CN107188928A - 四种具有结合hiv‑1病毒ccr5共受体活性的多肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了四种具有结合HIV‑1病毒CCR5共受体活性的多肽，其氨基酸序列如下所示：（1）序列Ⅰ：SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，（2）序列Ⅱ：SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，（3）序列Ⅲ：SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，（4）序列Ⅳ：SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。本发明提供的四种具有结合HIV‑1病毒CCR5共受体活性的多肽可通过化学合成法得到，或者通过基因工程方法从细胞中表达得到。上述四种多肽可以单独使用，也可以组合使用，发明人预期，当组合使用时，其具有更高的特异性和药效。本发明通过噬菌体展示技术筛选得到四个小分子活性肽，四个多肽具有拮抗CCR5共受体的功能，具有潜在的药用价值。

Description

四种具有结合HIV-1病毒CCR5共受体活性的多肽及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及四种具有结合HIV-1病毒CCR5共受体活性的多肽及其应用。

背景技术

艾滋病(AIDS)是威胁人类健康的重大传染病之一，它是由I型人类免疫缺陷病毒(HIV-1)感染CD4⁺T淋巴细胞所导致的免疫功能缺陷疾病。HIV-1入侵宿主细胞需要CD4受体和共受体CCR5或CXCR4的共同作用。HIV-1是导致全球艾滋病流行的主要病毒亚型，CCR5是大多数HIV-1流行株的传播所需的共受体，HIV-1通过gp120与CD4受体作用引起构相变化从而暴露共受体CCR5的结合位点，通过与CD4和共受体的相互作用从而感染宿主细胞。趋化因子受体CCR5在HIV-1进入宿主细胞过程中的关键作用加上CCR5基因中32个碱基对的缺失导致受体功能的缺失的个体能够抵御HIV-1的感染，因此CCR5可以作为艾滋病预防与治疗的重要研究位点，用来研究HIV-1受体拮抗剂。目前所研究的HIV-1受体拮抗剂主要有4种：趋化因子衍生物、非肽类小分子拮抗剂、肽类拮抗剂和单克隆抗体。

肽类拮抗剂具有安全性高，毒副作用低的优点，CCR5肽类受体拮抗剂能够通过与CCR5的胞外结构域相互作用从而抑制HIV-1的侵染。目前肽类拮抗剂主要通过噬菌体展示技术来筛选。噬菌体展示技术通过把外源DNA融合表达在噬菌体的衣壳蛋白上从而在噬菌体表面展示多肽，利用噬菌体多肽库与靶分子相互作用，在适当的淘选条件下通过几轮淘选除去非特异性结合的噬菌体，最后筛选出能够与靶分子特异性相互作用的噬菌体。通过DNA测序便可以获得筛选出来的多肽的序列信息，这种技术已经广泛用于多肽药物的筛选，蛋白质之间相互作用的研究，新型疫苗的研制等方面。

趋化因子受体CCR5由八个跨膜α-螺旋组成，它们连接了三个胞内环(ICL)和三个细胞外环(ECL)，在HIV-1进入过程中ECL2形成β-发夹结构并与gp120的v3环相互作用，从而促进膜融合。MCP-3是CCR5的天然拮抗剂，MIP-1α，MIP-1β和RANTES是由CD8⁺T细胞产生的HIV抑制因子(HIV-SF)，可诱导CCR5内吞作用并有助于控制HIV的感染。目前，已经将7种趋化因子确定为CCR5配体，包括MIP-1α，MIP-1β，RANTES，AOP-RANTES，MCP-2，MCP-3和MCP-4。CCR5特异性结合多肽能够发挥与这些配体相似的功能，从而抑制HIV-1的感染，因此我们利用稳定表达CCR5的GHOST细胞从噬菌体肽库中进行淘选，期望可以获得能够与CCR5发生特异性结合的多肽。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供四种具有结合HIV-1病毒CCR5共受体活性的多肽及其应用。

