CN103739709B - 针对人血管生成素2的抗体 - Google Patents

Abstract

本发明涉及针对人血管生成素2的抗体(抗‑ANG‑2抗体)，用于制备它们的方法，包含所述抗体的药物组合物，及其应用。

Description

针对人血管生成素2的抗体

本申请是申请日为2009年12月14日、发明名称为“针对人血管生成素2的抗体”的中国专利申请No.201210237207.1的分案申请。

本发明涉及针对人血管生成素2的抗体(抗-ANG-2抗体)，用于制备它们的方法，包含所述抗体的药物组合物，及其应用。

发明背景

血管发生参与各种病症的发病机理，所述疾病包括实体瘤、眼内新血管综合征如增殖性视网膜病或年龄相关的黄斑变性(AMD)、类风湿性关节炎和银屑病(Folkman,J.,等,J.Biol.Chem.(生物的化学杂志)267(1992)10931-10934;Klagsbrun,M.,等,Annu.Rev.Physiol.(物理学年度综述)53(1991)217-239;和Garner,A.,Vasculardiseases(血管疾病),在:Pathobiology of ocular disease,A dynamic approach(眼科疾病，即动力学途径的病理学),Garner,A.,和Klintworth,G.K,(编辑)第二版MarcelDekker,纽约,(1994),第1625-1710页)。在实体瘤的情形中，与正常细胞相比较，新血管生成允许所述肿瘤细胞获得生长优势和增殖自主性。因此，在乳腺癌以及在一些其它肿瘤中，已经观察到在肿瘤切片中的微脉管密度与患者存活之间的相关性(Weidner,N.,等,N.Engl.J.Med.(新英格兰医学杂志)324(1991)1-8;Horak,E.R.,等,Lancet340(1992)1120-1124;和Macchiarini,P.,等,Lancet340(1992)145-146)。

ANG-2和抗-ANG-2抗体

人血管生成素-2(ANG-2)(替代地缩写为ANGPT2或ANG2)(SEQ IDNo:107)在Maisonpierre,P.C.,等,Science(科学)277(1997)55-60和Cheung,A.H.,等,Genomics48(1998)389-91中描述。发现血管生成素-1和-2(ANG-1(SEQ ID No:108)和ANG-2(SEQ IDNo:107))是Ties的配体，Ties是选择性在血管内皮内表达的酪氨酸激酶家族。Yancopoulos,G.D.,等,Nature(自然)407(2000)242-48。现在有四种明确的血管生成素家族的成员。血管生成素-3和-4(Ang-3和Ang-4)可代表小鼠和人中相同基因座的非常不同的对应物。Kim,I.,等,FEBS Let,443(1999)353-56;Kim,I.,等,JBiol Chem(生物化学杂志)274(1999)26523-28。ANG-1和ANG-2最初在组织培养实验中分别作为激动剂和拮抗剂而鉴定(对于ANG-1，见:Davies,S.,等,Cell(细胞),87(1996)1161-1169;对于ANG-2，见:Maisonpierre,P.C.,等,Science(科学)277(1997)55-60)。所有已知血管生成素基本上都结合Tie2，且Ang-1和-2均以3nM(Kd)的亲和力结合Tie2。Maisonpierre,P.C.,等,Science(科学)277(1997)55-60。显示Ang-1支持EC存活并促进内皮完整性，Davis,S.,等,Cell(细胞)87(1996)1161-1169;Kwak,H.J.,等,FEBS Lett448(1999)249-53;Suri,C.,等,Science(科学)282(1998)468-71;Thurston,G.,等,Science(科学)286(1999)2511-14;Thurston,G.,等,Nat.Med.6(2000)460-63，而ANG-2具有相反效应，在存活因子VEGF或碱性成纤维细胞生长因子不存在时促进血管去稳定和退化。Maisonpierre,P.C.,等,Science(科学)277(1997)55-60。然而，ANG-2功能的许多研究已经表明更复杂的情况。ANG-2可能是血管重塑的复杂调节因子，在血管萌芽和血管退化中均发挥作用。支持ANG-2的这种作用，表达分析揭示在成人血管生成萌芽环境中ANG-2和VEGF一起迅速诱导，而在血管退化环境中在不存在VEGF时ANG-2被诱导。Holash,J.,等,Science(科学)284(1999)1994-98;Holash,J.,等,Oncogene18(1999)5356-62。与背景-依赖性作用相一致，ANG-2特异性结合相同的内皮-特异性受体Tie-2，Tie-2被Ang-1激活，但一旦激活具有背景-依赖性效应。Maisonpierre,P.C.,等,Science(科学)277(1997)55-60。

角膜血管生成测定已显示ANG-1和ANG-2均具有相似效应，与VEGF协同作用促进新血管的生长。Asahara,T.,等,Circ.Res.,83(1998)233-40。体外高浓度ANG-2也可促进血管生成，这种观察提出了这样的可能性，即存在剂量-依赖性内皮反应。Kim,I.,等,Oncogene(原癌基因)19(2000)4549-52。高浓度ANG-2作为内皮细胞在血清饥饿凋亡中的凋亡存活因子起作用，这种凋亡经PI-3激酶和Akt途径激活Tie2。Kim,I.,等,Oncogene(原癌基因)19(2000)4549-52。

其它体外实验表明在持续暴露过程中，ANG-2的效应可从Tie2的拮抗剂进行性转变为其激活剂，且在更晚时间点，ANG-2可直接促进脉管的管形成和新血管稳定。Teichert-Kuliszewska,K.,等,Cardiovasc.Res.(心血管研究)49(2001)659-70。另外，如果EC在纤维蛋白胶上培养，也观察到ANG-2激活Tie2，可能暗示ANG-2的作用依赖于EC分化状态。Teichert-Kuliszewska;K.,等,Cardiovasc.Res.(心血管研究)49(2001)659-70。在三维胶原蛋白胶中培养的微血管EC中，ANG-2也能诱导Tie2激活并促进毛细血管样结构的形成。Mochizuki,Y.,等,J.Cell.Sci.(细胞科学杂志)115(2002)175-83。使用3-D球状共培养作为血管成熟的体外模型证明EC和间充质细胞的直接接触消除了对VEGF的反应性，而VEGF和ANG-2的存在诱导萌芽。Korff,T.,等,Faseb J.15(2001)447-57。Etoh,T.等证明组成型表达Tie2的EC中，在VEGF存在下ANG-2强烈地上调MMP-1,-9和u-PA的表达。Etoh,T.,等,Cancer Res.(癌症研究)61(2001)2145-53。通过体内瞳孔膜模型，Lobov,I.B.,等显示存在内源VEGF时ANG-2促进毛细管直径的迅速增加、促进基底层重塑、内皮细胞的增殖和迁移，并刺激新血管的萌芽。Lobov,I.B.,等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)99(2002)11205-10。相反，没有内源VEGF时ANG-2促进内皮细胞死亡和血管退化。Lobov,I.B.,等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)99(2002)11205-10。相似地，通过体内肿瘤模型，Vajkoczy,P.,等证明多细胞凝集物通过血管原性萌芽起始脉管生长，该萌芽经过宿主和肿瘤内皮同时表达VEGFR-2和ANG-2发生。Vajkoczy,P.,等,J.Clin.Invest.(临床研究杂志)109(2002)777-85。这种模型说明生长中的肿瘤的建立的微血管具有连续重塑的特征，这推测由VEGF和ANG-2的表达介导。Vajkoczy,M.A.,等,J Clin.Invest.(临床研究杂志)09(2002)777-85。

Tie-2和血管生成素-1敲除小鼠的研究显示相似的表型并表明血管生成素-1刺激的Tie-2磷酸化介导了发育中血管的重塑和稳定，促进血管在血管生成过程中的成熟并维持内皮细胞-支持细胞粘附(Dumont,D.J.,等,Genes&Development(基因和发育),8(1994)1897-1909;Sato,T.N.,Nature(自然),376(1995)70-74;(Thurston,G.,等,NatureMedicine(自然医学)6(2000)460-463)。认为血管生成素-1的作用在成人中是保守的，在成人中其广泛且组成型表达(Hanahan,D.,Science,277(1997)48-50;Zagzag,D.,等,ExpNeurology,159(1999)391-400)。相比之下，血管生成素-2的表达主要局限于血管重塑位点，人们认为在那里血管生成素-2阻断血管生成素-1的组成型稳定或成熟功能，允许血管恢复且保持在可塑状态，该状态对萌芽信号更有反应性(Hanahan,D.,1997;Holash,J.,等,Orzcogerze18(1999)5356-62;Maisonpierre,P.C.,1997)。在病理性血管生成中血管生成素-2表达的研究已经发现许多肿瘤类型显示血管中血管生成素-2的表达(Maisonpierre,P.C.,等,Science(科学)277(1997)55-60)。功能研究表明血管生成素-2参与肿瘤血管生成并且血管生成素-2过量表达与小鼠异种移植模型中增加的肿瘤生长相关(Ahmad,S.A.,等,Cancer Res.(癌症研究),61(2001)1255-1259)。其它研究已经将血管生成素-2过量表达与肿瘤血管过度形成相关联(Etoh,T.,等,Cancer Res.(癌症研究)61(2001)2145-53;Tanaka,F.,等,Cancer Res.(癌症研究)62(2002)7124-29)。

近年来已经提出将血管生成素-1,血管生成素-2和/或Tie-2作为可能的抗-癌治疗靶标。例如US6,166,185,US5,650,490和US5,814,464中每个公开了抗-Tie-2配体和受体抗体。据报道使用可溶性Tie-2的研究降低了啮齿动物中肿瘤的数目和大小(Lin,P,1997;Lin,P.,1998)。Siemester,G.,等(1999)产生了表达Tie-2胞外域的人黑色素瘤细胞系，将其注射到裸鼠中并报道了可溶性Tie-2导致肿瘤生长和肿瘤血管生成的显著抑制。考虑到血管生成素-1和血管生成素-2均结合Tie-2，从这些研究中尚不清楚血管生成素-1、血管生成素-2或Tie-2是否将是抗-癌治疗的有吸引力的靶标。然而，认为有效抗-血管生成素-2治疗在治疗疾病(如癌症)中有益，这些疾病中进展依赖于异常血管生成，其中阻断该过程可预防疾病的进展(Folkman,J.,Nature Medicine(自然医学)1,(1995)27-31)。

此外，一些研究组已经报道结合血管生成素-2的抗体和肽的应用。见例如US6,166,185和US2003/10124129,WO03/030833,WO2006/068953,WO03/057134或US2006/0122370。

血管生成素-2病灶性(focal)表达效应的研究已经显示拮抗血管生成素-1/Tie-2信号使紧密的脉管结构松弛由此将EC暴露于来自血管生成诱导剂(如VEGF)的激活信号(Hanahan,1997)。这种血管生成素-1的抑制导致的促-血管生成效应表明抗-血管生成素-1治疗将不是有效的抗-癌治疗。

发育过程中ANG-2在发生血管重塑的位点表达。Maisonpierre,P.C.,等,Science(科学)277(1997)55-60。在成人个体中，ANG-2表达限制在血管重塑位点以及高度血管化的肿瘤中，包括神经胶质瘤，Osada,H.,等,Int.J.Oncol.18(2001)305-09;Koga,K.,等,Cancer Res.(癌症研究)61(2001)6248-54，肝细胞癌，Tanaka,S.,等,J.Clin.Invest.(临床研究杂志)103(1999)341-45，胃癌，Etoh,T.,等,Cancer Res.(癌症研究)61(2001)2145-53;Lee,J.H.,等,,Int.J.Oncol.18(2001)355-61，甲状腺瘤，Bunone,G.,等,AmJPathol155(1999)1967-76，非-小细胞肺癌，Wong,M.P.,等,Lung Cancer(肺癌)29(2000)11-22和结肠癌，Ahmad,S.A.,等,Cancer(癌症)92(2001)1138-43，和前列腺癌Wurmbach,J.H.,等,Anti Cancer Res(抗癌研究).20(2000)5217-20。发现一些肿瘤细胞表达ANG-2。例如，Tanaka,S.,等,J.Clin.Invest.(临床研究杂志)103(1999)341-45在人肝细胞癌(HCC)的12个样品的10个中检测到ANG-2mRNA。Ellis研究组报道ANG-2在肿瘤上皮中广泛表达。Ahmad,S.A.,等,Cancer(癌症)92(2001)1138-43。其他研究者报道了相似的发现。Chen,L.,等,J.Tongji Med.Univ.21(2001)228-30,235(2001)。通过在存档的人乳腺癌样品中检测ANG-2mRNA水平，Sfilogoi,C.,等,Int.J.Cancer(国际癌症杂志)103(2003)466-74报道ANG-2mRNA与辅助淋巴结侵袭、短的无疾病时间和差的总体生存显著相关。Tanaka,F.,等,Cancer Res.(癌症研究)62(2002)7124-29综述了分别具有病理I-期至IIIA期非小细胞肺癌(NSCLC)的总共236个患者。使用免疫组织化学，他们发现16.9%的NSCLC患者是ANG-2阳性的。ANG-2阳性肿瘤的微血管密度比ANG-2阴性的微血管密度显著更高。ANG-2的这种血管生成效应仅在VEGF表达高的时候可见。此外，ANG-2的阳性表达是预测较差手术后生存的显著因子。Tanaka,F.,等,Cancer Res.(癌症研究)62(2002)7124-29。然而，他们没有发现Ang-1表达和微血管密度之间有显著相关性。Tanaka,F.,等,Cancer Res.(癌症研究)62(2002)7124-29。这些结果表明ANG-2是数种类型癌症预后不良患者的指示剂。

最近，使用ANG-2敲除小鼠模型，Yancopoulos研究组报道出生后血管生成中需要ANG-2。Gale,N.W.,等,Dev.Cell3(2002)411-23。他们显示眼中玻璃样脉管系统的发育编程性退化在ANG-2敲除小鼠中没有发生，并且它们的视网膜血管没有从视网膜中央动脉萌发出来。Gale,N.W.,等,Dev.Cell(细胞)3(2002)411-23。他们还发现ANG-2缺失导致淋巴脉管系统的模式形成和功能的严重缺陷。Gale,N.W.,等,Dev.Cell(细胞)3(2002)411-23。通过Ang-1的遗传拯救纠正了淋巴缺陷，但没有纠正血管生成缺陷。Gale,N.W.,等,Dev.Cell(细胞)3(2002)411-23。

