CN101412750B - 三肽囊素特异性结合肽及筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种三肽囊素特异性结合的短肽及其筛选方法，属于生物技术领域。本发明筛选的短肽氨基酸序列分别为短肽1：ACTKHLCLLQPL或短肽2：MSCNDTLCLLPN。用重组的TRX-BS融合蛋白作为靶分子，利用噬菌体展示技术筛选与靶分子特异结合的肽，包括噬菌体12肽库的亲和筛选，噬菌体克隆的ELISA鉴定，最后噬菌体阳性克隆DNA的制备及序列测定。经试验研究表明，该短肽能不同程度的抑制囊素与杂交瘤细胞的结合。为囊素免疫佐剂以及囊素抑制肽的研究开发有着很好的应用前景。

Description

三肽囊素特异性结合肽及筛选方法

技术领域

本发明涉及三肽囊素特异性结合肽及筛选方法，属于生物技术领域，涉及从噬菌体肽库中筛选到能与三肽囊素的结合肽。可抑制囊素分子与杂交瘤细胞的结合，为进一步研究囊素分子生物学特性奠定了基础。

背景技术

噬菌体随机肽库技术是将编码外源肽的DNA序列插入噬菌体表面编码外壳蛋白的基因中，使大量的随机肽段以融合形式表达在噬菌体的表面。通过分析筛选出来的多肽，以探求蛋白质分子之间的相互作用。

法氏囊(bursa of Fabricus，BF)最早于1961年发现，同时并确定了腔上囊的形态和位置，由此而命名为bursa of Fabricus。法氏囊是禽类特有的体液免疫的中枢淋巴器官，位于泄殖腔背侧，其盲端呈囊状，朝向躯体前端，颈部以短柄朝向躯体后下方，开口于泄殖腔。1986年首次报道鸡的法氏囊中分离到囊素(bursin，BS)。经质谱鉴定分析，认为得到BS是一种三肽排列结构的物质，其氨基酸组成顺序为Lys-His-Gly-NH2，其中Lys:His:Gly:NH2为1:0.9:1:0.8。并证明它能诱导B细胞前体的分化，这是从法氏囊得到且有关B细胞发育的第一个结构明确的活性因子。

许多学者对BS促进高水平抗体产生的机理进行了研究。已有结果证实BS能提高血清中第二信使cGMP的含量，增加了cGMP和cAMP的比值，提高了B细胞将DNA转录成mRNA的速度，促进了B细胞内蛋白质(即抗体)的合成，从而提高了血清中特异性抗体水平。抗体效价的升高与单纯的细胞数量增加没有直接关系，从而表明囊素提高杂交瘤细胞抗体的分泌不是通过促进细胞增殖实现的，而可能是诱发细胞的一系列复杂的生化变化过程来完成的。目前已知的B细胞信号传递途径包括：蛋白酪氨酸磷酸化途经，磷脂酰肌醇(PI)途经，磷脂酰肌醇-3-激酶(PI-3-K)和磷脂酶C(PKC)途经，G蛋白偶联的信号传导途经，至于囊素的作用机理如何尚须进一步研究。

发明内容

技术问题

本发明的目的在于利用噬菌体展示技术筛选能与三肽囊素特异结合的结合肽，可抑制囊素分子与杂交瘤细胞的结合，为进一步研究囊素分子生物学特性奠定了基础。

技术方案

本发明所述的结合肽氨基酸序列为：ACTKHLCLLQPL；或MSCNDTLCLLPN。

筛选上述结合肽的方法，其步骤如下：

1)噬菌体12肽库的亲和筛选

(1)预筛选：将硫氧还蛋白-囊素融合蛋白TRX-BS以TBS稀释为100ug/ml，并按与TRX-BS相同的稀释倍数稀释空质粒表达产物TRX，分别取稀释后的TRX-BS和空质粒表达产物TRX包被酶标板，100μl/孔，放置湿盒中4℃过夜；次日倾弃包被液，加入含0.05％Tween20的TBST洗涤3次，扣干，然后以含3％BSA的TBS按100μl/孔加入各孔，置湿盒中37℃封闭2小时；倾弃封闭液，以含0.05％Tween20的TBST溶液洗涤3次(每次静置3min)，叩干，以TBST稀释原始文库至1×10¹¹pfu/ml，取稀释后的文库液100μl加入到预先包被空质粒表达产物TRX的酶标板微孔内，于湿盒中37℃放置2小时，吸出孔内液体，并用100μl TBS清洗微孔一次，合并吸出的孔内液和清洗液为预筛选液。