本发明的目的是以下述方式实现的：

四种具有结合HIV-1病毒CCR5共受体活性的多肽，其氨基酸序列如下所示：

(1)序列Ⅰ：SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，

(2)序列Ⅱ：SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，

(3)序列Ⅲ：SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，

(4)序列Ⅳ：SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。

如上述的多肽在制备抑制HIV-1病毒活性的药物中的应用，上述的多肽通过抑制HIV-1病毒与CCR5受体结合从而抑制HIV-1病毒活性。

一种抗HIV-1病毒药物，其活性成分包括至少一种上述的多肽。

本发明利用噬菌体筛选技术，通过稳定表达CCR5的GHOST细胞从噬菌体肽库中筛选CCR5结合多肽。本发明利用蓝白斑筛选的原理对淘选的噬菌体进行滴度测定，用来表达多肽的噬菌体是M13KE噬菌体，这种噬菌体具有β-半乳糖苷酶α基因(lacZα)而宿主菌ER2738具有β-半乳糖苷酶ω基因(lacZω)基因，从而通过α-互补产生有活性的β-半乳糖苷酶。当噬菌体感染宿主菌之后在异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)的诱导下可以将无色化合物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝，因此在LB/IPTG/X-gal平板上被噬菌体感染的菌落显蓝色。

应用噬菌体展示技术可以进行高通量筛选，从数十亿的序列中筛选我们想要目的序列。本发明通过细胞筛选法从噬菌体随机肽库中经过四轮淘选富集了能够与CCR5结合的多肽，通过稳定表达CCR5的细胞来筛选多肽能够保证CCR5处于天然的结构，更有利于筛选具有抗HIV-1活性的拮抗多肽。将经过四轮淘选之后得到的单克隆扩增纯化进行ELISA鉴定分析，最终检测结果表明淘选得到的噬菌体中有8个是阳性克隆，本发明所淘选出来的8个克隆可以进一步用于研究其抗病毒活性。

噬菌体表面展示技术是一种对多肽功能非常有效的筛选技术，及将外源蛋白分子或多肽的基因克隆到丝状噬菌体基因组中，与噬菌体膜外蛋白融合表达，展示在噬菌体颗粒的表面。由于外源蛋白或多肽的基因型和表型统一在同一噬菌体颗粒内，因此，通过表型筛选就可以获得他的编码基因。基于生物分子与药物靶分子的亲和力，应用噬菌体表面展示技术可以从多肽库中进行快速筛选，从而成为药物开发的强有力工具。

在本发明中，以ECL2+NT为靶分子，通过三轮淘选，随着淘选轮次的增加，回收率逐步提高，证明能够与靶分子特异性结合的噬菌体多肽得到了富集，通过ELISA鉴定，得到14个阳性克隆，由此可以看出通过噬菌体展示肽库技术可以得到所需的短肽。同时这类短肽具有亲和力高，特异性强的特点，生产成本低，稳定性好，毒副作用小，对于治疗HIV具有很大的研究和开发空间。

本发明提供的四种具有结合HIV-1病毒CCR5共受体活性的多肽可通过化学合成法得到，或者通过基因工程方法从细胞中表达得到。上述四种多肽可以单独使用，也可以组合使用，发明人预期，当组合使用时，其具有更高的特异性和药效。本发明通过噬菌体展示技术筛选得到四个小分子活性肽，四个多肽具有拮抗CCR5共受体的功能，具有潜在的药用价值。

附图说明

图1是细胞法ELISA鉴定CCR5结合多肽噬菌体，Blank：空白对照，用GHOST(3)-CCR5铺板，但不加噬菌体，NC：阴性对照，不铺细胞加入与其他实验孔等量噬菌体。

图2是多肽法的阳性克隆与阴性克隆的吸光值。

图3是淘选出的噬菌体上的氨基酸序列对比。

具体实施方式

噬菌体展示技术是肽类药物研发的常用技术之一，其条件已十分成熟并有商业试剂盒出售，而研发的关键在于靶分子的选择及后续效果的验证。

主要实验材料和试剂：GHOST(3)-CCR5细胞，GHOST(3)-CXCR4细胞来源于NIH AIDSReagent Reference，HRP-M13抗体购自GE Healthcare公司，噬菌体表面展示肽库试剂盒Ph.D.TM-7随机肽库购自New England BioLabs公司。人源CCR5胞外结构域多肽(ECL-2多肽氨基酸序列为TRSQKEGLHYTCSSHFPYSQYQFWKNFQTLK；NT多肽氨基酸序列为MDYQVSSPIYDINYYTSEPCQKINVKQIAA)合成自上海吉尔生化公司。DMEM细胞培养基购自Hyclone。PEG8000购自于Sigma-Aldrich公司。

