CN104508132B - 用于产生作为与惰性免疫球蛋白Fc区Fc融合的可溶FcR的方法及其用途 - Google Patents

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Abstract

本文是具有式R1‑FC‑R2的融合多肽及其用途，其中R1表示第一Fc受体，R2表示第二Fc受体，并且FC表示重链Fc区多肽，其中R1或R2或二者均存在，其中FC基本上不结合R1和/或R2。

Description

用于产生作为与惰性免疫球蛋白Fc区Fc融合的可溶FcR的方 法及其用途
本文报道用于产生作为与防止自我聚集的惰性免疫球蛋白Fc区的融合多肽的可溶Fc受体的方法及其用途，例如FcR层析柱，测定低亲和力抗体的FcR相互作用。
发明背景
免疫球蛋白一般包含两条轻多肽链和两条重多肽链。每条重多肽链和轻多肽链包含含有能够与抗原相互作用的结合结构域的可变区(通常是多肽链的氨基端部分)。每条重多肽链和轻多肽链还包含恒定区(通常是羧基端部分)。重链的恒定区介导免疫球蛋白与例如具有Fcγ受体(FcγR)的细胞(如吞噬细胞)或与具有新生Fc受体(FcRn)(也称为Brambell受体)的细胞的结合，还介导与一些因子(包括经典补体系统的因子，如(C1q)成分)的结合。
Hulett和Hogarth(Hulett,M.D.和Hogarth,P.M.,Adv.Immunol.57(1994)1-127)报道，G类免疫球蛋白的Fc部分的胞外受体是跨膜糖蛋白家族，该家族包含具有不同结合特异性的三种不同受体类型：FcγRI、FcγRII和FcγRIII。I型受体与未复合的IgG相互作用，而II型和III型受体优选与复合的IgG相互作用。
人FcγRIII(CD 16)以两种同种型和两种多态形式存在。第一同种型FcγRIIIa是由与第二同种型FcγRIIIb不同的基因编码的跨膜分子，所述第二同种型FcγRIIIb是GPI锚定的膜蛋白。多态形式V159在氨基酸序列的159位具有缬氨酸残基而多态形式F159在159位具有苯丙氨酸残基。
对于IgG类免疫球蛋白，ADCC和ADCP由Fc区与称为Fc-gamma(Fcγ)受体(FcγR)的受体的家族的参与管控。在人中，此蛋白家族包含FcγRI(CD64)、包括同种型FcγRIIA、FcγRIIB，和FcγRIIC的FcγRII(CD32)，和包括同种型FcγRIIIA和FcγRIIIB的FcγRIII(CD16)(Raghavan和Bjorkman,Annu.Rev.Cell Dev.Biol.12(1996)181–220；Abes,等人,Expert Reviews(2009)735-747)。FcγR在多种免疫细胞上表达，并且Fc/FcγR复合体的形成将这些细胞招募至结合的抗原的位点，通常导致发信号和随后的免疫应答诸如炎症介质的释放、B细胞激活、内吞作用、吞噬作用，和细胞毒性攻击。此外，尽管FcγRI、FcγRIIA/C，和FcγRIIIA是由基于胞内免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)表征的激活受体，FcγRIIB具有抑制性基序(ITIM)并因此是抑制性的。尽管FcγRI以高亲和力结合单体IgG，FcγRIII和FcγRII是低亲和力受体，与复合的或聚集的IgG相互作用。
IgG与激活和抑制性Fcγ受体或补体的第一组分(C1q)的结合取决于位于铰链区和CH2结构域中的残基。CH2结构域的2个区域对于FcγR和补体C1q结合是至关重要的，并且具有独特的序列。替换人IgG1和IgG2第233-236位残基和IgG4第327、330和331位残基大大降低了ADCC和CDC(Armour,等人,Eur.J.Immunol.29(1999)2613-2624；Shields,等人,J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604)。Idusogie,等人(J.Immunol 166(2000)2571-2575)对治疗性抗体Rituxan(R)的C1q结合位点绘图并显示Pro329Ala替换降低了利妥昔单抗(Rituximab)结合C1q和激活补体的能力。已经报道用Ala替换Pro329导致降低的与FcγRI,FcγRII and FcγRIIIA受体的结合(Shields,等人,J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604)但是也已经将此突变描述为表现出与FcγRI和FcγRII的野生型样结合并且与FcγRIIIA受体的结合仅有非常小的降低(EP 1068241，Genentech中的表1和表2)。
在WO 2010/048313中报道了用于纯化含有Fc的融合蛋白的重组FcRn及其变体。Fc-X融合蛋白在哺乳动物细胞中的高水平表达和分泌由Lo等人报道(Lo,K-M.,等人,Prot.Eng.11(1998)495-500)。Dumont,F.A.,等人(Biodrugs 20(2006)151-160)报道了单体Fc融合物。受体Fc融合治疗剂，traps,和MIMETIBODYTM技术由Huang,C.(Curr.Opin.Biotechnol.20(2009)592-599)报道。在WO 01/03737中报道了免疫球蛋白融合蛋白。WO 00/40615中报道了作为Fc融合蛋白表达和输出抗肥胖蛋白。
发明概述
已发现，可以通过将Fc受体表达为具有基本上不结合融合的Fc受体的Fc区的融合多肽生产可溶Fc受体。使用融合多肽来表达Fc受体增加融合多肽形式或作为分离的受体的Fc受体的可获得的产量。此外，本文报道的融合多肽提供用于组合单个分子中的多于一个拷贝的Fc受体，例如用于增加的亲和力，或用于组合单个分子中的不同Fc受体(不同来源或不同类型或上述二者)的增加的灵活性。
本文报道的一个方面是根据式I的融合多肽：
R1-FC-R2 (式I)
其中
R1表示第一Fc受体，
R2表示第二Fc受体，和
FC表示重链Fc区多肽，
其中R1或R2或二者均存在，
其中FC基本上不结合R1和/或R2。
在一个实施方案中融合多肽具有式II
R1-CS1-L1-CS2-FC-CS3-L2-CS4-R2 (式II)
其中
R1表示第一Fc受体，
R2表示第二Fc受体，
FC表示重链Fc区多肽，
CS1表示第一切割位点，
CS2表示第二切割位点，
CS3表示第三切割位点，
CS4表示第四切割位点，
L1表示第一间插氨基酸序列，和
L2表示第二间插氨基酸序列，
其中R1或R2或二者均存在，
其中CS1、CS2、CS3、CS4中的任一者可以彼此独立地存在或不存在，
其中L1和L2可以彼此独立地存在或不存在，
其中FC基本上不结合R1和/或R2。
在一个实施方案中R1和R2彼此独立地选自人Fcγ受体、人新生Fc受体、鼠Fc受体，和兔新生Fc受体的组。
在一个实施方案中人Fcγ受体选自人FcγRI(CD64)、人FcγRII(CD32)、人FcγRIIA、人FcγRIIB、人FcγRIIC、人FcγRIII(CD16)、人FcγRIIIA，和人FcγRIIIB。
在一个实施方案中人新生Fc受体是人FcRn。
在一个实施方案中鼠Fc受体选自鼠FcγRI(CD64)、鼠FcγRII(CD32)、鼠FcγRIIB、鼠FcγRIII(CD16)、鼠FcγRIII-2(CD16-2)，和鼠FcγRIV。
在一个实施方案中Fc是选自人IgG重链多肽、鼠IgG重链多肽、兔IgG重链多肽的组的重链多肽的变体。
在一个实施方案中，FC是选自人IgG1重链多肽、人IgG2重链多肽、人IgG3重链多肽、人IgG4重链多肽、鼠IgG1重链多肽、鼠IgG2重链多肽、鼠IgG2a重链多肽、鼠IgG3重链多肽、兔IgG重链多肽的组的重链多肽的变体。
在一个实施方案中，重链Fc区多肽在位置234、235、236、237、238、239、253、254、265、266、267、268、269、270、288、297、298、299、307、311、327、328、329、330、331、332、434和435中的一个或多个处具有氨基酸突变。
在一个实施方案中，Fc受体中的一个或多个是Fcγ受体。
在一个实施方案中，人IgG1重链多肽在氨基酸位置233、234、235、236、265、297、329和331中的一个或多个处具有突变。
在一个实施方案中，人IgG1重链多肽具有氨基酸突变E233P、L234A、L235A、L235E、ΔG236、D265A、N297A、N297D、P329A、P329G和P331S中的一个或多个。
在一个实施方案中，人IgG1重链多肽具有氨基酸突变L234A和L235A及E233P、L235E、ΔG236、D265A、N297A、N297D、P329A、P329G和P331S中的一个或多个。
在一个实施方案中，人IgG1重链多肽具有氨基酸突变L234A和L235A及P329A或P329G。
在一个实施方案中，人IgG2重链多肽在氨基酸位置233、234、235、236、265和329中的一个或多个处具有突变。
在一个实施方案中，人IgG4重链多肽在氨基酸位置228、235、265和329中的一个或多个处具有突变。
在一个实施方案中，人IgG4重链多肽具有突变S228P、L235E、P329A和P329G中的一个或多个。
在一个实施方案中，人IgG4重链多肽具有突变S228P和L235E及P329A或P329G。
在一个实施方案中，重链Fc区多肽在位置248、250、251、252、253、254、255、256、257、272、285、288、290、291、308、309、310、311、314、385、386、387、428、433、434、435和436中的一个或多个处具有氨基酸突变。
在一个实施方案中，Fc受体中的一个或多个是FcRn。
在一个实施方案中，人IgG重链多肽在氨基酸位置238、252、253、254、255、256、265、272、286、288、303、305、307、309、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、386、388、400、413、415、424、433、434、435、436、439和/或447中的一个或多个处具有突变。
在一个实施方案中，具有减少的与FcRn的结合的人IgG重链多肽在氨基酸位置252、253、254、255、288、309、386、388、400、415、433、435、436、439和/或447处具有一个或多个氨基酸改变。
在一个实施方案中，具有减少的与FcRn的结合的人IgG重链多肽具有氨基酸突变I253A、H310A和H435A。
在一个实施方案中，间插氨基酸序列选自包含(G3S)3、(G3S)4、(G3S)5、(G3S)6、(G4S)3、(G4S)4、(G4S)5、(G5S)2、(G5S)3、和(G5S)4的第一组，或选自包含Arg标记、Avi标记、His-Avi标记、His标记、Flag标记、3xFlag标记、Strep标记、Nano标记、SBP标记、c-myc标记、S标记、钙调蛋白结合肽、纤维素结合结构域、几丁质结合结构域、GST标记或MBP标记的第二组，或选自这些组的两个元件的组合。
在一个实施方案中，切割位点选自IgA蛋白酶切割位点、颗粒酶B蛋白酶切割位点、Tev蛋白酶切割位点、Precision蛋白酶切割位点、凝血酶切割位点、Faktor10a蛋白酶位点、Ides蛋白酶切割位点、肠激酶切割位点或SUMO蛋白酶切割位点。
在一个实施方案中，融合多肽不包含额外的蛋白酶切割位点而是包含固有的蛋白酶切割位点，如木瓜蛋白酶切割位点、胃蛋白酶切割位点或Ides蛋白酶切割位点。
本文报道的一方面是包含本文报道的两条融合多肽的二聚体融合多肽。
在一个实施方案中第一FC包含突变T366W和任选地突变S354C并且第二FC包含突变T366S、L368A和Y407V和任选地突变Y349C。
在一个实施方案中融合多肽特征在于
a)第一和第二多肽的R1和R2相同，
b)第一融合多肽的R1和R2相同，第二融合多肽的R1和R2相同但与第一融合多肽的R1和R2不同，
c)第一和第二融合多肽的R1相同并且第一和第二多肽的R2相同但与R1不同，
d)第一和第二融合多肽的R1相同并且两个R2均不存在，
e)第一和第二融合多肽的R1不同并且两个R2均不存在，
f)第一和第二融合多肽的R2相同并且两个R1均不存在，
<PN 144659>
g)第一和第二融合多肽的R2不同并且两个R1均不存在，
h)第一融合多肽的R1和第二多肽的R2不同并且第一融合多肽的R2不存在并且第二多肽的R1不存在。
本文报道的一方面是生产可溶Fc受体的方法，所述方法包括以下步骤：
a)培养包含编码本文报道的融合多肽的核酸的细胞，
b)从细胞或培养基回收融合多肽，
c)任选地用蛋白酶切割融合多肽，
从而生产可溶Fc受体。
