要求1或4的方法,其中所述受试者HIV-1病毒负荷的减少维持至少1周。
24.权利要求23的方法,其中所述受试者HIV-1病毒负荷的减少维持至少2周。
25.权利要求24的方法,其中所述受试者HIV-1病毒负荷的减少维持至少4周。
26.权利要求25的方法,其中所述受试者HIV-1病毒负荷的减少维持至少3个月。
27.权利要求1或4的方法,其中所述抗体通过静脉内灌输施用。
28.权利要求1或4的方法,其中所述抗体通过皮下注射施用。
29.权利要求1或4的方法,其中所述受试者的HIV-1病毒负荷在施用了所述抗体后减少至少50%。
30.权利要求29的方法,其中所述受试者的HIV-1病毒负荷在施用了所述抗体后减少至少70%。
31.权利要求30的方法,其中所述受试者的HIV-1病毒负荷在施用了所述抗体后减少至少90%。
32.权利要求1或4的方法,进一步包括向所述受试者施用至少一种抗HIV-1抗逆转录病毒试剂。
33.权利要求32的方法,其中所述抗HIV-1抗逆转录病毒试剂是非核苷反转录酶抑制剂(NNRTI),核苷反转录酶抑制剂(NRTI),蛋白酶抑制剂(PI),融合抑制剂,或其任意组合。
34.权利要求1或4的方法,其中所述受试者是首次用于治疗的。
35.权利要求1或4的方法,其中所述受试者是经历过治疗的。
36.权利要求1或4的方法,其中(a)在向所述受试者施用所述单克隆抗体前,所述受试者接受了至少一种抗HIV-1抗逆转录病毒试剂的治疗,和(b)在施用所述单克隆抗体的同时,所述受试者继续接受所述一种或多种试剂的治疗,由此增强所述受试者体内HIV-1病毒负荷的减少。
37.权利要求36的方法,其中所述抗HIV-1抗逆转录病毒试剂是非核苷反转录酶抑制剂(NNRTI),核苷反转录酶抑制剂(NRTI),蛋白酶抑制剂(PI),融合抑制剂,或其任意组合。
38.用于抑制人类受试者中HIV-1相关病症的发作或发展的方法,所述抑制受到抑制所述受试者体内HIV-1与CCR5+CD4+靶细胞融合的影响,所述方法包括以预定的间隔向所述受试者施用有效融合抑制剂量的人源化抗体PRO140,或抗CCR5受体抗体,所述人源化抗体PRO140或抗CCR5受体抗体(i)与所述受试者体内的CD4+CCR5+细胞结合并抑制HIV-1与所述细胞的融合,(ii)抑制HIV-1与所述受试者的CD4+CCR5+细胞的融合,抑制功效的特征在于10μg/ml或更低的IC90,(iii)在不减少所述受试者体内CD4+CCR5+细胞数量的条件下,包被所述受试者中的该细胞,和/或(iv)在不诱导受试者中循环β趋化因子的血浆浓度增高的条件下,与所述受试者的CD4+CCR5+细胞结合,其中PRO140包括(i)两条轻链,每条轻链包括质粒pVK:HuPRO140-VK(ATCC保藏编号PTA-4097)的表达产物,和(ii)两条重链,每条重链包括质粒pVg4:HuPRO140HG2-VH(ATCC保藏编号PTA-4098)或质粒pVg4:HuPRO140(mut B+D+I)-VH(ATCC保藏编号PTA-4099)的表达产物,其中每次施用所述抗体向所述受试者递送0.1mg/kg-10mg/kg所述受试者体重,从而由此抑制所述HIV-1相关病症在所述受试者体内的发作或发展。
39.用于降低人类受试者感染HIV-1感染可能性的方法,其包括以预定的间隔向受试者施用有效融合抑制剂量的人源化抗体PRO140或抗CCR5受体抗体,所述人源化抗体PRO140或抗CCR5受体抗体(i)与所述受试者体内的CD4+CCR5+细胞结合,并抑制HIV-1和所述细胞的融合,(ii)抑制HIV-1和受试者CD4+CCR5+细胞的融合,抑制功效的特征在于10μg/ml或更低的IC90,(iii)在不减少受试者体内CD4+CCR5+细胞数量的条件下,包被受试者的所述细胞,和/或(iv)在不诱导受试者循环β趋化因子的血浆浓度增高的条件下,与受试者的CD4+CCR5+细胞结合,其中PRO140包括(i)两条轻链,每条轻链包含质粒pVK:HuPRO140-VK(ATCC保藏编号PTA-4097)的表达产物,和(ii)两条重链,每条重链包含质粒pVg4:HuPRO140HG2-VH(ATCC保藏编号PTA-4098)或质粒pVg4:HuPRO140(mut B+D+I)-VH(ATCC保藏编号PTA-4099)的表达产物,其中每次施用所述抗体向受试者递送0.1mg/kg-10mg/kg受试者体重,从而由此降低受试者感染HIV-1感染的可能性。