1.实验过程

1.1.细胞法噬菌体淘选

将GHOST(3)-CXCR4细胞接种在6孔板中加入7.5×10⁶细胞，加入2×10¹¹pfu噬菌体4℃缓缓慢摇动动结合2h，4℃，500×g离心5min，将上清移入6孔板中，加入1.1×10⁶个GHOST(3)-CCR5细胞4℃缓慢摇动结合2h。用PBST(0.1％Tween 20)+1％BSA洗细胞5次，每次洗涤时均在4℃缓慢摇动5min，4℃、500×g离心5min弃上清后加入1mlGlycine-HCl(pH2.2，1mg/ml BSA)重悬，冰上放置10min。4℃，500×g离心5min，上清转入1.5ml离心管中加150μl1MTris-HCl(pH9.1)混匀后放4℃储存。重复以上淘选步骤4次，后两轮淘选时把Tween-20浓度提高至0.3％，每轮淘选之后均测定噬菌体滴度，四次不同轮次噬菌体淘选的回收率分别为1.2×10^-6，2.0×10^-7，7.5×10^-6和1.2×10^-6。

1.2.多肽法噬菌体淘选

分别将ECL2冻干粉溶于550μl 0.1M pH8.6的NaHCO₃溶液，NT冻干粉溶于550μl的DMSO中，-20℃保存备用。制备100μg/mL的靶分子溶液(ECL2或ECL2+NT)包被96孔板，每孔150μl，反复旋转至完全浸润。4℃轻微振荡，孵育过夜。用移液枪将包被液剩余残液吸取干净，弃掉。加满封闭液，4℃作用1h。去除封闭液，用移液枪使液体完全除净。用TBST缓冲液洗板6次，每次每孔加入300μl，作用3min。加入10μl的2×10¹¹pfu的噬菌体，并用TBST稀释至100μl，加到已包被好的孔中，室温温和摇动1h。(二、三轮淘选每次加入噬菌体的滴度均为10¹¹pfu)。用移液枪吸取含有未结合的噬菌体残夜，TBST缓冲液洗板10次，加入100μl非特异性缓冲液(0.2M pH2.2Glycine-HCl+1g/LBSA)，室温振摇15min，将洗脱液吸入另一干净微量离心管中，用15μl 1M Tris-HCl(pH 9.1)中和上述洗脱液。将洗脱液在4℃保存至扩增或滴度测定使用。同时取1μl测定洗脱物的滴度。每轮淘选之后均测定噬菌体滴度，三次不同轮次噬菌体淘选的回收率分别为8.5×10^-6，3.5×10^-7和6.6×10^-7。

1.3.噬菌体扩增

挑ER2738单克隆于10ml LB/Tet溶液中，37℃，250rpm揺菌过夜，次日将摇好的菌液按1:100稀释于20ml LB培养基中，加入前一日淘选洗脱下来的噬菌体在37℃，250rpm揺4～5h。将培养液转入50ml离心管，4℃、4000×g离心10min，将16ml上清液转入新的离心管，加入4ml 20％PEG8000/2.5M NaCl混匀后冰上放置2h。4℃，12000×g离心10min，弃上清，加入1ml TBS重悬，转入1.5ml离心管放置10min。4℃，12000×g离心1min，上清转入新的离心管，加入167μl 20％PEG8000/2.5M NaCl溶液，混匀后冰上放置15min。4℃，12000×g离心10min，弃上清，用微量移液枪尽量除去残余液体，用200μl TBS重悬后便得到扩增的噬菌体，放于4℃储存。

1.4.噬菌体滴度测定

挑ER2738在10ml LB中，在37℃，250rpm揺至OD₆₀₀约0.5(对数中期)，将菌液分装200μl每管，将淘选洗脱下来的噬菌体按10、10²、10³倍稀释至1ml(扩增后的噬菌体按10⁸、10⁹、10¹⁰倍稀释)。分别在分装的菌液中加10μl稀释好的洗脱物，快速涡旋混匀，室温放置5min。将顶层琼脂微波加热融化后分装3ml每管，保证顶层琼脂流动性良好且温度低于55℃。将孵育好的菌液加入顶层琼脂中混匀，迅速倒在37℃预温1h的LB/IPTG/X-gal平板上，待琼脂凝固后将平板倒置于37℃恒温箱孵育过夜。

