BR122013022089B1

BR122013022089B1 - Anticorpo ou fragmento de anticorpo que especificamente se liga à angiopoietina-2 (ang- 2) humana, seu uso e composição farmacêutica

Info

Publication number: BR122013022089B1
Application number: BR122013022089-5A
Authority: BR
Inventors: Ulrich Brinkmann; Remko Albert Griep; Klaus Kaluza; Anita Kavlie; Christian Klein; Joerg Thomas Regula; Werner Scheuer
Original assignee: F. Hoffmann-La Roche Ag
Priority date: 2008-12-16
Filing date: 2009-12-14
Publication date: 2021-10-13
Also published as: CR20130418A; EP2379592A1; NZ600005A; RU2011129204A; IL213039A0; US20130156789A1; HK1172349A1; CR20110321A; ES2534635T3; US20200262904A1; US20180282404A1; BRPI0923434A2; CN102257008A; CA2744624C; JP2014000089A; CN102746400B; KR101381012B1; CL2012003054A1; KR101445518B1; AU2009328613A1

Abstract

anticorpo ou fragmento de anticorpo contra angiopoietina 2 humana, sua composição farmacêutica, seu uso, bem como ácido nucleico que codifica o anticorpo, seu vetor de expressão e célula hospedeira. a presente invenção se refere aos anticorpos contra a angiopoietina 2 humana (anticorpos anti-ang-2), aos métodos para a sua produção, às composições farmacêuticas contendo os ditos anticorpos, e usos dos mesmos.

Description

[0001] Dividido do PI0923434-9, depositado em 14.12.2009.

[0002] A presente invenção se refere aos anticorpos contra a An- giopoietina 2 humana (anticorpos anti-ANG-2), aos métodos para a sua produção, às composições farmacêuticas contendo os ditos anticorpos, e aos usos dos mesmos.

Antecedentes da Invenção

[0003] A angiogênese está envolvida na patogênese de uma vari edade de distúrbios, os quais incluem os tumores sólidos, as síndro- mes neovasculares intraoculares, tais como as retinopatias proliferati- vas ou a degeneração macular relacionada à idade (AMD), a artrite reumatoide, e a psoríase (Folkman, J., e col., J. Biol. Chem. 267 (1992) 10931-10934; Klagsbrun, M., e col., Annu. Rev. Physiol. 53 (1991) 217-239; e Garner, A., Vascular diseases, In: Pathobiology of ocular disease, A dynamic approach, Garner, A., e Klintworth, G. K. (eds.), 2aedição, Marcel Dekker, Nova York (1994), ppp. 1625-1710). No caso dos tumores sólidos, a neovascularização permite que as células de tumor adquiram uma vantagem de crescimento e autonomia proliferativa comparadas às células normais. Desse modo, observou- se uma correlação entre a densidade dos microvasos nas seções dos tumores e a sobrevivência da paciente no câncer de mama, bem como em diversos outros tumores (Weidner, N., e col., N. Engl. J. Med. 324 (1991) 1-8; Horak, E.R., e col., Lancet 340 (1992) 1120-1124; e Mac- chiarini, P., e col., Lancet 340 (1992) 145-146).

A ANG-2 e os anticorpos anti-ANG-2

[0004] A angiopoietina-2 (ANG-2) humana (alternativamente abre viada com ANGPT2 ou ANG2) (SEQ ID No: 107) é descrita em Mai- sonpierre, P.C., e col., Science 277 (1997) 55-60 e em Cheung, A.H., e col, Genomics 48 (1998) 389-91. As angiopoietinas-1 e -2 (ANG- 1(SEQ ID No: 108) e ANG-2 (SEQ ID No: 107)) foram descobertas como ligantes para as Ties, uma família de tirosina cinase que é seletivamente expressa dentro do endotélio vascular. Yancopoulos, G.D., e col., Nature 407 (2000) 242-48. Existem agora quatro novos membros definitivos da família da angiopoietina. A angiopoietina-3 e -4 (Ang-3 e Ang-4) podem representar equivalentes amplamente divergidos do mesmo loco de gene no camundongo e no homem. Kim, I., e col., FEBS Let, 443 (1999) 353-56; Kim, I., e col., J Biol Chem 274 (1999) 26523-28. A ANG-1 e a ANG-2 foram originalmente identificadas em experimentos de cultura de tecido como agonista e antagonista, respectivamente (ver para a ANG-1: Davies, S., e col., Cell, 87 (1996) 1161-1169; e para a ANG-2: Maisonpierre, P.C., e col., Science 277 (1997) 55-60). Todas as angiopoietinas conhecidas se ligam principalmenteà Tie2, e tanto a Ang-1 quanto a -2 se ligam à Tie2 com uma afinidade de 3 nM (Kd). Maisonpierre, P.C., e col., Science 277 (1997) 55-60. Mostrou-se que a Ang-1 auxiliava a sobrevivência da EC e promovia a integridade do endotélio, Davis, S., e col., Cell, 87 (1996) 1161-1169; Kwak, H.J., e col., FEBS Lett 448 (1999) 249-53; Suri, C., e col., Science 282 (1998) 468-71; Thurston, G., e col., Science 286 (1999) 2511-14; Thurston, G., e col., Nat. Med. 6 (2000) 460-63, enquanto a ANG-2 tinha o efeito oposto e promovia a desestabilização e a regressão do vaso sanguíneo na ausência dos fatores de sobrevivência VEGF ou fator do crescimento de fibroblasto básico. Maisonpi- erre, P.C., e col., Science 277 (1997) 55-60. Entretanto, muitos estudos da função da ANG-2 sugeriram uma situação mais complexa. A ANG-2 poderia ser um regulador complexo da remodelagem vascular que desempenha um papel tanto no crescimento do vaso quanto na regressão do vaso. Suportando tais papéis para a ANG-2, as análises da expressão revelam que a ANG-2 é rapidamente induzida, juntamente com o VEGF, em cenários adultos de regressão vascular. Ho- lash, J., e col., Science 284 (1999) 1994-98; Holash, J., e col., Oncogene 18 (1999) 5356-62. Consistente com um papel dependente do contexto, a ANG-2 especificamente se liga ao mesmo receptor endote- lial específico, Tie-2, que é ativado pela Ang-1, porém tem efeitos dependentes do contexto sobre a sua ativação. Maisonpierre, P.C., e col., Science 277 (1997) 55-60.

[0005] Os ensaios de angiogênese corneal mostraram que tanto a ANG-1 quanto a ANG-2 tinham efeitos similares, atuando sinergica- mente com o VEGF para promover o crescimento de novos vasos sanguíneos. Asahara, T., e col., Circ. Res., 83, (1998) 233-40. A possibilidade que havia uma resposta endotelial dependente da dose foi levantada pela observação que, in vitro, em alta concentração, a ANG- 2 pode também ser pró-angiogênica. Kim, I., e col., Oncogene 19 (2000) 4549-52. Em alta concentração, a ANG-2 atua como um fator de sobrevivência da apoptose para as células endoteliais, durante a apoptose com escassez de soro, através da ativação da Tie2 por meio da PI-3 Cinase e da via da Akt. Kim, I., e col., Oncogene 19 (2000) 4549-52.

[0006] Outros experimentos in vitro sugeriram que, durante a ex posição contínua, os efeitos da ANG-2 podem progressivamente mudar daquele de um antagonista para um agonista da Tie2, e em pontos de tempo posteriores, pode contribuir diretamente para a formação de tubo vascular e estabilização dos neovasos. Teichert-Kuliszewska, K., e col., Cardiovasc. Res. 49 (2001) 659-70. Além disso, se as ECs fossem cultivadas sobre gel de fibrina, era também observada a ativação da Tie2 com a ANG-2, talvez sugerindo que a ação da ANG-2 poderia depender do estado de diferenciação das ECs. Teichert-Kuliszewska; K., e col., Cardiovasc. Res. 49 (2001) 659-70. Na EC microvascular cultivada em um gel de colágeno tridimensional, a ANG-2 pode também induzir a ativação da Tie2 e promover a formação de estruturas similares aos capilares. Mochizuki, Y., e col., J. Cell. Sci. 115 (2002) 175-83. O uso de uma cocultura esferoidal 3-D como um modelo in vitro da maturação do vaso demonstrou que o contato direto entre as ECs e as células mesenquimais anula a sensibilidade ao VEGF, enquanto a presença de VEGF e ANG-2 induziu o crescimento. Korff, T., e col., Faseb J. 15 (2001) 447-57. Etoh, T., e col. demonstraram que ECs que expressam constitutivamente a Tie2, a expressão de MMP-1, -9 e u-PA, foram fortemente suprarreguladas pela ANG-2 na presença de VEGF. Etoh, T., e col., Cancer Res. 61 (2001) 2145-53. Com um modelo de membrana pupilar in vivo, Lobov, I.B, e col. mostraram que a ANG-2, na presença de VEGF endógeno, promove um aumento rápido no diâmetro capilar, uma remodelagem da lâmina basal, a proliferação e a migração de células endoteliais, e estimula o crescimento de novos vasos sanguíneos. Lobov, I.B., e col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99 (2002) 11205-10. Ao contrário, a ANG-2 promove a morte das células endoteliais e a regressão do vaso sem o VEGF endógeno. Lobov, I.B., e col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99 (2002) 11205-10. Similarmente, com um modelo de tumor in vivo, Vajkoczy, P. e col. demonstraram que os agregados multicelulares iniciam o crescimento vascular por desenvolvimento angiogênico através da expressão simultânea do VEGFR-2 e da ANG-2 pelo endotélio do hospedeiro e de tumor. Vajkoczy, P., e col., J. Clin. Invest. 109 (2002) 777-85. Este modelo ilustrou que a microvasculatura estabelecida dos tumores que crescem é caracterizada por uma remodelagem contínua, putativamente mediada pela expressão de VEGF e ANG-2. Vajkoczy, M.A., e col., J Clin. Invest. 09 (2002) 777-85.

[0007] Os estudos nos camundongos nocautes da Tie-2 e da An- giopoietina-1 mostram fenótipos similares e sugerem que a fosforila- ção da Tie-2 estimulada pela Angiopoietina-1 media a remodelagem e a estabilização do vaso que se desenvolve, promovendo a maturação do vaso sanguíneo durante a angiogênese e a manutenção da adesão da célula de suporte de célula endotelial (Dumont, D.J., e col., Genes & Development, 8 (1994) 1897-1909; Sato, T.N., Nature, 376 (1995) 70-74; (Thurston, G., e col., Nature Medicine 6 (2000) 460-463). Acredita-se que o papel da Angiopoietina-1 seja conservado no adulto, onde ela é expressa ampla e constitutivamente (Hanahan, D., Science, 277 (1997) 48-50; Zagzag, D., e col., Exp Neurology, 159 (1999) 391400). Ao contrário, a expressão da Angiopoietina-2 está principalmente limitada aos sítios de remodelagem vascular onde acredita-se que ela bloqueie a função constitutiva de estabilização ou maturação da Angi- opoietina-1, permitindo que os vasos revertam para, e permaneçam em, um estado plástico, o qual pode ser mais sensível aos sinais de crescimento (Hanahan, D., 1997; Holash, J., e col., Orzcogerze 18 (1999) 5356-62; Maisonpierre, P.C., 1997). Os estudos da expressão da Angiopoietina-2 na angiogênese patológica verificaram que muitos tipos de tumores mostram expressão da Angiopoietina-2 vascular (Maisonpierre, P.C., e col., Science 277 (1997) 55-60). Os estudos funcionais sugerem que a Angiopoietina-2 está envolvida na angiogê- nese do tumor e associam a superexpressão da Angiopoietina-2 com o crescimento aumentado do tumor em um modelo de xenoenxerto de camundongo (Ahmad, S.A., e col., Cancer Res., 61 (2001)1255-1259). Outros estudos associaram a superexpressão da Angiopoietina-2 com a hipervascularidade do tumor (Etoh, T., e col., Cancer Res. 61 (2001) 2145-53; Tanaka, F., e col., Cancer Res. 62 (2002) 7124-29).

[0008] Nos anos recentes, a Angiopoietina-1, a Angiopoietina-2 e/ou a Tie-2 foram propostas como alvos terapêuticos possíveis anti- câncer. Por exemplo, cada uma das US 6.166.185, US 5.650.490 e US 5.814.464 divulga anticorpos antiligante e receptor da Tie-2. Os estudos usando a Tie-2 solúvel foram descritos para diminuir o número e o tamanho dos tumores nos rodentes. (Lin, P, 1997; Lin, P., 1998). Siemester, G., e col. (1999) geraram linhagens de células de melanoma humanas expressando o domínio extracelular da Tie-2, injetaram linhagens de células de melanoma em camundongos nus e descreveram que a Tie-2 solúvel resultou na inibição significativa do crescimento do tumor e na angiogênese do tumor. Dado que tanto a Angiopoieti- na-1 quanto a Angiopoietina-2 se ligam à Tie-2, não está claro a partir destes estudos se a Angiopoietina-1, a Angiopoietina-2 ou a Tie-2 seria um alvo atraente para a terapia anticâncer. Entretanto, uma terapia antiangiopoietina-2 efetiva é acreditada ser de proveito no tratamento de doenças tais como o câncer, em que a progressão é dependente da angiogênese anormal, onde o bloqueio do processo pode resultar na prevenção do avanço da doença (Folkman, J., Nature Medicine. 1, (1995) 27-31.

[0009] Além disso, alguns grupos relataram o uso de anticorpos e peptídeos que se ligam à Angiopoietina-2. Ver, por exemplo, a US 6.166.185 e a US 2003/10124129, o WO 03/030833, o WO 2006/068953, o WO 03/057134 ou a US 2006/0122370.

[00010] O estudo do efeito da expressão focal da Angipoietina-2 mostrou que antagonizar o sinal da Angiopoietina-1/Tie-2 afrouxa a estrutura vascular esticada, com isso expondo as ECs aos sinais de ativação a partir de indutores da angiogênese, por exemplo, o VEGF (Hanahan, 1997). Este efeito pró-angiogênico resultante da inibição da Angiopoietina-1 indica que a terapia antiAngiopoietina-1 não seria um tratamento anticâncer efetivo.

[00011] A ANG-2 é expressa durante o desenvolvimento em locais onde está ocorrendo a remodelagem do vaso sanguíneo. Maisonpier- re, P.C., e col., Science 277 (1997) 55-60. Em indivíduos adultos, a expressão da ANG-2 está restrita aos locais de remodelagem vascu lar, bem como em tumores altamente vascularizados, incluindo o glioma, Osada, H., e col., Int. J. Oncol. 18 (2001) 305-09; Koga, K., e col., Cancer Res. 61 (2001) 6248-54, o carcinoma hepatocelular, Tanaka, S., e col, J. Clin. Invest. 103 (1999) 341-45, o carcinoma gástrico, Etoh, T., e col., Cancer Res. 61 (2001) 2145-53; Lee, J.H., e col, Int. J. Oncol. 18 (2001) 355-61, o tumor da tireoide, Bunone, G., e col., Am J Pathol 155 (1999) 1967-76, o câncer de pulmão de células não pequenas, Wong, M.P., e col., Lung Cancer 29 (2000) 11-22, e o câncer de cólon, Ahmad, S.A., e col., Cancer 92 (2001) 1138-43, e próstata Wurmbach, J.H., e col., Anticancer Res. 20 (2000) 5217-20. Verifica-se que algumas células de tumor expressam a ANG-2. Por exemplo, Tanaka, S., e col., J. Clin. Invest. 103 (1999) 341-45, detectaram o mRNA da ANG-2 em 10 dos 12 espécimes de carcinoma hepatocelular humano (HCC). O grupo de Ellis relatou que a ANG-2 é expressa ubi- quamente no epitélio de tumor. Ahmad, S.A., e col., Cancer 92 (2001) 1138-43. Outros investigadores relataram descobertas similares. Chen, L., e col., J. Tongji Med. Univ. 21 (2001) 228-30, 235 (2001). Por detecção dos níveis de mRNA da ANG-2 nos espécimes de câncer da mama humano, Sfilogoi, C,. e col., Int. J. Cancer 103 (2003) 466-74, relataram que o mRNA da ANG-2 está significativamente associado com a invasão do linfonodo auxiliar, o tempo sem doença curto e a sobrevivência global insatisfatória. Tanaka, F., e col., Cancer Res. 62 (2002) 7124-29, examinaram um total de 236 pacientes de câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC) com estágio patológico I a IIIA, respectivamente. Usando a imunoistoquímica, eles verificaram que 16,9% dos pacientes de NSCLC eram positivos para ANG-2. A densidade dos microvasos para o tumor positivo para ANG-2 é significativamente maior do que aquela do negativo para ANG-2. Tal efeito angiogênico da ANG-2 foi visto somente quando a expressão do VEGF era alta. Além disso, a expressão positiva da ANG-2 foi um fator significativo para predizer uma sobrevivência insatisfatória pós- operatória. Tanaka, F., e col., Cancer Res. 62 (2002) 7124-29. Entretanto, eles não encontraram nenhuma correlação significativa entre a expressão da Ang-1 e a densidade dos microvasos. Tanaka, F., e col., Cancer Res. 62 (2002) 7124-29. Estes resultados sugerem que a ANG-2 é um indicador de pacientes de prognóstico insatisfatório com diversos tipos de câncer.