本文报道的一个方面是固定化的本文报道的融合多肽或固定化的本文报道的二聚体融合多肽作为亲和层析配体的用途。
本文报道的一个方面是固定化的本文报道的融合多肽或固定化的本文报道的二聚体融合用于测定抗体的Fc受体结合的用途。
在一个实施方案中，融合多肽结合于固相。
本文报道的一个方面是包含本文报道的融合多肽的药物组合物。
本文报道的一个方面是本文报道的融合多肽在制备药物中的用途。
在一个实施方案中药物用于治疗炎性疾病。
在一个实施方案中疾病是特征为增加的抗体水平的疾病。
在一个实施方案中疾病是自身免疫病。
在一个实施方案中疾病是类风湿关节炎。
发明详述
附图简述
图1.融合多肽表达质粒的质粒图谱。
图2.木瓜蛋白酶切割的分析型SDS-PAGE凝胶。
图3.12％Bis Tris Gel+/-DTT；分别用PreScission蛋白酶(泳道3,8)、IgA蛋白酶(泳道2,7)切割FcγRIIIaV158-Avi-Fc LALA P239G：可以看到使用PP的非特异性切割(泳道3,8)。
图4.抗Her抗体(野生型，上部)和糖改造的抗Her抗体的不同糖基化形式的分离和定量。
图5.使用FcγRIIIaV158和Fc标记的FcγRIIIaV158的亲和柱的比较。
图6.与FcγRIIIaV158的40RU相比，FcγRIIIaV158-Fc LALA P329G融合多肽的响应的BIAcore传感图显示超过100个响应单位；FcgRIIIa V158_008表示非切割的融合多肽，FcgRIIIa V 158_007表示FcgRIIIa的缩短的非功能性变体(＝对照)，FcgRIIIa V 158_jf323表示包含FcgRIIIa的功能性变体的完整的HisAvi标记。
图7.Fcγ受体V158-Fc LALA P329G融合多肽(图7a)、Fcγ受体V158(图7b)、切割的Fcγ受体V158-Fc LALA P329G融合多肽(图7c)、非功能性Fcγ受体V158-Fc LALA P329G融合多肽(图7d)(＝对照)的传感图。
定义
术语“与Fc受体结合”指在例如BIAcore(R)测定法(Pharmacia Biosensor AB,Uppsala,瑞典)中Fc区与Fc受体的结合。
在BIAcore(R)测定法中，使Fc受体结合于表面，并通过表面等离振子共振(SPR)来测量分析物(例如含有Fc区的融合多肽或抗体)的结合。通过术语ka(缔合常数：Fc区融合多肽或缀合物缔合形成Fc区/Fc受体复合物的速率常数)、kd(解离常数：Fc区融合多肽或缀合物从Fc区/Fc受体复合物解离的速率常数)和KD(kd/ka)来定义结合的亲和力。备选地，可以就共振信号高度和解离行为将SPR传感图的结合信号与参考的响应信号直接比较。
术语“CH2结构域”指从约EU位置231延伸至EU位置340(按照Kabat的EU编号系统)的抗体重链多肽部分。在一个实施方案中，CH2结构域具有SEQ ID NO:01(APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQESTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK)的氨基酸序列。CH2结构域的独特性在于，它不与另一结构域紧密配对。相反，两个N连接的分枝糖链插在完整的天然Fc区的两个CH2结构域之间。已推测，糖可以提供结构域-结构域配对的替代，并帮助稳定CH2结构域。Burton,Mol.Immunol.22(1985)161-206。
术语“CH3结构域”指约从EU位置341延伸至EU位置446的抗体重链多肽部分。在一个实施方案中，CH3结构域具有SEQ ID NO:02(GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG)的氨基酸序列。
术语抗体的“类别”指它的重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五个主要类别的抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，这些中的几种可以进一步划分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。
术语“Fc区”指免疫球蛋白的C端区域。Fc区是包含两个二硫化物连接的抗体重链Fc区多肽(Fc区多肽链)的二聚体分子。Fc区可以通过木瓜蛋白酶消化或IdeS消化或胰蛋白酶消化完整(全长)抗体来产生或可以重组产生。
可从全长抗体或免疫球蛋白获得的Fc区包含全长重链C端的残基226(Cys)，因此包含部分铰链区和两个或三个恒定结构域，即CH2结构域、CH3结构域和任选的CH4结构域。从US 5,648,260和US 5,624,821已知，Fc区中确定的氨基酸残基的修饰导致表型效应。
通过所包含的CH3结构域的非共价二聚化来介导包含两个相同或不同的抗体重链片段的二聚体Fc区的形成(所涉及的氨基酸残基见例如Dall'Acqua,Biochem.37(1998)9266-9273)。通过铰链区中二硫键的形成来共价稳定Fc区(见例如Huber等,Nature 264(1976)415-420；Thies等,J.Mol.Biol.293(1999)67-79)。由于CH3-CH3结构域二聚化所涉及的残基的位置定位在CH3结构域的内侧界面，而Fc区-FcRn相互作用所涉及的残基定位在CH2-CH3结构域的外侧，为破坏CH3-CH3结构域相互作用的二聚化而在CH3结构域内引入的氨基酸残基改变对FcRn结合没有不利的影响。
Fc区相关效应子功能由Fc区与效应子功能特异性细胞表面受体的相互作用起始。大多数情况下，IgG1同种型的抗体可以实现受体激活，而IgG2和IgG4同种型的抗体不具有效应子功能或具有有限的效应子功能。
引出效应子功能的受体是Fc受体类型(和亚型)FcγRI、FcγRII和FcγRIII。可以通过在下铰链区中引入特异性氨基酸改变(如涉及FcγR和C1q结合的L234A和/或L235A)来减少与IgG1同种型相关的效应子功能。尤其是定位在CH2和/或CH3结构域中的某些氨基酸残基也与抗体分子或Fc区融合多肽在血流中的循环半寿期相关。通过Fc区与新生Fc受体(FcRn)的结合来测定循环半寿期。
按照Kabat(Kabat等1991,Sequences of Proteins of immunologicalInterest,U.S.Department of Public Health,Bethesda,Md.)的EU索引进行抗体恒定区中氨基酸残基的编号。
术语“人来源的Fc区”指人来源的免疫球蛋白重链的C端区域，其包含至少部分铰链区、CH2结构域和CH3结构域。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基端。但是，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可以存在或不存在。除非本文另有说明，Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号按照Kabat,E.A.等,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第5版,Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD(1991),NIH Publication 91-3242中所述的EU编号系统，也称为EU索引。
术语“Fc区的FcRn结合部分”指抗体重链多肽的部分，其约从EU位置243延伸至EU位置261，和约从EU位置275延伸至EU位置293，和约从EU位置302延伸至EU位置319，和约从EU位置336延伸至EU位置348，和约从EU位置367延伸至EU位置393和EU位置408，和约从EU位置424延伸至EU位置440。在一个实施方案中，改变以下根据Kabat的EU编号的氨基酸残基中的一个或多个：F243、P244、P245P、K246、P247、K248、D249、T250、L251、M252、I253、S254、R255、T256、P257、E258、V259、T260、C261、F275、N276、W277、Y278、V279、D280、V282、E283、V284、H285、N286、A287、K288、T289、K290、P291、R292、E293、V302、V303、S304、V305、L306、T307、V308、L309、H310、Q311、D312、W313、L314、N315、G316、K317、E318、Y319、I336、S337、K338、A339、K340、G341、Q342、P343、R344、E345、P346、Q347、V348、C367、V369、F372、Y373、P374、S375、D376、I377、A378、V379、E380、W381、E382、S383、N384、G385、Q386、P387、E388、N389、Y391、T393、S408、S424、C425、S426、V427、M428、H429、E430、A431、L432、H433、N434、H435、Y436、T437、Q438、K439和S440(EU编号)。
IgG1同种型的野生型人Fc区的多肽链具有以下氨基酸序列：
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具有突变L234A、L235A的IgG1同种型的变体人Fc区的多肽链具有以下氨基酸序列：
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具有突变T366S、L368A和Y407V的IgG1同种型的变体人Fc区的多肽链具有以下氨基酸序列：
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具有突变T366W的IgG1同种型的变体人Fc区的多肽链具有以下氨基酸序列：
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具有突变L234A、L235A和T366S、L368A和Y407V的IgG1同种型的变体人Fc区的多肽链具有以下氨基酸序列：
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具有突变L234A、L235A和T366W的IgG1同种型的变体人Fc区的多肽链具有以下氨基酸序列：
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具有突变P329G的IgG1同种型的变体人Fc区的多肽链具有以下氨基酸序列：
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具有突变L234A、L235A和P329G的IgG1同种型的变体人Fc区的多肽链具有以下氨基酸序列：
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具有突变P239G和T366S、L368A和Y407V的IgG1同种型的变体人Fc区的多肽链具有以下氨基酸序列：
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具有突变P329G和T366W的IgG1同种型的变体人Fc区的多肽链具有以下氨基酸序列：
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具有突变L234A、L235A、P329G和T366S、L368A和Y407V的IgG1同种型的变体人Fc区的多肽链具有以下氨基酸序列：
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具有突变L234A、L235A、P329G和T366W的IgG1同种型的变体人Fc区的多肽链具有以下氨基酸序列：
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IgG4同种型的野生型人Fc区的多肽链具有以下氨基酸序列：
ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO：15).
具有突变S228P和L235E的IgG4同种型的变体人Fc区的多肽链具有以下氨基酸序列：
ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO：16).
具有突变S228P、L235E和P329G的IgG4同种型的变体人Fc区的多肽链具有以下氨基酸序列：
ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO：17).