1.5.细胞法ELISA分析

用GHOST-CCR5细胞包被96孔板，待细胞贴壁长满后用100μl PBS洗1次，每孔加100μl0.25％戊二醛室温固定8min，再用100μlPBS洗3次，之后每孔加入200μl封闭液室温缓慢摇动动封闭1h，用清洗液(含3％Tween20的PBS)洗板5次，每次缓慢摇动3min在纸巾上将残余液体拍打干净。提前挑ER2738单克隆在10ml LB/Tet中揺菌过夜，次日将菌液1:100稀释于5ml LB培养基同时加入从四轮洗脱后滴度测定的平板上挑选的噬菌体单克隆，在37℃，250rpm揺菌4h。然后4℃，4000×g离心10min，将4ml上清液转入新的15ml离心管中，加入1ml20％PEG8000/2.5M NaCl混匀后冰上放置2h。4℃，12000×g离心10min，弃上清，加入500μlTBS重悬，转入1.5ml离心管冰上放置10min。4℃，12000×g离心1min，上清转入新的离心管，加入83μl20％PEG8000/2.5M NaCl，混匀后冰上放置15min。4℃，12000×g离心10min，弃上清，用50μl TBS重悬后进行滴度测定，之后每个样品取约10¹¹pfu用PBST(含3％Tween20)稀释至200μl，分别加入各孔，室温下缓慢摇动动结合2h。用清洗液洗板5次，清洗步骤与之前相同。每孔加入200μl用封闭液按1:6000倍稀释的HRP-M13抗体，室温下缓慢摇动结合1h。用清洗液洗板5次，每孔加200μl 2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)显色液在室温条件下避光反应30min后测OD₄₀₅。

1.6.多肽法ELISA分析

制备100μg/ml的ECL2和ECL2+NT靶分子溶液(方法同淘选步骤)包被96孔板，每孔150μl，每个待鉴定克隆1个包被孔及阴性对照孔，4℃孵育过夜。第2天去除残液，加满封闭液(PBS+0.5％脱脂奶粉)4℃作用1.5h(同时每个克隆设置阴性对照，不加靶分子溶液，仅加入封闭液，其他步骤相同)。甩出封闭液，0.5％TBST洗板6次。包被孔和阴性对照孔各加入10μl噬菌斑扩增液，加入0.5％TBST稀释至100μl，室温振荡作用1.5h。0.5％TBST洗板6次，每孔加入200μlHRP/anti-M13抗体(1∶6000稀释)，室温振荡作用1h。0.5％TBST洗板6次，每孔加200μl显色底物ABTS-H₂O₂溶液，室温作用30min，酶标仪读取405nm处的吸光度。

1.7.噬菌斑扩增测序

ELISA鉴定的噬菌体克隆分别接种到培养管中。37℃摇床培养4.5h。14 000×rpm离心30s，上清液转入新鲜离心管中，再离心，取80％的上清到另一离心管，即为扩增的噬菌体贮液。取200μl噬菌体扩增物送金唯智生物科技有限公司进行测序分析。