(2)亲和筛选：将100μl的预筛选液加入到预先包被TRX-BS的酶标板微孔内，放置湿盒中4℃过夜，弃孔内液体，并用TBST清洗10次，向微孔中加入100μl0.2M Glycine-HCl(pH2.2)，于室温温和摇动10min，洗脱液吸入另一干净微量离心管中。然后再用15μl1MTris-HCl(pH9.1)中和上述洗脱液。测定少量洗脱物的滴度。剩余洗脱物加入到20mlER2738培养物中(菌体应当处于对数前期)，37℃剧烈摇动培养4.5hr。根据常规M13方法进行第一轮噬菌体洗脱物的扩增。将第一轮筛选后的噬菌体液以TBS稀释为1×10¹⁰pfu/ml，取100μl加入到预先包被TRX-BS的酶标板微孔中进行第二轮筛选，37℃温育2小时，弃孔内液体，并用含0.05％Tween20的TBST溶液清洗10次，同上进行筛选后噬菌体的扩增和滴度的测定，重复以上步骤进行第四轮筛选。

2)噬菌体克隆的ELISA鉴定

(1)ELISA检测噬菌体展示短肽对靶分子的的结合活性：用100ul100μg/ml的靶分子TRX-BS(溶于0.1M pH8.6NaHCO3中)包被ELISA板的每个孔，并设TRX蛋白对照。在密封的湿盒中4℃包被过夜。经封闭液，4℃封闭1h后，PBST洗涤，加入100uL待测单个克隆的噬菌体上清(稀释至：10¹¹pfu/mL)为待测短肽，室温反应1h。PBST洗涤后，加入稀释至工作浓度的抗M13-HRP结合物，室温反应1h。PBST充分洗涤，加入TMB底物显色溶液，室温30min，后加50ul2M的H2SO4终止反应，测OD450值。

(2)竞争抑制试验：在湿盒中，包被靶分子TRX-BS并封闭，加入100uL不同浓度(25ug/ml、50ug/ml、100ug/ml、150ug/ml、200ug/ml)的人工合成的BS肽与上述阳性单克隆噬菌体(稀释至：10¹¹pfu/mL)等体积混合，室温作用10min，每孔100μL，室温轻摇孵育1h。PBS/Tween洗6次，加HRP-偶联抗M13抗体，室温轻摇孵育1h，PBS/Tween洗6次，加TMB底物显色，酶标仪上读OD₄₅₀值。

3)噬菌体阳性克隆DNA的制备及序列测定

将噬菌体阳性克隆提取其单链DNA后，用-96gIII测序引物交由上海英俊生物有限公司测序。分析噬菌体插入的12肽的氨基酸序列。

有益效果

本发明提供的结合肽，能与三肽囊素特异性结合。可抑制囊素分子与杂交瘤细胞的结合，为进一步研究囊素分子生物学特性奠定了基础。同时本发明所述的三肽囊素特异性结合肽筛选方法，也为其他小肽分子筛选结合肽提供了切实可行的技术方案。流式细胞仪分析结果，短肽1在高于400ug/ml浓度时能明显抑制杂交瘤细胞与BS的结合，抑制率呈显著差异(P<0.05)(图5A)。而短肽2高于800ug/ml浓度时能抑制杂交瘤细胞与BS的结合，抑制率呈显著差异(P<0.05)(图5B)。表明结合肽短肽1、短肽2在不同程度能特异性抑制囊素与杂交瘤细胞的结合。为囊素免疫佐剂以及囊素抑制肽的研究开发有着很好的应用前景。

附图说明：

图1ELISA检测噬菌体展示短肽对靶分子的的结合活性

图2竞争抑制试验结果

图3细胞免疫荧光实验

图4流式细胞仪分析杂交瘤细胞与BS的特异性结合

图5结合肽P3、P5抑制囊素与杂交瘤细胞的特异性结合

A：结合肽P3：200ug/ml、400ug/ml、600ug/ml、800ug/ml、1mg/ml时杂交瘤细胞与BS的结合率

B：结合肽P5：200ug/ml、400ug/ml、600ug/ml、800ug/ml、1mg/ml时杂交瘤细胞与BS的结合率

具体实施方式：

实验材料：

1随机十二肽噬菌体展示文库

以丝状噬菌体M13为载体构建的噬菌体展示的随机12肽库试剂盒(P.h.D-12PhageDisplay peptide Library Kit)100ul，1.5×10¹³pfu/ml。贮存于含50％甘油的TBS溶液中。复杂度～2.7×10⁹个转化子。