术语“Fc受体”、简称“FcR”指与Fc区结合的受体。在一个实施方案中，FcR是天然序列人FcR。此外，在一个实施方案中，FcR是结合IgG抗体的FcR(Fcγ受体)，且包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括其等位基因变体和可变剪接变体。FcγRII受体包括FcγRIIA(“激活受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，其具有主要在其胞质结构域中不同的相似的氨基酸序列。FcR综述于Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol 9(1991)457-492；Capel等，Immunomethods 4(1994)25-34；de Haas等，J.Lab.Clin.Med.126(1995)330-341中。本文的术语“FcR”涵盖其他FcR。该术语还包括负责将母体IgG转移至胎儿的新生受体FcRn(见例如Guyer等，J.Immuno1.117(1976)587；Kim等，J.Immuno1.24(1994)249)。
术语“Fcγ受体”、简称“FcγR”或“FcgammaR”指结合IgG抗体Fc区且由FcγR基因编码的蛋白质家族的任意成员。在人类中，此家族包括但不限于：FcγRI(CD64)，包括同种型FcγRIA、FcγRIB和FcγRIC；FcγRII(CD32)，包括同种型FcγRIIA(包括同种异型H131和R131)、FcγRIIB(包括FcγRIIB-1和FcγRIIB-2)和FcγRIIc；和FcγRIII(CD16)，包括同种型FcγRIIIA(包括同种异型V158和F158；Swiss-Prot入口P08637；N-端-MRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDSVTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRCQTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTALHKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSSETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQ-C-端；SEQ ID NO:18)和FcγRIIIb(包括同种异型FcγRIIB-NA1和FcγRIIB-NA2)(见例如Jefferis等,Immunol.Lett.82(2002)57-65，整体引入作为参考)；以及FcγR同种型或同种异型。FcγR可以来自任意生物，包括但不限于人类、小鼠、大鼠、兔和猴。小鼠FcγR包括但不限于FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、FcγRIII(CD16)和FcγRIII-2(CD16-2)，以及或FcγR同种型或同种异型。Fc区-FcγR相互作用所涉及的氨基酸残基是234-239(下铰链区)、265-269(B/C环)、297-299(D/E环)和327-332(F/G环)(Sondermann等,Nature 406(2000)267-273)。导致减少的对FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB和/或FcγRIIIA的结合/亲和力的氨基酸突变包括N297A(伴有降低的免疫原性和延长的半寿期结合/亲和力)(Routledge等,Transplantation 60(1995)847；Friend等,Transplantation 68(1999)1632；Shields等,J.Biol.Chem.276(1995)6591)、残基233-236(Ward和Ghetie,Ther.Immunol.2(1995)77；Armour等,Eur.J.Immunol.29(1999)2613)。一些示例性氨基酸取代描述于US 7,355,008和US 7,381,408中。
术语“新生Fc受体”、简称“FcRn”指结合IgG抗体Fc区且至少部分由FcRn基因编码的蛋白质。FcRn可以来自任意生物，包括但不限于人类、小鼠、大鼠、兔和猴。如本领域已知，功能性FcRn蛋白质包含常称为重链和轻链的两条多肽。轻链是β-2-微球蛋白，重链由FcRn基因编码。除非本文另有说明，FcRn或FcRn蛋白质指FcRn重链与β-2-微球蛋白的复合物。Fc区与FcRn的相互作用氨基酸残基在CH2和CH3结构域的连接处附近。Fc区-FcRn接触残基全都在单条IgG重链内。所涉及的氨基酸残基是248、250-257、272、285、288、290-291、308-311和314(全都在CH2结构域中)及氨基酸残基385-387、428和433-436(全都在CH3结构域中)。导致增加的对FcRn的结合/亲和力的氨基酸突变包括T256A、T307A、E380A和N434A(Shields等,J.Biol.Chem.276(2001)6591)。
在物种间保守的新生Fc受体的氨基酸残基是Fc区中的310和435位的组氨酸残基。这些残基造成Fc区FcRn相互作用的pH依赖性(见例如Victor,G.等,Nature Biotechnol.15(1997)637-640)；Dall'Acqua,W.F.等J.Immunol.169(2002)5171-5180)。减弱与FcRn的相互作用的Fc区突变可以降低抗体半寿期。
术语“铰链区”指抗体重链多肽的连接CH1结构域和CH2结构域的部分，例如从根据Kabat的EU编号系统的约216位至约230位。铰链区通常是由两条具有相同氨基酸序列的多肽组成的二聚体分子。铰链区通常包含约25个氨基酸残基，且具有允许抗原结合区独立移动的柔性。铰链区可以细分为三个结构域：上、中和下铰链区(Roux等,J.Immunol.161(1998)4083)。
术语Fc区的“下铰链区”指紧接着铰链区C端的一段氨基酸残基，即根据Kabat的EU编号的Fc区的残基233至239。
术语“野生型Fc区”指与见于自然界中的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。野生型人Fc区包括天然人IgG1Fc区(非A和A同种异型)、天然人IgG2Fc区、天然人IgG3Fc区和天然人IgG4Fc区，及其天然存在的变体。
术语“药物组合物”指这样的制剂，其处于这样的形式，以致允许包含在其中的活性成分的生物学活性有效，且其不包含对将施用该制剂的对象具有不可接受的毒性的额外成分。
“可药用载体”指药物组合物中除活性成分外的成分，其对对象无毒性。可药用载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
术语“多肽”指天然产生或合成产生的由通过肽键连接的氨基酸组成的聚合物。少于约20个氨基酸残基的多肽可以称为“肽”，而由两条或多条多肽组成或包含一条超过100个氨基酸残基的多肽的分子可以称为“蛋白质”。多肽还可以包含非氨基酸成分，如糖基、金属离子或羧酸酯。非氨基酸成分可以由其中表达该多肽的细胞加入，且可以随细胞类型而不同。本文根据其氨基酸骨架结构或编码其氨基酸骨架结构的核酸来定义多肽。加入物(如糖基)通常不指明，但可以存在。
术语“氨基酸序列标记”指具有特定结合特性的通过肽键相互连接的氨基酸残基的序列。在一个实施方案中，氨基酸序列标记是亲和或纯化标记。在一个实施方案中，氨基酸序列标记选自Arg标记、His标记、Avi标记、His-Avi标记、Flag标记、3xFlag标记、Strep标记、Nano标记、SBP标记、c-myc标记、S标记、钙调蛋白结合肽、纤维素结合结构域、几丁质结合结构域、GST标记和MBP标记。在一个实施方案中，氨基酸序列标记选自SEQ ID NO:19(RRRRR)、SEQ ID NO:20(RRRRRR)、SEQ ID NO:21(Avi-标记)、SEQ ID NO:22(His-Avi-标记)、SEQ ID NO:23(HHHHHH)、SEQ ID NO:24(KDHLIHNVHKEFHAHAHNK),SEQ ID NO:25(DYKDDDDK)、SEQ ID NO:26(DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK)、SEQ ID NO:27(AWRHPQFGG)、SEQID NO:28(WSHPQFEK)、SEQ ID NO:29(MDVEAWLGAR)、SEQ ID NO:30(MDVEAWLGARVPLVET)、SEQ ID NO:31(MDEKTTGWRGGHVVEGLAGELEQLRARLEHHPQGQREP)、SEQ ID NO:32(EQKLISEEDL)、SEQ ID NO:33(KETAAAKFERQHMDS)、SEQ ID NO:34(KRRWKKNFIAVSAANRFKKISSSGAL)、SEQ ID NO:35(纤维素结合结构域)、SEQ ID NO:36(纤维素结合结构域)、SEQ ID NO:37(TNPGVSAWQVNTAYTAGQLVTYNGKTYKCLQPHTSLAGWEPSNVPALWQLQ)、SEQ ID NO:38(GST标记)和SEQ ID NO:39(MBP标记)。
术语“酶切割位点”指可由蛋白酶特异性切割的通过肽键相互连接的氨基酸残基的序列。在一个实施方案中，蛋白酶是IgA蛋白酶、颗粒酶B、Tev蛋白酶、PreScission蛋白酶、凝血酶、因子10a、Ides蛋白酶或肠激酶。
术语“IgA蛋白酶”指衍生自淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)的具有包含以下序列之一的识别位点的蛋白酶，其中“↓”表示所切割的键的位置：
Pro-Ala-Pro↓Ser-Pro(SEQ ID NO:40),
Pro-Pro↓Ser-Pro(SEQ ID NO:41),
Pro-Pro↓Ala-Pro(SEQ ID NO:42),
Pro-Pro↓Thr-Pro(SEQ ID NO:43),
Pro-Pro↓Gly-Pro(SEQ ID NO:44),
Pro-Arg-Pro-Pro↓Thr-Pro(SEQ ID NO:45),
Val-Val-Ala-Pro-Pro↓Ala-Pro(SEQ ID NO:46),
Val-Val-Ala-Pro-Pro↓Ser-Pro(SEQ ID NO:47),
Val-Val-Ala-Pro-Pro↓Thr-Pro(SEQ ID NO:48),
Val-Val-Ala-Pro-Pro↓Gly-Pro(SEQ ID NO:49),
Pro-Arg-Pro-Pro↓Thr-Pro(SEQ ID NO:50),
Ala-Pro-Pro-Ala↓Ala-Pro(SEQ ID NO:51),
Pro-Arg-Pro-Pro↓Ala-Pro(SEQ ID NO:52),
Pro-Arg-Pro-Pro↓Ser-Pro(SEQ ID NO:53),
Pro-Arg-Pro-Pro↓Gly-Pro(SEQ ID NO:54).