Peters及其同事报道了可溶性Tie2当作为重组蛋白或在病毒表达载体中递送时，抑制小鼠模型中鼠乳腺癌(mammary carcinoma)和黑素瘤的体内生长。Lin,P.,等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)95(1998)8829-34;Lin,P.,等,J.Clin.Invest.(临床研究杂志)100(1997)2072-78。如此处理的肿瘤组织中血管密度大大降低。此外，可溶性Tie2阻断肿瘤细胞条件培养基刺激的大鼠角膜中的血管生成。Lin,P.,等,J.Clin.Invest.(临床研究杂志)100(1997)2072-78。另外，Isner及其小组证明向VEGF添加ANG-2比单独的VEGF显著促进更长且更多周围新血管生成。Asahara,T.,等,Circ.Res.,83(1998)233-40。过量可溶性Tie2受体妨碍VEGF-诱导的新血管生成经ANG-2的调节。Asahara,T.,等,Circ.Res.,83(1998)233-40。Siemeister,G.,等,Cancer Res.(癌症研究)59(1999)3185-91通过裸鼠异种移植显示在异种移植物中过量表达Flt-1或Tie2的胞外配体-结合结构域导致途径的显著抑制不能被另一种补偿，表明应当认为VEGF受体途径和Tie2途径是两种独立的体内血管生成过程中必需的介质。Siemeister,G.,等,CancerRes.(癌症研究)59(1999)3185-91。这一点被White,R.R.,等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)100(2003)5028-33更近的公开所证明。在他们的研究中，证明了特异性结合且抑制ANG-2的核酸酶-抗性RNA适体(aptamer)显著抑制大鼠角膜微袋(micropocket)血管生成模型中bFGF诱导的新血管形成。

发明概述

本发明包括特异性结合人血管生成素-2(ANG-2)的抗体，其特征在于包含SEQ IDNO:1,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:41或SEQ IDNO:49的CDR3区作为重链可变结构域CDR3区。

优选地，所述抗体特征在于：

a)所述重链可变结构域包含SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:17,SEQ IDNO:25,SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:49的CDR3区，SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:34,SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:50的CDR2区，和SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:35,SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:51的CDR1区,和

b)所述轻链可变结构域包含SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:20,SEQ IDNO:28,SEQ ID NO:36,SEQ ID NO:44或SEQ ID NO:52的CDR3区，SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:21,SEQ ID NO:29,SEQ ID NO:37,SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:53的CDR2区,和SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:22,SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:38,SEQ ID NO:46或SEQ ID NO:54的CDR1区。

优选地，所述抗体特征在于包含：

a)SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:23,SEQ ID NO:31,SEQ ID NO:39,SEQID NO:47或SEQ ID NO:55的重链可变结构域;和

b)SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:40,SEQID NO:48或SEQ ID NO:56的轻链可变结构域。

优选地，所述抗体特征在于所述抗体不特异性结合于血管生成素1(ANG-1)。

本发明的另一个实施方案是包含根据本发明所述的抗体的药物组合物。

本发明的另一个实施方案是根据本发明所述的抗体用于制备药物组合物的应用。

本发明的另一个实施方案是根据本发明所述的抗体用于预防转移的应用。

本发明的另一个实施方案是根据本发明所述的抗体用于治疗癌症的应用。

本发明的另一个实施方案是根据本发明所述的抗体用于治疗血管疾病的应用。

本发明的另一个实施方案是根据本发明所述的抗体用于治疗视网膜病的应用。

本发明的另一个实施方案是编码根据本发明所述的抗体的重链可变结构域和/或轻链可变结构域的核酸。

本发明还提供含有根据本发明所述核酸的表达载体，其能够在原核或真核宿主细胞中表达所述核酸，和用于重组产生所述抗体的含有这种载体的宿主细胞。

本发明还包括原核或者真核宿主细胞，其包含根据本发明的载体。

本发明还包括用于产生根据本发明所述的重组人或人源化的抗体的方法，其特征在于在原核或真核宿主细胞中表达根据本发明所述的核酸，并且从所述细胞或细胞培养上清液中回收所述抗体。本发明还包括可通过所述重组方法获得的抗体。

根据本发明所述的抗体特别用于预防继发性肿瘤/转移或用于治疗血管疾病如视网膜病。

发明详述

本发明包括特异性结合于人血管生成素-2(ANG-2)的抗体，其特征在于包含SEQID NO:1,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:25,SEQID NO:33,SEQ ID NO:41或SEQID NO:49的CDR3区作为重链可变结构域CDR3区。

在本发明的一个实施方案中，所述抗体特征在于

a)所述重链可变结构域包含SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:17,SEQ IDNO:25,SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:49的CDR3区，SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:34,SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:50的CDR2区，和SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:35,SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:51的CDR1区,和

b)所述轻链可变结构域包含SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:20,SEQ IDNO:28,SEQ ID NO:36,SEQ ID NO:44或SEQ ID NO:52的CDR3区，SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:21,SEQ ID NO:29,SEQ ID NO:37,SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:53的CDR2区,和SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:22,SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:38,SEQ ID NO:46或SEQ ID NO:54的CDR1区。

优选地，所述抗体特征在于包含

a)SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:23,SEQ ID NO:31,SEQ ID NO:39,SEQID NO:47或SEQ ID NO:55的重链可变结构域;和

b)SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:40,SEQID NO:48或SEQ ID NO:56的轻链可变结构域。

本发明的另一个实施方案是特异性结合于人ANG-2的抗体，特征在于所述抗体不特异性结合于人血管生成素1(ANG-1)。特异性结合于人ANG-2，而不特异性结合人ANG-1的典型抗体例如是Ang2s_R3_LC03,Ang2s_LC09,Ang2i_LC06,Ang2i_LC07，或这样的抗体，其结合于与Ang2s_R3_LC03,Ang2s_LC09,Ang2i_LC06,Ang2i_LC07,Ang2i_LC10相同的表位，优选地结合于与Ang2i_LC06相同的表位。因此，在本发明的一个实施方案中，特异性结合于人血管生成素-2(ANG-2)，但不特异性结合于人ANG-1的抗体结合于与Ang2s_R3_LC03,Ang2s_LC09,Ang2i_LC06,Ang2i_LC07,Ang2i_LC10相同的表位，优选地结合于与Ang2i_LC06相同的表位。特异性结合于ANG-2，但是不特异性结合于ANG-1的这些抗体与ANG-2和ANG-1特异性抗体相比，可以具有改善的性质如功效，较少的毒性，药物代谢动力学性质。

因此，在本发明的一个实施方案中，特异性结合于人血管生成素-2(ANG-2)但是不特异性结合于人ANG-1的抗体特征在于

a)所述重链可变结构域包含SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:25,SEQ IDNO:33或SEQ ID NO:49的CDR3区，SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:50的CDR2区，和SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:51的CDR1区,和

b)所述轻链可变结构域包含SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:28,SEQ IDNO:36或SEQ ID NO:52的CDR3区,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:29,SEQ ID NO:37或SEQ ID NO:53的CDR2区，和SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:38或SEQ ID NO:54的CDR1区。

优选地，特异性结合于人血管生成素-2(ANG-2)但是不特异性结合于人ANG-1的所述抗体特征在于包含：

a)SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:31,SEQ ID NO:39或SEQ ID NO:55的重链可变结构域;和

b)SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:40或SEQ ID NO:56的轻链可变结构域。

在一个实施方案中，根据本发明所述的抗体特征在于：

a)所述重链可变结构域包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:9的CDR3区,SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:10的CDR2区,和SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:11的CDR1区,和

b)所述轻链可变结构域包含SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:12的CDR3区,SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:13的CDR2区,和SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:14的CDR1区。

在一个实施方案中，根据本发明所述的抗体特征在于包含

a)SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:15的重链可变结构域;和

b)SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:16的轻链可变结构域。

在一个实施方案中，根据本发明所述的抗体特征在于：

a)所述重链可变结构域包含SEQ ID NO:1的CDR3区,SEQ ID NO:2的CDR2区,和SEQID NO:3的CDR1区,和

b)所述轻链可变结构域包含SEQ ID NO:4的CDR3区,SEQ ID NO:5的CDR2区,和SEQID NO:6的CDR1区。

在一个实施方案中，根据本发明所述的抗体特征在于包含：

a)SEQ ID NO:7的重链可变结构域;和

b)SEQ ID NO:8的轻链可变结构域。

在一个实施方案中，根据本发明所述的抗体特征在于：

a)所述重链可变结构域包含SEQ ID NO:17的CDR3区,SEQ ID NO:18的CDR2区,和SEQ ID NO:19的CDR1区,和

b)所述轻链可变结构域包含SEQ ID NO:20的CDR3区,SEQ ID NO:21的CDR2区,和SEQ ID NO:22的CDR1区。

在一个实施方案中，根据本发明所述的抗体特征在于包含：

a)SEQ ID NO:23的重链可变结构域;和

b)SEQ ID NO:24的轻链可变结构域。

优选地，根据本发明所述的抗体特征在于所述抗体是人IgG1亚类或人IgG4亚类的。

术语“抗体”涵盖抗体结构的多种形式，包括但不限于完整的抗体和抗体片段。根据本发明所述的抗体优选地是人源化的抗体、嵌合抗体或其它遗传改造的抗体，只要根据本发明的特征性质仍旧保留。

“抗体片段”包含完整长度抗体的一部分，优选其可变结构域，或至少其抗原结合位点。抗体片段的实例包括形成自抗体片段的双抗体、单链抗体分子(scFv或scFab)和多特异性抗体(例如双特异性)。ScFv抗体在例如Houston,J.S.,Methods in Enzymol(酶学方法).203(1991)46-88)中进行描述。此外，抗体片段包含这样的单链多肽，其具有V_H结构域的特征，

即能够与V_L结构域一起组装以形成功能性抗原结合位点并由此提供性质，或具有结合于ANG-2的V_L结构域的特征，即能够与V_H结构域一起组装形成功能性抗原结合位点并由此提供性质。可以使用例如下列来稳定ScFvs：a)二硫化物稳定(见例如在WO94/029350,Rajagopal,V.,等,Prot.Engin.(1997)1453-59;Kobayashi,H.,等,Nuclear Medicine &Biology(核医学和生物学),卷25,(1998)387-393;或Schmidt,M.,等,Oncogene(原癌基因)(1999)18 1711-1721中)或b)稳定的构架(例如通过特异性突变，见例如WO2007/109254，具体的稳定构架，见例如US7,258,985,Furrer,F.,等,Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.50(2009),第771–778页或Ottiger,M.,等,Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.50(2009),第779–786页。

术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”用于本文中时，指单一氨基酸组成的抗体分子制剂。

术语“嵌合抗体”指一种抗体，其包括来自一种来源或物种的可变区，即结合区，以及源自不同来源或物种的恒定区的至少一部分，其通常通过重组DNA技术进行制备。优选包括鼠可变区和人恒定区的嵌合抗体。本发明涵盖的“嵌合抗体”的其它优选形式是这样的那些，其中恒定区已经被从初始抗体的恒定区进行修饰或改变以产生按照本发明的特性，特别是关于C1q结合和/或Fc受体(FcR)结合。也将这种“嵌合”抗体称作“类别转换抗体”。嵌合抗体是被表达的免疫球蛋白基因的产物，该基因包括编码免疫球蛋白可变区的DNA区段和编码免疫球蛋白恒定区的DNA区段。制备嵌合抗体的方法包括在本领域众所周知的常规重组DNA和基因转染技术。见,例如,Morrison,S.L.,等,美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad Sci.USA)81(1984)6851-6855;US5,202,238和5,204,244。

术语“人源化抗体”指这样的抗体，其中的构架或“互补性决定区”(CDR)已经被修饰为包括与母体免疫球蛋白相比特异性不同的免疫球蛋白的CDR。在优选实施方案中，将鼠CDR移植到人抗体的构架区以制备“人源化抗体”。见例如，Riechmann,L.，等，自然(Nature)332(1988)323-327；和Neuberger，M.S.，等，自然(Nature)314(1985)268-270。特别优选的CDRs对应于识别以上指出的关于嵌合抗体的抗原的那些代表性序列。本发明涵盖的“人源化抗体”的其它形式是这样的那些，其中恒定区已经另外被从初始抗体的恒定区进行修饰或改变以产生按照本发明的特性，特别是关于C1q结合和/或Fc受体(FcR)结合。

用于本文时，术语“人抗体”意欲包括具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。人抗体是现有技术中公知的(van Dijk,M.A.,和van de Winkel,J.G.,当前化学生物学观点(Curr.Opin.Chem.Biol).5(2001)368-374)。人抗体还可以在转基因动物(例如小鼠)中产生，所述转基因动物在免疫时能够在缺乏内源免疫球蛋白生成的条件下产生人抗体的全部所有组成成分或选择部分(selection)。在所述种系突变小鼠中转移人种系免疫球蛋白基因阵列将导致在抗原攻击时产生人抗体(见例如Jakobovits,A.,等.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)90(1993)2551-2555;Jakobovits,A.,等.,Nature(自然)362(1993)255-258;Brueggemann,M.,等.,Year Immunol.(免疫学年度)7(1993)33-40)。人抗体还可以在噬菌体展示文库中产生(Hoogenboom,H.R.,和Winter,G.,J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)227(1992)381-388;Marks,J.D.,等.,J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)222(1991)581-597)。Cole,S.P.C.,等和Boerner,等的技术也可以用于制备人单克隆抗体(Cole,S.P.C.,等.,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy(单克隆抗体和癌症治疗),Liss A.R.,(1985)77-96;和Boerner,P.,等.,J.Immunol.(免疫学杂志)147(1991)86-95)。如已经对按照本发明的嵌合和人源化抗体所提及地，术语“人抗体”用于本文中时还包括这样的抗体，其在恒定区内进行修饰以产生按照本发明的特性，特别是关于C1q结合和/或FcR结合，例如通过“类别转换”即改变或突变Fc部分(例如由IgG1到IgG4和/或IgG1/IgG4突变。)