[00012] Recentemente, usando um modelo de camundongo nocaute de ANG-2, o grupo de Yancopoulos relatou que a ANG-2 é requerida para a angiogênese pós-natal. Gale, N.W., e col., Dev. Cell 3 (2002) 411-23. Eles mostraram que a regressão programada de maneira desenvolvida da vasculatura hialoide no olho não ocorre nos camundongos nocautes de ANG-2 e os seus vasos sanguíneos retinais não conseguem desenvolver-se a partir da artéria retinal central. Gale, N.W., e col., Dev. Cell 3 (2002) 411-23. Eles também verificaram que a remoção da ANG-2 resulta em defeitos profundos na padronização e na função da vasculatura linfática. Gale, N.W., e col., Dev. Cell 3 (2002) 411-23. O socorro genético com a Ang-1 corrige os defeitos lin-fáticos, porém não da angiogênese. Gale, N.W., e col., Dev. Cell 3 (2002) 411-23.

[00013] Peters e seus colegas relataram que a Tie2 solúvel, quando proporcionada como proteína recombinante ou em um vetor de expressão viral, inibiu o crescimento in vivo do carcinoma mamário e do melanoma de murino nos modelos de camundongos. Lin, P., e col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998) 8829-34; Lin , P., e col., J. Clin. Invest. 100 (1997) 2072-78. As densidades vasculares nos tecidos de tumor assim tratados foram bastante reduzidas. Além disso, a Tie2 solúvel bloqueou a angiogênese na córnea de rato estimulada por meios condicionados com células de tumor. Lin, P., e col., J. Clin. Invest. 100 (1997) 2072-78. Ademais, Isner e sua equipe demonstraram que a adição da ANG-2 ao VEGF promoveu uma neovascularidade significa-tivamente mais longa e mais circunferencial do que o VEGF sozinho. Asahara, T., e col., Circ. Res., 83 (1998) 233-40. O receptor da Tie2 solúvel em excesso impediu a modulação da neovascularização pela ANG-2 induzida pelo VEGF. Asahara, T., e col., Circ. Res., 83, (1998) 233-40. Siemeister, G., e col., Cancer Res. 59 (1999) 3185-91, mostraram, com xenoenxertos de camundongos nus, que a superexpressão dos domínios de ligação ao ligante extracelulares de Flt-1 ou Tie2 nos xenoenxertos resultando na inibição significativa da via não poderia ser compensada pela outra, sugerindo que a via do receptor do VEGF e a via da Tie2 devem ser consideradas como dois mediadores independentes, essenciais para o processo de angiogênese in vivo. Sie- meister, G., e col., Cancer Res. 59 (1999) 3185-91. Isto está provado por uma publicação mais recente por White, R.R., e col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100 (2003) 5028-33. Em seu estudo, demonstrou-se que um aptâmero de RNA resistente à nuclease, que liga especificamente e inibe a ANG-2, significativamente inibiu a neovascularização induzida pelo bFGF no modelo de angiogênese da microbolsa corneal de rato.

Sumário da Invenção

[00014] A invenção compreende um anticorpo que especificamente se liga à angiopoietina-2 (ANG-2) humana, caracterizado por compreender como região CDR3 do domínio variável da cadeia pesada uma região CDR3 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 41, ou SEQ ID NO: 49.

[00015] De preferência, o anticorpo é caracterizado pelo fato de que a) o domínio variável da cadeia pesada compreende uma região CDR3 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 41, ou SEQ ID NO: 49, uma região CDR2 de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 42, ou SEQ ID NO: 50, e uma região CDR1 de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 43, ou SEQ ID NO: 51, e b) o domínio variável da cadeia leve compreende uma região CDR3 de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 44, ou SEQ ID NO: 52, uma região CDR2 de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 45, ou SEQ ID NO: 53, e uma região CDR1 de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 46, ou SEQ ID NO: 54.

[00016] De preferência, o anticorpo é caracterizado por compreen der a) o domínio variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 47, ou SEQ ID NO: 55; e b) o domínio variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 48, ou SEQ ID NO: 56.

[00017] De preferência, o anticorpo é caracterizado pelo fato de que o anticorpo não está especificamente se ligando à Angiopoietina 1 (ANG-1).

[00018] Uma modalidade adicional da invenção é uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo de acordo com a invenção.

[00019] Uma modalidade adicional da invenção é o uso de um anticorpo de acordo com a invenção para a fabricação de uma composição farmacêutica.

[00020] Uma modalidade adicional da invenção é o uso de um anticorpo de acordo com a invenção para a prevenção da metástase.

[00021] Uma modalidade adicional da invenção é o uso de um anticorpo de acordo com a invenção para o tratamento de câncer.

[00022] Uma modalidade adicional da invenção é o uso de um anticorpo de acordo com a invenção para o tratamento de doenças vasculares.

[00023] Uma modalidade adicional da invenção é o uso de um anticorpo de acordo com a invenção para o tratamento de retinopatia.

[00024] Uma modalidade adicional da invenção é um ácido nucleico codificando um domínio variável da cadeia pesada e/ou um domínio variável da cadeia leve de um anticorpo de acordo com a invenção.

[00025] A invenção adicionalmente proporciona vetores de expressão contendo o ácido nucleico de acordo com a invenção, capazes de expressarem o dito ácido nucleico em uma célula hospedeira procarió- tica ou eucariótica, e células hospedeiras contendo tais vetores para a produção recombinante de tal anticorpo.

[00026] A invenção adicionalmente compreende uma célula hospe-deiraprocariótica ou eucariótica compreendendo um vetor de acordo com a invenção.

[00027] A invenção adicionalmente compreende um método para a produção de um anticorpo recombinante humano ou humanizado de acordo com a invenção, caracterizado por expressar um ácido nucleico de acordo com a invenção em uma célula hospedeira procariótica ou eucariótica e recuperar o dito anticorpo da dita célula ou do sobrena- dante da cultura de células. A invenção adicionalmente compreende o anticorpo obtenível por tal método recombinante.

[00028] Os anticorpos de acordo com a invenção são especialmenteúteis para a prevenção de tumores secundários/metástase ou no tratamento de doenças vasculares, tais como as retinopatias.

Descrição Detalhada da Invenção

[00029] A invenção compreende um anticorpo que especificamente se liga à angiopoietina-2 (ANG-2) humana, caracterizado por compreender como região CDR3 do domínio variável da cadeia pesada uma região CDR3 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 41, ou SEQ ID NO: 49.

[00030] Em uma modalidade da invenção, o anticorpo é caracterizado pelo fato de que a) o domínio variável da cadeia pesada compreende uma região CDR3 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 41, ou SEQ ID NO: 49, uma região CDR2 de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 42, ou SEQ ID NO: 50, e uma região CDR1 de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 43, ou SEQ ID NO: 51, e b) o domínio variável da cadeia leve compreende uma região CDR3 de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 44, ou SEQ ID NO: 52, uma região CDR2 de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 45, ou SEQ ID NO: 53, e uma região CDR1 de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 46, ou SEQ ID NO: 54.

[00031] De preferência, o anticorpo é caracterizado por compreender a) o domínio variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 47, ou SEQ ID NO: 55; e b) o domínio variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 48, ou SEQ ID NO: 56.

[00032] Uma outra modalidade da invenção é um anticorpo que es-pecificamente se liga à ANG-2 humana, que é caracterizado pelo fato de que o anticorpo não está se ligando especificamente à Angiopoieti- na 1 (ANG-1) humana. Os anticorpos típicos que especificamente se ligam à ANG-2 humana, porém não à ANG-1 humana, são, por exemplo, Ang2s_R3_LC03, Ang2s_LC09, Ang2i_LC06, Ang2i_LC07, ou os anticorpos que se ligam ao mesmo epítopo que Ang2s_R3_LC03, Ang2s_LC09, Ang2i_LC06, Ang2i_LC07, Ang2i_LC10, preferivelmente que se ligam ao mesmo epítopo que Ang2i_LC06. Portanto, em uma modalidade da invenção, o anticorpo que especificamente se liga à angiopoietina-2 (ANG-2) humana, porém, não à ANG-1 humana, se liga ao mesmo epítopo que Ang2s_R3_LC03, Ang2s_LC09, Ang2i_LC06, Ang2i_LC07, Ang2i_LC10, preferivelmente ao mesmo epítopo que Ang2i_LC06. Tais anticorpos que especificamente se li-gamà ANG-2, porém, não à ANG-1, podem ter propriedades aperfeiçoadas, tais como eficácia, menos toxicidade, propriedades farmaco- cinéticas, comparados aos anticorpos específicos para ANG-2 e ANG- 1.

[00033] Portanto, em uma modalidade da invenção, o anticorpo que especificamente se liga à angiopoietina-2 (ANG-2) humana, porém, não à ANG-1 humana, é caracterizado pelo fato de que a) o domínio variável da cadeia pesada compreende uma região CDR3 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 33, ou SEQ ID NO: 49, uma região CDR2 de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 34, ou SEQ ID NO: 50, e uma região CDR1 de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 35, ou SEQ ID NO: 51, e b) o domínio variável da cadeia leve compreende uma região CDR3 de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 36, ou SEQ ID NO: 52, uma região CDR2 de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 37, ou SEQ ID NO: 53, e uma região CDR1 de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 38, ou SEQ ID NO: 54.

[00034] De preferência, tal anticorpo que especificamente se liga à angiopoietina-2 (ANG-2) humana, porém não à ANG-1 humana, é caracterizado por compreender a) o domínio variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 39, ou SEQ ID NO: 55; e b) o domínio variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 40, ou SEQ ID NO: 56.

[00035] Em uma modalidade, o dito anticorpo de acordo com a invenção é caracterizado pelo fato de que a) o domínio variável da cadeia pesada compreende uma região CDR3 de SEQ ID NO: 1, ou SEQ ID NO: 9, uma região CDR2 de SEQ ID NO: 2, ou SEQ ID NO: 10, e uma região CDR1 de SEQ ID NO: 3, ou SEQ ID NO: 11, e b) o domínio variável da cadeia leve compreende uma região CDR3 de SEQ ID NO: 4, ou SEQ ID NO: 12, uma região CDR2 de SEQ ID NO: 5, ou SEQ ID NO: 13, e uma região CDR1 de SEQ ID NO: 6, ou SEQ ID NO: 14.

[00036] Em uma modalidade, o dito anticorpo de acordo com a invenção é caracterizado por compreender a) o domínio variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 7, ou SEQ ID NO: 15; e b) o domínio variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 8, ou SEQ ID NO: 16.

[00037] Em uma modalidade, o dito anticorpo de acordo com a invenção é caracterizado pelo fato de que a) o domínio variável da cadeia pesada compreende uma região CDR3 de SEQ ID NO: 1, uma região CDR2 de SEQ ID NO: 2, e uma região CDR1 de SEQ ID NO: 3, e o domínio variável da cadeia leve compreende uma região CDR3 de SEQ ID NO: 4, uma região CDR2 de SEQ ID NO: 5, e uma região CDR1 de SEQ ID NO: 6.

[00038] Em uma modalidade, o dito anticorpo de acordo com a invenção é caracterizado por compreender a) o domínio variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 7; e b) o domínio variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 8.

[00039] Em uma modalidade, o dito anticorpo de acordo com a invenção é caracterizado pelo fato de que a) o domínio variável da cadeia pesada compreende uma região CDR3 de SEQ ID NO: 17, uma região CDR2 de SEQ ID NO: 18, e uma região CDR1 de SEQ ID NO: 19, e b) o domínio variável da cadeia leve compreende uma região CDR3 de SEQ ID NO: 20, uma região CDR2 de SEQ ID NO: 21, e uma região CDR1 de SEQ ID NO: 22.

[00040] Em uma modalidade, o dito anticorpo de acordo com a invenção é caracterizado por compreender a) o domínio variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 23; e b) o domínio variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 24.

[00041] De preferência, o anticorpo de acordo com a invenção é caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo é da subclasse IgG1 humana ou é da subclasse IgG4 humana.

[00042] O termo "anticorpo" inclui as diversas formas das estruturas dos anticorpos, incluindo, porém não limitadas aos anticorpos inteiros e fragmentos dos anticorpos. O anticorpo de acordo com a invenção é preferivelmente um anticorpo humanizado, anticorpo quimérico ou, além disso, anticorpo geneticamente engenheirado, desde que sejam mantidas as propriedades características de acordo com a invenção.

[00043] Os "fragmentos dos anticorpos" compreendem uma parte de um anticorpo de tamanho natural, preferivelmente o seu domínio variável, ou pelo menos o seu sítio de ligação ao antígeno. Os exemplos de fragmentos dos anticorpos incluem os diacorpos, as moléculas de anticorpos de uma única cadeia (scFv ou scFab), e os anticorpos multiespecíficos (por exemplo, biespecíficos) formados a partir dos fragmentos dos anticorpos. Os anticorpos scFv são, por exemplo, descritos em Houston, J.S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-88). Além disso, os fragmentos dos anticorpos compreendem os polipeptídeos de uma única cadeia tendo as características de um domínio VH, a saber, sendo capazes de se agruparem juntos com um domínio VL, ou de um domínio VL que se liga à ANG-2, a saber, sendo capazes de se agruparem juntos com um domínio VH em um sítio de ligação ao antí- geno funcional e, com isso, proporcionando a propriedade. Os scFvs podem ser estabilizados usando, por exemplo, a) estabilização com dissulfeto (ver, por exemplo, no WO 94/029350, Rajagopal, V., e col., Prot. Engin. (1997) 1453-59; Kobayashi, H., e col., Nuclear Medicine & Biology, Vol. 25, (1998) 387-393; ou Schmidt, M., e col., Oncogene (1999) 18 1711-1721.) ou b) estruturas estabilizadas (por exemplo, por mutações específicas), ver, por exemplo, o WO 2007/109254, estruturas estabilizadas específicas, ver, por exemplo, a US7.258.985, Furrer, F., e col., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50 (2009), pp. 771-778 ou Ot- tiger, M., e col., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50 (2009), pp. 779-786.

[00044] Os termos "anticorpo monoclonal" ou "composição de anticorpo monoclonal", conforme usados neste documento, referem-se a uma preparação de moléculas de anticorpos de uma composição de um único aminoácido.

[00045] O termo "anticorpo quimérico"se refere a um anticorpo compreendendo uma região variável, i.e., região de ligação, a partir de uma fonte ou espécie e pelo menos uma parte de uma região constante derivada de uma fonte ou espécie diferente, normalmente preparado por técnicas de DNA recombinante. Preferem-se os anticorpos quiméricos compreendendo uma região variável de murino e uma região constante humana. As outras formas preferidas de "anticorpos quimé- ricos"incluídas pela presente invenção são aquelas nas quais a região constante tenha sido modificada ou alterada daquela do anticorpo original para gerar as propriedades de acordo com a invenção, especialmente em relação à ligação ao C1q e/ou à ligação ao receptor para Fc (FcR). Tais anticorpos quiméricos são também referidos como "anticorpos de classe trocada". Os anticorpos quiméricos são o produto de genes da imunoglobulina expressos que compreendem segmentos de DNA codificando as regiões variáveis da imunoglobulina e segmentos de DNA codificando as regiões constantes da imunoglobulina. Os métodos para a produção dos anticorpos quiméricos envolvem as práticas convencionais de DNA recombinante e transfecção de gene que são bastante conhecidas na técnica. Ver, por exemplo, Morrison, S.L., e col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855; US 5.202.238 e US 5.204.244.

[00046] O termo "anticorpo humanizado" se refere aos anticorpos nos quais a estrutura ou as "regiões determinantes de complementari- edade" (CDR) foram modificadas para compreender a CDR de uma imunoglobulina de especificidade diferente comparada àquela da imu- noglobulina de origem. Em uma modalidade preferida, uma CDR de murino é enxertada na região de estrutura de um anticorpo humano para preparar o "anticorpo humanizado". Ver, por exemplo, Riech- mann, L., e col., Nature 332 (1988) 323-327; e Neuberger, M.S., e col., Nature 314 (1985) 268-270. As CDRs particularmente preferidas correspondemàquelas representando sequências que reconhecem os antígenos observados acima para os anticorpos quiméricos. As outras formas de "anticorpos humanizados"incluídas pela presente invenção são aquelas nas quais a região constante tenha sido adicionalmente modificada ou alterada daquela do anticorpo original para gerar as propriedades de acordo com a invenção, especialmente em relação à ligação ao C1q e/ou à ligação ao receptor para Fc (FcR).