本申请中所用的术语“接头”或“肽接头”指天然来源和/或合成来源的肽接头。它们组成线性氨基酸链，其中20种天然存在的氨基酸是单体构件。链具有1至50个氨基酸、优选1和28个氨基酸之间、尤其优选3和25个氨基酸之间的长度。接头可以包含重复氨基酸序列或天然存在的多肽(如具有铰链功能的多肽)的序列。接头具有通过允许肽正确折叠和正确呈递来确保与抗-CD4抗体缀合的肽可以发挥其生物学活性的功能。优选地，接头是设计为富含甘氨酸、谷氨酰胺和/或丝氨酸残基的“合成肽接头”。这些残基例如以至多五个氨基酸的小重复单位排列，如GGGGS、QQQQG或SSSSG。此小重复单位可以重复两次至五次来形成多聚体单位。在多聚体单位的氨基端和/或羧基端，可以加入至多六个额外的任意的、天然存在的氨基酸。其他合成肽接头由重复10至20次之间的单种氨基酸组成，且可以在氨基端和/或羧基端包含至多六个额外的任意的、天然存在的氨基酸。所有肽接头都可以由核酸分子编码，因此可以重组表达。
本文报道的融合多肽
已发现，可以通过将Fc受体表达为具有基本上不结合融合的Fc受体的Fc区的融合多肽生产可溶Fc受体。
术语“基本上不结合Fc受体”表示Fc受体所融合至的Fc区不以使得形成聚集体的程度与Fc受体结合。
本文报道的一个方面是根据式I的融合多肽
R1-FC-R2 (式I)
其中
R1表示第一Fc受体，
R2表示第二Fc受体，和
FC表示重链Fc区多肽，
其中R1或R2或二者均存在，
其中FC基本上不结合R1和/或R2。
本文报道的一个方面是根据式II的融合多肽
R1-CS1-L1-CS2-FC-CS3-L2-CS4-R2 (式II)
其中
R1表示第一Fc受体，
R2表示第二Fc受体，
FC表示重链Fc区多肽，
CS1表示第一切割位点，
CS2表示第二切割位点，
CS3表示第三切割位点，
CS4表示第四切割位点，
L1表示第一间插氨基酸序列，和
L2表示第二间插氨基酸序列，
其中R1或R2或二者均存在，
其中CS1、CS2、CS3、CS4中的任一者可以彼此独立地存在或不存在，
其中L1和L2可以彼此独立地存在或不存在，
其中FC基本上不结合R1和/或R2。
本文报道的融合多肽中所含有的Fc受体可以是来自任何物种的任何Fc受体，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔，和猴。
在一个实施方案中Fc受体选自包含Fcγ-受体和新生Fc受体的组。在一个实施方案中Fc受体是人Fcγ-受体，人新生Fc受体，鼠Fcγ-受体，和兔新生Fc受体。
在一个实施方案中人Fcγ-受体选自人FcγRI(CD64)、人FcγRII(CD32)、人FcγRIIA、人FcγRIIB、人FcγRIIC、人FcγRIII(CD16)、人FcγRIIIA，和人FcγRIIIB。
在一个实施方案中人新生Fc受体是人FcRn。
在一个实施方案中鼠Fc受体选自鼠FcγRI(CD64)、鼠FcγRII(CD32)、鼠FcγRIIB、鼠FcγRIII(CD16)、鼠FcγRIII-2(CD16-2)，和鼠FcγRIV。
在一个实施方案中Fc是选自人IgG重链多肽、鼠IgG重链多肽、兔IgG重链多肽的组的重链多肽的变体。
在一个实施方案中，FC是选自人IgG1重链多肽、人IgG2重链多肽、人IgG3重链多肽、人IgG4重链多肽、鼠IgG1重链多肽、鼠IgG2重链多肽、鼠IgG2a重链多肽、鼠IgG3重链多肽、兔IgG重链多肽的组的重链多肽的变体。
本文报道的融合多肽中所包含的Fc区应基本上不结合与其融合的任何Fc受体。
在一个实施方案中，融合多肽基本上不具有效应子功能，这使它成为其中某些效应子功能不必要或有害的应用所希望的候选者。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定法来确认效应子功能的减少/消除。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定法来确保融合多肽缺乏FcγR结合(因此可能缺乏ADCC活性)。介导ADCC的主要细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、Fc RII和Fc RIII。造血细胞上的FcR表达总结在Ravetch,J.V.和Kinet,J.P.,Annu.Rev.Immunol.9(1991)457-492的464页上的表3中。评估目的分子的ADCC活性的体外测定法的非限制性实例描述于美国专利号5,500,362(见例如Hellstrom,I.等,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 83(1986)7059-7063；和Hellstrom,I.等,Proc.Nat’lAcad.Sci.USA 82(1985)1499-1502)；美国专利号5,821,337(见Bruggemann,M.等,J.Exp.Med.166(1987)1351-1361)中。备选地，可以利用非放射性测定方法(见例如用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定法(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA)和CytoTox非放射性细胞毒性测定法(Promega,Madison,WI))。可用于这类测定法的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。备选地或此外，可以在体内，例如在诸如公开于Clynes,R.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95(1998)652-656中的动物模型中评估目的分子的ADCC活性。还可以用本领域已知的方法进行FcRn结合和体内清除/半寿期测定(见例如Petkova,S.B.等,Int.Immunol.18(2006:1759-1769)。
可以通过本领域已知的用于测定Fc区/FcR相互作用(即Fc区与FcγR的特异性结合)的多种体外测定方法(基于生物化学或免疫学的测定)来测定Fc区对其配体的亲和力和结合特性，该体外测定方法包括但不限于平衡法(例如酶联免疫吸附测定(ELISA)或放射免疫测定(RIA))或动力学(例如分析)及其他方法，如间接结合测定、竞争性抑制测定、荧光共振能量转移(FRET)、凝胶电泳和层析(例如凝胶过滤)。这些及其他方法可以利用所检查的一种或多种成分上的标记和/或利用包括但不限于生色、荧光、发光或同位素标签的多种检测方法。结合亲和力和动力学的详细描述可以见于Paul,W.E.编辑,Fundamental Immunology,第4版,Lippincott-Raven,Philadelphia(1999)中。
在一个实施方案中，FC是人来源的IgG4亚类的Fc区或人来源的IgG1、IgG2或IgG3亚类的Fc区，其以这样的方式修饰，使得无Fcγ受体(例如FcγRIIIa)结合。在一个实施方案中，FC是人来源的、尤其是来自人IgG4亚类的Fc区，或来自人IgG1亚类的突变的Fc区。在一个实施方案中，FC属于具有突变L234A和L235A的人IgG1亚类。在一个实施方案中，FC属于具有突变S228P的人IgG4亚类。虽然IgG4显示减少的Fcγ受体(FcγRIIIa)结合，但其他IgG亚类的抗体显示强结合。但是，Pro238、Asp265、Asp270、Asn297(Fc糖类的丢失)、Pro329、Leu234、Leu235、Gly236、Gly237、Ile253、Ser254、Lys288、Thr307、Gln311、Asn434或/和His435是在如果改变时也提供减少的Fcγ受体结合的残基(Shields,R.L.等,J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604；Lund,J.等,FASEB J.9(1995)115-119；Morgan,A.等,Immunology 86(1995)319-324；EP 0307434)。在一个实施方案中，关于Fcγ受体结合，FC属于IgG4亚类，或属于IgG1或IgG2亚类，在L234、L235和/或D265中具有突变和/或包含PVA236突变。在一个实施方案中，FC包含突变S228P、L234A、L235A、L235E和/或PVA236(PVA236意指IgG1的氨基酸位置233至236的氨基酸序列ELLG(以单字母氨基酸密码给出)或IgG4的EFLG被PVA取代)中的一个或多个。在一个实施方案中，该突变是IgG4的S228P及IgG1的L234A和L235A。
Fc区结合位点为现有技术已知，并例如由Lukas,T.J.等,J.Immunol.127(1981)2555-2560；Brunhouse,R.和Cebra,J.J.,Mol.Immunol.16(1979)907-917；Burton,D.R.等,Nature 288(1980)338-344；Thommesen,J.E.等,Mol.Immunol.37(2000)995-1004；Idusogie,E.E.等,J.Immunol.164(2000)4178-4184；Hezareh,M.等,J.Virol.75(2001)12161-12168；Morgan,A.等,Immunology 86(1995)319-324；及EP 0307434描述。Fc区结合位点例如由氨基酸L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331和P329(根据Kabat的EU索引的编号)表征。
具有减少的效应子功能的Fc区包括具有Fc区残基238、265、269、270、297、327和329中的一个或多个的取代的那些(美国专利号6,737,056)。这类Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327中的两个或多个上具有取代的Fc突变体，包括残基265取代为丙氨酸的所谓“DA”Fc突变体及残基265和297取代为丙氨酸的所谓“DANA”Fc突变体(美国专利号7,332,581)。
描述了具有与FcR的改善或减弱的结合的某些Fc区变体(见例如美国专利号6,737,056；WO 2004/056312；和Shields,R.L.等,J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604)。
在一些实施方案中，在Fc区中进行改变，该改变导致改变的(即改善的或减弱的)C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)，例如，如美国专利号6,194,551；WO 99/51642；及Idusogie,E.E.等,J.Immunol.164(2000)4178-4184中所述。
关于Fc区变体的其他实例，还见Duncan,A.R.和Winter,G.,Nature322(1988)738-740；US 5,648,260；US 5,624,821；及WO 94/29351。
在一个实施方案中，重链Fc区多肽在位置234、235、236、237、238、239、253、254、265、266、267、268、269、270、288、297、298、299、307、311、327、328、329、330、331、332、434和435中的一个或多个上具有氨基酸突变。在一个实施方案中，Fc受体中的一个或多个是Fcγ受体。
在一个实施方案中，人IgG1重链多肽在氨基酸位置233、234、235、236、265、297、329和331中的一个或多个上具有突变。
在一个实施方案中，人IgG1重链多肽具有氨基酸突变E233P、L234A、L235A、L235E、ΔG236、D265A、N297A、N297D、P329A、P329G和P331S中的一个或多个。
在一个实施方案中，人IgG1重链多肽具有氨基酸突变L234A和L235A，及E233P、L235E、ΔG236、D265A、N297A、N297D、P329A、P329G和P331S中的一个或多个。
在一个实施方案中，人IgG1重链多肽具有氨基酸突变L234A和L235A和P329A或P329G。
在一个实施方案中，人IgG2重链多肽在氨基酸位置233、234、235、236、265和329中的一个或多个上具有突变。
在一个实施方案中，人IgG4重链多肽在氨基酸位置228、235、265和329中的一个或多个上具有突变。
在一个实施方案中，人IgG4重链多肽具有突变S228P、L235E、P329A和P329G中的一个或多个。
在一个实施方案中，人IgG4重链多肽具有突变S228P和L235E和P329A或P329G。