用于本文时，术语“重组人抗体”意欲包括通过重组方法制备、表达、产生或分离的所有人抗体，诸如分离自宿主细胞，诸如NS0或CHO细胞的抗体或分离自人免疫球蛋白基因的转基因动物(例如小鼠)的抗体，或利用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体。这种重组人抗体具有处于重排形式的可变区和恒定区。按照本发明的重组人抗体已经经历了体内体细胞高变。因此，重组抗体的VH和VL区域的氨基酸序列是尽管源自并涉及人种系VH和VL序列，但在体内可能不天然存在于人抗体种系所有组成成分中的序列。

“可变结构域”(轻链(V_L)的可变结构域，重链(V_H)的可变结构域)用于本文中时，表示直接参与抗体与抗原结合的每对轻链和重链结构域。可变轻链和重链的结构域具有相同的一般结构且每个结构域包括4个构架(FR)区，所述构架区的序列普遍保守，其通过3个“高变区”(或互补决定区,CDRs)相连接。构架区采用β-折叠构象且CDR可以形成连接β-折叠结构的环。每条链中的CDR通过构架区以其三维结构保持并与来自另一条链的CDR一起形成抗原结合位点。抗体重链和轻链CDR3区在按照本发明的抗体的结合特异性/亲和力方面发挥特别重要的作用并因此提供本发明的另一个目的。

用于本文时，术语“抗体的抗原结合部分”指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。抗体的抗原结合部分包括来自“互补决定区”或“CDRs”的氨基酸残基。“构架”或“FR”区是除本文中定义的高变区残基之外的那些可变结构域区域。因此，抗体的轻链和重链可变结构域从N端到C端包括结构域FR1,CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。特别地，重链的CDR3是最有助于抗原结合的区域并且限定抗体的性质。按照Kabat,E.A.,等，免疫目的的蛋白质序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，第5版，公众健康服务，国家健康研究所(Public Health Service，National Institutes of Health)，Bethesda，MD.(1991))的标准定义确定CDR和FR区域,和/或来自“高变环”的那些残基。

术语“核酸”或“核酸分子”，用于本文时，意欲包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链或双链的，但是优选是双链DNA。

术语”氨基酸”在本申请中使用时指天然存在的羧基α氨基酸的组，其包括丙氨酸(三字母编码:ala,一字母编码:A),精氨酸(arg,R),天冬酰胺(asn,N),天冬氨酸(asp,D),半胱氨酸(cys,C),谷氨酰胺(gln,Q),谷氨酸(glu,E),甘氨酸(gly,G),组氨酸(his,H),异亮氨酸(ile,I),亮氨酸(leu,L),赖氨酸(lys,K),甲硫氨酸(met,M),苯丙氨酸(phe,F),脯氨酸(pro,P),丝氨酸(ser,S),苏氨酸(thr,T),色氨酸(trp,W),酪氨酸(tyr,Y),和缬氨酸(val,V)。

当核酸在被置于与另一个核酸序列的功能关系中，是“可操作地连接的”。例如，前序列或分泌前导序列的DNA与多肽的DNA可操作地连接，条件是其表达为参与多肽分泌的前蛋白；启动子或增强子与编码序列可操作地连接，条件是其影响序列的转录；或核糖体结合位点与编码序列可操作地连接，条件是其被定位为促进翻译。一般地，“可操作地连接的”意指被连接的DNA序列是共线性的，且在分泌前导序列的情形中，是连续的且在可读框中。然而，增强子不必须是连续的。连接通过在方便的限制性位点处的连接来实现。如果所述位点不存在，则合成的寡核苷酸适体或接头根据常规实践使用。

用于本文中时，表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可交替使用，且全部这些名称都包括子代。因此，词语“转化体”和“转化的细胞”包括原代受试细胞和由其来源的培养物，而不考虑转移的次数。还理解所有的子代的DNA含量可能不精确一致，这归因于有意或无意的突变。包括在最初转化的细胞中筛选的具有相同功能或生物学活性的变异子代。

用于本文时，术语“结合”或“特异性结合”指在体外测定法中，优选地在用纯化的野生型ANG-2抗原的等离子共振测定(BIAcore,GE-Healthcare Uppsala,Sweden)(实施例3)中，抗体与抗原(ANG-2)的表位的结合。结合的亲和力由术语ka(来自抗体/抗原复合物的抗体的缔合的速率常数)，k_D(解离常数)和K_D(kD/ka)定义。结合或特异性结合意为10^-8mol/l以下，优选地10^-9M到10^-13mol/l的结合亲和力(K_D)。

抗体与FcγRIII的结合可以通过BIAcore测定法(GE-Healthcare,Uppsala,Sweden)进行研究。结合的亲和力由术语ka(来自抗体/抗原复合物的抗体的缔合的速率常数)，k_D(解离常数)和K_D(k_D/ka)定义。

用于本文时，术语“不结合ANG-1”或“不特异性结合ANG-1”表示在体外ANG-1结合ELISA测定法中抗体具有高于8000ng/ml的EC50值(根据实施例2)。

术语“表位”包括能够特异性结合抗体的任何多肽决定簇。在某些实施方案中，表位决定簇包括分子的化学活性表面定群(groupings)，诸如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，在某些实施方案中，可以具有特定的三维结构特征，和/或特定的带电特性。表位是被抗体结合的抗原区域。

抗体的“Fc部分”不直接涉及抗体与抗原的结合，而是显示不同的效应子功能。“抗体的Fc部分”是技术人员公知的术语并且基于抗体的木瓜蛋白酶裂解定义。根据它们重链的恒定区的氨基酸序列，抗体或免疫球蛋白被分类为下列类别：IgA,IgD,IgE,IgG和IgM，并且其中一些可进一步被分类为亚类(同种型)，例如IgG1,IgG2,IgG3,和IgG4,IgA1,和IgA2。

根据重链恒定区，将不同类别的免疫球蛋白分别称为α、δ、ε、γ和μ。抗体的Fc部分直接涉及ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用)和基于补体激活、C1q结合和Fc受体结合的CDC(补体依赖的细胞毒性)。补体激活(CDC)由补体因子C1q与大多数IgG抗体亚类的Fc部分结合而起始。尽管抗体对补体系统的影响取决于某些条件，与C1q的结合由在Fc部分中限定的结合位点所导致。这样的结合位点在现有技术中是已知的，并且例如由Boakle，R.J.,等Nature（自然）282（1975）742-743，Lukas,T.J.,等,免疫学杂志(J.Immunol.)127(1981)2555-2560;Brunhouse,R.,和Cebra,J.J.,分子免疫学(Mol.Immunol.)16(1979)907-917;Burton,D.R.,等,自然(Nature)288(1980)338-344;Thommesen,J.E.,等,分子免疫学(Mol.Immunol.)37(2000)995-1004;Idusogie,E.E.,等,免疫学杂志(J.Immunol.)164(2000)4178-4184;Hezareh,M.,等,病毒学杂志(J.Virology.)75(2001)12161-12168;Morgan,A.,等,免疫学(Immunology)86(1995)319-324;和EP0307434所描述。所述结合位点例如是L234,L235,D270,N297,E318,K320,K322,P331,和P329(根据Kabat的EU索引编号，见下)。亚类IgG1,IgG2和IgG3的抗体通常显示补体激活，和C1q和C3结合，而IgG4不激活补体系统并且不结合C1q和C3。

根据本发明所述的抗体优选地包含来自人起源的Fc部分，其是亚类IgG1的人抗体的Fc部分。

根据本发明所述的抗体特征在于人起源的恒定链。所述恒定链是现有技术中众所周知的，并且例如由Kabat,E.A.(见，例如Johnson,G.和Wu,T.T.,Nucleic Acids Res.(核酸研究)28(2000)214-218)描述。例如，有用的人重链恒定区包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列或SEQ ID NO:58的氨基酸序列。例如有用的人轻链恒定区包含SEQ ID NO:59的κ-轻链恒定区的氨基酸序列，或SEQ ID NO:60的λ-轻链恒定区的氨基酸序列。

术语“恒定区”用于本申请时指除了可变区之外的抗体的结构域的总合。恒定区不直接涉及抗原的结合，但是显示不同的效应子功能。取决于它们重链的恒定区的氨基酸序列，抗体被分为下述类别：IgA,IgD,IgE,IgG和IgM，并且这些中的一些可以被进一步分为亚类如IgG1,IgG2,IgG3,和IgG4,IgA1和IgA2。对应于不同种类的抗体的重链恒定区分别被称为α、δ、ε、γ和μ。可以在所有5种抗体种类中发现的轻链恒定区被称为к(kappa)和λ(lambda)。

术语“来自人来源的恒定区”在本申请中使用时，指亚类IgG1,IgG2,IgG3,或IgG4的人抗体的恒定重链区和/或恒定轻链к区。这样的恒定区是现有技术中公知的并且例如由Kabat,E.A.,描述(见，例如Johnson,G.和Wu,T.T.,核酸研究(Nucleic Acids Res.)28(2000)214-218;Kabat,E.A.,等.,美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)72(1975)2785-2788)。

当IgG4亚类的抗体显示减少的Fc受体(FcγRIIIa)结合时，其它IgG亚类的抗体显示强烈的结合。然而，Pro238,Asp265,Asp270,Asn297(失去Fc糖),Pro329,Leu234,Leu235,Gly236,Gly237,Ile253,Ser254,Lys288,Thr307,Gln311,Asn434,和His435是这样的残基，其如果改变的话，还提供减少的Fc受体结合(Shields,R.L.,等,生物化学杂志(J.Biol.Chem.)276(2001)6591-6604;Lund,J.,等,FASEB J.9(1995)115-119;Morgan,A.,等,免疫学(Immunology)86(1995)319-324;EP0307434)。

在一个实施方案中，根据本发明所述的抗体与IgG1抗体比较具有减少的FcR结合，并且所述单特异性二价母体抗体涉及具有S228，L234,L235和/或D265中突变的IgG4亚类的或IgG1或IgG2亚类的FcR结合，和/或包含PVA236突变。在一个实施方案中，在单特异性二价母体抗体中的突变是S228P,L234A,L235A,L235E和/或PVA236。在另一个实施方案中，在单特异性二价母体抗体中的突变在IgG4中是S228P，在IgG1中是L234A和L235A。恒定重链区在SEQ ID NO:57和58中显示。在一个实施方案中，单特异性二价母体抗体的恒定重链区是具有突变L234A和L235A的SEQ ID NO:57的恒定重链区。在另一个实施方案中，单特异性二价母体抗体的恒定重链区是具有突变S228P的SEQ ID NO:58的恒定重链区。在另一个实施方案中，单特异性二价母体抗体的恒定轻链区是SEQ ID NO:59的к轻链区或SEQ ID NO:60的λ轻链恒定区。在本发明的一个实施方案中，单特异性二价母体抗体的恒定重链区是SEQ IDNO:57或具有突变S228P的SEQ ID NO:58的恒定重链区。

抗体的恒定区直接涉及ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用)和CDC(补体依赖的细胞毒性)。补体激活(CDC)由补体因子C1q与大多数IgG抗体亚类的恒定区结合而起始。C1q与抗体的结合由在所谓的结合位点的定义的蛋白-蛋白相互作用所导致。这样的恒定区结合位点在现有技术中是已知的，并且例如由Lukas,T.J.,等,免疫学杂志(J.Immunol.)127(1981)2555-2560;Brunhouse,R.,和Cebra,J.J.,分子免疫学(Mol.Immunol.)16(1979)907-917;Burton,D.R.,等,自然(Nature)288(1980)338-344;Thommesen,J.E.,等,分子免疫学(Mol.Immunol.)37(2000)995-1004;Idusogie,E.E.,等,免疫学杂志(J.Immunol.)164(2000)4178-4184;Hezareh,M.,等,病毒学杂志(J.Virol.)75(2001)12161-12168;Morgan,A.,等,免疫学(Immunology)86(1995)319-324;和EP0307434所描述。所述恒定区结合位点例如特征在于氨基酸L234,L235,D270,N297,E318,K320,K322,P331,和P329(根据Kabat的EU索引编号)。

术语“抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)”指在存在效应细胞时，由根据本发明的抗体裂解人靶细胞。ADCC优选地通过用根据本发明的抗体在存在效应细胞时处理表达CCR5的细胞的制备物进行测量，所述效应细胞如新鲜分离的PBMC或来自暗黄覆盖层的纯化的效应细胞，如单核细胞或天然杀伤(NK)细胞或永久生长的NK细胞系。

术语“补体依赖的细胞毒性(CDC)”指由补体因子C1q与大多数IgG抗体亚类的Fc部分结合而起始的过程。C1q与抗体的结合由在所谓结合位点的限定的蛋白-蛋白相互作用所导致。这些Fc部分结合位点是现有技术已知的(见上)。这些Fc部分结合位点例如特征在于氨基酸L234,L235,D270,N297,E318,K320,K322,P331,和P329(根据Kabat的EU索引编号)。亚类IgG1,IgG2,和IgG3的抗体通常显示包括C1q和C3结合的补体激活，而IgG4不激活补体系统并且不结合C1q和/或C3。