[00047] O termo "anticorpo humano", conforme usado neste documento,é pretendido incluir os anticorpos tendo regiões variáveis e constantes derivadas das sequências de imunoglobulina da linha ger- minativa humana. Os anticorpos humanos são bastante conhecidos no estado da técnica (van Dijk, M.A., e van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5 (2001) 368-374). Os anticorpos humanos podem também ser produzidos em animais transgênicos (por exemplo, camundongos) que sejam capazes, com a imunização, de produzir um repertório completo ou uma seleção de anticorpos humanos na ausência de produção de imunoglobulina endógena. A transferência do arranjo de genes da imunoglobulina da linhagem germinativa humana em tais camundongos mutantes da linhagem germinativa resultará na produção de anticorpos humanos com a provocação por antígeno (ver, por exemplo, Jakobovits, A., e col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 2551-2555; Jakobovits, A., e col., Nature 362 (1993) 255-258; Brueggemann, M., e col., Year Immunol. 7 (1993) 33-40). Os anticorpos humanos podem também ser produzidos em bibliotecas de exposição em fagos (Hoogenboom, H.R., e Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388; Marks, J.D., e col., J. Mol. Biol. 222 (1991) 581-597). As técnicas de Cole, S.P.C., e col., e Boerner, e col. estão também disponíveis para a preparação de anticorpos monoclonais humanos (Cole, S.P.C., e col., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Liss, A.R., (1985) 77-96; e Boerner, P., e col., J. Immunol. 147 (1991) 8695). Conforme já mencionado para os anticorpos quiméricos e humanizados de acordo com a invenção, o termo "anticorpo humano", como usado neste documento, também compreende tais anticorpos que são modificados na região constante para gerar as propriedades de acordo com a invenção, especialmente em relação à ligação ao C1q e/ou à ligação ao FcR, por exemplo, por "troca de classe", i.e., modificação ou mutação das partes Fc (por exemplo, da IgG1 para IgG4 e/ou mutação de IgG1/IgG4).

[00048] O termo "anticorpo humano recombinante", como usado neste documento, é pretendido incluir todos os anticorpos humanos que forem preparados, expressos, criados ou isolados por meio re- combinante, tais como os anticorpos isolados de uma célula hospedeira, tal como uma célula NS0 ou CHO, ou de um animal (por exemplo, um camundongo) que seja transgênico para os genes da imunoglobu- lina humanos, ou os anticorpos expressos usando um vetor de expressão recombinante transfectado em uma célula hospedeira. Tais anticorpos humanos recombinantes têm regiões variáveis e constantes em uma forma rearranjada. Os anticorpos humanos recombinantes de acordo com a invenção foram submetidos à hipermutação somática in vivo. Assim, as sequências de aminoácidos das regiões VH e VL dos anticorpos recombinantes são sequências que, embora derivadas de, e relacionadas às, sequências de VH e VL da linha germinativa humana, podem não existir naturalmente dentro do repertório da linha ger- minativa do anticorpo humano in vivo.

[00049] O "domínio variável" (domínio variável de uma cadeia leve (VL), domínio variável de uma cadeia pesada (VH)), como usado neste documento, significa cada um do par de domínios das cadeias leves e pesadas que esteja envolvido diretamente na ligação do anticorpo ao antígeno. Os domínios variáveis das cadeias leves e pesadas têm a mesma estrutura geral e cada domínio compreende quatro regiões de estrutura (FR), cujas sequências estão amplamente conservadas, conectadas por três "regiões hipervariáveis"(ou regiões determinantes de complementariedade, CDRs). As regiões de estrutura adotam uma conformação de folha β e as CDRs podem formar loops que conectam a estrutura de folha β. As CDRs em cada cadeia são mantidas em sua estrutura tridimensional pelas regiões de estrutura e formam, junta-mente com as CDRs da outra cadeia, o sítio de ligação ao antígeno. As regiões CDR3 das cadeias pesadas e leves do anticorpo desempenham um papel particularmente importante na especificidade/afinidade de ligação dos anticorpos de acordo com a invenção e, portanto, proporcionam um objetivo adicional da invenção.

[00050] O termo "porção de ligação ao antígeno de um anticorpo", quando usado neste documento, se refere aos resíduos de aminoáci- dos de um anticorpo que são responsáveis pela ligação ao antígeno. A porção de ligação ao antígeno de um anticorpo compreende resíduos de aminoácidos a partir das "regiões determinantes de complementari- edade" ou "CDRs". As regiões de "estrutura" ou "FR"são aquelas regiões de domínios variáveis diferentes dos resíduos das regiões hiper- variáveis, conforme definido neste documento. Portanto, os domínios variáveis das cadeias leves e pesadas de um anticorpo compreendem a partir da extremidade de N até a de C os domínios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, e FR4. Especialmente, a CDR3 da cadeia pesada é a região que contribui mais para a ligação ao antígeno e define as propriedades do anticorpo. As regiões CDR e FR são determinadas de acordo com a definição padrão de Kabat, E.A., e col., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5aed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) e/ou aqueles resíduos de um "loop hipervariável".

[00051] Os termos "ácido nucleico" ou "molécula de ácido nucleico", conforme usados neste documento, são pretendidos incluir as moléculas de DNA e as moléculas de RNA. Uma molécula de ácido nucleico pode ser um DNA de fita simples ou de fita dupla, porém, preferivelmente,é de fita dupla.

[00052] O termo "aminoácido", conforme usado dentro deste pedido,significa o grupo de a-aminoácidos de ocorrência natural compreendendo a alanina (código de três letras: ala, código de uma letra: A), a arginina (arg, R), a asparagina (asn, N), o ácido aspártico (asp, D), a cisteína (cys, C), a glutamina (gln, Q), o ácido glutâmico (glu, E), a gli- cina (gly, G), a histidina (his, H), a isoleucina (ile, I), a leucina (leu, L), a lisina (lys, K), a metionina (met, M), a fenilalanina (phe, F), a prolina (pro, P), a serina (ser, S), a treonina (thr, T), o triptofano (trp, W), a ti- rosina (tyr, Y), e a valina (val, V).

[00053] Um ácido nucleico está "ligado operável"quando ele for colocado em uma relação funcional com um outro ácido nucleico. Por exemplo, o DNA para uma pré-sequência ou líder secretória está ligadooperável ao DNA para um polipeptídeo se ele for expresso como uma pré-proteína que participa na secreção do polipeptídeo; um promotor ou intensificador está ligado operável a uma sequência de codificação se ele afetar a transcrição da sequência; ou um sítio de ligação ao ribossomo está ligado operável a uma sequência de codificação se ele estiver posicionado de modo a facilitar a tradução. Geralmente, "ligadooperável"significa que as sequências de DNA que estão sendo ligadas são colineares, e, no caso de uma líder secretória, contíguas e no quadro de leitura. Entretanto, os intensificadores não têm de ser contíguos. A ligação é efetuada por ligação em sítios de restrição convenientes. Se tais sítios não existirem, os adaptadores ou ligadores de oligonucleotídeos sintéticos são usados de acordo com a prática convencional.

[00054] Conforme usadas neste documento, as expressões "célula","linhagem celular", e "cultura de células" são usadas de modo in- tercambiável e todas as tais designações incluem a progênie. Assim, as palavras "transformantes" e "células transformadas" incluem a célulaprimária exposta e as culturas derivadas dela, sem consideração pelo número de transferências. Entende-se também que toda progênie pode não ser exatamente idêntica no teor de DNA, devido a mutações intencionais ou acidentais. Está incluída a progênie variante que tem a mesma função ou atividade biológica como examinada na célula origi- nalmente transformada.

[00055] Conforme usado neste documento, o termo "ligação"ou "que especificamente se liga" se refere à ligação do anticorpo a um epítopo do antígeno (ANG-2) em um ensaio in vitro, preferivelmente em um ensaio de ressonância plasmônica (BIAcore, GE-Healthcare Uppsala, Suécia) (exemplo 3) com o antígeno ANG-2 do tipo selvagem, purificado. A afinidade da ligação é definida pelos termos ka (constante da taxa para a associação do anticorpo a partir do complexo de anticorpo/antígeno), kD (constante de dissociação), e KD (kD/ka). Ligação ou que especificamente se liga significa uma afinidade de ligação (KD) de 10-8moles/l ou menos, preferivelmente 10-9M a 10-13 moles/l.

[00056] A ligação do anticorpo ao FcyRIII pode ser investigada por um ensaio BIAcore (GE-Healthcare Uppsala, Suécia). A afinidade da ligação é definida pelos termos ka (constante da taxa para a associação do anticorpo a partir do complexo de anticorpo/antígeno), kD (constante de dissociação), e KD (kD/ka).

[00057] Conforme usado neste documento, o termo "que não se liga à ANG-1" ou "que especificamente não se liga à ANG-1" significa que o anticorpo tem um valor de EC50 acima de 8000 ng/ml em um ensaio ELISA de ligação à ANG-1 in vitro (de acordo com o exemplo 2).

[00058] O termo "epítopo" inclui qualquer determinante de polipep- tídeo capaz de ligação específica a um anticorpo. Em certas modalidades, o determinante de epítopo inclui os agrupamentos de moléculas da superfície quimicamente ativos, tais como os aminoácidos, as cadeias laterais de açúcares, a fosforila, ou a sulfonila, e, em certas modalidades, pode ter características estruturais tridimensionais específicas, e ou características de carga específicas. Um epítopo é uma região de um antígeno que é ligada por um anticorpo.

[00059] A "parte Fc" de um anticorpo não está envolvida diretamen- te na ligação de um anticorpo a um antígeno, porém, exibe diversas funções efetoras. Uma "parte Fc de um anticorpo"é um termo bastante conhecido para o técnico versado e é definida com base na clivagem pela papaína dos anticorpos. Dependendo da sequência de aminoáci- dos da região constante de suas cadeias pesadas, os anticorpos ou as imunoglobulinas estão divididas nas classes: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e diversas destas podem ser adicionalmente divididas em subclasses (isótipos), por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4, IgA1, e IgA2. De acordo com as regiões constantes da cadeia pesada, as diferentes classes de imunoglobulinas são chamadas α, δ, ε. y, e μ, respectivamente. A parte Fc de um anticorpo está diretamente envolvida na ADCC (citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo) e na CDC (citotoxicidade dependente de complemento) com base na ativação do complemento, ligação ao C1q e ligação ao receptor para Fc. A ativação do complemento (CDC) é iniciada por ligação do fator de complemento C1q à parte Fc da maioria das subclasses dos anticorpos IgG. Embora a influência de um anticorpo sobre o sistema de complemento seja dependente de certas condições, a ligação ao C1q é causada por sítios de ligação definidos na parte Fc. Tais sítios de ligação são conhecidos no estado da técnica e descritos, por exemplo, por Boakle, R.J., e col., Nature 282 (1975) 742-743, Lukas, T.J., e col., J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560, Brunhouse, R., e Cebra, J.J., Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917, Burton, D.R., e col., Nature 288 (1980) 338-344, Thommesen, J.E., e col., Mol. Immunol. 37 (2000) 995-1004, Idusogie, E.E., e col., J. Immunol.164 (2000) 4178-4184, Hezareh, M., e col., J. Virology 75 (2001) 12161-12168, Morgan, A., e col., Immunology 86 (1995) 319-324, EP 0307434. Tais sítios de ligação são, por exemplo, o L234, o L235, o D270, o N297, o E318, o K320, o K322, o P331 e o P329 (numeração de acordo com o índice EU de Kabat, ver abaixo). Os anticorpos da subclasse IgG1, IgG2 e IgG3 normalmente mostram ativação do complemento e ligação ao C1q e C3, embora a IgG4 não ativa o sistema de complemento e não liga C1q e C3.

[00060] O anticorpo de acordo com a invenção preferivelmente compreende uma parte Fc de origem humana que é a parte Fc de um anticorpo humano da subclasse IgG1.

[00061] O anticorpo de acordo com a invenção é caracterizado pelo fato de que as cadeias constantes são de origem humana. Tais cadeias constantes são bastante conhecidas no estado da técnica e são descritas, por exemplo, por Kabat, E.A. (ver, por exemplo, Johnson, G. e Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218). Por exemplo, uma região constante da cadeia pesada humana útil compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 57 ou de SEQ ID NO: 58. Por exemplo, uma região constante da cadeia leve humana útil compreende uma sequência de aminoácidos de uma região constante da cadeia leve capa de SEQ ID NO: 59, ou de uma região constante da cadeia leve lambda de SEQ ID NO: 60.

[00062] O termo "região constante", conforme usado dentro dos presentes pedidos, significa a soma dos domínios de um anticorpo, exceto a região variável. A região constante não está envolvida diretamente na ligação de um antígeno, porém, exibe diversas funções efetoras. Dependendo da sequência de aminoácidos da região constante de suas cadeias pesadas, os anticorpos são divididos nas classes: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e diversas destas podem ser adicionalmente divididas em subclasses, tais como IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4, IgA1 e IgA2. As regiões constantes da cadeia pesada que correspon-dem às diferentes classes de anticorpos são chamadas α, δ, ε. y, e μ, respectivamente. As regiões constantes da cadeia leve que podem ser encontradas em todas as cinco classes de anticorpos são chamadas K (capa) e À (lambda).

[00063] O termo "região constante derivada de origem humana", conforme usado no presente pedido, significa uma região constante da cadeia pesada de um anticorpo humano da subclasse IgG1, IgG2, IgG3, ou IgG4 e/ou a região constante da cadeia leve K. Tais regiões constantes são bastante conhecidas no estado da técnica e são descritas, por exemplo, por Kabat, E.A., (ver, por exemplo, Johnson, G. e Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218; Kabat, E.A., e col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72 (1975) 2785-2788).

[00064] Embora os anticorpos da subclasse IgG4 mostrem ligação reduzida ao receptor para Fc (FcyRIIIa), os anticorpos das outras subclasses de IgG mostram ligação forte. Entretanto, Pro238, Asp265, Asp270, Asn297 ( perda de carboidrato Fc ), Pro329, Leu234, Leu235, Gly236, Gly237, Ile253, Ser254, Lys288, Thr307, Gln311, Asn434, e His435 são resíduos que, se alterados, proporcionam também ligação reduzida ao receptor para Fc (Shields, R.L., e col., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604; Lund, J., e col., FASEB J. 9 (1995) 115-119; Morgan, A., e col., Immunology 86 (1995) 319-324; EP 0 307 434).

[00065] Em uma modalidade, um anticorpo de acordo com a invenção tem uma ligação reduzida ao FcR, comparado a um anticorpo IgG1, e o anticorpo de origem bivalente monoespecífico está, em relação à ligação ao FcR da subclasse IgG4 ou da subclasse IgG1 ou IgG2, com uma mutação em S228, L234, L235 e/ou D265, e/ou contém a mutação PVA236. Em uma modalidade, as mutações no anticorpo de origem bivalente monoespecífico são S228P, L234A, L235A, L235E e/ou PVA236. Em uma outra modalidade, as mutações no anticorpo de origem bivalente monoespecífico são em IgG4 S228P e em IgG1 L234A e L235A. Regiões constantes da cadeia pesada mostradas em SEQ ID NO: 57 e 58. Em uma modalidade, a região constante da cadeia pesada do anticorpo de origem bivalente monoespecífico é de SEQ ID NO: 57, com as mutações L234A e L235A. Em uma outra modalidade, a região constante da cadeia pesada do anticorpo de ori- gem bivalente monoespecífico é de SEQ ID NO: 58, com a mutação S228P. Em uma outra modalidade, a região constante da cadeia leve do anticorpo de origem bivalente monoespecífico é uma região da cadeia leve capa de SEQ ID NO: 59, ou uma região constante da cadeia leve lambda de SEQ ID NO: 60. Em uma modalidade da invenção, a região constante da cadeia pesada do anticorpo de origem bivalente monoespecífico é de SEQ ID NO: 57 ou de SEQ ID NO: 58, com a mutação S228P.

[00066] A região constante de um anticorpo está diretamente envolvida na ADCC (citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo) e na CDC (citotoxicidade dependente de complemento). A ativação do complemento (CDC) é iniciada por ligação do fator de complemento C1q à região constante da maioria das subclasses dos anticorpos IgG. A ligação do C1q a um anticorpo é causada por interações definidas entre proteína-proteína, no assim chamado sítio de ligação. Tais sítios de ligação da região constante são conhecidos no estado da técnica e descritos, por exemplo, por Lukas, T.J., e col., J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560; Brunhouse, R. e Cebra, J.J., Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917; Burton, D.R., e col., Nature 288 (1980) 338-344; Tho- mmesen, J.E., e col., Mol. Immunol. 37 (2000) 995-1004; Idusogie, E.E., e col., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184; Hezareh, M., e col., J. Virol. 75 (2001) 12161-12168; Morgan, A., e col., Immunology 86 (1995) 319-324; e EP 0 307 434. Tais sítios de ligação da região constantesão caracterizados, por exemplo, pelos aminoácidos L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331, e P329 (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).

[00067] O termo "citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC)" se refere à lise de células-alvo humanas por um anticorpo de acordo com a invenção, na presença de células efetoras. A ADCC é medida preferivelmente pelo tratamento de uma preparação de células que expressam o CCR5 com um anticorpo de acordo com a invenção, na presença de células efetoras, tais como a PBMC recentemente isolada ou as células efetoras purificadas a partir de camadas leucocitá- rias, como os monócitos ou as células exterminadoras naturais (NK) ou uma linhagem de células NK que se desenvolvem permanentemente.