在一个实施方案中，重链Fc区多肽在位置248、250、251、252、253、254、255、256、257、272、285、288、290、291、308、309、310、311、314、385、386、387、428、433、434、435和436中的一个或多个上具有氨基酸突变。在一个实施方案中，Fc受体中的一个或多个是FcRn。
在一个实施方案中，人IgG重链多肽在氨基酸位置238、252、253、254、255、256、265、272、286、288、303、305、307、309、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、386、388、400、413、415、424、433、434、435、436、439和/或447中的一个或多个上具有突变。
在一个实施方案中，具有减少的与FcRn的结合的人IgG重链多肽在氨基酸位置252、253、254、255、288、309、386、388、400、415、433、435、436、439和/或447上具有一个或多个氨基酸改变。
融合多肽可以在Fc受体和Fc区之间包含接头多肽。此接头多肽可以用来调节Fc受体和Fc区之间的距离，以允许两个区域以预期的方式发挥作用。
在一个实施方案中，接头多肽选自包含(G3S)3、(G3S)4、(G3S)5、(G3S)6、(G4S)3、(G4S)4、(G4S)5、(G5S)2、(G5S)3、和(G5S)4的组及其任意组合。
此外，融合多肽可以在Fc受体和Fc区之间包含标记，例如适合用于亲和纯化或固定化的标记。
在一个实施方案中，该标记选自包含Arg标记、Avi标记、His-Avi标记、His标记、Flag标记、3xFlag标记、Strep标记、Nano标记、SBP标记、c-myc标记、S标记、钙调蛋白结合肽、纤维素结合结构域、几丁质结合结构域、GST标记、MBP标记、链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白、生物素、凝集素、多糖、类固醇、类固醇结合蛋白、激素和激素受体的组。
接头多肽和标记可以组合在定位在Fc受体和Fc区之间的间插氨基酸序列中。
在一个实施方案中，间插氨基酸序列选自包含(G3S)3、(G3S)4、(G3S)5、(G3S)6、(G4S)3、(G4S)4、(G4S)5、(G5S)2、(G5S)3、和(G5S)4的第一组，或选自包含Arg标记、Avi标记、His-Avi标记、His标记、Flag标记、3xFlag标记、Strep标记、Nano标记、SBP标记、c-myc标记、S标记、钙调蛋白结合肽、纤维素结合结构域、几丁质结合结构域、GST标记、MBP标记的第二组，或选自这些组的两个元件的组合。
间插氨基酸序列可以在融合多肽中定位在切割位点之前或之后。
在一个实施方案中，切割位点是酶切割位点。在一个实施方案中，酶切割位点选自包含IgA蛋白酶切割位点、颗粒酶B蛋白酶切割位点、Tev蛋白酶切割位点、PreScission蛋白酶切割位点、凝血酶切割位点、Faktor10a蛋白酶位点、Ides蛋白酶切割位点、SUMO蛋白酶切割位点和肠激酶切割位点的组。在一个实施方案中，切割位点选自IgA蛋白酶切割位点、PreScission蛋白酶切割位点、颗粒酶B切割位点和Ides蛋白酶切割位点的组。
在一个实施方案中，融合多肽包含木瓜蛋白酶、或胃蛋白酶、或Ides蛋白酶的固有切割位点。
本文报道的一个方面是包含本文报道的两种融合多肽的二聚体融合多肽。
由于本文报道的融合多肽包含Fc区，所述Fc区转而包含免疫球蛋白铰链区，二聚体融合多肽包含将第一融合多肽与第二融合多肽共价连接的一个或多个二硫桥。
二聚体融合多肽可以是同二聚体融合多肽或异二聚体融合多肽。
额外地二聚体融合多肽可以包含根据式I
R1-FC-R2 (式I)
其中
R1表示第一Fc受体，
R2表示第二Fc受体，和
FC表示重链Fc区多肽，
其中R1或R2或二者均存在，
其中FC基本上不结合R1和/或R2，
或根据式II的第一融合多肽
R1-CS1-L1-CS2-FC-CS3-L2-CS4-R2 (式II)
其中
R1表示第一Fc受体，
R2表示第二Fc受体，
FC表示重链Fc区多肽，
CS1表示第一切割位点，
CS2表示第二切割位点，
CS3表示第三切割位点，
CS4表示第四切割位点，
L1表示第一间插氨基酸序列，和
L2表示第二间插氨基酸序列，
其中R1或R2或二者均存在，
其中CS1、CS2、CS3、CS4中的任一者可以彼此独立地存在或不存在，
其中L1和L2可以彼此独立地存在或不存在，
其中FC基本上不结合R1和/或R2，
其中二聚体融合多肽的第一和第二融合多肽可以彼此独立地选自式I和式II。
如果二聚体融合多肽可以包含两条不同的融合多肽，必须使用确保异二聚化的机制。
在一个实施方案中第一FC包含突变T366W和任选地突变S354C并且第二FC包含突变T366S、L368A和Y407V和任选地突变Y349C。
在一个实施方案中融合多肽特征在于
a)第一和第二多肽的R1和R2相同，
b)第一融合多肽的R1和R2相同，第二融合多肽的R1和R2相同但与第一融合多肽的R1和R2不同，
c)第一和第二融合多肽的R1相同并且第一和第二多肽的R2相同但与R1不同，
d)第一和第二融合多肽的R1相同并且两个R2均不存在，
e)第一和第二融合多肽的R1不同并且两个R2均不存在，
f)第一和第二融合多肽的R2相同并且两个R1均不存在，
g)第一和第二融合多肽的R2不同并且两个R1均不存在，
h)第一融合多肽的R1和第二多肽的R2不同并且第一融合多肽的R2不存在并且第二多肽的R1不存在。
本文报道的融合多肽的应用
本文报道的一个方面是固定化的本文报道的融合多肽作为亲和层析配体的用途。
在一个实施方案中，融合多肽结合于固相。在一个实施方案中，固相是层析材料。在一个实施方案中，生物素化融合多肽，并用链霉抗生物素蛋白衍生固相。
在一个实施方案中，融合多肽在Fc受体和Fc区之间包含切割位点。在一个实施方案中，在生物素化之前切割融合多肽。
在一个实施方案中，融合多肽在Fc受体和切割位点之间包含固定化标记。在一个实施方案中，固定化标记是His-Avi标记。
还报道包含基质和基质结合的层析官能团的亲和层析柱，其特征在于，基质结合的层析官能团包含本文报道的融合多肽。
在一个实施方案中，融合多肽在Fc受体和Fc区之间包含切割位点。在一个实施方案中，在生物素化之前切割融合多肽。
在一个实施方案中，融合多肽在Fc受体和切割位点之间包含固定化标记。在一个实施方案中，固定化标记是Avi标记。
本文报道的一个方面是固定化的本文报道的融合多肽用于测定抗体的Fc受体结合的用途。
在一个实施方案中抗体是低亲和力抗体。
在一个实施方案中测定是通过表面等离子体共振。在一个实施方案中抗体由单体Fc受体捕获。在一个实施方案中抗体由二聚体抗体捕获。
重组方法
本文报道的一个方面是用于产生可溶Fc受体的方法，其包括以下步骤
a)培养包含编码本文报道的融合多肽的核酸的细胞，
b)从细胞或培养基回收融合多肽，
c)任选地用蛋白酶切割融合多肽，
从而产生可溶Fc受体。
本领域技术人员已知的用于实施本发明的方法和技术描述于例如Ausubel,F.M.编辑,Current Protocols in Molecular Biology,I至III卷(1997),Wiley and Sons；Sambrook等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)中。
可以在宿主细胞中表达编码本文报道的融合多肽的核酸。重组表达后，可以通过本领域技术人员已知的方法纯化融合多肽。这些方法是完善且广泛用于免疫球蛋白纯化，且单独或组合利用。这类方法是例如使用微生物衍生的蛋白质的亲和层析(例如A蛋白或G蛋白亲和层析)、离子交换层析(例如阳离子交换(羧甲基树脂)、阴离子交换(氨基乙基树脂)和混合模式交换层析)、亲硫吸附(例如用β-巯基乙醇和其他SH配体)、疏水相互作用或芳香族化合物吸附层析(例如使用苯基-琼脂糖、氮杂-arenophilic树脂或间-氨基苯基硼酸)、金属螯合亲和层析(例如使用Ni(II)-和Cu(II)-亲和材料)、大小排阻层析和制备型电泳方法(如凝胶电脉、毛细管电泳)(Vijayalakshmi,M.A.,Appl.Biochem.Biotech.75(1998)93-102)。在层析纯化前或层析纯化后，可以酶促切割融合多肽以释放Fc受体。表达盒包含启动子、编码分泌信号序列的DNA区段、结构基因和终止子/多腺苷酸化信号。元件以有效连接的形式组装在编码全部所需的不同融合多肽的一个质粒上，或各编码一个融合多肽的两个或多个质粒上。为了表达结构基因，将一个或多个质粒引入适宜的宿主细胞中。在哺乳动物细胞如CHO细胞、NS0细胞、Sp2/0细胞、COS细胞、HEK细胞、K562细胞、BHK细胞、细胞等中产生蛋白质。在一个实施方案中，在CHO细胞、或BHK细胞、或HEK细胞中表达融合多肽。必须以这样的方式选择质粒的调节元件，使得它们在所选择的宿主细胞中有功能。所表达的融合多肽功能性组装。
“表达质粒”是提供在宿主细胞中表达所包含的一个或多个结构基因所需的全部元件的核酸。通常，表达质粒包含原核质粒繁殖单位，例如，对于大肠杆菌，包含复制起点，选择标记，真核选择标记，一个或多个用于表达一个或多个目的结构基因的表达盒，该表达盒各包含启动子、结构基因和转录终止子(包括多腺苷酸化信号)。基因表达通常置于启动子的控制下，并且这种结构基因称为与启动子“有效连接”。类似地，如果调节元件调节核心启动子的活性，则调节元件和核心启动子有效连接。
可以用例如描述于美国专利号4,816,567中的重组方法和组合物产生抗体。在一个实施方案中，提供编码本文所述的融合多肽抗体的分离的核酸。在一个实施方案中，提供一个或多个包含这种核酸的载体(例如表达载体)。在另一实施方案中，提供包含这种核酸的宿主细胞。在一个这种实施方案中，宿主细胞包含以下(例如已用以下转化)：(1)载体，其包含编码含有第一融合多肽的氨基酸序列和含有第二融合多肽的氨基酸序列的核酸；或(2)第一载体，其包含编码含有第一融合多肽的氨基酸序列的核酸，和第二载体，其包含编码含有第二融合多肽的氨基酸序列的核酸。在一个实施方案中，宿主细胞是真核细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如Y0、NS0、Sp20细胞)。在一个实施方案中，提供制备融合多肽的方法，其中该方法包括在适于表达融合多肽的条件下培养含有编码上文提供的融合多肽的核酸的宿主细胞，并任选地从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收融合多肽。
为了重组产生本文报道的融合多肽，分离如上文所述的编码融合多肽的核酸，并插入一个或多个载体中进行进一步克隆，和/或在宿主细胞中表达。这种核酸可以用常规方法(例如使用能够特异性结合编码融合多肽的基因的寡核苷酸探针)容易地分离和测序。
适合用于克隆或表达编码融合多肽的载体的宿主细胞包括本文所述的原核或真核细胞。例如，尤其是在不需要糖基化和Fc效应子功能时，可以在细菌中产生融合多肽。对于抗体片段和多肽在细菌中的表达见例如US 5,648,237、US 5,789,199和US 5,840,523(还见Charlton,K.A.,In:Methods in Molecular Biology,248卷,Lo,B.K.C.(编辑),Humana Press,Totowa,NJ(2003),245-254页，其描述抗体片段在大肠杆菌中的表达)。表达后，可以从可溶级分中的细菌细胞糊分离融合多肽，并可以进一步纯化。
除原核生物外，诸如丝状真菌或酵母的真核微生物也是编码融合多肽的载体的适宜的克隆或表达宿主，包括糖基化途径已“人源化”，导致产生具有部分或完全人糖基化模式的融合多肽的真菌和酵母菌株(见Gerngross,T.U.,Nat.Biotech.22(2004)1409-1414；和Li,H.等,Nat.Biotech.24(2006)210-215)。
适合用于表达糖基化融合多肽的宿主细胞也衍生自多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已鉴定了许多可以与昆虫细胞结合使用，尤其是用于转染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞的杆状病毒毒株。
植物细胞培养物也可以用作宿主(见例如美国专利号5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429(描述用于在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIESTM技术))。