2.实验结果

2.1细胞法淘选结果

将GHOST(3)-CXCR4与GHOST(3)-CCR5细胞进行传代培养用于淘选，首先用PBST稀释2×10¹¹pfu的噬菌体，使其先与GHOST(3)-CXCR4细胞结合以除去非特异性结合的噬菌体，再将剩余噬菌体与GHOST(3)-CCR5细胞结合。用含1％BSA的PBST洗涤细胞5次。最后用Glycine-HCl(pH2.2,1mg/ml BSA)洗脱噬菌体。利用蓝白斑筛选的原理测定噬菌体滴度，计算回收率，将洗脱下来的噬菌体扩增后继续投入淘选，富集能与CCR5特异性结合的噬菌体，进行4轮淘选。四轮淘选之后的噬菌体稀释之后进行滴度测定，在10倍稀释的LB/IPTG/Xgal平板上挑选24个间隔良好的蓝色噬菌斑进行扩增，扩增产物取10μl进行滴度测定，测定结果是噬菌体滴度约3.2×10¹¹pfu/10μl。ELISA分析时分别取10μl噬菌体扩增产物用PBST(含3％Tween20)稀释至200μl后加入各孔，并设置空白对照与阴性对照，OD₄₀₅检测结果如表1所示，其中14，15，16，18，19，20，22和23号克隆的吸光度均大于空白对照的两倍以上，可以认定为阳性克隆，即这几个噬菌体表面展示的多肽与GHOST细胞表面的CCR5受体有特异性结合。8个阳性克隆结果如图1所示。

表1 ELISA分析细胞法淘选得到的噬菌体克隆与CCR5的结合能力

2.2多肽法亲和淘选与CCR5第二胞外环及N末端特异性结合的噬菌体

CCR5的生理功能主要通过其胞外部分的N端和第二胞外环来实现，以人工合成的ECL2及ECL2+NT作为靶分子，对噬菌体7肽库共进行了3轮筛选。随淘选次数的增加，同时增加洗脱强度，从固相平板(96孔板)上洗脱下来的噬菌体数量逐渐增加，回收率逐轮提高，证明能与靶分子ECL2+NT特异性结合的噬菌体得到了富集。经过3轮淘选之后的噬菌体稀释之后进行滴度测定，在10倍稀释的LB/IPTG/Xgal平板上挑选间隔良好的蓝色噬菌斑进行扩增，扩增产物取10μl进行滴度测定，测定结果是噬菌体滴度约7.1×10¹¹pfu/10μl。将噬菌斑扩增后做ELISA检测，同时设置阴性对照(不包被靶分子，只加入含有脱脂奶粉的PBS作为封阻液进行封阻)。挑选出能与ECL2结合的克隆有9个，能与ECL2+NT结合的30个克隆中有14个阳性克隆，16个阴性克隆。本实验中阳性克隆为OD₄₀₅值高于阴性对照OD₄₀₅值的2倍(见表2及图2)。

表2 ELISA法鉴定ECL2和ECL2+NT淘选所得噬菌体克隆的结合能力

2.3噬菌体克隆氨基酸序列的分析

通过对噬菌体克隆氨基酸的分析获得28条序列，如表3和图3所示，其中CCR5-开头的为细胞法淘选出的氨基酸序列，ECL2开头的为多肽法淘选出的氨基酸序列。其中基于细胞淘选的共有序列为序列Ⅰ：AWPYVTL，多肽淘选的共有序列为序列Ⅱ：SPSTNPS，细胞和多肽淘选的共有序列为序列Ⅲ：GFHYSLH和序列Ⅳ：LETVVSS。因此，以上4个七肽序列均是可以结合CCR5的多肽，尤其是基于细胞和多肽淘选的共有序列。

表3 细胞法淘选所得噬菌体克隆的氨基酸序列

表4 多肽法淘选所得噬菌体克隆的氨基酸序列

以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明整体构思前提下，还可以作出若干改变和改进，这些也应该视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南大学淮河医院

<120> 四种具有结合HIV病毒CCR5共受体活性的多肽及其应用

<130> 1

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Ala Trp Pro Tyr Val Thr Leu

1 5

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Ser Pro Ser Thr Asn Pro Ser

1 5

<210> 3

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Gly Phe His Tyr Ser Leu His

1 5

<210> 4

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Leu Glu Thr Val Val Ser Ser

1 5

Claims (3)

1.四种具有结合HIV-1病毒CCR5共受体活性的多肽，其氨基酸序列如下所示：

（1）序列Ⅰ：SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，

（2）序列Ⅱ：SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，

（3）序列Ⅲ：SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，

（4）序列Ⅳ：SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。

2.如权利要求1所述的多肽在制备抑制HIV-1病毒活性的药物中的应用，其特征在于：权利要求1所述的多肽通过抑制HIV-1病毒与CCR5受体结合从而抑制HIV-1病毒活性。

3.一种抗HIV-1病毒药物，其活性成分包括至少一种权利要求1所述的多肽。