根据本发明所述的抗体由重组方式产生。因此，本发明的一个方面是编码根据本发明所述的抗体的核酸，并且另一个方面是包含编码根据本发明抗体的所述核酸的细胞。用于重组生产的方法是现有技术中广泛已知的并且包含在原核细胞和真核细胞中的蛋白表达，以及随后的抗体分离和通常纯化为药用纯度。对于将前述抗体在宿主细胞中的表达，将编码各个修饰的轻链和重链的核酸通过标准方法插入表达载体中。在适合的原核或真核宿主细胞如CHO细胞,NS0细胞,SP2/0细胞,HEK293细胞,COS细胞,PER.C6细胞,酵母,或大肠杆菌细胞中进行表达，并且将所述抗体从细胞(上清液或裂解后的细胞)中回收。用于重组生产抗体的一般方法是现有技术中公知的，并且例如在Makrides,S.C.,ProteinExpr.Purif.17(1999)183-202;Geisse,S.,等,Protein Expr.Purif.8(1996)271-282;Kaufman,R.J.,分子生物技术(Mol.Biotechnol.)16(2000)151-161;Werner,R.G.,J.DrugRes(药物研究杂志).48(1998)870-880的综述文章中描述。

根据本发明所述的抗体适当地从培养基中通过常规免疫球蛋白纯化方法分离，所述纯化方法如，例如蛋白A-琼脂糖,羟基磷灰石层析法，凝胶电泳，透析或亲和层析法。编码所述单克隆抗体的DNA和RNA容易地使用常规方法进行分离和测序。杂交瘤细胞可以充当所述DNA和RNA的来源。一旦被分离，可以将DNA插入表达载体中，所述表达载体接着被转染到不另外产生免疫球蛋白的宿主细胞如HEK293细胞,CHO细胞,或骨髓瘤细胞中，从而在宿主细胞中获得重组单克隆抗体的合成。

根据本发明所述抗体的氨基酸序列变体(或突变体)通过将适合的核苷酸变化引入抗体DNA中，或通过核苷酸合成进行制备。然而，这样的修饰可以仅在例如如上述的非常有限的范围内进行。例如，修饰不改变上述提及的抗体特征如IgG同种型和抗原结合，但是可以提高重组生产的产率、蛋白稳定性或有利于纯化。

术语“宿主细胞”用于本申请时是指可以被改造从而产生根据本发明所述的抗体的细胞系统的任何种类。在一个实施方案中，将HEK293细胞和CHO细胞用作宿主细胞。用于本文时，表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可交替使用，且全部这些名称都包括后代。因此，词语“转化体”和“转化的细胞”包括原代受试者细胞和由其来源的培养物，而不考虑转移数。还理解所有的后代的DNA含量可能不精确一致，这归因于有意或无意的突变。包括在最初转化的细胞中筛选的具有相同功能或生物学活性的变异后代。

在NS0细胞中的表达记述在,例如,Barnes,L.M.,等.,细胞技术学(Cytotechnology)32(2000)109-123;Barnes,L.M.,等.,生物技术和生物工程(Biotech.Bioeng.)73(2001)261-270中。瞬时表达记述在,例如,Durocher,Y.,等.,核酸研究(Nucl.Acids.Res.)30(2002)E9中。可变结构域的克隆记述在Orlandi,R.,等.,美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86(1989)3833-3837;Carter,P.,等.,美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)89(1992)4285-4289;和Norderhaug,L.,等.,免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods)204(1997)77-87中。优选的瞬时表达系统(HEK293)记述在Schlaeger,E.-J.,和Christensen,K.,在细胞技术学(Cytotechnology)30(1999)71-83中和Schlaeger,E.-J.,在免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods)194(1996)191-199中。

适合用于原核生物的控制序列，例如包括启动子，任选地操纵子序列，和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、增强子和多腺苷酸化信号。

当核酸在被置于与另一个核酸序列的功能关系中，是“可操作地连接的”。例如，前序列或分泌前导序列的DNA与多肽的DNA可操作地连接，条件是其表达为参与多肽分泌的前蛋白；启动子或增强子与编码序列可操作地连接，条件是其影响序列的转录；或核糖体结合位点与编码序列可操作地连接，条件是其被定位为促进翻译。一般地，“可操作地连接的”意指被连接的DNA序列是连续的，且在分泌前导序列的情形中，是连续的且在可读框中。然而，增强子不必须是连续的。连接通过在方便的限制性位点处的连接来实现。如果所述位点不存在，则合成的寡核苷酸适体或接头根据常规实践使用。

通过标准技术，包括碱/SDS处理，CsCl分级(CsCl banding)，柱层析法，琼脂糖凝胶电泳，和其它本领域公知的技术，进行抗体的纯化从而消除细胞成分或其它污染物，例如其它细胞核酸或蛋白。见Ausubel,F.,等,编辑,现代分子生物学中的方法(CurrentProtocols in Molecular Biology),Greene Publishing和Wiley Interscience,NewYork(1987)。不同的方法是充分建立的并且广泛用于蛋白纯化，如用微生物蛋白进行的亲和层析法(例如，蛋白A或蛋白G亲和层析法),离子交换层析法(例如阳离子交换(羧甲基树脂),阴离子交换(氨基乙基树脂)和混合模式的交换)，亲硫吸附(例如，用β-巯基乙醇和其它SH配体)，疏水相互作用或芳香吸附层析法(例如用苯基-琼脂糖、氮杂-arenophilic树脂，或间氨基苯基硼酸)，金属螯合亲和层析法(例如用Ni(II)-和Cu(II)-亲和力材料),大小排阻层析和电泳方法(如凝胶电泳，毛细管电泳)(Vijayalakshmi,M.,A.应用生物化学生物技术(Appl.Biochem.Biotech).75(1998)93-102)。

本发明包括用于治疗需要治疗的患者的方法，其特征在于向所述患者施用治疗有效量的根据本发明所述的抗体。

本发明包括根据本发明所述的抗体用于治疗的应用。

本发明包括根据本发明所述的抗体用于制备预防转移的药物的应用。

本发明包括根据本发明所述的抗体用于制备用于治疗癌症的药物的应用。

本发明的一个方面是包含根据本发明所述的抗体的药物组合物。本发明的另一个方面是将根据本发明所述的抗体用于制备药物组合物的应用。本发明的另一个方面是用于制备包含根据本发明所述的抗体的药物组合物的方法。在另一个方面中，本发明提供包含与药用载体一起配制的根据本发明所述的抗体的组合物，例如药物组合物。

本发明的另一个方面是用于预防转移的所述药物组合物。

本发明的另一个方面是用于预防转移的根据本发明所述的抗体。

本发明的另一个方面是根据本发明所述的抗体用于制备用于预防转移的药物的应用。

本发明的另一个方面是在遭受原发癌的患者中预防转移的方法，所述方法通过向需要所述预防性治疗的患者施用根据本发明所述的抗体进行。

我们可以显示在原位和皮下癌症模型中对自发转移/继发性肿瘤的体内高度有效的预防(见实施例9)(与其中静脉内注射肿瘤细胞的实验模型对比)。这与细胞从原发肿瘤播散并转移到继发器官如肺或肝(其中继发肿瘤)的临床情形相似。

根据本发明的术语“转移”指癌细胞从原发性肿瘤传播到患者中的一个或多个其他位点，然后在那里发展继发性肿瘤。确定癌症是否转移的转移方式(MetastasMeans)是本领域已知的，并包括骨扫描、胸部X线检查、CAT扫描、MRI扫描和肿瘤标记检测。

术语“预防转移”或“预防继发肿瘤”用于本文时具有相同的含义并且指以抑制或减少癌细胞自原发肿瘤向患者中一个或多个其它位点进一步传播的这种方式，在遭受复发性HER2阳性癌症的患者中针对转移的预防剂。这意味着原发性肿瘤或癌症的转移被预防、延缓或减少，并由此预防、延缓或减少继发肿瘤的发展。优选地，肺的转移，即肺的继发肿瘤被预防或减少，这意味着癌细胞从原发肿瘤向肺的转移性传播被预防或减少。

本发明的另一个方面是用于治疗癌症的所述药物组合物。

本发明的另一个方面是用于治疗癌症的根据本发明所述的抗体。

本发明的另一个方面是根据本发明所述的抗体用于制备治疗癌症的药物的应用。

本发明的另一个方面是通过向需要所述治疗的患者施用根据本发明所述的抗体治疗遭受癌症的患者的方法。

用于本文时，“药物载体”包括生理相容的任何和所有的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗试剂和吸附延缓试剂等。优选地，所述载体适合用于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊或表皮施用(例如通过注射或输注)。

本发明的组合物可以通过多种本领域已知的方法施用。如技术人员所理解地，施用的路径和/或方式将根据需要的结果变化。为了通过某些施用路径施用本发明的化合物，可能需要用防止其失活的材料包被所述化合物，或使所述化合物与防止其失活的材料共同施用。例如，所述化合物可以在适合的载体中施用于受试者，所述载体例如是脂质体或稀释剂。药用稀释剂包括盐水和水性缓冲溶液。药物载体包括无菌水溶液或分散体和用于即时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。这些介质和药剂用于药物活性物质是本领域已知的。

术语“肠胃外施用”和“肠胃外地施用”用于本文时意为除了肠和局部施用之外的施用方式，通常通过注射施用，并且包括，但不限于，静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眼内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、角质下(subcuticular)、关节内、囊下、蛛网膜下、脊内、硬膜外和胸骨内注射和输注。

术语癌症用于本文时指增生性疾病，如淋巴瘤(lymphomas)，淋巴细胞性白血病(lymphocytic leukemias)，肺癌(lung cancer)，非小细胞肺(NSCL)癌(non small celllung(NSCL)cancer)，支气管肺泡细胞肺癌(bronchioloalviolar cell lung cancer)，骨癌(bone cancer)，胰腺癌(pancreaticcancer)，皮肤癌(skin cancer)，头或颈癌(cancerof the head or neck)，皮肤或眼内黑素瘤(cutaneous or intraocular melanoma)，子宫癌(uterine cancer)，卵巢癌(ovarian cancer)，直肠癌(rectal cancer)，肛区癌(cancerof the analregion)，胃癌(stomach cancer)，胃癌(gastric cancer)，结肠癌(coloncancer)，乳腺癌(breast cancer)，子宫癌(uterine cancer)，输卵管癌(carcinoma ofthefallopian tubes)，子宫内膜癌(carcinoma of the endometrium)，子宫颈癌(carcinoma of the cervix)，阴道癌(carcinoma of the vagina)，外阴癌(carcinoma ofthe vulva)，霍奇金病(Hodgkin's Disease)，食管癌(cancer of theesophagus)，小肠癌(cancer of the small intestine)，内分泌系统癌(cancer ofthe endocrine system)，甲状腺癌(cancer of the thyroid gland)，甲状旁腺癌(cancer of the parathyroidgland)，肾上腺癌(cancer of the adrenal gland)，软组织肉瘤(sarcoma of softtissue)，尿道癌(cancer of the urethra)，阴茎癌(cancer of the penis)，前列腺癌(prostate cancer)，膀胱癌(cancer of thebladder)，肾癌或输尿管癌(cancer of thekidney or ureter)，肾细胞癌(renal cellcarcinoma)，肾盂癌(carcinoma of the renalpelvis)，间皮瘤(mesothelioma)，肝细胞癌(hepatocellular cancer)，胆管癌(biliarycancer)，中枢神经系统(CNS)肿瘤(neoplasms of the central nervous system(CNS))，脊椎轴肿瘤(spinal axistumors)，脑干胶质瘤(brain stem glioma)，多形性成胶质细胞瘤(glioblastomamultiforme)，星形细胞瘤(astrocytomas)，神经鞘瘤(schwanomas)，室管膜瘤(ependymonas)，成髓细胞瘤(medulloblastomas)，脑膜瘤(meningiomas)，鳞状细胞癌(squamous cell carcinomas)，垂体腺瘤(pituitary adenoma)，和尤因瘤(Ewing’ssarcoma)，包括上述癌症任一的难治性形式，或一种或多种上述癌症的组合。

本发明的另一方面是作为抗-血管生成剂的所述药物组合物。这种抗-血管生成剂可用于治疗癌症(特别是实体瘤)和其它血管疾病。

本发明的另一个方面是根据本发明所述的抗体用于制备治疗血管疾病的药物的应用。

本发明的另一个方面是用于治疗血管疾病的根据本发明所述的抗体。

优选的实施方案是用于治疗视网膜病的根据本发明所述的抗体。

优选的实施方案是根据本发明所述的抗体用于制备治疗视网膜病的药物的应用。

本发明的另一方面是通过向需要这种治疗的患者施用根据本发明所述的抗体治疗患有血管疾病的患者的方法。

术语“血管疾病(vascular diseases)”包括癌症(Cancer)，炎性疾病(Inflammatory diseases)，动脉粥样硬化(Atherosclerosis)，缺血(Ischemia)，

创伤(Trauma)，脓毒症(Sepsis)，COPD，哮喘(Asthma)，糖尿病(Diabetes)，AMD，视网膜病(Retinopathy)，中风(Stroke)，肥胖(Adipositas)，急性肺损伤(Acute lunginjury)，出血(Hemorrhage)，血管渗漏(Vascular leak)例如细胞因子诱导的血管渗漏，变态反应(Allergy)，格雷夫斯病((Graves’Disease)，桥本自身免疫性甲状腺炎(Hashimoto’s Autoimmune Thyroiditis)，特发性血小板减少性紫癜(Idiopathic ThrombocytopenicPurpura)，巨细胞动脉炎(Giant Cell Arteritis)，类风湿性关节炎(RheumatoidArthritis)，系统性红斑狼疮(Systemic Lupus Erythematosus(SLE))，狼疮性肾炎(LupusNephritis)，局限性回肠炎(Crohn’s Disease)，多发性硬化(Multiple Sclerosis)，溃疡性结肠炎(Ulcerative Colitis)，特别是实体瘤，眼内新血管综合征(intraocularneovascular syndromes)（诸如增殖性视网膜病(proliferative retinopathies)或年龄相关的黄斑变性(age-related macular degeneration(AMD))，类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)和银屑病(psoriasis)。(Folkman,J.,等,J.Biol.Chem.(生物的化学杂志)267(1992)10931-10934;Klagsbrun,M.,等,Annu.Rev.Physiol.(物理学年度综述)53(1991)217-239;和Garner,A.,Vasculardiseases(血管疾病),在:Pathobiology ofocular disease,A dynamic approach(眼科疾病，即动力学途径的病理学),Garner,A.,和Klintworth,G.K.(eds.)第二版Marcel Dekker,纽约,(1994),第1625-1710页)。