40.权利要求39的方法,其中所述受试者已经暴露于HIV-1。
41.权利要求39的方法,其中所述受试者处于暴露于HIV-1的危险中。
42.用于减少受HIV-1感染的人类受试者中的HIV-1病毒负荷的方法,所述受试者已经形成了对抗HIV-1疗法形式的抵抗力,所述方法包括以预定的间隔向所述受试者施用有效HIV-1病毒负荷减少剂量的(a)人源化抗体PRO140,或(b)抗CCR5受体单克隆抗体,所述人源化抗体PRO140或抗CCR5受体单克隆抗体(i)与所述受试者体内的CD4+CCR5+细胞结合,并抑制HIV-1和所述细胞的融合,(ii)抑制HIV-1和CD4+CCR5+细胞的融合,抑制功效等于或高于PRO140的功效,(iii)在不减少受试者体内CD4+CCR5+细胞数量的条件下,包被受试者中的所述细胞,和/或(iv)在不诱导受试者循环β趋化因子的血浆浓度增高的条件下,与受试者的CD4+CCR5+细胞结合,其中PRO140包括(i)两条轻链,每条轻链包含质粒pVK:HuPRO140-VK(ATCC保藏编号PTA-4097)的表达产物,和(ii)两条重链,每条重链包含质粒pVg4:HuPRO140HG2-VH(ATCC保藏编号PTA-4098)或质粒pVg4:HuPRO140(mut B+D+I)-VH(ATCC保藏编号PTA-4099)的表达产物,其中所述有效HIV-1病毒负荷减少剂量包括0.1mg/kg-10mg/kg受试者体重,从而由此减少受试者HIV-1的病毒负荷。
43.权利要求42的方法,其中所述抗HIV-1疗法的形式包括施用非核苷反转录酶抑制剂(NNRTI),核苷反转录酶抑制剂(NRTI),蛋白酶抑制剂(PI),融合抑制剂,或其任意组合。
44.权利要求43的方法,其中所述融合抑制剂是非抗体CCR5拮抗剂。
45.权利要求44的方法,其中所述非抗体CCR5拮抗剂是小分子CCR5拮抗剂。
46.权利要求45的方法,其中所述小分子CCR5拮抗剂是口服施用的。
47.用于治疗受HIV-1感染的受试者的方法,包括向所述受试者施用有效治疗所述受试者的量的(a)单克隆抗体,其(i)与所述受试者CD4+细胞表面上的CCR5受体结合,并(ii)抑制HIV-1与所述受试者的CCR5+CD4+细胞的融合,和(b)非抗体CCR5受体拮抗剂。
48.权利要求47的方法,其中(a)和(b)是同时施用的。
49.权利要求47的方法,其中所述单克隆抗体是由杂交瘤细胞系PA14(ATCC编号HB-12610)产生的PA14,或与单克隆抗体PA14竞争结合于所述CCR5受体的抗体。
50.权利要求47的方法,其中所述单克隆抗体是人抗体,人源化抗体或嵌合抗体。
51.权利要求50的方法,其中所述单克隆抗体是人源化的。
52.权利要求50的方法,其中所述单克隆抗体是人源化抗体PRO140或与PRO140竞争结合于所述CCR5受体的抗体,其中PRO140包括(i)两条轻链,每条轻链包含质粒pVK:HuPRO140-VK(ATCC保藏编号PTA-4097)的表达产物,和(ii)两条重链,每条重链包含质粒pVg4:HuPRO140HG2-VH(ATCC保藏编号PTA-4098)或质粒pVg4:HuPRO140(mut B+D+I)-VH(ATCC保藏编号PTA-4099)的表达产物。
53.权利要求52的方法,其中所述单克隆抗体是人源化抗体PRO140。
54.权利要求47或53的方法,其中所述抗体是多次施用的,且每次施用的有效量包括0.01mg/kg-50mg/kg所述受试者体重。
55.权利要求54的方法,其中所述量是0.05mg/kg-25mg/kg所述受试者体重。
56.权利要求55的方法,其中所述量是0.1mg/kg-10mg/kg所述受试者体重。
57.权利要求56的方法,其中所述量是0.5mg/kg-5mg/kg所述受试者体重。
58.权利要求57的方法,其中所述量是1mg/kg-3mg/kg所述受试者体重。
59.权利要求58的方法,其中所述量是约2mg/kg所述受试者体重。
60.权利要求47或53的方法,其中所述抗体是以预定的间隔施用的,且所述预定的间隔是至少每周一次。