脊椎动物细胞也可以用作宿主。例如，可以使用适应悬浮生长的哺乳动物细胞系。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他实例是SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7)；人胚肾细胞系(描述于例如Graham,F.L.等,J.Gen Virol.36(1977)59-74中的293或293细胞)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠支持细胞(描述于例如Mather,J.P.,Biol.Reprod.23(1980)243-252中的TM4细胞)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK)；buffalo大鼠肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562)；描述于例如Mather,J.P.等,Annals N.Y.Acad.Sci.383(1982)44-68中的TRI细胞；MRC 5细胞；及FS4细胞。其他有用的哺乳动物细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub,G.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77(1980)4216-4220)；及骨髓瘤细胞系，如Y0、NS0和Sp2/0。适合用于抗体产生的某些哺乳动物宿主细胞系的综述见例如Yazaki,P.和Wu,A.M.,Methods in Molecular Biology,248卷,Lo,B.K.C.(编辑),Humana Press,Totowa,NJ(2004),255-268页。
用于诊断和检测的方法和组合物
在某些实施方案中，本文提供的任意融合多肽可用来检测含有Fc区的分子在生物样品中的存在。本文所用的术语“检测”涵盖定量或定性检测。
在一个实施方案中，提供本文报道的融合多肽用于诊断或检测的方法。在另一方面，提供检测含有Fc区的分子在生物样品中的存在的方法。在某些实施方案中，方法包括使生物样品与本文报道的融合多肽在允许融合多肽与含有Fc区的分子结合的条件下接触，并检测融合多肽和含有Fc区的分子之间是否形成复合物。这种方法可以是体外或体内方法。
在某些实施方案中，提供经标记的融合多肽。标记物包括但不限于，直接检测到(如荧光、有色、电子致密、化学发光和放射性标记物)的标记物或部分，以及间接检测到(例如借助酶促反应或分子相互作用)的部分，如酶或配体。示例性标记物包括但不限于放射性同位素32P、14C、125I、3H和131I、荧光团如稀土元素螯合物或荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹磺酰、伞形酮、萤光素酶，例如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶(US专利号4,737,456)、萤光素、2,3-二氢二氮杂萘二酮、辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶，例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、杂环氧化酶如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶，其与利用过氧化氢来氧化染料前体的酶如HRP、乳过氧化物酶或微过氧化物酶偶联、生物素/抗生物素蛋白、自旋标记物、噬菌体标记物、稳定自由基等。
药物组合物
通过以下方式制备冻干制剂或水溶液形式的如本文报道的融合多肽的药物组合物：将具有所需纯度的此类融合多肽与一种或多种任选的可药用载体混合(Remington'sPharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.(编著)(1980))。可药用载体总体上在所用的剂量和浓度对接受者无毒，并且包括但不限于：缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸和其他有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲氯铵；苯扎氯铵、苯扎溴铵；苯酚、丁醇或苄醇；烷基尼泊金酯如尼泊金甲酯或丙酯；儿茶酚；雷琐辛；环己醇；3-戊醇和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚(乙烯吡咯烷酮)；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他糖包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖如蔗糖、甘露糖、海藻糖或山梨糖；形成盐的反离子如钠；金属复合物(例如，Zn-蛋白质复合物)和/或非离子表面活性剂如聚乙二醇(PEG)。本文中的示例性可药用载体还包括间质药物分散剂如可溶中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如，人可溶PH-20透明质酸酶糖蛋白，如rhuPH20(Baxter International,Inc.)。在美国专利公开号2005/0260186和2006/0104968中描述了某些示例性sHASEGP和使用方法，包括rhuPH20。在一个方面，sHASEGP与一种或多种额外的糖胺聚糖如软骨素酶组合。
在美国专利号6,267,958中描述了示例性冻干抗体制剂。水性抗体制剂包括在美国专利号6,171,586和WO 2006/044908中描述的那些制剂，后一类制剂包含组氨酸-乙酸盐缓冲剂。
本文中的制剂也可以含有正在治疗的特定适应症所需要的多于一种活性成分，优选地是具有并未相互不利影响的互补活性的那些活性成分。这种活性成分以有效用于预期目的的量适当地存在。
活性成分可以包埋于例如分别通过凝聚技术或界面聚合制备的微胶囊(例如，羟甲基纤维素微胶囊或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)、胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球体、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)或粗乳液中。此类技术在Remington's Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.(编著)(1980)中公开。
可以制备持续释放制品。持续释放制品的合适例子包括含有融合多肽的固态疏水性聚合物的半通透性基质，所述基质处于成型制品(例如，薄膜或微胶囊)形式。
待用于体内施用的制剂通常是无菌的。可以例如用通过无菌滤膜过滤轻易地实现无菌。
治疗方法和组合物
任何本文报道的融合多肽可以用于治疗方法中。
在一方面，提供用作药物的融合多肽。在另外的方面，提供了用于治疗特征为升高的抗体水平的疾病的融合多肽。在一个实施方案中，疾病是自身免疫疾病。在某些实施方案中，提供用于治疗方法的融合多肽。在某些实施方案中，本发明提供用于治疗具有特征为升高的抗体水平的疾病的个体的方法的融合多肽，所述方法包括向个体施用有效量的融合多肽。在一个这种实施方案中，该方法还包括对个体施用有效量的至少一种额外的治疗剂。在另外的实施方案中，本发明提供用于降低抗体水平的融合多肽。在某些实施方案中，本发明提供用于降低个体中的抗体水平的方法的融合多肽，所述方法包括向个体施用有效量的融合多肽以降低抗体水平。根据以上实施方案中任一个的“个体”优选是人。
在另一方面，本发明提供融合多肽在制造或制备药物中的用途。在一个实施方案中，药物用于治疗特征为升高的抗体水平的疾病。在一个实施方案中疾病是自身免疫疾病。在另一个实施方案中，药物用于治疗升高的抗体水平的方法中，所述方法包括向具有特征为升高的抗体水平的疾病的个体施用有效量的药物。在一个此类实施方案中，方法还包括对个体施用有效量的至少一种额外的治疗剂。在另一个实施方案中，药物用于降低抗体水平。在另一个实施方案中，药物用于降低个体中的抗体水平的方法中，所述方法包括向个体施用有效量的药物以降低抗体水平。根据以上实施方案中任一个的“个体”可以是人。
在另一方面，本发明提供治疗特征为升高的抗体水平的疾病的方法。在一个实施方案中疾病是自身免疫疾病。在一个实施方案中，方法包括向具有此类特征为升高的抗体水平的疾病的个体施用有效量的融合多肽。在一个这种实施方案中，该方法还包括对个体施用有效量的至少一种额外的治疗剂。根据以上实施方案中任一个的“个体”可以是人。
在另一方面，本发明提供用于降低个体中的抗体水平的方法。在一个实施方案中，方法包括向个体施用有效量的融合蛋白以降低抗体水平。在一个实施方案中，“个体”是人。
在另一方面，本发明提供包含本文报道的任意融合多肽的药物组合物，例如用于以上治疗方法中的任一种。在一个实施方案中，药物组合物包含本文报道的任意融合多肽和可药用载体。在另一实施方案中，药物组合物包含本文报道的任意融合多肽和至少一种额外的治疗剂。
本发明的融合多肽可以在治疗中单独或与其他活性剂组合使用。例如，本发明的融合多肽可以与至少一种额外的治疗剂共同施用。
上文指出的这类联合治疗涵盖组合施用(其中两种或多种治疗剂包含在相同或分开的制剂中)和分开施用，在这种情况下，本发明的融合多肽的施用可以在施用额外的治疗剂和/或佐剂之前、同时和/或之后进行。
本发明的融合多肽(和任何额外的治疗剂)可以通过任何合适的手段施用，所述的合适手段包括肠胃外、肺内和鼻内以及，如果局部治疗需要，病灶内施用。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。给药可以通过任何合适的途径进行，例如通过注射，如静脉内或皮下注射，这部分地取决于施用是否为短暂或长期。本文中构思了多种给药方案，包括但不限于单次或在多个时间点多次施用、团注施用和脉冲输注。
本发明的融合多肽将以符合良好医学规范的方式配制、给药和施用。在这种情况下考虑的因素包括正在治疗的特别的病症、正在治疗的特别的哺乳动物、个体患者的临床状况、病症原因、送递活性剂的部位、施用方法、施用计划和医疗执业者已知的其他因素。该融合多肽不需要，但任选地与目前用来预防或治疗所讨论病症的一种或多种活性剂一起配制。这类其他活性剂的有效量取决于制剂中存在的融合多肽的量、疾病或疗法类型，和上文讨论的其他因素。这些通常以与本文所述相同的剂量并且采用与本文所述相同的施用途径使用，或以约1％至99％的本文所述剂量使用，或以经验地/临床上确定适宜的任何剂量和任何途径使用。
对于预防或治疗疾病，本发明的融合多肽的适宜剂量(当单独或与一种或多种其他额外治疗剂组合使用时)将取决于待治疗疾病的类型、融合多肽的类型、疾病的严重性和过程，融合多肽是否出于预防或治疗目的施用、先前疗法、患者的临床史和对融合多肽的反应以及主治医师的决定。将融合多肽适当地按一次或经过一系列治疗施用至患者。取决于疾病的类型和严重性，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.5mg/kg-10mg/kg)的融合多肽可以是向患者施用的起始候选剂量，无论是否例如通过一次或多次单独施用或通过连续输注来施用。取决于上文提到的因素，一个常见的每日剂量可能是从约1μg/kg至100mg/kg或更多。对于在几日或更长时间范围内重复施用，取决于病状，治疗通常将持续直至所需的疾病症状抑制出现。融合多肽的一个示例性剂量将处于从约0.05mg/kg至约10mg/kg范围。因此，可以向患者施用约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg的一种或多种剂量(或其任意组合)。这类剂量可以间断地施用，例如，每周或每3周(例如，从而，患者接受从约2个至约20个或例如约6个剂量的融合多肽)。然而，可以使用其他剂量方案。通过常规技术和测定法容易地监测这种疗法的进程。
应理解，可以用本发明的免疫缀合物取代或加至融合多肽来进行以上制剂或治疗方法中的任一个。
制造品
在本发明的另一个方面，提供制造品，所述制造品含有上文描述的可用于治疗、预防和/或诊断病症的物质。该制造品包括容器和在该容器上或与之结合的标签或包装说明书。合适的容器例如包括瓶、小药瓶、注射器、静脉内输液袋等。容器可以从多种材料如玻璃或塑料中形成。该容器容纳了本身或与另一种组合物组合时有效治疗、预防和/或诊断病状的组合物并且可以具有无菌接入口(例如该容器可以是具有皮下注射针头可穿透的塞子的静脉内输液袋或小药瓶)。组合物中的至少一种活性剂是本发明的融合多肽。标签或包装说明书提示组合物用于治疗选择的病状。另外，制造品可以包含(a)其中含有组合物的第一容器，其中所述组合物包含本发明的融合多肽；和(b)其中含有组合物的第二容器，其中所述组合物包含其他细胞毒性活性剂或治疗剂。在本发明的这个实施方案中制造品还可以包含指示组合物可以用来治疗特定病状的包装说明书。备选或额外地，该制造品可以还包含第二(或第三)容器，其包含可药用缓冲液，如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、Ringer溶液和葡萄糖溶液。它可以还包括从商业和用户观点看受欢迎的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、滤器、针头和注射器。