-28gIII测序引物

5’-GTATGG GAT TTT GCT AAA CAA C-3’，100pmol，1pmol/μl

·-96gIII测序引物

5’-CCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3’，100pmol/μl，1pmol/μl

E.coli ER2738大肠杆菌宿主菌

F’lacIq Δ(lacZ)M15proA+B+zzf::Tn10(TetR)/fhuA2supE thi Δ(lac-proAB)Δ(hsdMS-mcrB)5(rk^-m k^-McrBC^-)。该菌株以含50％甘油的菌体培养物形式提供，非感受态细胞。贮存于-70℃。以上均为美国New England Biolabs公司产品。

2抗体

HRP-抗M13mAb为Pharmaeia公司产品。

3蛋白

TRX-BS融和蛋白、TRX蛋白由本实验室参照文献“‘Bursin as an adjuvant is a potentenhancer of immune response in mice immunized with the JEV subunit vaccine.VeterinaryImmunology and Immunopathology，Volume122，Issues3-4，15April2008，Pages265-274.”制备保存。

4人工合成多肽BS以及带有荧光标记的FITC-BS由西安华辰有限公司合成。纯度95％以上。

实验方法：

1)噬菌体12肽库的亲和筛选

(1)包被纯化的TRX-BS

1.将TRX-BS以TBS稀释为100ug/ml，并按与TRX-BS相同的稀释倍数稀释空质粒表达产物TRX，分别取稀释后的TRX-BS和空质粒表达产物TRX包被酶标板，100μl/孔，放置湿盒中4℃过夜；

2.次日倾弃包被液，加入含0.05％Tween20的TBST洗涤3次，扣干，然后以含3％BSA的TBS按100μl/孔加入各孔，置湿盒中37℃封闭2小时；

3.倾弃封闭液，以含0.05％Tween20的TBST溶液洗涤3次(每次静置3min)，叩干，将包被好的酶标板封口，于4℃保存待用。

(2)预筛选

以TBST稀释原始文库至1×10¹¹pfu/ml，取稀释后的文库液100μl加入到预先包被空质粒表达产物TRX的酶标板微孔内，于湿盒中37℃放置2小时，吸出孔内液体，并用100μl TBS清洗微孔一次，合并吸出的孔内液和清洗液为预筛选液。

(3)亲和筛选

1.第一轮筛选：

将100μl的预筛选液加入到预先包被TRX-BS的酶标板微孔内，放置湿盒中4℃过夜，弃孔内液体，并用TBST清洗10次，向微孔中加入100μl0.2M Glycine-HCl(pH2.2)，于室温温和摇动<10min，洗脱液吸入另一干净微量离心管中。然后再用15μl1MTris-HCl(pH9.1)中和上述洗脱液。测定少量(～1μl)洗脱物的滴度(具体方法详见1.2.3)。剩余洗脱物加入到20ml ER2738培养物中(菌体应当处于对数前期)，37℃剧烈摇动培养4.5hr。将培养物转入一离心管中，然后，4℃10,000rpm离心10min。上清液转入另一离心管中，再离心。将上清的上部80％转入一新鲜管中，加入1/6体积的PEG/NaCl。让噬菌体4℃沉淀过夜。次日，4℃10,000rpm离心PEG沉淀15min。倒掉上清液，再短暂离心，吸去残留上清液。沉淀物重悬于1ml TBS中，悬液转入微量离心管中，4℃离心5min使残余细胞沉淀。上清转入另一新鲜微量离心管，用1/6体积的PEG/NaCl再沉淀。冰上孵育15-60min。4℃离心10min，弃上清，再短暂离心，用微量移液器吸去残余上清。沉淀物重悬于200μl TBS，0.02％NaN3中。离心1min，沉淀任何残余的不溶物。上清转入新鲜管中。此即为第一轮扩增后的噬菌体洗脱物。根据上述常规M13方法用LB/IPTG/Xgal平板滴定扩增后的洗脱物。4℃贮存。