这些组合物还可以包含辅药如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。防止微生物的存在可以通过灭菌方法，见上文和通过包含各种抗细菌和抗真菌药剂，例如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、山梨酸等来确保。在组合物中包含等渗剂，如糖、氯化钠等也可能是理想的。此外，可以通过包含延缓吸附的试剂如单硬脂酸铝和明胶来导致可注射药物形式的延长的吸收。

不管所选择的施用路径为何，可以以适合的水合形式使用的本发明的化合物，和/或本发明的药物组合物通过本领域技术人员已知的常规方式配制到药用剂型中。

在本发明的药物组合物中的活性成分的实际剂量水平可以变化从而获得这样的活性成分的量，其对于特定的患者、组合物和施用方式有效获得需要的治疗反应，而不会对于患者具有毒性。选定的剂量水平将取决于多种药物代谢动力学因素包括所用的本发明的特定组合物的活性、施用路径、施用时间、使用的特定化合物的排泄速率、治疗的延续时间、与所用的特定组合物组合使用的其它药物、化合物和/或材料、待治疗的患者的年龄、性别、体重、病症、一般健康和以前的医疗病史，以及医疗领域已知的类似因素。

所述组合物必需是无菌和可流动的，到所述组合物可通过注射器递送的程度。除了水之外，所述载体优选地是等渗缓冲的盐水溶液。

适当的流动性可以例如通过使用包衣如卵磷脂，在分散体的情形中通过维持需要的颗粒大小和通过使用表面活性剂来维持。在许多情形中，优选在所述组合物中包括等渗剂，例如，糖、多元醇如甘露醇或山梨醇，和氯化钠。

用于本文中时，表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可交替使用，且全部这些名称都包括子代。因此，词语“转化体”和“转化的细胞”包括原代受试细胞和由其来源的培养物，而不考虑转移的次数。还理解所有的子代的DNA含量可能不精确一致，这归因于有意或无意的突变。包括在最初转化的细胞中筛选的具有相同功能或生物学活性的变异子代。在意指不同名称时，通过上下文其将是清楚的。

术语“转化”用于本文中时，指将载体/核酸转移到宿主细胞中的过程。如果将无难以克服的细胞壁屏障的细胞用作宿主细胞，则转染例如通过如Graham,F.L.,和van derEb.Virology(病毒学)52(1973)456-467所述的磷酸钙沉淀法来进行。然而，还可以使用其他将DNA引入细胞的方法，诸如通过核注射或通过原生质体融合。如果使用原核细胞或包含实质细胞壁结构的细胞，例如一种转染方法是利用氯化钙的钙处理，如Cohen,F.N,等,PNAS(美国科学院院报).69(1972)7110ff所述。

用于本文中时，“表达”指将核酸转录为mRNA的过程和/或将转录的mRNA(也称为转录物)随后翻译为肽、多肽或蛋白质的过程。转录物和被编码的多肽共同称为基因产物。如果多核苷酸源自基因组DNA，则在真核细胞中的表达可以包括mRNA的剪接。

“载体”是核酸分子，特别是自体复制的，其将插入的核酸分子转移到宿主细胞之中和/或之间。该术语包括主要功能为将DNA或RNA插入细胞(例如，染色体整合)的载体，主要功能是复制DNA或RNA的复制载体，和功能是转录和/或翻译DNA或RNA的表达载体。还包括提供多于一种上述功能的载体。

“表达载体”是多核苷酸，其在引入到合适的宿主细胞中时能够被转录和翻译为多肽。“表达系统”通常指包括表达载体的适当宿主细胞，所述表达载体可以起作用产生所需的表达产物。

提供下列实施例，序列表和图来辅助理解本发明，其真实范围在后附的权利要求中提出。需要理解可以在不背离本发明精神的情况下，对提出的方法进行修饰。

氨基酸序列描述

SEQ ID NO:1 重链CDR3,<ANG-2>Ang2i_LC06

SEQ ID NO:2 重链CDR2,<ANG-2>Ang2i_LC06

SEQ ID NO:3 重链CDR1,<ANG-2>Ang2i_LC06

SEQ ID NO:4 轻链CDR3,<ANG-2>Ang2i_LC06

SEQ ID NO:5 轻链CDR2,<ANG-2>Ang2i_LC06

SEQ ID NO:6 轻链CDR1,<ANG-2>Ang2i_LC06

SEQ ID NO:7 重链可变结构域,<ANG-2>Ang2i_LC06

SEQ ID NO:8 轻链可变结构域,<ANG-2>Ang2i_LC06

SEQ ID NO:9 重链CDR3,<ANG-2>Ang2i_LC07

SEQ ID NO:10 重链CDR2,<ANG-2>Ang2i_LC07

SEQ ID NO:11 重链CDR1,<ANG-2>Ang2i_LC07

SEQ ID NO:12 轻链CDR3,<ANG-2>Ang2i_LC07

SEQ ID NO:13 轻链CDR2,<ANG-2>Ang2i_LC07

SEQ ID NO:14 轻链CDR1,<ANG-2>Ang2i_LC07

SEQ ID NO:15 重链可变结构域,<ANG-2>Ang2i_LC07

SEQ ID NO:16 轻链可变结构域,<ANG-2>Ang2i_LC07

SEQ ID NO:17 重链CDR3,<ANG-2>Ang2k_LC08

SEQ ID NO:18 重链CDR2,<ANG-2>Ang2k_LC08

SEQ ID NO:19 重链CDR1,<ANG-2>Ang2k_LC08

SEQ ID NO:20 轻链CDR3,<ANG-2>Ang2k_LC08

SEQ ID NO:21 轻链CDR2,<ANG-2>Ang2k_LC08

SEQ ID NO:22 轻链CDR1,<ANG-2>Ang2k_LC08

SEQ ID NO:23 重链可变结构域,<ANG-2>Ang2k_LC08

SEQ ID NO:24 轻链可变结构域,<ANG-2>Ang2k_LC08

SEQ ID NO:25 重链CDR3,<ANG-2>Ang2s_LC09

SEQ ID NO:26 重链CDR2,<ANG-2>Ang2s_LC09

SEQ ID NO:27 重链CDR1,<ANG-2>Ang2s_LC09

SEQ ID NO:28 轻链CDR3,<ANG-2>Ang2s_LC09

SEQ ID NO:29 轻链CDR2,<ANG-2>Ang2s_LC09

SEQ ID NO:30 轻链CDR1,<ANG-2>Ang2s_LC09

SEQ ID NO:31 重链可变结构域,<ANG-2>Ang2s_LC09

SEQ ID NO:32 轻链可变结构域,<ANG-2>Ang2s_LC09

SEQ ID NO:33 重链CDR3,<ANG-2>Ang2i_LC10

SEQ ID NO:34 重链CDR2,<ANG-2>Ang2i_LC10

SEQ ID NO:35 重链CDR1,<ANG-2>Ang2i_LC10

SEQ ID NO:36 轻链CDR3,<ANG-2>Ang2i_LC10

SEQ ID NO:37 轻链CDR2,<ANG-2>Ang2i_LC10

SEQ ID NO:38 轻链CDR1,<ANG-2>Ang2i_LC10

SEQ ID NO:39 重链可变结构域,<ANG-2>Ang2i_LC10

SEQ ID NO:40 轻链可变结构域,<ANG-2>Ang2i_LC10

SEQ ID NO:41 重链CDR3,<ANG-2>Ang2k_LC11

SEQ ID NO:42 重链CDR2,<ANG-2>Ang2k_LC11

SEQ ID NO:43 重链CDR1,<ANG-2>Ang2k_LC11

SEQ ID NO:44 轻链CDR3,<ANG-2>Ang2k_LC11

SEQ ID NO:45 轻链CDR2,<ANG-2>Ang2k_LC11

SEQ ID NO:46 轻链CDR1,<ANG-2>Ang2k_LC11

SEQ ID NO:47 重链可变结构域,<ANG-2>Ang2k_LC11

SEQ ID NO:48 轻链可变结构域,<ANG-2>Ang2k_LC11

SEQ ID NO:49 重链CDR3,<ANG-2>Ang2s_R3_LC03

SEQ ID NO:50 重链CDR2,<ANG-2>Ang2s_R3_LC03

SEQ ID NO:51 重链CDR1,<ANG-2>Ang2s_R3_LC03

SEQ ID NO:52 轻链CDR3,<ANG-2>Ang2s_R3_LC03

SEQ ID NO:53 轻链CDR2,<ANG-2>Ang2s_R3_LC03

SEQ ID NO:54 轻链CDR1,<ANG-2>Ang2s_R3_LC03

SEQ ID NO:55 重链可变结构域,<ANG-2>Ang2s_R3_LC03

SEQ ID NO:56 轻链可变结构域,<ANG-2>Ang2s_R3_LC03

SEQ ID NO:57 来自IgG1的人重链恒定区

SEQ ID NO:58 来自IgG4的人重链恒定区

SEQ ID NO:59 κ轻链恒定区

SEQ ID NO:60 λ轻链恒定区

SEQ ID NO:61 人Tie-2受体

SEQ ID NO:62 具有前导序列和His标记的人血管生成素-2(ANG-2)

SEQ ID NO:63 具有前导序列和His标记的人血管生成素-1(ANG-1)

附图描述

图1克隆IgGs用于在表达载体中瞬时表达，瞬时表达A)Ang2i-LC06(图1A)B.)Ang2i-LC06(图1B)

图2纯化的抗ANG-2抗体Ang2i-LC06,Ang2i-LC07和Ang2k-LC08的SDS-PAGE凝胶

图3血管生成素-Tie2相互作用ELISA

图4通过Ang2i-LC06和Ang2k-LC08抑制ANG-2与Tie2的结合

图5通过Ang2i-LC06和Ang2k-LC08抑制ANG-1与Tie2的结合

图6用于测试抗ANG-2抗体的体内功效的Colo205异种移植模型

图7用于测试抗ANG-2抗体的体内功效的KPL-4异种移植模型

图8通过Biacore传感图的ANG-1结合

图9在原发性结肠肿瘤异种移植(9A)和原发性乳腺癌异种移植(9B)中由根据本发明所述的抗体预防肺转移/继发肿瘤

图10由根据本发明所述的抗体抑制视网膜病。

实验方法1

材料与一般方法

在Kabat,E.A.,等,免疫目的的蛋白序列(Sequences of Proteins ofImmunological Interest),第5版,公众健康服务(Public Health Service),国家健康研究所(National Institutes of Health),Bethesda,MD(1991)中提供关于人免疫球蛋白轻链和重链的核苷酸序列的一般信息。根据EU编号(Edelman,G.M.,等,美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)63(1969)78-85;Kabat,E.A.,等,免疫目的的蛋白序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest),第5版,公众健康服务(PublicHealth Service),国家健康研究所(National Institutes of Health),Bethesda,MD(1991)对抗体链的氨基酸进行编号和参考。

重组DNA技术

将标准方法用于操作DNA，如在Sambrook,J.,等,分子克隆：实验室手册(Molecular cloning:A laboratory manual);冷泉港实验室出版社(Cold Spring HarborLaboratory Press),冷泉港，纽约,1989中所述。根据生产商的说明书使用分子生物学试剂。

基因合成

需要的基因片段制备自通过化学合成制备的寡核苷酸。侧邻单限制性内切酶切割位点的基因片段通过包括PCR扩增的退火和寡核苷酸连接进行组装，并且将其随后通过指定的限制性酶切位点，例如KpnI/SacI或AscI/PacI克隆到基于pGA4克隆载体的pPCRScript(Stratagene)中。通过DNA测序证实亚克隆的基因片段的DNA序列。根据在Geneart(Regensburg,Germany)的指定说明对基因合成片段进行排序。

DNA序列确定

DNA序列通过在MediGenomix GmbH(Martinsried,Germany)或Sequiserve GmbH(Vaterstetten,Germany)进行的双链测序来确定。

DNA和蛋白序列分析和序列数据处理

使用GCG's(Genetics Computer组,Madison,Wisconsin)软件包10.2版本和Infomax's Vector NT1 Advance suite版本8.0来用于序列产生、作图、分析、注释和举例说明。

表达载体

为了表达所述抗体，应用基于具有CMV-内含子A启动子的cDNA构造(organization)或基于具有CMV启动子的基因组构造的用于瞬时表达(例如在HEK293 EBNA或HEK293-F中)或稳定表达(例如在CHO细胞中)的表达质粒的变体(例如图1)。

除抗体表达盒以外，所述载体包括：

-复制起点，其容许该质粒在大肠杆菌中复制，和

-β-内酰胺酶基因，其在大肠杆菌中赋予氨苄青霉素抗性。

抗体基因的转录单元由以下元件组成：

-5’末端处的独特限制位点

-来自人巨细胞病毒的立即早期增强子和启动子，

-在cDNA组构的情形中，随后是内含子A序列，

-人抗体基因的5’-非翻译区，

-免疫球蛋白重链信号序列，

-人抗体链(重链、修饰的重链或轻链)作为cDNA或作为具有免疫球蛋白外显子-内含子组构的基因组组构

-具有聚腺苷酸化信号序列的3’非翻译区，和

-3’末端处的独特限制位点。

如下所述的包括选定抗体重链序列的融合基因通过PCR和/或基因合成产生并使用已知的重组方法和技术，通过在基因组重链载体中例如利用独特NsiI和EcoRI位点来连接相应的核酸区段来装配。亚克隆的核酸序列通过DNA测序来验证。为了瞬时且稳定转染，通过来自转化的大肠杆菌培养物的质粒制剂来制备更大量的质粒(Nucleobond AX,Macherey-Nagel)。

细胞培养技术

如在细胞生物学中的当前方法(Current Protocols in Cell Biology)(2000),Bonifacino,J.S.,Dasso,M.,Harford,J.B.,Lippincott-Schwartz,J.和Yamada,K.M.(编辑),John Wiley & Sons,Inc中所述使用标准细胞培养技术。