[00068] O termo "citotoxicidade dependente de complemento (CDC)" significa um processo iniciado por ligação do fator de complemento C1q à parte Fc da maioria das subclasses de anticorpos IgG. A ligação do C1q a um anticorpo é causada por interações definidas entreproteína-proteína no assim chamado sítio de ligação. Tais sítios de ligação da parte Fc são conhecidos no estado da técnica (ver acima). Tais sítios de ligação da parte Fc são caracterizados, por exemplo, pelosaminoácidos L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331, e P329 (numeração de acordo com o índice EU de Kabat). Os anticor-pos da subclasse IgG1, IgG2, e IgG3 normalmente mostram ativação do complemento, incluindo a ligação ao C1q e C3, enquanto a IgG4 não ativa o sistema de complemento e não liga C1q e/ou C3.

[00069] O anticorpo de acordo com a invenção é produzido por meio recombinante. Assim, um aspecto da presente invenção é um ácido nucleico codificando o anticorpo de acordo com a invenção e um aspecto adicional é uma célula compreendendo o dito ácido nucleico codificando um anticorpo de acordo com a invenção. Os métodos para a produção recombinante são amplamente conhecidos no estado da técnica e compreendem a expressão protéica em células procarióticas e eucarióticas, com o isolamento subsequente do anticorpo e normalmente a purificação até uma pureza farmaceuticamente aceitável. Para a expressão dos anticorpos como acima mencionados em uma célula hospedeira, os ácidos nucleicos codificando as cadeias leves e pesadas modificadas respectivas são inseridos nos vetores de expres- são por métodos padrão. A expressão é efetuada em células hospe-deirasprocarióticas ou eucarióticas apropriadas, como as células CHO, as células NS0, as células SP2/0, as células HEK293, as células COS, as células PER.C6, a levedura, ou as células de E.coli, e o anticorpoé recuperado das células (sobrenadante ou células após a lise). Os métodos gerais para a produção recombinante dos anticorpos são bastante conhecidos no estado da técnica e descritos, por exemplo, nos artigos revistos de Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202;

[00070] Geisse, S., e col., Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282; Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-161; Werner, R.G., J. Drug Res. 48 (1998) 870-880.

[00071] Os anticorpos de acordo com a invenção são adequadamente separados do meio de cultura por procedimentos convencionais de purificação da imunoglobulina, tais como, por exemplo, proteína A- Sepharose, cromatografia com hidroxilapatita, eletroforese em gel, diá- lise, ou cromatografia por afinidade. O DNA e o RNA codificando os anticorpos monoclonais são prontamente isolados e sequenciados usando procedimentos convencionais. As células de hibridoma podem servir como uma fonte de tais DNA e RNA. Assim que isolado, o DNA pode ser inserido em vetores de expressão, os quais são então trans- fectados em células hospedeiras, tais como as células HEK 293, as células CHO, ou as células de mieloma, que, de outra forma, não produzem a proteína imunoglobulina, para obter a síntese dos anticorpos monoclonais recombinantes nas células hospedeiras.

[00072] As variantes (ou mutantes) da sequência de aminoácidos do anticorpo de acordo com a invenção são preparadas por introdução de modificações de nucleotídeos apropriadas no DNA do anticorpo, ou por síntese de nucleotídeos. Tais modificações podem ser efetuadas, entretanto, somente em uma faixa muito limitada, por exemplo, con- forme descrito acima. Por exemplo, as modificações não alteram as características do anticorpo acima mencionadas, tais como o isótipo de IgG e a ligação ao antígeno, porém podem melhorar o rendimento da produção recombinante, a estabilidade da proteína ou facilitar a purificação.

[00073] O termo "célula hospedeira", conforme usado no presente pedido, significa qualquer tipo de sistema celular que possa ser enge- nheirado para gerar os anticorpos de acordo com a presente invenção. Em uma modalidade, as células HEK293 e as células CHO são usadas como células hospedeiras. Conforme usadas neste documento, as expressões "célula", "linhagem celular", e "cultura de células" são usadas de modo intercambiável e todas as tais designações incluem a progênie. Assim, as palavras "transformantes" e "células transformadas" incluem a célula primária exposta e as culturas derivadas dela, sem consideração pelo número de transferências. Entende-se também que toda progênie pode não ser exatamente idêntica no teor de DNA, devido a mutações intencionais ou acidentais. Está incluída a progênie variante que tem a mesma função ou atividade biológica como examinada na célula originalmente transformada.

[00074] A expressão nas células NS0 é descrita, por exemplo, por Barnes, L.M., e col., Cytotechnology 32 (2000) 109-123; Barnes, L.M., e col., Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270. A expressão transiente é descrita, por exemplo, por Durocher, Y., e col., Nucl. Acids. Res. 30 (2002) E9. A clonagem dos domínios variáveis é descrita por Orlandi, R., e col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837; Carter, P., e col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289; e Norderhaug, L., e col., J. Immunol. Methods 204 (1997) 77-87. Um sistema de expressão transiente preferido (HEK 293) é descrito por Schlaeger, E.-J., e Christensen, K., em Cytotechnology 30 (1999) 71-83, e por Schlae- ger, E.-J., em J. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199.

[00075] As sequências de controle que são adequadas para os pro- cariotos, por exemplo, incluem um promotor, opcionalmente uma sequência operadora, e um sítio de ligação ao ribossomo. As células eu- carióticas são conhecidas por utilizarem promotores, intensificadores e sinais de poliadenilação.

[00076] Um ácido nucleico está "ligado operavelmente" quando ele for colocado em uma relação funcional com uma outra sequência de ácidos nucleicos. Por exemplo, o DNA para uma pré-sequência ou lídersecretória está ligada operavelmente ao DNA para um polipeptídeo se ele for expresso como uma pré-proteína que participa na secreção do polipeptídeo; um promotor ou intensificador está ligado operavel- mente a uma sequência de codificação se ele afetar a transcrição da sequência; ou um sítio de ligação ao ribossomo está ligado operavel- mente a uma sequência de codificação se ele estiver posicionado de modo a facilitar a tradução. Geralmente, "ligado operavelmente"significa que as sequências de DNA que estão sendo ligadas são contíguas, e, no caso de uma líder secretória, contíguas e no quadro de leitura. Entretanto, os intensificadores não têm de ser contíguos. A ligação é efetuada por ligação em sítios de restrição convenientes. Se tais sítios não existirem, os adaptadores ou ligadores de oligonucleotí- deos sintéticos são usados de acordo com a prática convencional.

[00077] A purificação dos anticorpos é efetuada para eliminar os componentes celulares ou outros contaminantes, por exemplo, outros ácidos nucleicos celulares ou proteínas, por técnicas padrão, incluindo o tratamento alcalino/SDS, a ligação com CsCl, a cromatografia em coluna, a eletroforese em gel de agarose, e outras bastante conhecidas na técnica. Ver Ausubel, F., e col., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, Nova York (1987). São bem estabelecidos e amplamente usados diferentes métodos para a purificação de proteínas, tais como a cromatografia por afinidade com proteínas microbianas (por exemplo, cromatografia por afinidade com proteína A ou proteína G), cromatografia por troca iôni- ca (por exemplo, troca catiônica (resinas de carboximetila), troca aniô- nica (resinas de amino etila) e troca de modo misto), adsorção tiofílica (por exemplo, com beta-mercaptoetanol e outros ligantes de SH), interação hidrofóbica ou cromatografia por adsorção aromática (por exemplo, com fenil-sepharose, resinas aza-arenofílicas, ou ácido m- aminofenilborônico), cromatografia por afinidade com quelato de metal (por exemplo, com material de afinidade por Ni(II) e Cu(II)), cromato- grafia por exclusão de tamanho, e métodos eletroforéticos (tais como a eletroforese em gel, a eletroforese capilar) (Vijayalakshmi, M.A. Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102).

[00078] A invenção compreende um método para o tratamento de um paciente que necessita de terapia, caracterizado por administrar ao paciente uma quantidade terapeuticamente efetiva de um anticorpo de acordo com a invenção.

[00079] A invenção compreende o uso de um anticorpo de acordo com a invenção para a terapia.

[00080] A invenção compreende o uso de um anticorpo de acordo com a invenção para a preparação de um medicamento para a prevenção da metástase.

[00081] A invenção compreende o uso de um anticorpo de acordo com a invenção para a preparação de um medicamento para o tratamento de câncer.

[00082] Um aspecto da invenção é uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo de acordo com a invenção. Um outro aspecto da invenção é o uso de um anticorpo de acordo com a invenção para a fabricação de uma composição farmacêutica. Um aspecto adicional da invenção é um método para a fabricação de uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo de acordo com a in- venção. Em um outro aspecto, a presente invenção proporciona uma composição, por exemplo, uma composição farmacêutica, contendo um anticorpo de acordo com a presente invenção, formulado juntamente com um veículo farmacêutico.

[00083] Um outro aspecto da invenção é a dita composição farmacêutica para a prevenção da metástase.

[00084] Um outro aspecto da invenção é um anticorpo de acordo com a invenção para a prevenção da metástase.

[00085] Um outro aspecto da invenção é o uso de um anticorpo de acordo com a invenção para a fabricação de um medicamento para a prevenção da metástase.

[00086] Um outro aspecto da invenção é um método para a prevenção da metástase em um paciente que sofre de câncer primário, por administração de um anticorpo de acordo com a invenção a um paciente que necessita de tal tratamento preventivo.

[00087] Foi possível mostrar a prevenção altamente eficiente de metástase espontânea/tumores secundários in vivo em um modelo de câncer ortotópico e um subcutâneo (ver o exemplo 9) (em contraste com o modelo experimental onde as células de tumor são injetadas i.v. Isto é similar à situação clínica em que as células disseminam-se a partir de um tumor primário e invadem por metástase um órgão secundário, como o pulmão ou o fígado (onde tumores secundários).

[00088] O termo metástase, de acordo com a invenção, se refere à transmissão de células cancerosas a partir do tumor primário para um ou mais locais em outra parte, em um paciente, onde então os tumores secundários se desenvolvem. Os "MetastasMeans" para determinar se um câncer metastatizou são conhecidos na técnica e incluem a varredura do osso, o raio X do tórax, a varredura por CAT, a varredura por MRI e os testes com marcadores de tumor.

[00089] O termo "prevenção da metástase"ou "prevenção de tumo- res secundários", como usado neste documento, tem o mesmo significado e se refere a um agente profilático contra a metástase em um paciente que sofre de câncer positivo para HER2 recorrente, deste modo inibindo ou reduzindo uma transmissão adicional de células cancerosas a partir do tumor primário para um ou mais locais em outra parte, em um paciente. Isto significa que a metástase do tumor ou câncer primário é impedida, retardada, ou reduzida e, assim, o desen-volvimento de tumores secundários é impedido, retardado, ou reduzido. De preferência, a metástase, i.e., os tumores secundários do pulmão são impedidos ou reduzidos, o que significa que a transmissão metastática de células cancerosas a partir do tumor primário para o pulmão é impedida ou reduzida.

[00090] Um outro aspecto da invenção é a dita composição farmacêutica para a o tratamento de câncer.

[00091] Um outro aspecto da invenção é um anticorpo de acordo com a invenção para o tratamento de câncer.

[00092] Um outro aspecto da invenção é o uso de um anticorpo de acordo com a invenção para a fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer.

[00093] Um outro aspecto da invenção é um método de tratamento de paciente que sofre de câncer, por administração de um anticorpo de acordo com a invenção a um paciente que necessita de tal tratamento.

[00094] Conforme usado neste documento, o "veículo farmacêutico"inclui quaisquer solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e que retardam a absorção, e similares, que sejam fisiologicamente compatíveis. De preferência, o veículo é adequado para a administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, parenteral, espinhal ou epidérmica (por exemplo, por injeção ou infusão).

[00095] Uma composição da presente invenção pode ser administrada por uma variedade de métodos conhecidos na técnica. Conforme será apreciado pelo técnico versado, a rota e/ou o modo de administração variarão, dependendo dos resultados desejados. Para administrar um composto da invenção por certas rotas de administração, pode ser necessário revestir o composto com, ou coadministrar o composto com, um material para impedir a sua inativação. Por exemplo, o composto pode ser administrado a um paciente em um veículo apropriado, por exemplo, lipossomos, ou um diluente. Os diluentes farmaceutica- mente aceitáveis incluem a solução salina e as soluções de tampão aquosas. Os veículos farmacêuticos incluem as soluções ou as dispersões aquosas estéreis e os pós estéreis para a preparação extempo-rânea de soluções ou dispersão injetável estéril. O uso de tais meios e agentes para substâncias farmaceuticamente ativas é conhecido na técnica.

[00096] As expressões "administração parenteral" e "administrado parenteralmente", como usadas neste documento, significam os modos de administração, a não ser a administração enteral e tópica, normalmente por injeção, e incluem, sem limitação, a injeção e a infusão intravenosas, intramusculares, intra-arteriais, intratecais, intracapsula- res, intraorbitais, intracardíacas, intradérmicas, intraperitoneais, trans- traqueais, subcutâneas, subcuticulares, intra-articulares, subcapsula- res, subaracnoideoides, intraespinhais, epidurais e intraesternais.

[00097] O termo câncer, conforme usado neste documento, se refereàs doenças proliferativas, tais como linfomas, leucemias linfocíticas, câncer de pulmão, câncer de pulmão de células não pequenas (NSCL), câncer de pulmão de células bronquioloalveolares, câncer dos ossos, câncer pancreático, câncer de pele, câncer da cabeça ou do pescoço, melanoma cutâneo ou intraocular, câncer uterino, câncer ovariano, câncer retal, câncer da região anal, câncer do estômago, câncer gástrico, câncer do cólon, câncer de mama, câncer uterino, carcinoma das trompas de Falópio, carcinoma do endométrio, carcinoma do cérvix, carcinoma da vagina, carcinoma da vulva, doença de Hodgkin, câncer do esôfago, câncer do intestino delgado, câncer do sistema endócrino, câncer da glândula tireoide, câncer da glândula pa- ratireoide, câncer da glândula adrenal, sarcoma de tecido mole, câncer da uretra, câncer do pênis, câncer da próstata, câncer da bexiga, câncer do rim ou ureter, carcinoma de células renais, carcinoma da pélvis renal, mesotelioma, câncer hepatocelular, câncer biliar, neoplasmas do sistema nervoso central (CNS), tumores da coluna espinhal, glioma do tronco cerebral, glioblastoma multiforme, astrocitomas, schwanomas, ependimomas, meduloblastomas, meningiomas, carcinomas de células escamosas, adenoma pituitário e sarcoma de Ewings, incluindo as versões resistentes de quaisquer dos cânceres acima mencionados, ou uma combinação de um ou mais dos cânceres acima mencionados.

[00098] Um outro aspecto da invenção é a dita composição farmacêutica como agente antiangiogênico. Tal agente antiangiogênico pode ser usado para o tratamento de câncer, especialmente os tumores sólidos, e outras doenças vasculares.

[00099] Um outro aspecto da invenção é o uso de um anticorpo de acordo com a invenção para a fabricação de um medicamento para o tratamento de doenças vasculares.

[000100] Um outro aspecto da invenção é um anticorpo de acordo com a invenção para o tratamento de doenças vasculares.

[000101] Uma modalidade preferida é um anticorpo de acordo com a invenção para o tratamento de retinopatia.

[000102] Uma modalidade preferida é o uso de um anticorpo de acordo com a invenção para a fabricação de um medicamento para o tratamento de retinopatia.

[000103] Um outro aspecto da invenção é um método de tratamento de um paciente que sofre de doenças vasculares, por administração de um anticorpo de acordo com a invenção a um paciente que necessita de tal tratamento.

[000104] O termo "doenças vasculares" inclui o Câncer, as Doenças inflamatórias, a Aterosclerose, a Isquemia, o Trauma, a Sepse, a COPD, a Asma, a Diabetes, a AMD, a Retinopatia, o Acidente Vascular Cerebral, as Adiposes, a Lesão do pulmão aguda, a Hemorragia, o Vazamento vascular, p.ex., Induzido por citocinas, a Alergia, a Doença de Graves, a Tiroidite Autoimune de Hashimoto, a Púrpura Tromboci- topênica Idiopática, a Arterite de Células Gigantes, a Artrite Reumatoi- de, o Lupo Sistêmico Eritematoso (SLE), a Nefrite por Lupo, a Doença de Crohn, a Esclerose Múltipla, a Colite Ulcerativa, especialmente para tumores sólidos, síndromes neovasculares intraoculares (tais como as retinopatias proliferativas ou a degeneração macular relacionada à idade (AMD)), artrite reumatoide, e psoríase (Folkman, J., e col., J. Biol. Chem. 267 (1992) 10931- 10934; Klagsbrun, M., e col., Annu. Rev. Physiol. 53 (1991) 217-239; e Garner, A., Vascular diseases, In: Pathobiology of ocular disease, A dynamic approach, Garner, A., e Klintworth, G. K. (eds.), 2aedição, Marcel Dekker, Nova York (1994), pp. 1625-1710).