应理解，以上制造品中的任一种可以包含本发明的免疫缀合物取代或加至融合多肽。
提供以下实施例、附图和序列来辅助理解本发明，本发明真正的范围在所附权利要求中显示。应理解，可以在所示方法中进行修改而不背离本发明的精神。
实施例
实施例1
表达质粒的产生
a)FcγRIIIaV158-Avi-IgA蛋白酶-Fc LALA P239G融合多肽的表达质粒的产生
通过融合编码以下的化学合成的DNA片段来组装FcγRIIIaV158-Avi-IgA蛋白酶-Fc LALA P239G融合多肽编码基因：i)鼠免疫球蛋白重链信号序列(MGWSCIILFLVATATGVHS:SEQ ID NO:55)；ii)来自氨基酸残基2-193(即排除起始甲硫氨酸)的人Fcγ受体IIIaV158；和iii)具有突变L234A、L235A和P329G的人Fc-γ-1-重链恒定区(铰链-CH2-CH3)。
除FcγRIIIaV158-Avi-IgA蛋白酶-Fc LALA P239G融合多肽表达盒外，用于在HEK293细胞中瞬时表达FcγRIIIaV158-Avi-IgA蛋白酶-FcLALA P239G融合多肽的表达质粒包含允许此质粒在大肠杆菌中复制的来自载体pUC18的复制起点、和在大肠杆菌中赋予氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因。详细地，FcγRIIIaV158-Avi-IgA蛋白酶-Fc LALAP239G融合多肽编码基因的转录单位包含以下功能性元件：
-包括内含子A的来自人巨细胞病毒(P-CMV)的立即早期增强子和启动子，
-人重链免疫球蛋白5’-非翻译区(5'UTR)，
-鼠免疫球蛋白重链信号序列，
-来自野生型人Fcγ受体III V158蛋白质的氨基酸位置2-193的可溶人Fcγ受体III V158多肽，
-人Fc-γ-1-重链恒定区(铰链-CH2-CH3、LALA P329G)，和
-牛生长激素多腺苷酸化序列(BGH poly A信号序列)。
成熟FcγRIIIaV158-Avi-IgA蛋白酶-Fc LALA P239G融合多肽的氨基酸序列是：
GMRTEDLPKA VVFLEPQWYR VLEKDSVTLK CQGAYSPEDN STQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGE YRCQTNLSTL SDPVQLEVHI GWLLLQAPRWVFKEEDPIHL RCHSWKNTAL HKVTYLQNGKGRKYFHHNSD FYIPKATLKDSGSYFCRGLV GSKNVSSETV NITITQGLAV STISSFFPPGYQGLNDIFEAQKIEWHELVVAPPAPEDKTH TCPPCPAPEA AGGPSVFLFP PKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALGAPIEKTISKAKGQPR EPQVYTLPPSRDELTKNQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS PGK
(SEQ ID NO：56)。
以下融合多肽可以类似地获得：
-FcγRIIa-LR(H131)-Avi-IgA蛋白酶-Fc LALA P239G融合多肽：
QAAAPPKAVL KLEPPWINVL QEDSVTLTCQ GARSPESDSIQWFHNGNLIPTHTQPSYRFKANNNDSGEYT CQTGQTSLSD PVHLTVLSEW LVLQTPHLEFQEGETIMLRCHSWKDKPLVK VTFFQNGKSQ KFSHLDPTFS IPQANHSHSGDYHCTGNIGY TLFSSKPVTI TVQVPSMGSSSPMGIGLNDI FEAQKIEWHELVVAPPAPED KTHTCPPCPA PEAAGGPSVF LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDP EVKFNWYVDG VEVHNAKTKP REEQYNSTYR VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAP IEKTISKAKG QPREPQVYTL PPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPVLDSD GSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL SLSPGK
(SEQ ID NO：57)。
-FcγRIIb-Avi-IgA蛋白酶-Fc LALA P239G融合多肽：
APPKAVLKLE PQWINVLQED SVTLTCRGTH SPESDSIQWF HNGNLIPTHTQPSYRFKANNNDSGEYTCQT GQTSLSDPVH LTVLSEWLVL QTPHLEFQEGETIVLRCHSW KDKPLVKVTF FQNGKSKKFSRSDPNFSIPQ ANHSHSGDYHCTGNIGYTLY SSKPVTITVQ APGLNDIFEA QKIEWHELVVAPPAPEDKTHTCPPCPAPEA AGGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QYNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKALGAPIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPSRDELTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN HYTQKSLSLS PGK
(SEQ ID NO：58)。
-FcγRIIIb-Avi-IgA蛋白酶-Fc LALA P239G融合多肽：
GMRTEDLPKA VVFLEPQWYS VLEKDSVTLK CQGAYSPEDN STQWFHNESLISSQASSYFIDAATVNDSGE YRCQTNLSTL SDPVQLEVHI GWLLLQAPRWVFKEEDPIHL RCHSWKNTAL HKVTYLQNGKDRKYFHHNSD FHIPKATLKDSGSYFCRGLV GSKNVSSETV NITITQGLAV STISSFSPPGYQGLNDIFEAQKIEWHELVV APPAPEDKTH TCPPCPAPEA AGGPSVFLFP PKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALGAPIEKTISKAKGQPR EPQVYTLPPSRDELTKNQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS PGK
(SEQ ID NO：59)。
-最小FcγRIIIa-Avi-Fc LALA p239G融合多肽(无蛋白酶切割位点)：GWLLLQAPRWVFKEEDPIHL RCHSWKNTAL HKVTYLQNGK GRKYFHHNSDFYIPKATLKD SGSYFCRGLV GSKNVSSETVNITITQGLAV STISSFFPPGYQGLNDIFEA QKIEWHELED KTHTCPPCPA PEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTC VVVDVSHEDP EVKFNWYVDG VEVHNAKTKP REEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKC KVSNKALGAP IEKTISKAKG QPREPQVYTLPPSRDELTKN QVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL SLSPGK
(SEQ ID NO：60)。
c)二聚体Fc受体融合多肽的“结入孔”表达质粒的产生
用于在HEK293细胞中瞬时表达Fc受体Fc区融合多肽(孔)的表达质粒衍生自上文a)项下所述的表达载体。它在编码在人γ-1重链恒定区内具有孔突变T366S、L368A、Y407V和Y349C的Fc区的DNA序列上与之不同。
用于在HEK293细胞中瞬时表达Fc受体Fc区融合多肽(结)的表达质粒衍生自上文a)项下所述的表达载体。它在编码在人γ-1重链恒定区内具有结突变T366W和S354C的Fc区的DNA序列上与之不同。
除融合多肽(结/孔)表达盒外，用于在HEK293细胞中瞬时表达Fc受体Fc区融合多肽(结/孔)的表达质粒包含允许此质粒在大肠杆菌中复制的来自载体pUC18的复制起点、和在大肠杆菌中赋予氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因。详细地，融合多肽(结/孔)编码基因的转录单位包含以下功能性元件：
-包括内含子A的来自人巨细胞病毒(P-CMV)的立即早期增强子和启动子，
-人重链免疫球蛋白5’-非翻译区(5’UTR)，
-鼠免疫球蛋白重链信号序列，
-在人γ-1重链恒定区内具有孔突变T366S、L368A、Y407V和Y349C或结突变T366W和S354C的人Fc-γ-1重链恒定区(铰链-CH2-CH3)，和
-牛生长激素多腺苷酸化序列(BGH poly A信号序列)。
实施例2
FcγRIIIaV158-Avi-IgA蛋白酶-Fc LALA P239G融合多肽的瞬时表达、纯化和分析表征
通过瞬时转染培养在F17培养基(Invitrogen Corp.)中的HEK293细胞(人胚肾细胞系293衍生)来获得融合多肽。对于转染，使用“293-Free”转染试剂(Novagen)。转染时使用等摩尔质粒比，从两个不同质粒表达结入孔融合多肽对。按厂家说明书中所指定进行转染。转染后七天收获含有融合多肽的细胞培养物上清。上清保存在降低的温度下，直至纯化。
关于在例如HEK293细胞中重组表达人免疫球蛋白的一般信息在Meissner,P.等,Biotechnol.Bioeng.75(2001)197-203中给出。
过滤含有融合多肽的培养物上清，并通过两个层析步骤纯化。使用用PBS(1mMKH2PO4、10mM Na2HPO4、137mM NaCl、2.7mM KCl)、pH 7.4平衡的HiTrap MabSelectSuRe(GEHealthcare)，通过亲和层析捕获融合多肽。通过用平衡缓冲液洗涤来去除未结合的蛋白质，并用0.05M柠檬酸缓冲液pH 3回收融合多肽，洗脱后立即用1M Tris碱pH 9.0中和至pH6.5。用Superdex 200TM(GE Healthcare)上的大小排阻层析作为第二纯化步骤。大小排阻层析在2mM MOPS缓冲液、0.125M NaCl、pH 7.2中进行。用配有Biomax-SK膜的Ultrafree-CL离心过滤单元(Millipore,Billerica,MA)浓缩所洗脱的融合多肽，并保存在-80℃。
按照此流程纯化了四种不同的FcγRIIIa-Fc融合多肽：
a)FcγRIIIaV158-Avi-Fc LALA P239G(无切割位点)
b)最小FcγRIIIaV158-Avi-Fc LALA P239G(无切割位点)
c)FcγRIIIaV158-Avi-PreScission蛋白酶(PP)-Fc LALA P239G
d)FcγRIIIaV158-Avi-IgA蛋白酶-Fc LALA P239G
使用根据氨基酸序列计算的摩尔消光系数，通过测量280nm光密度(OD)来测定融合多肽的蛋白质浓度。通过存在和缺乏还原剂(5mM 1.4-二硫苏糖醇)情况下的SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色来分析融合多肽的纯度和正确的二聚体形成。通过使用Superdex 200TM分析型大小排阻柱(GEHealthcare)的高效SEC来测定融合多肽制备物的聚集体含量。通过用神经氨酸酶、O-聚糖酶和肽N-糖苷酶F(Roche Applied Science)的组合酶处理去除N-聚糖后，通过Nano Electrospray QTOF质谱来验证还原的融合多肽的氨基酸骨架的完整性。
实施例3
通过木瓜蛋白酶切割