HEK293-F系统中的瞬时转染

通过利用HEK293-F系统(Invitrogen)按照制造商的说明瞬时转染两种质粒(分别编码重链或修饰的重链和相应的轻链)来生成抗体。简言之，用两种各自的表达质粒和293fectin或fectin(Invitrogen)的混合物来转染在摇瓶中或在搅拌发酵器中在无血清FreeStyle293表达培养基(Invitrogen)中悬浮生长的HEK293-F细胞(Invitrogen)。对于例如2L摇瓶(Corning)，以1.0E*6细胞/mL的密度接种600mL HEK293-F细胞并以120rpm,8%CO2温育。第二天，用约42mL的混合物，以约1.5E*6细胞/mL的细胞密度来转染细胞，所述混合物为A)具有600μg分别编码等摩尔比的重链或修饰的重链,和相应轻链的总质粒DNA(1μg/mL)的20mL Opti-MEM(Invitrogen)和B)20ml Opti-MEM+1.2mL293fectin或fectin(2μl/mL)的混合物。在发酵过程中根据葡萄糖的消耗，添加葡萄糖溶液。在5-10天后收获包含分泌的抗体的上清液，并且直接由上清液纯化抗体或冷冻并保存上清液。

蛋白确定

使用基于根据Pace,C.N.,等,蛋白科学(Protein Science),4(1995),2411-1423的氨基酸序列计算的摩尔消光系数通过确定280nm的光密度(OD)，来确定纯化的抗体和衍生物的蛋白浓度。

在上清液中的抗体浓度确定

抗体和衍生物在细胞培养物上清液中的浓度通过使用蛋白质A琼脂糖-珠(Roche(罗氏))的免疫沉淀法来评估。60μL蛋白质A琼脂糖珠在TBS-NP40(50mM Tris,pH7.5,150mMNaCl,1%Nonidet-P40)洗涤三次。随后，将1-15mL细胞培养物上清液加样于在TBS-NP40中预平衡的蛋白质A琼脂糖珠。室温下温育1h后，将该珠在Ultrafree-MC-过滤柱(Amicon)上用0.5mL TBS-NP40洗涤1次，用0.5mL2x磷酸盐缓冲液(2xPBS,Roche(罗氏))洗涤2次并用0.5mL100mM柠檬酸钠pH5.0简单洗涤4次。通过添加35μlLDS样品缓冲液(Invitrogen)洗脱结合的抗体。样品的一半分别与样品还原剂混合或保持未还原，并在70°C加热10min。因此，将20μl应用于4-12%Bis-Tris SDS-PAGE(Invitrogen)(具有MOPS缓冲液，以用于非还原的SDS-PAGE，和具有抗氧化运行缓冲液添加剂的MES缓冲液(Invitrogen)，以用于还原的SDS-PAGE)并用考马斯蓝染色。

通过蛋白A-HPLC层析法测量细胞培养物上清液中的抗体和衍生物的浓度。简言之，将包含结合蛋白A的抗体和衍生物的细胞培养物上清液施加到HiTrap蛋白A柱(GEHealthcare)上，所述柱在50mM K2HPO4,300mM NaCl,pH7.3中，并在Dionex HPLC系统上，用50mM乙酸,pH2.5从基质中洗脱。通过UV吸光度和峰面积的积分(integration)来量化洗脱的蛋白。将纯化的标准IgG1抗体用作标准。

备选地，抗体和衍生物在细胞培养物上清液中的浓度通过夹心式-IgG-ELISA来测量。简言之，StreptaWell高结合链霉亲和素(StreptaWell High Bind Strepatavidin)A-96孔微滴定板(Roche(罗氏))用100μL/孔生物素化的抗人IgG捕获分子F(ab’)2<h-Fcγ>BI(Dianova)，以0.1μg/mL在室温下包被1h或备选地在4°C包被过夜，并随后用200μL/孔PBS,0.05%吐温(PBST,Sigma(西格玛))洗涤3次。将100μL/孔包含各种抗体的细胞培养物上清液在PBS(Sigma(西格玛))中的稀释物系列加入到孔中并在微滴定板摇动器上，以室温温育1-2h。孔用200μL/孔的PBST洗涤三次并且用100μl浓度为0.1μg/mL的F(ab')2<hFcγ>POD(Dianova)作为检测抗体，在微滴定板摇动器上，以室温检测结合的抗体1-2h。未结合的检测抗体用200μL/孔的PBST以三次洗掉，并且结合的检测抗体通过添加100μLABTS/孔来检测。在Tecan Fluor分光计上，以405nm的测量波长(参比波长492nm)来进行吸光度的测定。

蛋白质纯化

参考标准流程，从过滤的细胞培养物上清液中纯化蛋白。简言之，将抗体加样于蛋白质A琼脂糖柱(GE Healthcare(GE健康护理))并用PBS洗涤。在酸性pH进行抗体洗脱，并随后立即中和样品。在20mM组氨酸,140mM NaCl pH6.0中，通过大小排阻层析法(Superdex200,GE healthcare(GE健康护理))将聚集的蛋白质与单体抗体分开。将单体抗体级分合并，如果需要，利用例如MILLIPORE Amicon Ultra(30MWCO)离心浓缩器浓缩，在-80°C保存。提供部分样品进行随后的例如通过SDS-PAGE、大小排阻层析法、质谱法和内毒素测量(见图2)进行的蛋白质分析和分析表征。

SDS-PAGE

预制凝胶系统(Invitrogen)按照制造商的说明来使用。具体地，使用4-20%TRIS-甘氨酸预制(Pre-Cast)凝胶和TRIS-甘氨酸SDS运行缓冲液。(见例如图1)。样品的还原通过在运行凝胶前添加样品还原剂完成。

分析大小排阻层析法

用于确定抗体聚集和低聚状态的大小排阻层析法是通过HPLC层析法来进行。简言之，将蛋白质A纯化抗体加样于Dionex HPLC系统上的300mM NaCl,50mM KH2PO4/K2HPO4,pH7.5中的Tosoh TSKgel G3000SW柱或Dionex HPLC-系统上的2x PBS中的Superdex200柱(GE Healthcare(GE健康护理))。洗脱的蛋白通过UV吸光度和峰面积的积分(integration)来量化。BioRad凝胶过滤标准151–1901起标准物的作用。

质谱法

抗体的总去糖基化质量通过电喷雾离子化质谱法(ESI-MS)来确定和验证。简言之，用处于100mM KH2PO4/K2HPO4,pH7中的50mU N-糖苷酶F(PNGaseF,ProZyme)在37°C，以蛋白质浓度至多为2mg/ml来将100μg纯化的抗体去糖基化达12-24h，并随后通过SephadexG25柱(GEHealthcare(GE健康护理))上的HPLC来脱盐。各种重链和轻链的质量在去糖基化和还原后通过ESI-MS来确定。简言之，处于115μl中的50μg抗体用60μl1M TCEP和50μl8M盐酸胍来温育并随后脱盐。总质量和还原的重链和轻链的质量通过在装配了NanoMate源的Q-Star Elite MS系统上进行ESI-MS来确定。

ANG-1和ANG-2结合ELISA

抗体针对ANGPTs(血管生成素1或血管生成素2)的结合性质在使用全长血管生成素-2-His蛋白(R&D Systems#623-AN/CF或内部生产的材料)或血管生成素-1-His(R&Dsystems#923-AN)的ELISA测定中评估。因此，96孔板(Falcon聚苯乙烯增透微量滴定板或Nunc Maxisorb)用100μl1μg/mL重组人血管生成素-1或血管生成素-2(无载体)在PBS(Sigma)中室温包被2h或在4°C包被过夜。用300μl PBST(0.2%Tween20)洗涤孔三次并用200μl2%BSA0.1%Tween20室温封闭30min并且随后用300μl PBST洗涤三次。将100μL/孔稀释系列(40pM-0.01pM)的处于PBS中的针对<ANG-2>的纯化测试抗体和作为参照的Mab536(Oliner,J.,等,CancerCell(癌细胞).11月6日（2004）507-16,US2006/0122370)加入到孔中并在微量滴定板摇动器上在室温下温育1h。该孔用300μl PBST(0.2%Tween20)洗涤三次，并且结合的抗体用100μL/孔在2%BSA0.1%Tween20中的0.1μg/ml F(ab’)<hk>POD(BiozolCat.No.206005)作为检测抗体在微量滴定板摇动器上室温1h进行检测。未结合的检测抗体使用300μL/孔的PBST，以三次洗掉，并且结合的检测抗体通过添加100μL ABTS/孔来检测。在Tecan Fluor分光计上，以405nm的测量波长(参比波长492nm)来进行吸光度的确定。

ANG-2结合BIACORE

抗体与抗原(例如人ANG-2)的结合通过利用BIACORE T100仪器(GEHealthcareBiosciences AB,Uppsala,瑞典)的表面等离子共振来研究。简言之，为了亲和力测量，山羊<hIgG-Fcγ>多克隆抗体通过胺偶联固定在CM4芯片上用于呈递针对人ANG-2的抗体。结合在HBS缓冲液(HBS-P(10mMHEPES,150mM NaCl,0.05%Tween20,ph7.4)中,25°C测量。将纯化的ANG-2-His(R&D系统或内部纯化的)以0.41nM和200nM之间的不同浓度加入到溶液中。缔合通过ANG-2-注射3分钟来测量；解离通过用HBS缓冲液洗涤芯片表面5分钟来测量且KD值利用1:1朗缪尔结合模型(Langmuir binding model)来评估。由于ANG-2制剂的异质性，不能观察到1:1的结合；因此KD值仅是相对评估。从样品曲线中减去阴性对照数据(例如缓冲液曲线)，以用于校正系统固有的基线漂移和用于噪音信号的降低。使用Biacore T100评估软件版本1.1.1来分析传感图(sensorgrams)和用于计算亲和力数据。备选地，Ang-2以捕获水平2000-1700RU通过经胺偶联(无BSA)固定在CM5芯片上的五组氨酸抗体(无BSA的5-His-Ab,Qiagen No.34660)捕获(见下文)。

抑制huANG-2与Tie-2的结合(ELISA)

相互作用ELISA在384孔微量滴定板(MicroCoat,DE,Cat.No.464718)上，在RT下进行。每次温育步骤后，用PBST洗涤板3次。用0.5μg/ml Tie-2蛋白(R&D Systems,英国,Cat.No.313-TI)包被ELISA板至少2小时(h)。其后，用增补了0.2%吐温-20和2%BSA(RocheDiagnostics GmbH(罗氏诊断GmbH),DE)的PBS封闭孔1小时。纯化的抗体在PBS中的稀释物与0.2μg/ml人血管生成素-2(huAngiopoietin-2)(R&D Systems(R&D系统),UK,Cat.No.623-AN)一起在RT下温育1小时。洗涤后，添加0.5μg/ml生物素化的抗-血管生成素-2克隆BAM0981(R&D Systems(R&D系统),UK)和1:3000稀释的链霉抗生物素蛋白HRP(RocheDiagnostics GmbH(罗氏诊断GmbH),DE,Cat.No.11089153001)的混合物1小时。其后，用PBST洗涤板6次。在RT下，用新鲜制备的ABTS试剂(Roche Diagnostics GmbH(罗氏诊断GmbH),DE,缓冲液#204530001,片剂#11112422001)对该板进行显色30分钟。在405nm处测量吸光度。

抑制huANG-1与Tie-2的结合(ELISA)

相互作用ELISA在384孔微量滴定板(MaxiSorb Nunc#442768)上，在RT下进行。每次温育步骤后，用PBST洗涤板3次。用0.5μg/ml Tie-2蛋白(R&D Systems,英国,Cat.No.313-TI或内部生产的材料)包被ELISA板至少2小时(h)。其后，用增补了0.2%吐温-20和2%BSA(Roche DiagnosticsGmbH(罗氏诊断GmbH),DE)的PBS封闭孔1小时。纯化的抗体在PBS中的稀释物与0.2μg/ml人血管生成素-1(huAngiopoietin-1)(R&DSystems#923-AN/CF或内部生产的材料))一起在RT下温育1小时。洗涤后，添加0.5μg/ml生物素化的抗-血管生成素-1克隆(R&D Systems#BAF923)和1:3000稀释的链霉抗生物素蛋白HRP(RocheDiagnostics GmbH(罗氏诊断GmbH),DE,Cat.No.11089153001)的混合物1小时。其后，用PBST洗涤板6次。在RT下，用新鲜制备的ABTS试剂(Roche Diagnostics GmbH(罗氏诊断GmbH),DE,缓冲液#204 530 001,片剂#11 112 422 001)对该板进行显色30分钟。在405nm处测量吸光度。

HEK293-Tie2细胞系的产生

为确定血管生成素-2抗体干扰ANGPT2刺激的Tie2磷酸化和ANGPT2与Tie2在细胞上的结合，产生了重组HEK293-Tie细胞系。简言之，基于pcDNA3的质粒(RB22-pcDNA3TopohTie2)，其编码在CMV启动子控制下的全长人Tie2(SEQ ID61)和新霉素抗性标记，该质粒使用Fugene(Roche Applied Science)作为转染试剂转染到HEK293细胞(ATCC)中，并在DMEM10%FCS,500μg/ml G418中选择抗性细胞。单个克隆通过克隆柱(cloning cylinder)分离，并随后通过FACS分析Tie2的表达。克隆22被鉴定为具有高且稳定Tie2表达的克隆(即使在没有G418时)(HEK293-Tie2克隆22)。HEK293-Tie2克隆22随后用于细胞测定：ANGPT2诱导的Tie2磷酸化和ANGPT2细胞配体结合测定。