2.第二、三、四轮筛选

将第一轮筛选后的噬菌体液以TBS稀释为1×10¹⁰pfu/ml，取100μl加入到预先包被TRX-BS的酶标板微孔中进行第二轮筛选，37℃温育2小时，弃孔内液体，并用含0.05％Tween20的TBST溶液清洗10次，同上进行筛选后噬菌体的扩增和滴度的测定，重复以上步骤进行第四轮筛选。

在筛选过程中，将每轮投入筛选的噬菌体量记为Input、洗脱得到的噬菌体量记为output，分析比较每轮产出/投入比(Input/Output)情况，来反映特异性结合噬菌体的富集程度。经过4轮筛选发现：从产出/投入比来看，筛选结果回收率逐轮提高(表1)，显示较好的富集效果。

表1四轮亲和筛选对噬菌体的富集

2)单克隆噬菌体的扩增

接种一管ER2738于20ml LB培养基中，37℃培养至稍微浑浊。用灭菌的吸头从第三轮和第四轮淘选物中随机分别挑取10个克隆。然后每个噬菌体克隆加入到每管ER2738培养液中，37℃通气培养4.5hrs。上述培养物转入离心管中，10,000rpm离心10min。上清移入新鲜离心管，再离心。取80％上清于新鲜离心管中，加1/6体积的PEG/NaCl。4℃沉淀至少1hr或过夜。4℃10,000rpm15min离心沉淀，弃上清，再进行短暂离心，吸去残余上清。沉淀重悬于1ml TBS中，悬液转入微量离心管，4℃离心5min除去沉淀中的残留细胞。上清转入新鲜微量离心管，加1/6体积的PEG/NaCl再沉淀。冰上作用15-60min。4℃离心10min，弃上清，再进行短暂离心，吸去残余上清。沉淀重悬于50μl TBS中，按常规分子克隆M13方法中所述测定噬菌体滴度。4℃贮存。

3)ELISA检测噬菌体展示短肽对靶分子的的结合活性

为了进一步验证得到的噬菌体克隆是与BS蛋白结合蛋白，而不是与TRX蛋白结合，从第3轮和第四轮筛选后测滴度的琼脂板中随机挑选20个单个噬菌体克隆，以TRX-BS融合蛋白和TRX包被酶联板做间接ELISA试验，以鉴定其是否具有与BS结合的特性，用100ul100μg/ml的靶分子TRX-BS(溶于0.1M pH8.6NaHCO3中)包被ELISA板的每个孔，并设TRX蛋白对照。在密封的湿盒中4℃包被过夜。经封闭液，4℃封闭1h后，PBST洗涤，加入100uL待测单个克隆的噬菌体上清(稀释至：10¹¹pfu/mL)为待测短肽，室温反应1h。PBST洗涤后，加入稀释至工作浓度的抗M13-HRP结合物，室温反应1h。PBST充分洗涤，加入TMB底物显色溶液，室温30min，后加50ul2M的H2SO4终止反应，测OD₄₅₀值。

结果显示其中10个克隆显示较强的阳性结果(见图1)。分别命名为P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7、P8、P9、P10。

4)竞争抑制试验

将上述10个克隆，做竞争ELISA实验，以人工合成的多肽BS来阻断阳性噬菌体与BS结合，以进一步鉴定所筛选的噬菌体展示肽是否特异性地与BS蛋白结合，在湿盒中，包被靶分子TRX-BS并封闭(方法同上)，加入100uL不同浓度(25ug/ml、50ug/ml、100ug/ml、150ug/ml、200ug/ml)的人工合成的BS肽与上述单克隆噬菌体(稀释至：10¹¹pfu/mL)等体积混合，室温作用10min，每孔100μL，室温轻摇孵育1h。PBS/Tween洗6次，加HRP-偶联抗M13抗体，室温轻摇孵育1h，PBS/Tween洗6次，加TMB底物显色，酶标仪上读OD₄₅₀值。