[000105] Estas composições podem também conter adjuvantes, tais como conservantes, agentes molhantes, agentes emulsificantes e agentes dispersantes. A prevenção da presença de microorganismos pode ser garantida tanto por procedimentos de esterilização, supra, quanto pela inclusão de diversos agentes antibacterianos e antifúngi- cos, por exemplo, parabeno, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, e similar. Pode também ser desejável incluir agentes isotônicos, tais como os açúcares, o cloreto de sódio, e similar, nas composições. Além disso, a absorção prolongada da forma farmacêutica injetável pode ser promovida pela inclusão de agentes que retardem a absorção, tais como o monoestearato de alumínio e a gelatina.

[000106] Não obstante à rota de administração selecionada, os compostos da presente invenção, que podem ser usados em uma forma hidratada adequada, e/ou as composições farmacêuticas da presente invenção, são formulados em formas de dosagem farmaceuticamente aceitáveis por métodos convencionais, conhecidos para aqueles de habilidade na técnica.

[000107] Os níveis de dosagem efetivos dos ingredientes ativos nas composições farmacêuticas da presente invenção podem ser variados, de modo a obter uma quantidade do ingrediente ativo que seja efetiva para atingir a resposta terapêutica desejada para um paciente, composição, e modo de administração particular, sem ser tóxica para o paciente. O nível de dosagem selecionado dependerá de uma variedade de fatores farmacocinéticos, incluindo a atividade das composições particulares empregadas da presente invenção, a rota de administração, o tempo de administração, a taxa de excreção do composto particular que está sendo empregado, a duração do tratamento, outros fármacos, compostos e/ou materiais usados em combinação com as composições particulares empregadas, a idade, o sexo, o peso, a condição, a saúde geral e a história médica anterior do paciente que está sendo tratado, e fatores similares bastante conhecidos nas técnicas médicas.

[000108] A composição deve ser estéril e fluida na medida em que a composição seja proporcionada por seringa. Além da água, o veículo preferivelmente é uma solução salina tamponada isotônica.

[000109] A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de revestimento, tal como a lecitina, por manutenção do tamanho de partícula requerido, no caso de dispersão, e pelo uso de tensoati- vos. Em muitos casos, é preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois, tais como manitol ou sorbitol, e cloreto de sódio, na composição.

[000110] Conforme usadas neste documento, as expressões "célu-la","linhagem celular", e "cultura de células" são usadas de modo in- tercambiável e todas as tais designações incluem a progênie. Assim, as palavras "transformantes" e "células transformadas" incluem a célulaprimária exposta e as culturas derivadas dela, sem consideração pelo número de transferências. Entende-se também que toda progênie pode não ser exatamente idêntica no teor de DNA, devido às mutações intencionais ou acidentais. Está incluída a progênie variante que tem a mesma função ou atividade biológica como examinada na célula originalmente transformada. Onde forem pretendidas designações diferentes,estará claro a partir do contexto.

[000111] O termo "transformação", conforme usado neste documento, se refere ao processo de transferência de vetores/ácido nucleico para uma célula hospedeira. Se forem usadas células sem as enormes barreiras das paredes celulares como as células hospedeiras, a trans- fecção é realizada, por exemplo, pelo método de precipitação com fosfato de cálcio, como descrito por Graham, F.L., e van der Eb, Virology 52 (1973) 456-467. Entretanto, podem também ser usados outros métodos para introduzir o DNA nas células, tais como por injeção nuclear ou por fusão de protoplasto. Se forem usadas células procarióticas ou células que contiverem construções de paredes celulares substanciais, por exemplo, um método de transfecção é o tratamento com cálcio usando cloreto de cálcio, como descrito por Cohen, F. N, e col, PNAS. 69 (1972) 7110ff.

[000112] Conforme usada neste documento, a "expressão"se refere ao processo pelo qual um ácido nucleico é transcrito no mRNA e/ou ao processo pelo qual o mRNA transcrito (também referido como transcrito)está subsequentemente sendo traduzido em peptídeos, polipeptí- deos, ou proteínas. Os transcritos e os polipeptídeos codificados são coletivamente referidos como produto de gene. Se o polinucleotídeo for derivado do DNA genômico, a expressão em uma célula eucariótica pode incluir a remoção do mRNA.

[000113] Um "vetor"é uma molécula de ácido nucleico, em particular, de autoduplicação, que transfere uma molécula de ácido nucleico inserida para, e/ou entre, as células hospedeiras. O termo inclui os vetores que atuam principalmente para a inserção de DNA ou RNA em uma célula (por exemplo, integração cromossômica), a replicação de vetores que atuam principalmente para a replicação de DNA ou RNA, e vetores de expressão que atuam para a transcrição e/ou a tradução do DNA ou do RNA. Também estão incluídos os vetores que proporcionam mais do que uma das funções como descritas.

[000114] Um "vetor de expressão" é um polinucleotídeo que, quando introduzido em uma célula hospedeira apropriada, pode ser transcrito e traduzido em um polipeptídeo. Um "sistema de expressão" normalmente se refere a uma célula hospedeira adequada, compreendida de um vetor de expressão que pode atuar para produzir um produto de expressão desejado.

[000115] Os exemplos, a listagem de sequências e as figuras a se- guir são fornecidos para auxiliar o entendimento da presente invenção, cujo escopo real é apresentado nas reivindicações em anexo. Enten- de-se que podem ser feitas modificações nos procedimentos apresentados, sem sair do espírito da invenção. Descrição das Sequências de Aminoácidos SEQ ID NO: 1 CDR3 da cadeia pesada, < ANG-2>Ang2i_LC06 SEQ ID NO: 2 CDR2 da cadeia pesada, <ANG-2> Ang2i_LC06 SEQ ID NO: 3 CDR1 da cadeia pesada, <ANG-2>Ang2i_LC06 SEQ ID NO: 4 CDR3 da cadeia leve, <ANG-2>Ang2i_LC06 SEQ ID NO: 5 CDR2 da cadeia leve, <ANG-2>Ang2i_LC06 SEQ ID NO: 6 CDR1 da cadeia leve, <ANG-2>Ang2i_LC06 SEQ ID NO: 7 domínio variável da cadeia pesada, Ang2i_LC06 SEQ ID NO: 8 domínio variável da cadeia leve, Ang2i_LC06 SEQ ID NO: 9 CDR3 da cadeia pesada, <ANG-2>Ang2i_LC07 SEQ ID NO: 10 CDR2 da cadeia pesada, <ANG-2>Ang2i_LC07 SEQ ID NO: 11 CDR1 da cadeia pesada, <ANG-2>Ang2i_LC07 SEQ ID NO: 12 CDR3 da cadeia leve, <ANG-2>Ang2i_LC07 SEQ ID NO: 13 CDR2 da cadeia leve, <ANG-2>Ang2i_LC07 SEQ ID NO: 14 CDR1 da cadeia leve, <ANG-2>Ang2i_LC07 SEQ ID NO: 15 domínio variável da cadeia pesada, <ANG2>Ang2i_LC07 SEQ ID NO: 16 domínio variável da cadeia leve, Ang2i_LC07 SEQ ID NO: 17 CDR3 da cadeia pesada, < ANG-2>Ang2k_LC08 SEQ ID NO: 18 CDR2 da cadeia pesada, <ANG-2> Ang2k_LC08 SEQ ID NO: 19 CDR1 da cadeia pesada, <ANG-2> Ang2k_LC08 SEQ ID NO: 20 CDR3 da cadeia leve, <ANG-2> Ang2k_LC08 SEQ ID NO: 21 CDR2 da cadeia leve, <ANG-2> Ang2k_LC08 SEQ ID NO: 22 CDR1 da cadeia leve, <ANG-2> Ang2k_LC08 SEQ ID NO: 23 domínio variável da cadeia pesada, <ANG-2> Ang2k_LC08 SEQ ID NO: 24 domínio variável da cadeia leve, <ANG-2> Ang2k_LC08 SEQ ID NO: 25 CDR3 da cadeia pesada, <ANG-2> Ang2s_LC09 SEQ ID NO: 26 CDR2 da cadeia pesada, <ANG-2> Ang2s_LC09 SEQ ID NO: 27 CDR1 da cadeia pesada, <ANG-2> Ang2s_LC09 SEQ ID NO: 28 CDR3 da cadeia leve, <ANG-2> Ang2s_LC09 SEQ ID NO: 29 CDR2 da cadeia leve, <ANG-2> Ang2s_LC09 SEQ ID NO: 30 CDR1 da cadeia leve, <ANG-2> Ang2s_LC09 SEQ ID NO: 31 domínio variável da cadeia pesada, <ANG-2> Ang2s_LC09 SEQ ID NO: 32 domínio variável da cadeia leve, <ANG-2> Ang2s_LC09 SEQ ID NO: 33 CDR3 da cadeia pesada, <ANG-2> Ang2i_LC10 SEQ ID NO: 34 CDR2 da cadeia pesada, <ANG-2> Ang2i_LC10 SEQ ID NO: 35 CDR1 da cadeia pesada, <ANG-2> Ang2i_LC10 SEQ ID NO: 36 CDR3 da cadeia leve, <ANG-2> Ang2i_LC10 SEQ ID NO: 37 CDR2 da cadeia leve, <ANG-2> Ang2i_LC10 SEQ ID NO: 38 CDR1 da cadeia leve, <ANG-2> Ang2i_LC10 SEQ ID NO: 39 domínio variável da cadeia pesada, <ANG-2> Ang2i_LC10 SEQ ID NO: 40 domínio variável da cadeia leve, <ANG-2> Ang2i_LC10 SEQ ID NO: 41 CDR3 da cadeia pesada, <ANG-2> Ang2k_LC11 SEQ ID NO: 42 CDR2 da cadeia pesada, <ANG-2> Ang2k_LC11 SEQ ID NO: 43 CDR1 da cadeia pesada, <ANG-2> Ang2k_LC11 SEQ ID NO: 44 CDR3 da cadeia leve, <ANG-2> Ang2k_LC11 SEQ ID NO: 45 CDR2 da cadeia leve, <ANG-2> Ang2k_LC11 SEQ ID NO: 46 CDR1 da cadeia leve, <ANG-2> Ang2k_LC11 SEQ ID NO: 47 domínio variável da cadeia pesada, <ANG-2> Ang2k_LC11 SEQ ID NO: 48 domínio variável da cadeia leve, <ANG-2> Ang2k_LC11 SEQ ID NO: 49 CDR3 da cadeia pesada, <ANG-2> Ang2s_R3_LC03 SEQ ID NO: 50 CDR2 da cadeia pesada, <ANG-2> Ang2s_R3_LC03 SEQ ID NO: 51 CDR1 da cadeia pesada, <ANG-2> Ang2s_R3_LC03 SEQ ID NO: 52 CDR3 da cadeia leve, <ANG-2> Ang2s_R3_LC03 SEQ ID NO: 53 CDR2 da cadeia leve, <ANG-2> Ang2s_R3_LC03 SEQ ID NO: 54 CDR1 da cadeia leve, <ANG-2> Ang2s_R3_LC03 SEQ ID NO: 55 domínio variável da cadeia pesada, <ANG-2> Ang2s_R3_LC03 SEQ ID NO: 56 domínio variável da cadeia leve, <ANG-2> Ang2s_R3_LC03 SEQ ID NO: 57 região constante da cadeia pesada humana derivada de IgG1 SEQ ID NO: 58 região constante da cadeia pesada humana derivada de IgG4 SEQ ID NO: 59 região constante da cadeia leve capa SEQ ID NO: 60 região constante da cadeia leve lambda SEQ ID NO: 61 Receptor para Tie-2 humana SEQ ID NO: 62 Angiopoietina-2 (ANG-2) humana com líder e marca de His SEQ ID NO: 63 Angiopoietina-1 (ANG-1) humana com líder e marca de His Descrição das figuras figura 1 Clonagem das IgGs para as expressões tran sientes em vetores de expressão, expressões transientes A) Ang2i- LC06 (figura 1A) B.) Ang2i-LC06 (figura 1B) figura 2 Gel de SDS-PAGE dos anticorpos anti ANG-2 purificados Ang2i-LC06, Ang2i-LC07 e Ang2k-LC08 figura 3 ELISA de interação entre Angiopoietina-Tie2 figura 4 Inibição da ligação da ANG-2 à Tie2 pelos Ang2i-LC06 e Ang2k-LC08 figura 5 Inibição da ligação da ANG-1 à Tie2 pelos Ang2i-LC06 e Ang2k-LC08 figura 6 Modelo de xenoenxerto Colo205 para testar a eficácia in vivo dos anticorpos anti ANG-2 figura 7 Modelo de xenoenxerto KPL-4 para testar a eficácia in vivo dos anticorpos anti ANG-2. figura 8 Ligação à ANG-1 por meio do sensograma Biacore. figura 9 Prevenção de metástase/tumores secundários do pulmão pelos anticorpos de acordo com a invenção no xenoenxerto de tumor de cólon primário (9A) e no xenoenxerto de mama primário (9B) figura 10 Inibição da retinopatia pelos anticorpos de acordo com a invenção.

Procedimento Experimental 1 Materiais e métodos gerais

[000116] A informação geral referente às sequências de nucleotídeos das cadeias leves e pesadas das imunoglobulinas humanas é dada em: Kabat, E.A., e col., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5aed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). Os aminoácidos das cadeias dos anticorpos são numerados e referidos de acordo com a numeração EU (Edelman, G.M., e col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63 (1969) 78-85; Kabat, E.A., e col., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, (1991)).

Técnicas de DNA recombinante

[000117] Foram usados métodos padrão para manipular o DNA, como descrito em Sambrook, J. e col., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989. Os reagentes biológicos moleculares foram usados de acordo com as instruções do fabricante.

Síntese de genes

[000118] Os segmentos de genes desejados foram preparados a partir de oligonucleotídeos feitos por síntese química. Os segmentos de genes, os quais são ladeados por sítios de clivagem por endonuclease de restrição singulares, foram agregados por anelamento e ligação de oligonucleotídeos, incluindo a amplificação por PCR, e subsequentemente clonados por meio dos sítios de restrição indicados, por exemplo, KpnI/ SacI ou AscI/PacI, em um vetor de clonagem pGA4 baseado no pPCRScript (Stratagene). As sequências de DNA dos fragmentos de genes subclonados foram confirmadas por sequenciamen- to do DNA. Os fragmentos da síntese de genes foram arranjados de acordo com as especificações dadas na Geneart (Regensburg, Alemanha).

Determinação da sequência de DNA

[000119] As sequências de DNA foram determinadas por sequenci- amento de fita dupla efetuado em MediGenomix GmbH (Martinsried, Alemanha) ou Sequiserve GmbH (Vaterstetten, Alemanha).

Análise da sequência de DNA e de proteína e controle dos dados da sequência

[000120] O pacote de software da GCG (Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin) versão 10.2, e o software integrado Vector NT1 Advance da Informax versão 8.0, foi usado para a criação, o mapea-mento, a análise, a anotação e a ilustração da sequência.

Vetores de expressão

[000121] Para a expressão dos anticorpos descritos, aplicaram-se variantes de plasmídios de expressão para a expressão transiente (por exemplo, nas células HEK293 EBNA ou HEK293-F) ou para a expressão estável (por exemplo, nas células CHO) com base em uma organização de cDNA com um promotor de CMV-Íntron A ou em uma organização genômica com um promotor de CMV (por exemplo, figura 1).

[000122] Além do cassete de expressão do anticorpo, os vetores continham: - uma origem de replicação que permite a replicação deste plasmídio em E. coli, e - um gene de β-lactamase que confere resistência à ampici- lina em E. coli. A unidade de transcrição do gene do anticorpo é composta dos seguintes elementos: - sítio(s) de restrição único(s) na extremidade 5' - o intensificador inicial imediato e o promotor a partir do ci- tomegalovírus humano, - seguidos pela sequência de Íntron A no caso da organiza-ção de cDNA, - uma região não traduzida em 5' de um gene de anticorpo humano, - uma sequência de sinal da cadeia pesada da imunoglobu- lina, - a cadeia do anticorpo humano (cadeia pesada, cadeia pe-sada modificada ou cadeia leve) como cDNA ou como organização genômica com uma organização de éxon-íntron da imunoglobulina, - uma região não traduzida em 3' com uma sequência de sinal de poliadenilação, e - sítio(s) de restrição único(s) na extremidade 3'.

[000123] Os genes de fusão compreendendo as sequências das cadeias pesadas do anticorpo selecionado, como descrito abaixo, foram gerados por PCR e/ou síntese de gene e agregados com métodos re- combinantes e técnicas conhecidos por união dos segmentos de ácidos nucleicos correspondentes, por exemplo, usando sítios únicos de NsiI e EcoRI nos vetores das cadeias pesadas genômicos. As sequências de ácidos nucleicos subclonados foram verificadas por sequenci- amento de DNA. Para as transfecções transientes e estáveis, foram preparadas quantidades maiores dos plasmídios por preparação do plasmídio a partir de culturas de E. coli transformadas (Nucleobond AX, Macherey-Nagel).