不包含酶切割位点的FcγRIIIa-Fc融合多肽可以通过木瓜蛋白酶来切割。通过加入半胱氨酸和0.1mU/mg融合多肽木瓜蛋白酶(来自Carica papaya,Roche DiagnosticsGmbH)来在37℃切割FcγRIIIa-Fc融合多肽1小时。随后的纯化按实施例2中所述进行。图2中显示分析型SDS-PAGE凝胶。
实施例4
通过Ides蛋白酶切割
用Ides蛋白酶切割FcγRIIIaV158-Avi-Fc LALA P239G融合多肽效率非常低，因此在这种情况下无用。
实施例5
通过PreScission蛋白酶切割
对50mM Tris、150NaCl、1mM EDTA、1mM DTT pH 7.4透析后，通过加入1-15U之间的PreScission蛋白酶(GE Healthcare)/100μg融合多肽来在室温切割FcγRIIIa-(PP)-Fc融合多肽过夜。只有部分蛋白质可被切割。另一方面，观察到了PreScission蛋白酶对不含PP切割位点的受体的非特异性切割。
实施例6
通过IgA蛋白酶切割
用Slide-a-lyzer透析盒对50mM Tris pH 8透析后，通过按w(蛋白酶)/w(融合多肽)1:100的比例加入IgA蛋白酶(Roche Diagnostics GmbH)来在21℃切割FcγRIIIa-Fc融合多肽过夜。通过分析型大小排阻层析(SEC,Superdex 75；GE Healthcare)来控制切割。切割后，将FcγRIIIa受体通过Superdex 75TM(GE Healthcare)上的制备型大小排阻层析与IgA蛋白酶分开，并通过HiTrap MabSelectSuRe(GE Healthcare)柱与Fc-Tag分开。图3中显示分析型SDS-PAGE凝胶。
表格：包含不同FcγRIIIa V158的融合多肽的发酵和纯化的产量
实施例7
FcγRIIIa V158亲和柱的制备
通过体外生物素化Avi标记然后偶联至链霉抗生物素蛋白琼脂糖来制备具有FcγRIIIa V158的亲和柱。这可以用完整的融合多肽以及用已经切去Fc区后的受体进行。它是用于制备用于分析和制备目的的亲和柱的非常快速和有效的方法。
受体的生物素化
纯化后按以下流程来生物素化在HEK293细胞中表达的具有Avi标记的FcγRIIIaV158的可溶胞外结构域：按照厂家的说明用来自Avidity的生物素化试剂盒生物素化3mlPBS中的2mM MOPS、125mM NaCl pH 7.2、0.02％Tween和1片全蛋白酶抑制剂(Roche)的PBS中的1.2和12mg之间的标记的FcγRIIIaV158或2.4和24mg之间的标记的FcγRIIIaV158Fc区融合多肽。在室温进行生物素化反应过夜。在4℃对20mM磷酸钠缓冲液、150mM NaCl pH 7.5透析经修饰的多肽过夜，以去除过量的生物素。
偶联至链霉抗生物素蛋白琼脂糖
将1g链霉抗生物素蛋白琼脂糖(GE Healthcare)加至经生物素化和透析的受体，震荡孵育2小时，最后装入1ml XK柱(GE Healthcare)。
实施例8
层析方法
一般条件：
平衡缓冲液A：20mM柠檬酸/150mM NaCl pH 6.0
洗脱缓冲液B：20mM柠檬酸/150mM NaCl pH 3.0
洗脱：5分钟100％A，
60分钟内至100％B，
0.1分钟100％B，
6分钟100％A
样品量：50μg或更多
岩藻糖基化和无岩藻糖基化(afucosylated)抗体的分开
在FcgRIIIa柱上层析抗体允许定量完全岩藻糖基化和无岩藻糖基化的抗体级分。无岩藻糖基化的抗体级分与抗体制备物的ADCC相关。
在图4中，显示了抗Her抗体(野生型，上部)和糖改造的抗Her抗体的不同糖基化形式在Fc-FcgRIIIa柱上的分开和定量。可以通过改变梯度同时保持分辨率来缩短分析时间。
使用FcγRIIIaV158和Fc标记的FcγRIIIaV158的亲和柱的比较
按等摩尔量偶联两种受体构建体后，亲和柱在分开完全岩藻糖基化和无岩藻糖基化的抗体上表现得等同(图5：黑色：FcγRIIIaV158；蓝色：FcγRIIIaV158-Fc)。
实施例9
FcγRIIIaV158-Avi-IgA蛋白酶-Fc LALA P329G-IgG相互作用测量
系统完善用于分子相互作用的研究。它允许连续实时监测配体/分析物结合，从而测定缔合速率常数(ka)、解离速率常数(kd)和平衡常数(KD)。折射率的变化指示由固定化的配体与在溶液中注入的分析物的相互作用引起的表面上的质量变化。如果分子结合表面上的固定化的配体，则质量增加，在解离的情况下，质量减少。
对于FcγRIIIaV158-Fc LALA P329G融合多肽的活性测定，使用了直接结合测定法。
用GE提供的胺偶联试剂盒在pH 5.0将约400共振单位(RU)的捕获系统(20μg/ml人Fab捕获试剂盒GE Healthcare,28-9583-25)偶联至CM5芯片(GE Healthcare BR1005-30)上。样品和系统缓冲液是HBS-P+pH 7.4(10mM HEPES、pH 7.4、150mM NaCl、0.05％(v/v)表面活性剂P20)。流动池设为25℃，样品区设为12℃。通过按10μl/分钟的流速注入50nM溶液360秒来捕获抗体。通过按50μl/分钟的流速注射50nM的FcγRIIIa融合多肽180秒进行缔合而360秒进行解离来测量结合。通过按20μl/分钟的流速用甘氨酸pH 2.1溶液洗涤60秒来再生表面。对于构建体的活性评价，比较了信号高度和解离行为。
如图6中所示，与FcγRIIIaV158的40RU相比，FcγRIIIaV158-FcLALA P329G融合多肽的响应显示超过100响应单位。
实施例10
切割前和切割后的FcγRIIIaV158-Avi-IgA蛋白酶-Fc LALA P329G融合多肽IgG动力学相互作用测量
对于经切割的FcγRIIIaV158-Fc LALA P329G融合多肽的活性测定，使用了直接结合测定法。
用GE提供的胺偶联试剂盒在pH 5.0将约400共振单位(RU)的捕获系统(20μg/ml人Fab捕获试剂盒GE Healthcare,28-9583-25)偶联至CM5芯片(GE Healthcare BR1005-30)上。样品和系统缓冲液是HBS-P+pH 7.4(10mM HEPES、pH 7.4、150mM NaCl、0.05％(v/v)表面活性剂P20)。流动池设为25℃，样品区设为12℃。通过按10μl/分钟的流速注入50nM溶液80秒来捕获抗体。
使范围从0至250nM(1:2稀释)的不同浓度的抗体以30μl/分钟的流速通过流动池来在25℃测量结合120秒。通过从样品溶液转换至运行缓冲液来监测解离期420秒。通过按20μl/分钟的流速用甘氨酸pH 2.1溶液洗涤60秒来再生表面。
通过减去获自没有捕获的RIIIaV158的表面的响应来校正体积折射率差异。还减去空白缓冲液注射物(＝双参考)。
通过用BIAevaluation软件包分析用几种不同浓度获得的传感图曲线来测定定义为ka/kd的平衡解离常数(KD)。数据的拟合遵循适宜的结合模型。在图7中，显示了Fcγ受体V158-Fc LALA P329G融合多肽(图7a)、Fcγ受体V158(图7b)、切割的Fcγ受体V158-FcLALA P329G融合多肽(图7c)的传感图。

Claims (24)

1.根据式I的融合多肽：
R1-FC-R2(式I)
其中
R1表示第一Fc受体，
R2表示第二Fc受体，和
FC表示重链Fc区多肽，
其中R1或R2存在，或R1和R2二者均存在，
其中FC不结合R1和/或R2，
其中R1和R2彼此独立地选自人Fcγ-受体、人新生Fc受体、鼠Fc受体，和兔新生Fc受体的组，和
其中FC是突变的人IgG1重链Fc区多肽，
其中突变是L234A、L235A、P329G，以及孔突变T366S、L368A、Y407V和Y349C，或
突变是L234A、L235A、P329G，以及结突变T366W和S354C。
2.根据权利要求1的融合多肽，其中融合多肽具有式II
R1-CS1-L1-CS2-FC-CS3-L2-CS4-R2(式II)
其中
R1表示第一Fc受体，
R2表示第二Fc受体，
FC表示重链Fc区多肽，
CS1表示第一切割位点，
CS2表示第二切割位点，
CS3表示第三切割位点，
CS4表示第四切割位点，
L1表示第一间插氨基酸序列，和
L2表示第二间插氨基酸序列，
其中R1或R2存在，或R1和R2二者均存在，
其中CS1、CS2、CS3、CS4中的任一者可以彼此独立地存在或不存在，
其中L1和L2可以彼此独立地存在或不存在，
其中FC不结合R1和/或R2。
3.根据权利要求1的融合多肽，其中人Fcγ受体选自人FcγRI(CD64)、人FcγRII(CD32)、人FcγRIIA、人FcγRIIB、人FcγRIIC、人FcγRIII(CD16)、人FcγRIIIA，和人FcγRIIIB。
4.根据权利要求3的融合多肽，其中人新生Fc受体是人FcRn。
5.根据权利要求1的融合多肽，其中鼠Fc受体选自鼠FcγRI(CD64)、鼠FcγRII(CD32)、鼠FcγRIIB、鼠FcγRIII(CD16)、鼠FcγRIII-2(CD16-2)，和鼠FcγRIV。
6.根据权利要求1的融合多肽，其中Fc受体中的一个或多个是Fcγ受体。
7.根据权利要求1的融合多肽，其中Fc受体中的一个或多个是FcRn。
8.根据权利要求2的融合多肽，其中间插氨基酸序列选自包含(G3S)3、(G3S)4、(G3S)5、(G3S)6、(G4S)3、(G4S)4、(G4S)5、(G5S)2、(G5S)3、和(G5S)4的第一组，或选自包含Arg标记、Avi标记、His-Avi标记、His标记、Flag标记、3xFlag标记、Strep标记、Nano标记、SBP标记、c-myc标记、S标记、钙调蛋白结合肽、纤维素结合结构域、几丁质结合结构域、GST标记或MBP标记的第二组，或选自这些组的两个元件的组合。
9.根据权利要求2的融合多肽，其中切割位点选自IgA蛋白酶切割位点、颗粒酶B蛋白酶切割位点、Tev蛋白酶切割位点、Precision蛋白酶切割位点、凝血酶切割位点、Faktor10a蛋白酶位点、Ides蛋白酶切割位点、肠激酶切割位点或SUMO蛋白酶切割位点。
10.根据权利要求2的融合多肽，其中融合多肽不包含额外的蛋白酶切割位点而是包含固有的蛋白酶切割位点。
11.根据权利要求10的融合多肽，其中所述固有的蛋白酶切割位点是木瓜蛋白酶切割位点、胃蛋白酶切割位点或Ides蛋白酶切割位点。
12.包含两条根据权利要求1至11中任一项的融合多肽的二聚体融合多肽。
13.根据权利要求12的融合多肽，其中，
第一融合多肽的FC是突变的人IgG1重链Fc区多肽，其中所述突变是L234A、L235A、P329G，以及结突变T366W和S354C；并且
第二融合多肽的FC是突变的人IgG1重链Fc区多肽，其中所述突变是L234A、L235A、P329G，以及孔突变T366S、L368A、Y407V和Y349C。
14.根据权利要求12的融合多肽，其中融合多肽特征在于
a)第一和第二融合多肽的R1和R2相同，
b)第一融合多肽的R1和R2相同，第二融合多肽的R1和R2相同但与第一融合多肽的R1和R2不同，
c)第一和第二融合多肽的R1相同并且第一和第二融合多肽的R2相同但与R1不同，
d)第一和第二融合多肽的R1相同并且两个R2均不存在，
e)第一和第二融合多肽的R1不同并且两个R2均不存在，
f)第一和第二融合多肽的R2相同并且两个R1均不存在，
g)第一和第二融合多肽的R2不同并且两个R1均不存在，
h)第一融合多肽的R1和第二融合多肽的R2不同并且第一融合多肽的R2不存在并且第二融合多肽的R1不存在。
15.产生可溶Fc受体的方法，所述方法包括以下步骤
a)培养包含编码根据权利要求1至14中任一项的融合多肽的核酸的细胞，
b)从细胞或培养基回收融合多肽，
c)任选地用蛋白酶切割融合多肽，
并从而产生可溶Fc受体。
16.根据权利要求1至14中任一项的固定化的融合多肽或固定化的二聚体融合多肽作为亲和层析配体的用途。
17.根据权利要求1至14中任一项的固定化的融合多肽或固定化的二聚体融合多肽用于测定抗体的Fc受体结合的用途。
18.根据权利要求17的用途，其中融合多肽结合于固相。
19.包含根据权利要求1至14中任一项的融合多肽的药物组合物。
20.根据权利要求1至14中任一项的融合多肽在制备用于治疗疾病的药物中的用途。
21.根据权利要求20的用途，其中药物用于治疗炎性疾病。
22.根据权利要求20至21中任一项的用途，其中疾病是特征为增加的抗体水平的疾病。
23.根据权利要求20至21中任一项的用途，其中疾病是自身免疫病。
24.根据权利要求20至21中任一项的用途，其中疾病是类风湿关节炎。
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