ANGPT2诱导Tie2磷酸化测定

根据下述测定原则测量ANGPT2抗体对ANGPT2诱导的Tie2磷酸化的抑制。HEK293-Tie2克隆22在不存在或存在ANGPT2抗体时用ANGPT2刺激5分钟并且P-Tie2通过夹心ELISA定量。简言之，每孔2x10⁵HEK293-Tie2克隆22细胞在聚-D-赖氨酸包被的96孔微量滴定板上于100μl DMEM,10%FCS,500μg/ml遗传霉素(Geneticin)中培养过夜。第二天在微量滴定板中制备一排滴定ANGPT2抗体(4-倍浓缩,75μl终体积/孔,两份)并与75μl的ANGPT2(R&Dsystems#623-AN]稀释物(3.2μg/ml作为4-倍浓缩液)混合。抗体和ANGPT2在室温预温育15分钟。添加100μl混合物到HEK293-Tie2克隆22细胞(与1mM NaV3O4,Sigma#S6508预温育5分钟)中并在37°C温育5分钟。随后，用每孔200μl冰冷PBS+1mMNaV3O4洗涤细胞，并通过在冰上每孔添加120μl裂解缓冲液(20mM Tris,pH8.0,137mM NaCl,1%NP-40,10%丙三醇,2mMEDTA,1mM NaV3O4,1mM PMSF和10μg/ml抑酶肽)裂解细胞。细胞在微量滴定板摇动器上4°C裂解30分钟，并且100μl裂解物直接转移到p-Tie2ELISA微量滴定板(R&D Systems,R&D#DY990)中，不进行在先离心和不进行总蛋白测量。P-Tie2的量根据制造商说明书定量，且抑制的IC50值使用用于Excel的XLfit4分析插件(plug-in)(剂量-反应单点(dose-responseone site)，模式205)测量。IC50值可在实验内比较但可以在实验与实验之间变化。

ANGPT1诱导Tie2磷酸化测定

根据下述测定原则测量ANGPT1抗体对ANGPT1诱导的Tie2磷酸化的抑制。HEK293-Tie2克隆22在不存在或存在ANGPT1抗体时用ANGPT1刺激5分钟并且P-Tie2通过夹心ELISA定量。简言之，每孔2x10⁵HEK293-Tie2克隆22细胞在聚-D-赖氨酸包被的96孔微量滴定板上于100μl DMEM,10%FCS,500μg/ml遗传霉素(Geneticin)中培养过夜。第二天在微量滴定板中制备一排滴定ANGPT1抗体(4-倍浓缩,75μl终体积/孔,两份)并与75μl的ANGPT1(R&Dsystems#923-AN)稀释物(0.8μg/ml作为4-倍浓缩液)混合。抗体和ANGPT1在室温预温育15分钟。添加100μl混合物到HEK293-Tie2克隆22细胞(与1mM NaV3O4,Sigma#S6508预温育5分钟)中并在37°C温育5分钟。随后，用每孔200μl冰冷PBS+1mMNaV3O4洗涤细胞，并通过在冰上每孔添加120μl裂解缓冲液(20mM Tris,pH8.0,137mM NaCl,1%NP-40,10%甘油,2mM EDTA,1mM NaV3O4,1mM PMSF和10μg/ml抑酶肽)裂解细胞。细胞在微量滴定板摇动器上4°C裂解30分钟，并且100μl裂解物直接转移到p-Tie2ELISA微量滴定板(R&D Systems,R&D#DY990)中，不进行在先离心和不进行总蛋白测量。P-Tie2的量根据制造商说明书定量，且抑制的IC50值使用用于Excel的XLfit4分析插件(剂量-反应单点，模式205)测量。IC50值可在实验内比较但可以在实验与实验之间变化。

实施例1

单克隆<ANG-2>抗体Ang2i-LC06,Ang2i-LC07和Ang2k-LC08的表达和纯化

将相应的抗体Ang2i-LC06,Ang2i-LC07和Ang2k-LC08的轻链和重链如上所述构建在表达载体中。将重链和κ轻链克隆在基因组表达盒中，而将λ轻链作为含有内含子A的cDNA进行克隆(图1B)。将质粒在大肠杆菌中扩增，纯化并随后转染用于在HEK293-F细胞中瞬时表达重组蛋白(使用Invitrogen’s FreeStyle293系统)。7天后，收集HEK293-F细胞上清液，过滤并通过蛋白A和大小排阻层析法纯化抗体。所有的抗体的均质性通过在非还原和还原条件下的SDS-PAGE以及分析大小排阻层析法证实。在还原条件(图1)下，<ANG-2>抗体的多肽重链在SDS-PAGE上显示约50kDa的表观分子大小，类似于计算的分子量，多肽轻链显示根据他们预期大小的25kDa的表观分子量。质谱证实纯化的抗体的相同性。所有构建体的表达水平通过蛋白A HPLC进行分析。

纯化的抗体的大小排阻层析法分析。制备所有的抗体，并且类似于上述方法进行分析表征。将相应的抗体的SEC数据总结在下面的表中。

实施例2

与人ANG-1和与人ANG-2的ELISA结合测定法

<ANG-2>抗体Ang2i-LC06，Ang2i-LC07和Ang2k-LC08与人ANG-1和人ANG-2的结合如上述在ANG-1或ANG-2结合ELISA中确定。简言之，ELISA-型测定法基于人野生型血管生成素-1或-2在微量滴定板中的固定。抗体针对固定的ANG-1或ANG-2的结合通过具有POD缀合物的<人Fc>(抗-IgG)抗体测量。<ANG-2>抗体的系列稀释物允许确定EC50浓度。使用人抗-ANG-2抗体<ANG-2>抗体Mab536作为参照(Oliner等,CancerCell.(癌细胞)11月6日(2004)507-16,US2006/0122370)。将测定的EC50浓度在下表中总结。

所有的抗体特异性结合于ANG-2。MAb536和Ang2k-LC08也显示针对ANG-1的特异性结合，而Ang2i-LC06和Ang2i-LC07非特异性结合于ANG-1，因为它们的EC50-值超过8000ng/ml(检测界限)。

实施例3:

通过Biacore结合于ANG-2

用如上所述的Biacore测定法检查结合于人ANGPT2的亲和力。简言之，在该测定法中，将捕获抗体(抗-Fc)固定于Biacore芯片的表面，其捕获并且呈递相应的抗体(例如Ang2i-LC06)。所述配体(此处是ANGPT2)从溶液中捕获。用假定1:1相互作用确定关于该相互作用的亲和力。关于该实验的详情可以见于一般方法部分。将关于ANGPT2-结合(KD)确定的亲和力在下表中总结。

所述抗体Ang2i-LC06和Ang2k以高亲和力结合于ANGPT2。

实施例4:

ANGPT1/2-Tie2相互作用的中和(人)

通过受体相互作用ELISA显示对人ANGPT1/2/人Tie2相互作用的封闭。将384-孔Maxisorp板(Nunc)用0.5μg/ml人Tie2(R&D Systems,UK,Cat.No.313-TI或内部生产的材料)在室温包被2小时，并且用补充了0.2%Tween-20和2%BSA(Roche Diagnostics GmbH(罗氏诊断GmbH),DE)的PBS在室温，在摇动下封闭1小时。同时，将PBS中的纯化抗体的稀释物与0.2μg/ml人血管生成素-1/2(R&D Systems#923-AN/CF,R&DSystems,UK,Cat.No.623-AN或内部生产的材料)在室温一起温育1小时。在洗涤后，添加0.5μg/ml生物素化的抗-血管生成素-1/2克隆(R&DSystems#BAF923,BAM0981R&D Systems，UK)和1:3000稀释的链霉抗生物素蛋白HRP(Roche Diagnostics GmbH(罗氏诊断GmbH),DE,Cat.No.11089153001)的混合物1小时。其后，用PBST洗涤板6次。在RT下，用新鲜制备的ABTS试剂(Roche Diagnostics GmbH(罗氏诊断GmbH),DE,缓冲液#204530001,片剂#11112422001)对该板进行显色30分钟。在405nm处测量吸光度。

将获得的抑制浓度总结在下表中。

上表显示关于两种抗体Ang2i-LC06和Ang2k-LC08的不同选择性模式。Ang2i-LC06是ANGPT2选择性的，而Ang2k-LC08在抑制ANGPT1/2Tie2相互作用中是ANGPT1/2交叉反应性的。

实施例5:

Tie2磷酸化

在如上所述的ANGPT2和ANGPT1诱导的Tie2磷酸化测定法中检验鉴定的ANGPT2抗体干扰ANGPT2和ANGPT1介导的Tie2磷酸化的能力。将测定法设置的示意图显示在图3中。

两种抗体Ang2i-LC06和Ang2k-LC08都显示了如在图4中所显示的对ANGPT2刺激的Tie2磷酸化的剂量依赖性的干扰，其具有可比较的IC50值。Ang2i-LC06干扰ANGPT2刺激的Tie2磷酸化，其IC50值约为508ng/ml，而Ang2k-LC08干扰ANGPT2刺激的Tie2磷酸化，其IC50值约为499ng/ml。与此相反，仅Ang2k-LC08干扰ANGPT1刺激的Tie2磷酸化，其IC50值约为391ng/ml，而在相同的测试浓度范围内，Ang2i-LC06不干扰ANGPT2刺激的Tie2磷酸化(图5)。

实施例6:体内功效

抗ANGPT抗体对Colo205异种移植物生长的作用

在分期(staged)的皮下Colo205异种移植模型中，<ANGPT2>抗体Ang2i-LC06和Ang2k-LC08与<ANGPT2>Mab536比较的体内功效。

在雌性Scid米色小鼠中，在分期的皮下Colo205异种移植模型(Ang2_PZ_Colo205_006)中，将纯化的Ang2i-LC06和Ang2k-LC08抗体与抗体Mab536进行比较。

抗体:将Mab536作为冷冻的贮存溶液(c=4.5mg/mL)提供，Ang2i-LC06和Ang2k-LC08作为在20mM组氨酸,140mM NaCl,pH6.0中的冷冻贮存溶液(c=1mg/mL)提供。如果需要，在注射前将抗体溶液从贮液适当稀释在PBS中，并将PBS用作赋形剂。将人源化的IgG1抗-IgE抗体Xolair(奥马珠单抗)作为阳性对照并且取自药房。

细胞系和培养条件:Colo205人结肠直肠癌细胞起初获自ATCC，并且在扩增后，保藏于Roche Penzberg内部细胞库中。在37°C，于水饱和大气中在5%CO₂中，将肿瘤细胞系常规培养在补充了10%胎牛血清(PAA实验室,Austria)和2mM L-谷氨酰胺的RPMI1640培养基(PAA,实验室,Austria)中。将第3代用于移植。

动物:雌性SCID米色小鼠(购自Charles River Germany)根据确定指南(committed guidelines)(GV-Solas;Felasa;TierschG)维持在无特异病原体、每日12h光/12h暗循环条件下。实验研究方案经地方政府评阅且批准。到达后动物维持在动物实验室的检疫部一周以适应新环境和用于观察。定期进行连续健康监测。无限制提供饮食(ProvimiKliba3337)和水(酸化的pH2.5-3)。研究开始时鼠龄是大约12-14周。

监测：每日管控(control)动物的临床症状并检测副作用。对于整个实验监测中记录动物的体重并在分期后用测径器测量肿瘤体积。

肿瘤细胞注射：注射当天，离心Colo205细胞，洗涤一次并在PBS中重悬浮。再次用PBS洗涤后细胞浓度和细胞大小使用细胞计数器和分析系统(Vi-CELL,Beckman Coulter)测量。对于Colo205细胞的注射，最终滴度调整为5.0x10⁷细胞/ml,活力约90%。随后对应于每只动物2.5*10⁶细胞的100μl这种混悬液s.c.注射到小鼠的右胁。

动物处理：动物处理在随机化的天数、细胞移植后16天(研究Ang2_PZ_Colo205_006)在平均肿瘤体积是178mm³时开始。

研究Ang2PZColo205006的剂量方案:

直至第50天的肿瘤生长抑制显示在图6中。数据显示ANGPT2选择性抗体Ang2i-LC06是最有活性的抗体(肿瘤控制定量(tumor control ration)(TCR)值0.39)。与抗体MAb536(TCR值0.47)和ANGPT2选择性，ANGPT1交叉反应性抗体Ang2k-LC08(TCR值0.46)相比，Ang2i-LC06在抑制肿瘤生长上更为有效。

抗ANGPT抗体对KPL-4异种移植生长的作用

在分期原位KPL-4异种移植模型中，<ANGPT2>抗体Ang2i-LC06和Ang2k-LC08与<ANGPT2>Mab536比较的体内功效

在雌性Scid米色小鼠中，在分期的原位KPL-4异种移植模型(Ang2_PZ_KPL-4_002)中，将纯化的Ang2i-LC06和Ang2k-LC08抗体与抗体Mab536进行比较。

抗体：Mab536作为冷冻的贮液(c=4.5mg/mL)提供，Ang2i-LC06和Ang2k-LC08作为在20mM组氨酸,140mM NaCl,pH6.0中的冷冻的贮液(c=1mg/mL)提供。如果需要，在注射前，将抗体溶液从贮液适当稀释在PBS中并且将PBS用作赋形剂。

细胞系和培养条件:KPL-4人乳腺癌细胞最初从具有炎性皮肤转移的乳腺癌患者的恶性胸腔积液建立。KPL-4细胞由J.Kurebayashi教授(Kawasaki Medical School,Kurashiki,Japan)惠赠。将肿瘤细胞在补充了10%胎牛血清(PAN Biotech,Germany)和2mML-谷氨酰胺(PAN Biotech,Germany)的DMEM培养基(PAN Biotech,Germany)中，在37°C于水饱和大气中在5%CO₂中常规地培养。用胰蛋白酶/EDTA1x(PAN)进行培养物传代，每周分裂3次。

动物：雌性SCID米色小鼠(购自Charles River Germany)根据确定指南(committed guidelines)(GV-Solas;Felasa;TierschG)维持在无特异病原体、每日12h光/12h暗循环条件下。实验研究方案经地方政府评阅且批准。到达后动物维持在动物实验室的检疫部一周以适应新环境和用于观察。定期进行连续健康监测。无限制提供饮食(ProvimiKliba3337)和水(酸化的pH2.5-3)。研究开始时鼠龄是大约12周。