Técnicas de culturas de células

[000124] Foram usadas técnicas padrão de culturas de células, conforme como descritas em Current Protocols in Cell Biology (2000), Bo- nifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J. e Yamada, K.M. (eds.), John Wiley & Sons, Inc.

Transfecções transientes no sistema de HEK293-F

[000125] Os anticorpos foram gerados por transfecção transiente dos dois plasmídios que codificam a cadeia pesada ou pesada modificada, respectivamente, e a cadeia leve correspondente, usando o sistema de HEK293-F (Invitrogen) de acordo com a instrução do fabricante. Resumidamente, as células HEK293-F (Invitrogen) que se desenvolvem em suspensão, em um frasco de agitação ou em um fermentador agitado em meio de expressão FreeStyle 293 sem soro (Invitrogen), foram transfectadas com uma mistura dos dois plasmídios de expressão respectivos e a 293fectina ou a fectina (Invitrogen). Para, por exemplo, o frasco de agitação de 2 L (Corning), as células HEK293-F foram semeadas em uma densidade de 1,0E*6 células/mL em 600 mL e incubadas a 120 rpm, 8% de CO2. No dia seguinte, as células foram transfectadas em uma densidade celular de cerca de 1,5E*6 célu- las/mL com cerca de 42 mL de mistura de A) 20 mL de Opti-MEM (In- vitrogen) com 600 μg de DNA de plasmídio total (1 μg/mL) codificando a cadeia pesada ou pesada modificada, respectivamente, e a cadeia leve correspondente, em uma razão equimolar , e B) 20 ml de Opti- MEM + 1,2 mL de 293 fectina ou fectina (2 μl/mL). De acordo com o consumo de glicose, a solução de glicose foi adicionada durante o curso da fermentação. O sobrenadante contendo o anticorpo secretado foi coletado após 5-10 dias e os anticorpos foram diretamente purifica- dos do sobrenadante ou o sobrenadante foi congelado e armazenado.

Determinação da proteína

[000126] A concentração de proteína dos anticorpos purificados e dos derivados foi determinada estabelecendo-se a densidade óptica (DO) a 280 nm, usando o coeficiente de extinção molar calculado com base na sequência de aminoácidos, de acordo com Pace, C.N., e col., Protein Science, 4 (1995), 2411-1423.

Determinação da concentração dos anticorpos nos sobrenadantes

[000127] A concentração dos anticorpos e dos derivados nos sobre- nadantes da cultura de células foi estimada por imunoprecipitação com glóbulos de Proteína A Agarose (Roche). 60 μL dos glóbulos de Proteína A Agarose são lavados três vezes em TBS-NP40 (Tris a 50 mM, pH 7,5, NaCl a 150 mM, 1% de Nonidet-P40). Subsequentemente, 115 mL do sobrenadante da cultura de células são aplicados aos glóbulos de Proteína A Agarose pré-equilibrados em TBS-NP40. Após incubação por 1 h na temperatura ambiente, os glóbulos são lavados sobre uma coluna de filtro Ultrafree-MC (Amicon) uma vez com 0,5 mL de TBS-NP40, duas vezes com 0,5 mL de 2x solução salina tamponada com fosfato (2xPBS, Roche) e brevemente quatro vezes com 0,5 mL de citrato de Na a 100 mM pH 5,0. O anticorpo ligado é eluído por adição de 35 μl de Tampão de Amostra NuPAGE®LDS (Invitrogen). Metade da amostra é combinada com o Agente Redutor de Amostra NuPAGE®ou deixada não reduzida, respectivamente, e aquecida por 10 min a 70°C. Consequentemente, 20 μl são aplicados a um NuPAGE®Bis-Tris SDS-PAGE 4-12% (Invitrogen) (com tampão de MOPS para SDS-PAGE não reduzido e tampão de MES com o aditivo de tampão de corrida Antioxidante NuPAGE®(Invitrogen) para SDS- PAGE reduzido) e coloridos com Azul de Coomassie.

[000128] A concentração de anticorpos e derivados nos sobrenadan- tes das culturas de células foi medida por Proteína A-cromatografia HPLC. Resumidamente, os sobrenadantes das culturas de células contendo os anticorpos e os derivados que se ligam à Proteína A foram aplicados a uma coluna de Proteína A HiTrap (GE Healthcare) em K2HPO4 a 50 mM, NaCl a 300 mM, pH 7,3, e eluídos da matriz com ácido acético a 50 mM, pH 2,5, sobre um sistema de HPLC Dionex. A proteína eluída foi quantificada por absorbância de UV e integração das áreas de pico. Um anticorpo IgG1 padrão purificado serviu como um padrão.

[000129] Alternativamente, a concentração de anticorpos e derivados nos sobrenadantes das culturas de células foi medida por ELISA de IgG em Sanduíche. Resumidamente, as placas de microtitulação de 96 poços com Estreptavidina A StreptaWell High Bind (Roche) foram revestidas com a molécula de captura de IgG anti-humana biotinlada a 100 μL/poço F(ab')2<h-FcY> BI (Dianova), a 0,1 μg/mL, por 1 h, na temperatura ambiente, ou, alternativamente, durante a noite, a 4°C, e subsequentemente lavada três vezes com 200 μL/poço de PBS, 0,05% de Tween (PBST, Sigma). 100 μL/poço de uma série de diluições em PBS (Sigma) dos respectivos sobrenadantes das culturas de células contendo os anticorpos foram adicionados aos poços e incubados por 1-2 h sobre um agitador de placa de microtitulação, na temperatura ambiente. Os poços foram lavados três vezes com 200 μL/poço de PBST e o anticorpo ligado foi detectado com 100 μl de F(ab')2<hFcgamma>POD (Dianova), a 0,1 μg/mL, como o anticorpo de detecção, por 1-2 h, sobre um agitador de placa de microtitulação, na temperatura ambiente. O anticorpo de detecção não ligado foi removido por lavagem três vezes com 200 μL/poço de PBST e o anticorpo de detecção ligado foi detectado por adição de 100 μL de ABTS/poço. A determinação da absorbância foi efetuada sobre um Espectrômetro de Flúor Tecan, em um comprimento de ondas de medição de 405 nm (comprimento de ondas de referência 492 nm).

Purificação das proteínas

[000130] As proteínas foram purificadas dos sobrenadantes das culturas de células filtrados em relação a protocolos padrões. Em resumo, os anticorpos foram aplicados a uma coluna de Proteína A Sepharose (GE Healthcare) e lavados com PBS. A eluição dos anticorpos foi obtida em pH ácido, seguida por neutralização imediata da amostra. A proteína agregada foi separada dos anticorpos monoméricos através de cromatografia por exclusão de tamanho (Superdex 200, GE Healthcare) em Histidina a 20 mM, NaCl a 140 mM pH 6,0. As frações de anticorpos monoméricos foram reunidas, concentradas, se requerido, usando, por exemplo, um concentrador centrífugo MILLIPORE Amicon Ultra (30 MWCO), e armazenadas a -80 °C. Parte das amostras foi fornecida para a analítica de proteína subsequente e a caracterização analítica, por exemplo, por SDS-PAGE, cromatografia por exclusão de tamanho, espectrometria de massa e determinação da Endotoxina (ver a figura 2).

SDS-PAGE

[000131] O sistema de gel NuPAGE®Pre-Cast (Invitrogen) foi usado de acordo com a instrução do fabricante. Em particular, foram usados os géis NuPAGE®Novex®TRIS-Glicina Pre-Cast a 4-20% e um tampão de corrida Novex®TRIS-Glicina SDS (ver, por exemplo, a figura 1). A redução das amostras foi obtida por adição do agente redutor de amostra NuPAGE®antes de correr o gel.

Cromatografia analítica por exclusão de tamanho

[000132] A cromatografia por exclusão de tamanho para a determinação da agregação e do estado oligomérico dos anticorpos foi efetuada por cromatografia HPLC. Resumidamente, os anticorpos purificados de Proteína A foram aplicados a uma coluna Tosoh TSKgel G3000SW em NaCl a 300 mM, KH2PO4/K2HPO4 a 50 mM, pH 7,5, sobre um sistema de HPLC Dionex, ou a uma coluna Superdex 200 (GE Healthcare) em 2 x PBS, sobre um Sistema de HPLC Dionex. A proteína eluída foi quantificada por absorbância de UV e integração das áreas de pico. O Padrão de Filtração em Gel da BioRad 151-1901 serviu com um padrão.

Espectrometria de massa

[000133] A massa desglicosilada total dos anticorpos foi determinada e confirmada por meio de espectrometria de massas com ionização por electrospray (ESI-MS). Resumidamente, 100 μg de anticorpos purificados foram desglicosilados com 50 mU de N-Glicosidase F (PNGa- seF, ProZyme) em KH2PO4/K2HPO4 a 100 mM, pH 7, a 37°C, por 1224 h, em uma concentração de proteína de até 2 mg/ml, e subsequentemente dessalinizados por meio de HPLC sobre uma coluna Sephadex G25 (GE Healthcare). A massa das respectivas cadeias pesadas e leves foi determinada por ESI-MS após desglicosilação e redução. Em resumo, 50 μg de anticorpo em 115 μl foram incubados com 60 μl de TCEP a 1M e 50 μl de cloridrato de Guanidínio a 8 M subsequentemente dessalinizados. A massa total e a massa das cadeias pesadas e leves reduzidas foram determinadas por meio de ESIMS sobre um sistema de MS Q-Star Elite equipado com uma fonte NanoMate.

ELISA de ligação à ANG-1 e à ANG-2

[000134] As propriedades de ligação dos anticorpos dirigidos contra as ANGPTs (Angiopoietina 1 ou 2) foram avaliadas em um ensaio ELISA com a proteína de tamanho natural Angiopoietina-2-His (R&D Systems no 623-AN/CF ou em material produzido na empresa) ou a Angiopoietina-1-His (R&D systems no 923-AN). Portanto, as placas de 96 poços (placas de microtitulação intensificadas claras de poliestireno da Falcon ou Maxisorb Nunc) foram revestidas com 100 μl de Angio- poietina-1 ou Angiopoietina-2 humana recombinante a 1 μg/mL (sem veículo) em PBS (Sigma), por 2 h na temperatura ambiente, ou duran- te a noite a 4°C. Os poços foram lavados três vezes com 300 μl de PBST (0,2% de Tween 20) e bloqueados com 200 μl de 2% de BSA 0,1% de Tween 20, por 30 min, na temperatura ambiente, e subsequentemente lavados três vezes com 300 μl de PBST. 100 μL/poço de uma série de diluições (40 pM-0,01 pM) do anticorpo de teste purificado contra <ANG-2> e, como uma referência, Mab536 (Oliner, J., e col., Cancer Cell. Nov 6 (2004) 507-16, US 2006/0122370) em PBS foram adicionados aos poços e incubados por 1 h sobre um agitador de placa de microtitulação na temperatura ambiente. Os poços foram lavados três vezes com 300 μl de PBST (0,2% de Tween 20) e o anticorpo ligado foi detectado com 100 μL/poço de F(ab') <hk>POD a 0,1 μg/ml (Biozol Cat.No 206005) em 2% de BSA 0,1% de Tween 20, como o anticorpo de detecção, por 1 h, sobre um agitador de placa de microti- tulação, na temperatura ambiente. O anticorpo de detecção não ligado foi removido por lavagem três vezes com 300 μL/poço de PBST e o anticorpo de detecção ligado foi detectado por adição de 100 μL de ABTS/poço. A determinação da absorbância foi efetuada sobre um Espectrômetro de Flúor Tecan, em um comprimento de ondas de medição de 405 nm (comprimento de ondas de referência 492 nm).

BIACORE de ligação à ANG-2

[000135] A ligação dos anticorpos ao antígeno, por exemplo, a ANG- 2 humana, foi investigada por ressonância plasmônica de superfície, usando um instrumento BIACORE T100 (GE Healthcare Biosciences AB, Uppsala, Suécia). Resumidamente, para as medições da afinidade, os anticorpos policlonais <hIgG-Fcgama> em cabra foram imobilizados sobre um chip CM4 por meio de acoplamento de amina para a apresentação dos anticorpos contra a ANG-2 humana. A ligação foi medida em tampão de HBS (HBS-P (HEPES a 10 mM, NaCl a 150 mM, 0,05% de Tween 20, pH 7,4), 25°C. A ANG-2-His purificada (R&D systems ou purificada na firma) foi adicionada em diversas concentra ções entre 0,41 nM e 200 nM, em solução. A associação foi medida por uma injeção de ANG-2 de 3 minutos; a dissociação foi medida por lavagem da superfície do chip com tampão de HBS por 5 minutos e um valor de KD foi estimado usando um modelo de ligação de Langmuir 1:1. Devido à heterogeneidade da preparação da ANG-2, nenhumaligação 1:1 pôde ser observada; os valores de KD são, assim, somente estimativas relativas. Os dados de controle negativo (por exemplo, curvas de tampão) foram subtraídos das curvas de amostra para a correção do deslocamento da linha de base intrínseco do sistema e para a redução do sinal de ruído. O Software T100 Evaluation da Bia- core versão 1.1.1 foi usado para a análise dos sensogramas e para o cálculo dos dados de afinidade. Alternativamente, a Ang-2 pôde ser captura com um nível de captura de 2000-1700 RU por meio do AnticorpoPentaHis (PentaHis-Ab sem BSA, Qiagen No 34660) que foi imobilizado sobre um chip CM5 por meio de acoplamento de amina (sem BSA) (ver abaixo).

Inibição da ligação da huANG-2 à Tie-2 (ELISA)

[000136] A ELISA de interação foi efetuada sobre placas de microti- tulação de 384 poços (MicroCoat, DE, Cat. No 464718), na TA. Após cada etapa de incubação, as placas foram lavadas 3 vezes com PBST. As placas de ELISA foram revestidas com 0,5 μg/ml de proteína Tie-2 (R&D Systems, UK, Cat. No 313-TI) por pelo menos 2 horas (h). Após isso, os poços foram bloqueados com PBS suplementada com 0,2% de Tween-20 e 2% de BSA (Roche Diagnostics GmbH, DE) por 1 h. As diluições dos anticorpos purificados em PBS foram incubadas juntamente com 0,2 μg/ml de huAngiopoietina-2 (R&D Systems, UK, Cat. No 623-AN), por 1 h, na TA. Após a lavagem, foi adicionada uma mistura de 0,5 μg/ml de clone de antiangiopoietina-2 biotinilado BAM0981 (R&D Systems, UK) e estreptavidina HRP diluídas a 1:3000 (Roche Diagnostics GmbH, DE, Cat. No 11089153001), por 1 h. Após isso, as placas foram lavadas 6 vezes com PBST. As placas foram reveladas com reagente de ABTS recentemente preparado (Roche Diagnostics GmbH, DE, tampão no 204 530 001, comprimidos no 11 112 422 001) por 30 minutos, na TA. A absorbância foi medida a 405 nm.

Inibição da ligação da huANG-1 à Tie-2 (ELISA)

[000137] A ELISA de interação foi efetuada sobre placas de microti- tulação de 384 poços (MaxiSorb Nunc no 442768), na TA. Após cada etapa de incubação, as placas foram lavadas 3 vezes com PBST. As placas de ELISA foram revestidas com 0,5 μg/ml de proteína Tie-2 (R&D Systems, UK, Cat. No 313-TI ou em material produzido na empresa) por pelo menos 2 horas (h). Após isso, os poços foram bloqueados com PBS suplementada com 0,2% de Tween-20 e 2% de BSA (Roche Diagnostics GmbH, DE) por 1 h. As diluições dos anticorpos purificados em PBS foram incubadas juntamente com 0,2 μg/ml de huAngiopoietina-1 (R&D Systems no 923-AN/CF ou em material produzido na empresa), por 1 h, na TA. Após a lavagem, foi adicionada uma mistura de 0,5 μg/ml de clone de anti-Angiopoietina-1 biotinilado (R&D Systems no BAF923) e estreptavidina HRP diluídas a 1:3000 (Roche Diagnostics GmbH, DE, Cat. No 11089153001), por 1 h. Após isso, as placas foram lavadas 6 vezes com PBST. As placas foram reveladas com reagente de ABTS recentemente preparado (Roche Diagnostics GmbH, DE, tampão no 204 530 001, comprimidos no 11 112 422 001) por 30 minutos, na TA. A absorbância foi medida a 405 nm.

Geração da linhagem celular HEK293-Tie2

[000138] Para determinar a interferência dos anticorpos para Angio- poietina-2 com a fosforilação da Tie2 estimulada pela ANGPT2 e a li-gação da ANGPT2 à Tie2 sobre as células, uma linhagem celular re- combinante HEK293-Tie foi gerada. Resumidamente, um plasmídio à base de pcDNA3 (RB22-pcDNA3 Topo hTie2) codificando para a Tie2 humana de tamanho natural (SEQ ID 61), sob o controle de um promo tor de CMV e um marcador de resistência à Neomicina, foi transfecta- do usando Fugene (Roche Applied Science) como reagente de trans- fecção nas células HEK293 (ATCC) e as células resistentes foram selecionadas em DMEM 10% de FCS, 500 μg/ml de G418. Os clones individuais foram isolados por meio de um cilindro de clonagem, e analisados subsequentemente quanto à expressão da Tie2 por FACS. O clone 22 foi identificado como clone com expressão da Tie2 alta e estável,mesmo na ausência de G418 (clone de HEK293-Tie2 22). O clone de HEK293-Tie2 22 foi subsequentemente usado para os ensaios celulares: ensaio de fosforilação da Tie2 induzida pela ANGPT2 e ligaçãodo ligante celular de ANGPT2.