61.权利要求60的方法,其中所述预定的间隔是每隔2-4周。
62.权利要求61的方法,其中所述预定的间隔是每隔2周。
63.权利要求61的方法,其中所述预定的间隔是每隔4周。
64.权利要求47或53的方法,其中所述抗体是以预定的间隔施用的,且所述预定的间隔是至少每月一次。
65.权利要求47或53的方法,其中所述抗体是通过静脉内灌输施用的。
66.权利要求47或53的方法,其中所述抗体是通过皮下注射施用的。
67.权利要求47或53的方法,其中所述非抗体CCR5受体拮抗剂是小有机分子。
68.权利要求67的方法,其中所述CCR5受体拮抗剂是SCH-D,UK-427,857,TAK-779,TAK-652或GW873140。
69.权利要求47或53的方法,其中所述CCR5受体拮抗剂是与SCH-D竞争结合于所述CCR5受体的试剂。
70.权利要求47或53的方法,其中所述CCR5受体拮抗剂是与UK-427,857竞争结合于所述CCR5受体的试剂。
71.权利要求47或53的方法,其中所述CCR5受体拮抗剂是与TAK-779竞争结合于所述CCR5受体的试剂。
72.权利要求47或53的方法,其中所述CCR5受体拮抗剂是与TAK-652竞争结合于所述CCR5受体的试剂。
73.权利要求47或53的方法,其中所述CCR5受体拮抗剂是与GW873140竞争结合于所述CCR5受体的试剂。
74.权利要求67的方法,其中所述CCR5受体拮抗剂是多次施用的,且每次施用的有效量包括0.5mg-2,500mg。
75.权利要求74的方法,其中所述量是5mg-1,250mg。
76.权利要求74的方法,其中所述量是向所述受试者施用5mg-15mg所述拮抗剂。
77.权利要求76的方法,其中所述量是向所述受试者施用50mg-1,250mg所述拮抗剂。
78.权利要求77的方法,其中所述量是向所述受试者施用200mg-800mg所述拮抗剂。
79.权利要求78的方法,其中所述量是向所述受试者施用300mg-600mg所述拮抗剂。
80.权利要求67的方法,其中所述CCR5受体拮抗剂是每日一次或两次口服施用的。
81.权利要求68的方法,其中所述CCR5受体拮抗剂是每日三次或较少次口服施用的。
82.权利要求47或53的方法,进一步包括向所述受试者施用至少一种另外的抗逆转录病毒试剂。
83.权利要求82的方法,其中所述抗逆转录病毒试剂是非核苷反转录酶抑制剂(NNRTI),核苷反转录酶抑制剂(NRTI),蛋白酶抑制剂(PI),融合抑制剂,或其任意组合。
84.权利要求47或53的方法,其中所述受试者是首次用于治疗的。
85.权利要求47或53的方法,其中所述受试者是经历过治疗的。
86.用于抑制受试者中HIV-1相关病症的发作或发展的方法,所述抑制受到抑制所述受试者体内HIV-1与CCR5+CD4+靶细胞融合的影响,所述方法包括向所述受试者施用有效抑制所述受试者中HIV-1相关病症发作或发展的量的(a)单克隆抗体,其(i)与所述受试者CD4+细胞表面上的CCR5受体结合,并(ii)抑制HIV-1与所述受试者的CCR5+CD4+细胞的融合,和(b)非抗体CCR5受体拮抗剂。
87.用于降低受试者感染HIV-1感染可能性的方法,其包括向所述受试者施用有效降低所述受试者感染HIV-1感染可能性的量的(a)单克隆抗体,其(i)与所述受试者CD4+细胞表面上的CCR5受体结合,并(ii)抑制HIV-1与所述受试者的CCR5+CD4+细胞的融合,和(b)非抗体CCR5受体拮抗剂。
88.权利要求87的方法,其中所述受试者已经暴露于HIV-1。
89.权利要求87的方法,其中所述受试者处于暴露于HIV-1的危险中。
90.用于加强(i)抗CCR5受体单克隆抗体或(ii)非抗体CCR5受体拮抗剂在治疗受试者体内HIV-1感染中的HIV-1抑制活性的方法,其包括:向受试者施用HIV-1抑制活性加强量的抗CCR5受体单克隆抗体和HIV-1抑制活性加强量的非抗体CCR5受体拮抗剂的组合,其中所述组合对抑制HIV-1感染产生协同作用,由此加强(i)所述抗CCR5受体单克隆抗体或(ii)所述非抗体CCR5受体拮抗剂的抑制活性。
91.权利要求90的方法,其中由于所述协同作用,所述非抗体CCR5受体拮抗剂导致抗CCR5受体单克隆抗体约4-10倍的剂量减少,且所述抗CCR5受体单克隆抗体导致所述非抗体CCR5受体拮抗剂约3-16倍的剂量减少。