抑制率(％)＝(未抑制OD一抑制后OD)/未抑制ODX100％

结果表明(图2)，人工合成的多肽对噬菌体P3、P5与BS结合具有一定的阻断作用。也说明噬菌体P3、P5为BS的特异性结合肽。

5)单链噬菌体DNA的制备

将ER2738过夜培养物按1:100稀释接种于LB培养基，分1ml到培养管中。每个要鉴定的克隆一管。用灭菌牙签或吸头，挑一蓝色噬菌斑(注意：要从总量不到100个噬菌斑的平板上挑选，以便保证每个被挑的噬菌斑仅含一个DNA序列)到上述1ml培养管中。37℃摇床培养4.5-5hrs(不要过长)。培养物转入微量离心管中，离心30sec。上清转入以新鲜管中，再离心后，将500μl含噬菌体上清转入一新鲜离心管。加200μlPEG/NaCl，颠倒混匀，室温放置10min。离心10min，弃上清液。短暂离心，小心吸去残余上清。用70％的乙醇洗沉淀，短暂真空干燥。沉淀重悬于30μl TE[10mMTris-HCl(pH8.0)，1mM EDTA]中。

6阳性噬菌体DNA序列测定

将上述2个将噬菌体阳性克隆提取其单链DNA后，用-96gIII测序引物交由上海英俊生物有限公司测序，以推测其相应的肽序列，结果显示，得到的序列分别如下，P3(SEQID NO.1)：ACTKHLCLLQPL；P5(SEQ ID NO.2)：MSCNDTLCLLPN；其中保守序列为LCLL。

7化学合成多肽

采用固相合成法合成上述多肽P3、P5，由西安华辰有限公司合成。纯度95％以上。

8囊素肽与杂交瘤细胞的特异性结合

将杂交瘤细胞约2×10⁵细胞离心回收，用冷0.1mol/L PBS洗2次，离心回收，每次5min，细胞悬浮于0.1mol/L PBS中，平均分为4管，每管分别加入100uL不同浓度(0ug/ml、200ug/ml、400ug/ml、600ug/ml)的FITC-BS，4℃反应10min，反应后离心回收用冷PBS洗2次，离心细胞重悬于PBS1mL中取少许细胞用台盼蓝检测存活率，用流式细胞仪分析，激发波长488nm，发射波长513nm，计数2000个细胞。

结果表明：杂交瘤细胞与FITC-BS作用后，荧光显微镜观察，检测细胞圆而亮，不被台盼蓝着色，表明细胞状态好，细胞膜附有大量荧光，说明BS与杂交瘤细胞细胞膜能特异结合(图3)。流式细胞仪分析结果，杂交瘤细胞与BS的结合率随FITC-BS的量增加而增高，当FITC-BS在400ug/ml、600ug/ml浓度时结合率达到最高(图4)。结合率分别为51.0％、50.6％。二者的结合率无显著差异(P<0.05)。表明二者结合有饱和性。

9结合肽P3、P5抑制囊素与杂交瘤细胞的特异性结合

将杂交瘤细胞约2×10⁵细胞离心回收，用冷0.1mol/L PBS洗2次，离心回收，每次5min，细胞悬浮于0.1mol/L PBS中，每管加入100uL浓度600ug/ml的FITC-BS，同时分别加入100uL不同浓度(200ug/ml、400ug/ml、600ug/ml、800ug/ml、1mg/ml)的P3、P5，同时设不加结合肽对照。4℃反应30min，反应后离心回收用冷PBS洗2次，离心细胞重悬于PBS1mL后，用流式细胞仪分析，激发波长488nm，发射波长513nm，计数2000个细胞。流式细胞仪分析结果，P3肽在高于400ug/ml浓度时能明显抑制杂交瘤细胞与BS的结合，抑制率呈显著差异(P<0.05)(图5A)。而P5肽高于800ug/ml浓度时能抑制杂交瘤细胞与BS的结合，抑制率呈显著差异(P<0.05)(图5B)。表明结合肽P3、P5在不同程度能特异性抑制囊素与杂交瘤细胞的结合。

序列表

<110>南京农业大学

<120>三肽囊素特异性结合肽及筛选方法

<130>说明书

<140>00

<141>2008-09-18

<160>4

<170>PatentIn version3.1

<210>1

<211>12

<212>PRT

<213>人工合成

<220>

<221>短肽1

<222>(1)..(12)

<223>

<400>1

<210>2

<211>12

<212>PRT

<213>人工合成

<220>

<221>短肽2

<222>(1)..(12)

<223>

<400>2

<210>3

<211>22

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>-28gIII测序引物

<222>(1)..(22)

<223>

<400>3

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>-96gIII测序引物

<222>(1)..(20)

<223>

<400>4

Claims (1)

1.三肽囊素特异性结合肽，其氨基酸序列为：短肽1：SEQ ID NO.1或短肽2：SEQ IDNO.2。

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