Ensaio de fosforilação da Tie2 induzida pela ANGPT2

[000139] A inibição da fosforilação da Tie2 induzida pela ANGPT2 pelos anticorpos para ANGPT2 foi medida de acordo com o seguinte princípio de ensaio. O clone de HEK293-Tie2 22 foi estimulado com a ANGPT2 por 5 minutos, na ausência ou na presença do anticorpo para ANGPT2, e a P-Tie2 foi quantificada por um ELISA de sanduíche. Resumidamente, 2x105 células de clone de HEK293-Tie2 22 por poço foram desenvolvidas durante a noite sobre uma placa de microtitula- ção de 96 poços revestida com Poli-D-Lisina, em 100 μl de DMEM, 10% de FCS, 500 μg/ml de Geneticina. No dia seguinte, a fileira de titulação dos anticorpos para ANGPT2 foi preparada em uma placa de microtitulação (concentrada 4 vezes, volume final de 75 μl/poço, duplicatas) e misturada com 75 μl de uma diluição de ANGPT2 (R&D systemsno 623-AN) (3,2 μg/ml como solução concentrada 4 vezes). Os anticorpos e a ANGPT2 foram pré-incubados por 15 min na temperatura ambiente. 100 μl da mistura foram adicionados às células de clone de HEK293-Tie2 22 (pré-incubadas por 5 min com NaV3O4 a 1 mM, Sigma no S6508) e incubados por 5 min a 37°C. Subsequentemente, as células foram lavadas com 200 μl de PBS gelada + NaV3O4 a 1 mM por poço e lisadas por adição de 120 μl de tampão de lise (Tris a 20 mM, pH 8,0, NaCl a 137 mM, 1% de NP-40, 10% de glicerol, EDTA a 2 mM, NaV3O4 a 1 mM , PMSF a 1 mM e 10 μg/ml de Aprotinina) por poço, sobre gelo. As células foram lisadas por 30 min a 4°C sobre um agitador de placa de microtitulação e 100 μl de lisado foram transferidos diretamente para uma placa de microtitulação de ELISA de p- Tie2 (R&D Systems, R&D no DY990), sem centrifugação prévia e sem determinação da proteína total. As quantidades de P-Tie2 foram quantificadas de acordo com as instruções do fabricante e os valores de IC50 para a inibição foram determinados usando plug-in de análise XLfit 4 para Excel (um site de resposta à dose, modelo 205). Os valores de IC50 podem ser comparados dentro do experimento, porém podem variar de experimento para experimento.

Exemplo 1 Expressão e purificação dos anticorpos monoclonais para <ANG-2> Ang2i-LC06, Ang2i-LC07 e Ang2k-LC08

[000140] As cadeias leves e pesadas dos anticorpos correspondentes Ang2i-LC06, Ang2i-LC07 e Ang2k-LC08 foram construídas em vetores de expressão, conforme descrito acima. A cadeia pesada e a capa leve foram clonadas em um cassete de expressão genômico, enquanto a cadeia leve lambda foi clonada como cDNA com o íntron A (figura 1b). Os plasmídios foram ampliados em E. coli, purificados, e subsequentemente transfectados para a expressão transiente das proteínas recombinantes nas células HEK293-F (utilizando o sistema FreeStyle 293 da Invitrogen). Após 7 dias, os sobrenadantes das células HEK 293-F foram coletados, filtrados e os anticorpos foram purificados por proteína A e cromatografia por exclusão de tamanho. A homogeneidade de todos os anticorpos foi confirmada por SDS-PAGE sob condições não-redutoras e redutoras e cromatografia por exclusão de tamanho analítica. Sob as condições redutoras (figura 1), as cadeias pesadas de polipeptídeos dos anticorpos para <ANG-2> mostraram, com SDS-PAGE, tamanhos moleculares aparentes de cerca de 30 kDa, análogos aos pesos moleculares calculados, as cadeias leves de polipeptídeos mostraram massas moleculares aparentes de 24 kDa, de acordo com o seu tamanho predito. A espectrometria de massa confirmou a identidade dos anticorpos purificados. Os níveis de expressão de todas as construções foram analisados por Proteína A HPLC.

[000141] Análise através de cromatografia por exclusão de tamanho dos purificados. Todos os anticorpos foram preparados e analiticamente caracterizados de modo análogo ao procedimento descrito. Os dados de SEC dos anticorpos correspondentes foram resumidos na tabela abaixo.

Exemplo 2 Ensaio de ligação por ELISA à ANG-1 humana e à ANG-2 humana

[000142] A ligação dos anticorpos para <ANG-2> Ang2i-LC06, Ang2i- LC07 e Ang2k-LC08 à ANG-1 humana e à ANG-2 humana foi determinada em um ELISA de ligação à ANG-1 ou ANG-2, conforme descrito acima. Resumidamente, o ensaio do tipo ELISA é baseado na imobilização da Angiopoietina-1 ou -2 do tipo selvagem humana em uma placa de microtitulação. A ligação de um anticorpo dirigido contra a ANG- 1 ou a ANG-2 imobilizada é medida por meio de um anticorpo <Fc humano> (anti-IgG) com um conjugado de POD. Uma série de diluições do anticorpo para <ANG-2> permite determinar uma concentração EC50. Como uma referência, foi usado o anticorpo anti-ANG-2 humano anticorpo para <ANG-2> Mab536 (Oliner e col., Cancer Cell. Nov 6 (2004) 507-16, US 2006/0122370). As concentrações EC50 determinadassão resumidas na tabela abaixo.

[000143] Todos os anticorpos estão se ligando especificamente à ANG-2. O MAb536 e o Ang2k-LC08 mostram também ligação específica para ANG-1, enquanto o Ang2i-LC06 e o Ang2i-LC07 não estão especificamente se ligando à ANG-1, visto que eles têm um valor de EC50 de acima de 8000 ng/ml (limite de detecção).

Exemplo 3 Ligação à ANG-2 por meio de Biacore

[000144] A afinidade pela ligação à ANGPT2 humana foi examinada com um ensaio Biacore, como descrito acima. Resumidamente, neste ensaio um anticorpo de captura (anti-Fc) é imobilizado na superfície do chip Biacore, que captura e apresenta o anticorpo correspondente (por exemplo, Ang2i-LC06). O ligante (aqui, a ANGPT2) é capturado da so-lução. A afinidade por esta interação é determinada com a suposição de uma interação de 1:1. Os detalhes deste experimento podem ser encontrados na seção de métodos gerais. As afinidades determinadas para a ligação à ANGPT2 (KD) são resumidas na tabela abaixo.

[000145] Os anticorpos Ang2i-LC06 e Ang2k se ligam com alta afinidadeà ANGPT2.

Exemplo 4 Neutralização da interação entre ANGPT1/2-Tie 2 (humanas)

[000146] O bloqueio da interação entre ANGPT1/2 humana/Tie2 humana foi mostrado por ELISA de interação do receptor. As placas de 384 poços Maxisorp (Nunc) foram revestidas com 0,5 μg/ml de Tie2 humana (R&D Systems, UK, Cat. No 313-TI ou em material produzido na empresa) por 2 h, na temperatura ambiente, e bloqueadas com PBS suplementada com 0,2% de Tween-20 e 2% de BSA (Roche Diagnostics GmbH, DE) por 1 h, na temperatura ambiente, sob agitação. Nesse meio tempo, as diluições dos anticorpos purificados em PBS foram incubadas juntamente com 0,2 μg/ml de huAngiopoietina-1/2 (R&D Systems no 923-AN/CF, R&D Systems, UK, Cat. No 623-AN ou em material produzido na empresa) por 1 h, na TA. Após a lavagem, foi adicionada uma mistura de 0,5 μg/ml de clone de anti- Angiopoietina-1/2 biotinilado (R&D Systems no BAF923, BAM0981 R&D Systems, UK) e estreptavidina HRP diluídas a 1:3000 (Roche Di-agnostics GmbH, DE, Cat. No 11089153001), por 1 h. Após isso, as placas foram lavadas 6 vezes com PBST. As placas foram reveladas com reagente de ABTS recentemente preparado (Roche Diagnostics GmbH, DE, tampão no 204 530 001, comprimidos no 11 112 422 001) por 30 minutos, na TA. A absorbância foi medida a 405 nm.

[000147] As concentrações inibitórias obtidas são resumidas na tabela a seguir.

[000148] A tabela acima mostra os diferentes perfis de seletividade para os dois anticorpos Ang2i-LC06 e Ang2k-LC08. O Ang2i-LC06 é seletivo para a ANGPT2, enquanto o Ang2k-LC08 é reativo cruzado com ANGPT1/2 na inibição pela interação entre ANGPT1/2 Tie2.

Exemplo 5 Fosforilação da Tie2

[000149] A capacidade dos anticorpos para ANGPT2 identificados de interferir com a fosforilação da Tie2 mediada pela ANGPT2 e pela ANGPT1 foi examinada nos ensaios de fosforilação da Tie2 induzida por ANGPT2 e ANGPT1, como descritos acima. Uma representação esquemática da configuração do ensaio é representada na figura 3.

[000150] Ambos os anticorpos Ang2i-LC06 e Ang2k-LC08 mostraram uma interferência dependente da dose com a fosforilação da Tie2 estimulada pela ANGPT2, como mostrado na figura 4, com valores de IC50 comparáveis. O Ang2i-LC06 interferiu com a fosforilação da Tie2 estimulada pela ANGPT2 com um valor de IC50 de aprox. 508 ng/ml e o Ang2k-LC08 interferiu com a fosforilação da Tie2 estimulada pela ANGPT2 com um valor de IC50 de aprox. 499 ng/ml. Em contraste, somente o Ang2k-LC08 interferiu com a fosforilação da Tie2 estimulada pela ANGPT1, com um valor de IC50 de aprox. 391 ng/ml, enquanto o Ang2i-LC06 não interferiu com a fosforilação da Tie2 estimulada pela ANGPT2 na mesma faixa de concentrações testada (figura 5).

Exemplo 6: Eficácia in vivo Efeito dos anticorpos anti ANGPT sobre o crescimento do xenoenxerto Colo205

[000151] Eficácia in vivo dos anticorpos para <ANGPT2> Ang2i-LC06 e Ang2k-LC08 em comparação com <ANGPT2> Mab536 no modelo de xenoenxerto Colo205 subcutâneo de estágio

[000152] Os anticorpos purificados Ang2i-LC06 e Ang2k-LC08 foram comparados com o anticorpo Mab536 no modelo de xenoenxerto Co- lo205 subcutâneo de estágio (Ang2_PZ_Colo205_006), nos camun-dongosfêmeos beges Scid.

[000153] Anticorpos: O Mab536 foi proporcionado como solução de estoque congelada (c = 4,5 mg/mL), o Ang2i-LC06 e o Ang2k-LC08 foram proporcionados como solução de estoque congelada (c = 1 mg/mL) em Histidina a 20 mM, NaCl a 140 mM, pH 6,0. A solução de anticorpo foi diluída apropriadamente em PBS a partir do estoque, antes das injeções, onde requerido, e a PBS foi aplicada como veículo. O anticorpo anti-IgE IgG1 humanizado Xolair (Omalizumab) serviu como controle positivo e foi trazido de uma farmácia.

[000154] Linhagens celulares e condições de cultura: As células de câncer colorretal humanas Colo205 foram originalmente obtidas da ATCC e, após expansão, depositadas no banco de células interno Penzberg da Roche. A linhagem de células de tumor foi rotineiramente cultivada em meio RPMI 1640 (PAA, Laboratories, Áustria) suplementado com 10% de soro bovino fetal (PAA, Laboratories, Áustria) e L- glutamina a 2 mM, a 37 °C, em uma atmosfera saturada com água, a 5% de CO2. A passagem 3 foi usada para a transplantação.

[000155] Animais: Os camundongos fêmeos beges SCID (adquiridos de Charles River Alemanha) foram mantidos sob condição sem pató- geno específico, com ciclos diários de 12 h de luz/12 h de escuridão, de acordo com as diretrizes comprometidas (GV-Solas; Felasa; TierschG). O protocolo de estudo experimental foi revisto e aprovado pelo governo local. Após a chegada, os animais foram mantidos na parte de quarentena do recinto dos animais por uma semana, para acostumarem-se ao novo ambiente e para observação. O monitoramentocontínuo da saúde foi realizado em base regular. Foram proporcionadasração dietética (Provimi Kliba 3337) e água (pH acidificado 2,5-3) ad libitum. A idade dos camundongos no início do estudo era cerca de 12-14 semanas.

[000156] Monitoramento: Os animais foram controlados diariamente quanto aos sintomas clínicos e detecção de efeitos adversos. Para o monitoramento por todo o experimento, o peso do corpo dos animais foi documentado e o volume do tumor foi medido por compasso de calibre após o estadiamento.

[000157] Injeção das células de tumor: No dia da injeção, as células Colo205 foram centrifugadas, lavadas uma vez e suspensas novamente em PBS. Após uma lavagem adicional com PBS, a concentração das células e o tamanho das células foram determinados usando um contador de células e o sistema analisador (Vi-CELL, Beckman Coulter). Para a injeção das células Colo205, o título final foi ajustado para 5,0 x 10E7 células/ml, viabilidade de cerca de 90%. Subsequentemente, 100 μl desta suspensão correspondendo a 2,5*106 células por animal foram injetados s.c. no lado direito dos camundongos.

[000158] Tratamento dos animais: O tratamento dos animais começou no dia da randomização, 16 dias após a transplantação das células (estudo Ang2_PZ_Colo205_006), em um volume de tumor médio de 175 mm3. Roteiro da dose do estudo Ang2_PZ_Colo205_006:

[000159] A inibição do crescimento do tumor até o Dia 50 é mostrada na figura 6. Os dados mostram que o anticorpo seletivo para ANGPT2 Ang2i-LC06 era o anticorpo mais ativo (Valor da ração de controle do tumor (TCR) 0,39). O Ang2i-LC06 era mais eficaz na inibição do cres-cimento do tumor do que o anticorpo MAb536 (valor da TCR 0,47) e o anticorpo reativo cruzado com ANGPT1, seletivo para ANGPT2, Ang2k-LC08 (valor da TCR 0,46).

Efeito dos anticorpos anti ANGPT sobre o crescimento do xenoenxerto KPL-4

[000160] Eficácia in vivo dos anticorpos para <ANGPT2> Ang2i-LC06 e Ang2k-LC08 em comparação com <ANGPT2> Mab536 no modelo de xenoenxerto KPL-4 ortotópico de estágio

[000161] Os anticorpos purificados Ang2i-LC06 e Ang2k-LC08 foram comparados com o anticorpo Mab536 no modelo de xenoenxerto KPL- 4 ortotópico de estágio (Ang2_PZ_KPL-4_002), nos camundongos fêmeos beges Scid.

[000162] Anticorpos: O Mab536 foi proporcionado como solução de estoque congelada (c = 4,5 mg/mL), o Ang2i-LC06 e o Ang2k-LC08 foram proporcionados como solução de estoque congelada (c = 1 mg/mL) em Histidina a 20 mM, NaCl a 140 mM, pH 6,0. A solução de anticorpo foi diluída apropriadamente em PBS a partir do estoque, antes das injeções, onde requerido, e a PBS foi aplicada como veículo.

[000163] Linhagens celulares e condições de cultura: as células de câncer de mama humanas KPL-4 foram originalmente estabelecidas a partir da efusão pleural maligna de uma paciente com câncer de mama com uma metástase da pele inflamatória. As células KPL-4 foram gen-tilmente fornecidas pelo Prof. J. Kurebayashi (Kawasaki Medical School, Kurashiki, Japão). As células de tumor foram rotineiramente cultivadas em meio DMEM (PAN Biotech, Alemanha) suplementado com 10% de soro bovino fetal (PAN Biotech, Alemanha) e L-glutamina a 2 mM (PAN Biotech, Alemanha), a 37 °C, em uma atmosfera saturada com água, a 5% de CO2. A passagem da cultura foi efetuada com trip- sina / EDTA 1x (PAN) separando-se três vezes / semana.

[000164] Animais: Os camundongos fêmeos beges SCID (adquiridos de Charles River Alemanha) foram mantidos sob condição sem pató- geno específico, com ciclos diários de 12 h de luz/12 h de escuridão, de acordo com as diretrizes comprometidas (GV-Solas; Felasa; TierschG). O protocolo de estudo experimental foi revisto e aprovado pelo governo local. Após a chegada, os animais foram mantidos na parte de quarentena do recinto dos animais por uma semana, para acostumarem-se ao novo ambiente e para observação. O monitoramentocontínuo da saúde foi realizado em base regular. Foram proporcionadasração dietética (Provimi Kliba 3337) e água (pH acidificado 2,5-3) ad libitum. A idade dos camundongos no início do estudo era cerca de 12 semanas.