92.权利要求90的方法,其中所述方法包括HIV-1抑制活性加强量的一种或多种非抗体CCR5受体拮抗剂。
93.权利要求90的方法,其中所述方法包括HIV-1抑制活性加强量的一种或多种抗CCR5受体单克隆抗体。
94.权利要求90的方法,其中所述抗CCR5受体单克隆抗体和所述非抗体CCR5受体拮抗剂是同时施用于所述受试者的。
95.权利要求88或权利要求90的方法,其中所述单克隆抗体是由所述杂交瘤细胞系PA14(ATCC编号HB-12610)产生的PA14,或与单克隆抗体PA14竞争结合于所述CCR5受体的抗体。
96.权利要求88或权利要求90的方法,其中所述单克隆抗体是人源化抗体PRO140或与PRO140竞争结合于所述CCR5受体的抗体,其中PRO140包括(i)两条轻链,每条轻链包含质粒pVK:HuPRO140-VK(ATCC保藏编号PTA-4097)的表达产物,和(ii)两条重链,每条重链包含质粒pVg4:HuPRO140HG2-VH(ATCC保藏编号PTA-4098)或质粒pVg4:HuPRO140(mut B+D+I)-VH(ATCC保藏编号PTA-4099)的表达产物。
97.权利要求96的方法,其中所述单克隆抗体是人源化抗体PRO140。
98.权利要求88或权利要求90的方法,其中所述单克隆抗体是CCR5mAb004或2D7。
99.权利要求88,89或90的方法,其中所述非抗体CCR5受体拮抗剂是SCH-D,TAK-779,TAK-652,UK-427,857,RANTES,GW873140,或其组合。
100.权利要求99的方法,其中所述非抗体CCR5受体拮抗剂是小有机分子,其与SCH-D竞争结合于所述CCR5受体。
101.权利要求99的方法,其中所述非抗体CCR5受体拮抗剂是小有机分子,其与UK-427,857竞争结合于所述CCR5受体。
102.权利要求99的方法,其中所述非抗体CCR5受体拮抗剂是小有机分子,其与TAK-779竞争结合于所述CCR5受体。
103.权利要求99的方法,其中所述非抗体CCR5受体拮抗剂是小有机分子,其与TAK-652竞争结合于所述CCR5受体。
104.权利要求99的方法,其中所述非抗体CCR5受体拮抗剂是小有机分子,其与GW873140竞争结合于所述CCR5受体。
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Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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CN102905698A (zh) * | 2010-04-02 | 2013-01-30 | 菲弗科-1有限责任公司 | 包含ccr5拮抗剂、hiv-1蛋白酶抑制剂和药代动力学增强剂的组合疗法 |
CN106661113A (zh) * | 2014-08-20 | 2017-05-10 | 西托戴恩股份有限公司 | Hiv抗体治疗作为治疗替代 |
CN107188928A (zh) * | 2017-06-30 | 2017-09-22 | 河南大学淮河医院 | 四种具有结合hiv‑1病毒ccr5共受体活性的多肽及其应用 |
CN111886249A (zh) * | 2017-09-18 | 2020-11-03 | 西托戴恩股份有限公司 | 用于鉴定和治疗适合长期抗-ccr5剂治疗的hiv-1感染患者亚群的筛选方法 |
WO2024008177A1 (en) * | 2022-07-08 | 2024-01-11 | Nanjing Curegene Technology Co., Ltd. | Engineered cells and uses thereof |
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2006
- 2006-07-21 CN CNA2006800345119A patent/CN101495145A/zh active Pending
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