监测：每日管控(control)动物的临床症状并检测副作用。对于整个实验监测中记录动物的体重并在分期后用测径器测量肿瘤体积。

肿瘤细胞注射：注射当天，从培养瓶(Greiner TriFlask)中收获肿瘤细胞(胰蛋白酶-EDTA)并转移到50ml培养基中，洗涤一次并在PBS中重悬浮。用PBS再次进行洗涤步骤和过滤(细胞滤过器；Falcon^TM;100μm)后调整终细胞滴度至1.5x10⁸/ml。肿瘤细胞混悬液用移液器小心混合以避免细胞聚集。麻醉如下进行，对小动物使用带有预温育室(聚甲基丙烯酸甲酯有机玻璃(plexiglas))的Stephens吸入装置、个体小鼠鼻罩(nose-mask)(silicon)并使用不燃烧或爆炸的麻醉化合物异氟烷(Pharmacia-Upjohn,Germany)在闭式循环系统中进行。注射前两天将动物刮毛。对于i.m.f.p.注射，将细胞以20μl(3*10⁶/动物)的体积原位注射到每只麻醉小鼠的右边倒数第二个腹股沟乳腺脂肪垫中。对于原位植入，使用Hamilton微升注射器和30Gx1/2"针头将细胞混悬液通过皮肤注射到乳头下。

动物处理在细胞移植(研究Ang2_PZ_KPL-4_002)后35天，在肿瘤范围为60-180mm³的随机化的天数开始动物处理，平均肿瘤体积约90mm³。研究Ang2_PZ_KPL-4_002的剂量方案:

直到第64天的肿瘤生长抑制显示在图7中。数据显示在KPL-4模型中，ANGPT2选择性抗体Ang2i-LC06是最具有活性的抗体(TCR值0.55)。与抗体MAb536(TCR值0.57)和ANGPT2选择性，ANGPT1交叉反应性抗体Ang2k-LC08(TCR值0.57)相比，Ang2i-LC06在抑制肿瘤生长上更有效。

实施例7:

通过Biacore结合ANG-1

用Biacore测定法检查与人ANG-1结合的亲和力：使用胺偶联化学法将huAng-1固定在CM5生物传感器芯片上。以5μl/min的流速，将蛋白在20分钟内以10μg/ml注射在pH4.5的乙酸钠中。这得到约20000RU的表面密度。在参照流动细胞上，在相同的条件下固定BSA。将抗体在HBS-P中稀释到100nM并注射达3分钟(缔合阶段)。在用运行缓冲液洗涤3分钟(解离阶段)后，将表面通过以5μl/min注射10mM氢氧化钠1分钟再生。将结果显示在图8中：Ang2k_LC08具有约50s的复合物解离半衰期，Ang2i_LC06具有约5s的复合物解离半衰期，并且Ang2i_LC10不显示与ANG-1的结合。

实施例8:在携带原发性肿瘤时体内预防转移/继发肿瘤

a)在异种移植了原发Colo205肿瘤的小鼠中预防转移/继发肿瘤

细胞系和培养条件：

Colo205人结肠直肠癌细胞起初获自ATCC，并且在扩增后，保藏于Roche Penzberg内部细胞库中。在37°C，于水饱和大气中在5%CO₂中，将肿瘤细胞系常规培养在补充了10%胎牛血清(PAA实验室,Austria)和2mM L-谷氨酰胺的RPMI1640培养基(PAA,实验室,Austria)中。将第3代用于移植。

动物：

雌性SCID米色小鼠;4–5周龄到达(购自Charles River Germanyd)时根据确定指南(GV-Solas;Felasa;TierschG)维持在无特异病原体、每日12h光/12h暗循环条件下。实验研究方案经地方政府评阅且批准。到达后动物维持在动物实验室的检疫部一周以适应新环境和用于观察。定期进行连续健康监测。无限制提供饮食(Provimi Kliba3337)和水(酸化的pH2.5-3)。研究开始时鼠龄是大约10周。

肿瘤细胞注射：

注射当天，从培养瓶(Greiner)中收获Colo205肿瘤细胞(胰蛋白酶-EDTA)并转移到50ml培养基中，洗涤一次并在PBS中重悬浮。用PBS再次进行洗涤步骤和过滤(细胞滤过器；Falcon100μm)后调整终细胞滴度至2.5x10⁷/ml。肿瘤细胞混悬液用移液器小心混合以避免细胞聚集。此后，细胞混悬液使用宽针(wide needle,1.10x40mm)装入1.0ml结核菌素注射器(Braun Melsungen)；对于注射，改变针的大小(0.45x25mm)并且每次注射使用新的针。麻醉如下进行，对小动物使用带有预温育室(聚甲基丙烯酸甲酯有机玻璃(plexiglas))的Stephens吸入装置、个体小鼠鼻罩(nose-mask)(silicon)并使用不燃烧或爆炸的麻醉化合物异氟烷(cp-pharma)在闭式循环系统中进行。注射前两天将动物刮毛，对于细胞注射，用解剖镊子小心的提起麻醉动物的皮肤在动物的右胁皮下注射100μl细胞悬液(=2.5x10⁶细胞)。监测原发肿瘤的肿瘤生长（数据未显示）。

通过量化人Alu序列监测例如肺中的继发肿瘤

在研究结束时(第103天)，从所有组的动物中收集肺。简言之，立即将样品转移到液氮中。在进一步的步骤中，根据生产商的说明书，用MagNAPure LC仪器将总DNA分离自样品。选择人Alu特异性引物用于通过定量PCR(LightCycler仪器)选择性扩增Alu序列。(T.Schneider等,Clin.Exp.Metas.2002;19:571-582).

处理动物

在细胞移植(研究Ang2_PZ_Colo205_008)后14天，平均肿瘤体积为340mm³时开始用阿瓦斯丁(Avastin)处理动物(10mg/kg i.p.每周一次)。7周后，在第51天，将小鼠进行随机化以开始用在下表中列出的化合物进行随后的次级处理。在研究Ang2_PZ_Colo205_008的第51天开始次级处理。

将预防转移/继发肿瘤(在肺中)的结果列在下表中并且显示在图9A中

表1:用不同的抗体处理后，在开始携带原发性Colo205肿瘤的小鼠的肺中量化人ALU DNA

结果显示，与阿瓦斯丁比较，ANG2i-LC06明显地改善对继发肿瘤/转移的预防。

b)在用原发KPL-4肿瘤异种移植的小鼠中预防转移/继发肿瘤

肿瘤细胞系

人乳腺癌细胞系KPL-4(由J.Kurebayashi教授惠赠)从具有炎性皮肤转移的乳腺癌患者的恶性胸腔积液建立。将肿瘤细胞在补充了10%胎牛血清(PAN Biotech,Germany)和2mM L-谷氨酰胺(PAN Biotech,Germany)的DMEM培养基(PAN Biotech,Germany)中，在37°C于水饱和大气中在5%CO₂中常规地培养。用胰蛋白酶/EDTA1x(PAN)进行培养物传代，每周分裂3次。

小鼠

达到后，将雌性SCID米色小鼠(10-12周龄；体重18-20g)Charles River,Sulzfeld,Germany)维持在动物实验室的检疫部一周以适应新环境和用于观察。进行连续健康监测。将小鼠根据国际指南(GV-Solas;Felasa;TierschG)维持在SPF、每日12h光/12h暗循环条件下。无限制提供饮食(KlibaProvimi3347)和水(过滤的)。实验研究方案经地方政府评阅且批准。(Regierung von Oberbayern;registration no.211.2531.2-22/2003).

肿瘤细胞注射

注射当天，从培养瓶(Greiner TriFlask)中收获肿瘤细胞(胰蛋白酶-EDTA)并转移到50ml培养基中，洗涤一次并在PBS中重悬浮。用PBS再次进行洗涤步骤和过滤(细胞滤过器；Falcon100μm)后调整终细胞滴度至1.5x10⁸/ml。肿瘤细胞混悬液用移液器小心混合以避免细胞聚集。麻醉如下进行，对小动物使用带有预温育室(聚甲基丙烯酸甲酯有机玻璃)的Stephens吸入装置、个体小鼠鼻罩(silicon)并使用不燃烧或爆炸的麻醉化合物异氟烷(Pharmacia-Upjohn,Germany)在闭式循环系统中进行。注射前两天将动物刮毛。对于i.m.f.p.注射，将细胞以20μl的体积原位注射到每只麻醉小鼠的右边倒数第二个腹股沟乳腺脂肪垫中。对于原位植入，使用Hamilton微升注射器和30Gx1/2"针头将细胞混悬液通过皮肤注射到乳头下。监测原发肿瘤的肿瘤生长(数据未显示)。

通过量化人Alu序列监测例如肺中的继发肿瘤

在研究结束时(第103天)，从所有组的动物中收集肺。简言之，立即将样品转移到液氮中。在进一步的步骤中，根据生产商的说明书，用MagNAPure LC仪器将总DNA分离自样品。选择人Alu特异性引物用于通过定量PCR(LightCycler仪器)选择性扩增Alu序列。(T.Schneider等,Clin.Exp.Metas.2002;19:571-582).

处理动物

在细胞移植后35天，平均肿瘤体积为60-160mm³时开始处理动物。将化合物和剂量方案在下表中列出。

将预防转移/继发肿瘤(在肺中)的结果在下表中列出并显示在图9B中

表2:用不同的抗体处理后，在最初携带原发性KPL4肿瘤的小鼠的肺中量化人ALUDNA

结果显示，ANG2i-LC06,ANG2i-LC07,ANG2k-LC08非常有效地预防继发肿瘤/转移。

实施例9:在治疗视网膜病中的作用

方法

将C57/Bl6小狗与CD1护理母畜进行乳仔交换并且从P7到P12暴露于75%氧(PRO-OX110室氧气操纵器(oxygen controller),Biospherix Ltd,Redfield,NY)，其诱导视网膜中央的脉管闭塞和毛细管中断(cessation)。将小狗和护理母畜置于正常空气中，导致相对低氧并诱导新血管化作用。在P13，将小狗使用异氟烷麻醉(5%诱导,3%维持与1.5%氧组合)，暴露眼睛并且使用装备有35号针头(WPI,Sarasota,FL)的Nanofil注射器将1μl眼内注射剂注射到左眼中。在P17，解剖双眼，在4°C在4%低聚甲醛中固定4h，并解剖视网膜。将视网膜在包含0.5%Triton X-100和1%牛血清白蛋白的PBS中渗透，用在PBS pH6.8,1%Triton-X100,0.1mM CaCl₂,0.1mM MgCl₂中的20μg/ml生物素化的同工凝集素B4(Sigma Aldrich,Gillingham,UK)，随后用20μg/ml ALEXA488-链霉抗生物素蛋白(Molecular Probes,Eugene,OR)进行染色，并将其平封固在Vectashield(Vector实验室,Burlingame,CA)中。使用Nikon落射荧光显微镜(epifluorescence)，以4x放大对视网膜进行成像。使用PhotoshopCS3以及Image J(NIH)以盲方式(blinded fashion)进行新血管和局部缺血区域的量化，并将其表示为总的视网膜区域(=正常+局部缺血+新血管)的百分比。

结果

图10A显示通过同工凝集素染色观察的具有视网膜脉管系统的代表性平封固视网膜。中央的局部缺血区域诱导新血管化作用并且通过生血管诱导剂的上调使视网膜脉管再生。新血管前部是过度增生的，导致不规则血管模式中的扭曲脉管。大部分外部区域包含正常的不受影响的脉管。视网膜平封片的量化显示用阿瓦斯丁抑制VEGF减少视网膜新血管化作用(见图10B，未注射的36.7±1.8%对比注射的22.4±3.0%)，如所预期的那样。使用抗体LC06或LC08抑制Ang2也导致新血管化作用的减少(31.5±1.1%对比18.8±1.3%和34.0±3.1%对比25.4±3.4%)。人Ig G的对照注射对新血管化作用没有影响(见图10B，38.3±1.1%对比38.3±0.8%)。

Claims (12)

1.特异性结合于人血管生成素-2的抗体，其中

a)重链可变结构域包含SEQ ID NO:33的CDR3区、SEQ ID NO:34的CDR2区和SEQ ID NO:35的CDR1区,并且

b)轻链可变结构域包含SEQ ID NO:36的CDR3区、SEQ ID NO:37的CDR2区和SEQ ID NO:38的CDR1区。

2.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于包含

a)SEQ ID NO:39的重链可变结构域；和

b)SEQ ID NO:40的轻链可变结构域。

3.根据权利要求1-2中任一项的抗体，其中所述抗体不结合于人血管生成素1。

4.根据权利要求1-2中任一项的抗体，其中所述抗体是人IgG4亚类或人IgG1亚类的抗体。

5.由根据权利要求1或权利要求2的抗体的抗体片段形成的特异性结合于人血管生成素-2的双抗体、单链抗体分子或多特异性抗体。

6.药物组合物，其特征在于包含根据权利要求1-4中任一项的抗体或根据权利要求5的双抗体、单链抗体分子或多特异性抗体。

7.根据权利要求1-4中任一项的抗体或根据权利要求5的双抗体、单链抗体分子或多特异性抗体用于制备预防实体瘤转移的药物的应用。

8.根据权利要求1-4中任一项的抗体或根据权利要求5的双抗体、单链抗体分子或多特异性抗体用于制备治疗实体瘤的药物的应用。

9.根据权利要求1-4中任一项的抗体或根据权利要求5的双抗体、单链抗体分子或多特异性抗体用于制备治疗进展依赖于异常血管生成的血管疾病的药物的应用。

10.核酸，其编码特异性结合于人血管生成素-2的抗体的重链，其特征在于所述抗体包含根据权利要求1所述的重链可变结构域和轻链可变结构域。

11.表达载体，其特征在于包含根据权利要求10所述的核酸，所述表达载体用于在原核宿主细胞或真核宿主细胞中表达特异性结合于人血管生成素-2的抗体。

12.原核宿主细胞或真核宿主细胞，其包含根据权利要求11所述的载体。