[000165] Monitoramento: Os animais foram controlados diariamente quanto aos sintomas clínicos e detecção de efeitos adversos. Para o monitoramento por todo o experimento, o peso do corpo dos animais foi documentado e o volume do tumor foi medido por compasso de calibre após o estadiamento.

[000166] Injeção das células de tumor: No dia da injeção, as células de tumor foram coletadas (tripsina-EDTA) dos frascos de cultura (Greiner TriFlask) e transferidas para 50 ml de meio de cultura, lavadas uma vez e suspensas novamente em PBS. Após uma etapa de lavagem adicional com PBS e filtração (filtro de células; Falcon®; 100 μm), o título final das células foi ajustado para 1,5 x 108 / ml. A suspensão de células de tumor foi cuidadosamente misturada com a pipeta de transferência para evitar a agregação das células. A anestesia foi efetuada usando uma unidade de inalação da Stephens para animais pequenos, com câmara de pré-incubação (plexiglas), máscara para nariz de camundongo individual (silício) e composto de anestesia não inflamável ou explosivo Isoflurano (Pharmacia-Upjohn, Alemanha), em um sistema de circulação fechado. Dois dias antes da injeção, o pelo dos animais foi raspado. Para a injeção i.m.f.p., as células foram injetadas de modo ortotópico, em um volume de 20 μl (3*106 / animal), no coxim gorduroso mamário inguinal penúltimo direito de cada camundongo anestesiado. Para a implantação ortotópica, a suspensão de células foi injetada através da pele, sob o mamilo, usando uma seringa de microlitro Hamilton e uma agulha 30Gx1/2".

[000167] O tratamento dos animais iniciou no dia da randomização, com os tumores variando de 60-180 mm, 3,35 dias após a transplantação das células (estudo Ang2_PZ_KPL-4_002), em um volume de tumor médio de cerca de 90 mm3. Roteiro da dose do estudo Ang2_PZ_KPL-4_002:

[000168] A inibição do crescimento do tumor até o dia 64 é mostrada na figura 7. Os dados mostram que o anticorpo seletivo para ANGPT2 Ang2i-LC06 era o anticorpo mais ativo (valor da TCR 0,55) no modelo de KPL-4. O Ang2i-LC06 era mais eficaz na inibição do crescimento do tumor do que o anticorpo MAb536 (valor da TCR 0,57) e o anticorpo reativo cruzado com ANGPT1, seletivo para ANGPT2, Ang2k-LC08 (valor da TCR 0,57).

Exemplo 7: Ligação à ANG-1 por meio de Biacore

[000169] A afinidade pela ligação à ANG-1 humana foi examinada com um ensaio Biacore: a huAng-1 foi imobilizada sobre um chip de biossensor CM5 usando a química de acoplamento de amina. A proteína foi injetada por 20 min em acetato de sódio, pH 4,5, a 10 μg/ml, em uma vazão de 5 μl/min. Isto resultou em uma densidade de superfície de aprox. 20000 RU. Sobre a célula de fluxo de referência, a BSA foi imobilizada sob as mesmas condições. Os anticorpos foram diluídos em HBS-P até 100 nM e injetados por 3 min (fase de associação). Após lavagem com tampão de corrida por 3 min (fase de dissociação), a superfície foi regenerada injetando hidróxido de sódio a 10 mM por 1 min a 5 μl/min. Os resultados são mostrados na figura. 8: o Ang2k_LC08 teve uma meiotempo de dissociação complexa de aproximadamente 50 s, o Ang2i_LC06 de aprox. 5 s e o Ang2i_LC10 não mostrou nenhuma ligação à ANG-1. Exemplo 8: Prevenção de metástase/tumores secundários in vivo em tumores primários que se espalham a) Prevenção de metástase/ secundários em camundongos xenoen- xertados com tumores primários Colo205

Linhagens celulares e condições de cultura:

[000170] As células de câncer colorretal humanas Colo205 foram originalmente obtidas da ATCC e, após expansão, depositadas no banco de células interno Penzberg da Roche. A linhagem de células de tumor foi rotineiramente cultivada em meio RPMI 1640 (PAA, Laboratories, Áustria) suplementado com 10% de soro bovino fetal (PAA, Laboratories, Áustria) e L-glutamina a 2 mM, a 37 °C, em uma atmosfera saturada com água, a 5% de CO2. A passagem 3 foi usada para a transplantação.

Animais:

[000171] Os camundongos fêmeas beges SCID; idade 4-5 semanas na chegada (adquiridos de Charles River Alemanha), foram mantidos sob condição sem patógeno específico, com ciclos diários de 12 h de luz/12 h de escuridão, de acordo com as diretrizes comprometidas (GV-Solas; Felasa; TierschG). O protocolo de estudo experimental foi revisto e aprovado pelo governo local. Após a chegada, os animais foram mantidos na parte de quarentena do recinto dos animais por uma semana, para acostumarem-se ao novo ambiente e para observação. O monitoramento contínuo da saúde foi realizado em base regular. Foram proporcionadas ração dietética (Provimi Kliba 3337) e água (pH acidificado 2,5-3) ad libitum. A idade dos camundongos no início do estudo era cerca de 10 semanas.

Injeção das células de tumor

[000172] No dia da injeção, as células de tumor Colo205 foram coletadas (tripsina-EDTA) dos frascos de cultura (Greiner) e transferidas para 50 ml de meio de cultura, lavadas uma vez e suspensas novamente em PBS. Após uma etapa de lavagem adicional com PBS e filtração (filtro de células; Falcon 0 100 μm), o título final das células foi ajustado para 2,5 x 107/ ml. A suspensão de células de tumor foi cuidadosamente misturada com a pipeta de transferência para evitar a agregação das células. Após isso, a suspensão de células foi inserida em uma seringa de tuberculina de 1,0 ml (Braun Melsungen) usando uma agulha grande (1,10 x 40 mm); para a injeção, o tamanho da agulha foi alterado (0,45 x 25 mm) e, para cada injeção, uma nova agulha era usada. A anestesia foi efetuada usando uma unidade de inalação da Stephens para animais pequenos, com câmara de pré-incubação (plexiglas), máscara para nariz de camundongo individual (silício) e composto de anestesia não inflamável ou explosivo Isoflurano (cp- pharma), em um sistema de circulação fechado. Dois dias antes da injeção, os animais foram raspados e, para a injeção das células, a pele dos animais anestesiados foi cuidadosamente suspensa com um fórceps anatômico e foram injetados 100 μl de suspensão de células (= 2,5 x 106células) subcutaneamente no lado direito dos animais. O crescimento do tumor dos tumores primários foi monitorado (dados não mostrados).

Monitoramento dos tumores secundários, por exemplo, no pulmão por Quantificação das sequências de Alu humanas

[000173] No término do estudo (dia 103), os pulmões foram coletados dos animais de todos os grupos. Resumidamente, as amostras foram transferidas imediatamente para o nitrogênio fluido. Em uma etapa adicional, o DNA total foi isolado das amostras com o Instrumento MagNA Pure LC de acordo com as instruções do fabricante. Os ini-ciadores específicos para Alu humanos foram escolhidos para a ampli-ficação seletiva das sequências de Alu por PCR quantitativa (instrumento LightCycler). (T. Schneider e col., Clin. Exp. Metas. 2002; 19: 571-582).

Tratamento dos animais

[000174] O tratamento dos animais com a Avastina (10 mg/kg i.p., uma vez por semana) foi iniciado 14 dias após a transplantação das células (estudo Ang2_PZ_Colo205_008), em um volume médio de tumor de 340 mm3. Após 7 semanas, os camundongos foram escolhidos a esmo para o tratamento secundário subsequente que começou no dia 51 com os compostos listados na tabela abaixo. Tratamento secundário iniciando no dia 51 do Estudo Ang2_PZ_Colo205_008.

[000175] Os resultados da prevenção de metástase/ tumores secundários (no pulmão) são listados na tabela abaixo e mostrados na figura 9A. Tabela 1: Quantificação do DNA de ALU humano nos pulmões de ca-mundongos originalmente contendo tumores primários Col205, após tratamento com diferentes anticorpos

[000176] Os resultados mostram uma prevenção claramente aperfeiçoada de tumores secundários/metástase pelo ANG2i-LC06 em comparação com a Avastina.

b) Prevenção de metástase/ secundários em camundongos xenoen- xertados com tumores primários KPL-4 Linhagens de células de tumor

[000177] As células de câncer de mama humanas KPL-4 (gentilmente fornecidas pelo Prof. J. Kurebayashi) foram estabelecidas a partir da efusão pleural maligna de uma paciente com câncer de mama com uma metástase da pele inflamatória. As células de tumor são rotineiramente cultivadas em meio DMEM (PAN Biotech, Alemanha) suplementado com 10% de soro bovino fetal (PAN Biotech, Alemanha) e L- glutamina a 2 mM (PAN Biotech, Alemanha), a 37 °C, em uma atmosfera saturada com água, a 5% de CO2. A passagem da cultura é efetuada com tripsina / EDTA 1x (PAN) separando-se três vezes / semana.

Camundongos

[000178] Após a chegada, os camundongos fêmeos beges SCID (idade 10-12 semanas; peso do corpo 18-20 g, Charles River, Sulzfeld, Alemanha) foram mantidos na parte de quarentena do recinto dos animais por uma semana, para acostumarem-se ao novo ambiente e para observação. O monitoramento contínuo da saúde foi realizado. Os camundongos foram mantidos sob condições SPF de acordo com as diretrizes internacionais (GV-Solas; Felasa; TierschG), com ciclos diários de 12 h de luz/12 h de escuridão. Foram proporcionadas ração dietética (Kliba Provimi 3347) e água (filtrada) ad libitum. O protocolo do estudo experimental foi revisto e aprovado pelo governo local (Regierung von Oberbayern; registro no 211.2531.2-22/2003).

Injeção das células de tumor

[000179] No dia da injeção, as células de tumor foram coletadas (tripsina-EDTA) dos frascos de cultura (Greiner TriFlask) e transferidas para 50 ml de meio de cultura, lavadas uma vez e suspensas novamente em PBS. Após uma etapa de lavagem adicional com PBS e filtração (filtro de células; Falcon 0 100 μm), o título final das células foi ajustado para 1,5 x 108/ ml. A suspensão de células de tumor foi cuidadosamente misturada com a pipeta de transferência para evitar a agregação das células. A anestesia é efetuada usando uma unidade de inalação da Stephens para animais pequenos, com câmara de pré- incubação (plexiglas), máscara para nariz de camundongo individual (silício) e composto de anestesia não inflamável ou explosivo Isoflura- no (Pharmacia-Upjohn, Alemanha), em um sistema de circulação fechado. Dois dias antes da injeção, o pelo dos animais foi raspado. Para a injeção i.m.f.p., as células foram injetadas de modo ortotópico, em um volume de 20 μl, no coxim gorduroso mamário inguinal penúltimo direito de cada camundongo anestesiado. Para a implantação ortotópi- ca, a suspensão de células foi injetada através da pele, sob o mamilo, usando uma seringa de microlitro Hamilton e uma agulha 30Gx1/2". O crescimento do tumor dos tumores primários foi monitorado (dados não mostrados).

[000180] No término do estudo (dia 103), os pulmões foram coletados dos animais de todos os grupos. Resumidamente, as amostras são transferidas imediatamente para o nitrogênio fluido. Em uma etapa adicional, o DNA total foi isolado das amostras com o Instrumento MagNA Pure LC de acordo com as instruções do fabricante. Os inicia-dores específicos para Alu humanos foram escolhidos para a amplifi-cação seletiva das sequências de Alu por PCR quantitativa (instrumento LightCycler). (T. Schneider e col., Clin. Exp. Metas. 2002; 19: 571582).

Tratamento dos animais

[000181] O tratamento dos animais foi iniciado 35 dias após a transplantação das células, em um volume de tumor médio de 60-160 mm3. Os compostos e o roteiro da dose são listados na tabela abaixo.

[000182] Os resultados da prevenção de metástase/ tumores secundários (no pulmão) são listados na tabela abaixo e mostrados na figura 9B. Tabela 2: Quantificação do DNA de ALU humano nos pulmões de ca- mundongos originalmente contendo tumores primários KPL4, após tra-tamento com diferentes anticorpos

[000183] Os resultados mostram uma prevenção muito eficiente de tumores secundários/metástase pelo ANG2i-LC06, pelo ANG2i-LC07, pelo ANG2k-LC08.

Exemplo 9: Efeitos no tratamento de retinopatia Métodos

[000184] Os cachorrinhos C57/B16 são adotados por fêmeas que amamentam CD1, e são expostos a 75% de oxigênio de P7 até P12 (controlador de oxigênio da câmara PRO-OX 110, Biospherix Ltd, Re-dfield, NY), o que induz a obliteração dos vasos e a cessação dos ca-pilares no centro da retina. Os cachorrinhos e as fêmeas que amamen-tam são colocados em ar normal, resultando em hipoxia relativa e na indução da neovascularização. Em P13, os cachorrinhos foram anes-tesiados usando isoflurano (5% de indução, 3% de manutenção com-binado com 1,5% de oxigênio) e o olho foi exposto e foram efetuadas injeções intraoculares de 1 μl usando uma seringa Nanofil adaptada com uma agulha de calibre 35 (WPI, Sarasota, FL) no olho esquerdo. Em P17, ambos os olhos foram dissecados, fixados em 4% de para- formaldeído, por 4 h, a 4°C, e as retinas foram dissecadas. As retinas foram permeabilizadas em PBS contendo 0,5% de Triton X-100 e 1% de soro albumina bovina, coloridas com 20 μg/ml de isolectina B4 bio- tinilada (Sigma Aldrich, Gillingham, UK) em PBS, pH 6,8, 1% de Triton- X100, CaCl2 a 0,1 mM, MgCl2 a 0,1 mM, seguidos por 20 μg/ml de ALEXA 488-estreptavidina (Molecular Probes, Eugene, OR), e montadas horizontalmente em Vectashield (Vector Laboratories, Burlingame, CA). As retinas foram representadas por imagens usando um microscópio de epifluorescência Nikon em ampliação de 4x. A quantificação das áreas neovascular e isquêmica foi efetuada em um modo às cegas usando Photoshop CS3 juntamente com Image J (NIH) e expressa como porcentagem da área retinal total (=normal+isquêmica+neovascular).

Resultados

[000185] A figura 10A mostra as retinas representativas montadas horizontalmente, com a vasculatura retinal visualizada por coloração com isolectina. As áreas isquêmicas do centro induzem a neovascula- rização e o crescimento novamente dos vasos retinais por suprarregu- lação dos indutores angiogênicos. A frente neovascular é hiperprolife- rativa, resultando em vasos sinuosos em um padrão de vaso irregular. As áreas mais externas contêm os vasos normais não afetados. A quantificação das montagens retinais horizontais mostrou que a inibição do VEGF com a Avastina reduziu a neovascularização retinal (ver a figura 10B, não injetado 36,7±1,8% até injetado 22,4±3.0%), conforme esperado. A inibição da Ang2 usando os anticorpos LC06 ou LC08 também resultou em uma redução na neovascularização (31,5±1,1% até 18,8±1,3% e 34,0±3,1% até 25,4±3,4%). A injeção de controle da Ig G humana não teve nenhum efeito sobre a neovascularização (ver a figura 10B, 38,3±1,1% a 38,3±0,8%).

Claims

1. Anticorpo ou fragmento de ligação do antígeno do mesmo que especificamente se liga à angiopoietina-2 (ANG-2) humana, caracterizado pelo fato de que: a) o domínio variável da cadeia pesada compreende uma região CDR3 de SEQ ID NO: 33, uma região CDR2 de SEQ ID NO: 34 e uma região CDR1 SEQ ID NO: 35, e b) o domínio variável da cadeia leve compreende uma região CDR3 de SEQ ID NO: 36, uma região CDR2 de SEQ ID NO: 37 e uma região CDR1 de SEQ ID NO: 38.

2. Anticorpo ou fragmento de ligação do antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender: a) o domínio variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 39; e b) o domínio variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 40.

3. Anticorpo ou fragmento de ligação do antígeno do mesmo, de acordo a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o anticorpo não se liga à Angiopoietina 1 (ANG-1) humana.

4. Anticorpo ou fragmento de ligação do antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo é da subclasse IgG4 humana ou é da subclasse IgG1 humana.

5. Composição farmacêutica, caracterizada por compreender um anticorpo ou fragmento de ligação de ligação do antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3.

6. Uso do anticorpo ou fragmento de ligação do antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento para prevenção de metástase.

7. Uso do anticorpo ou fragmento de ligação do antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer.

8. Uso do anticorpo ou fragmento de ligação do antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento para o tratamento de doenças vasculares.