MX2011005908A - Anticuerpos contra la angiopoyetina 2 humana. - Google Patents

Anticuerpos contra la angiopoyetina 2 humana.

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Abstract

La presente invención se refiere a anticuerpos contra la angiopoyetina 2 humana (anticuerpos anti-ANG-2), a métodos para su obtención, a composiciones farmacéuticas que contienen los anticuerpos y a usos de los mismos.

Description

ANTICUERPOS CONTRA LA ANGIOPOYETINA 2 HUMANA Campo de la Invención La presente invención se refiere a anticuerpos contra la angiopoyetina 2 humana (anticuerpos anti-ANG-2) , a métodos para su obtención, a composiciones farmacéuticas que contienen los anticuerpos y a usos de los mismos.
Antecedentes de la Invención La angiogénesis está implicada en la patogénesis de muchos trastornos que incluyen tumores sólidos, síndromes neovasculares intraoculares , por ejemplo las retinopatías proliferativas o degeneración macular debida a la edad (AMD) , artritis reumatoide y psoriasis (Folkman, J. et al., J. Biol. Chem. 267, 10931-10934, 1992; Klagsbrun, M. et al., Annu. Rev. Physiol. 53, (1991) 217-239; y Garner, A., Vascular diseases, In: Pathobiology of ocular disease, A dynamic approach, Garner, A. and Klintworth, G.K. (eds.), 2nd edition, Marcel Dekker, New York (1994) , pp. 1625-1710) . En el caso de los tumores sólidos, la neovascularización permite que las células tumorales adquieran ventaja de crecimiento y autonomía proliferativa, si se comparan con las células normales. Por lo tanto, se ha observado una correlación entre la densidad de microvasos en las secciones tumorales y la supervivencia de las pacientes de cáncer de mama así como en varios tumores más (Weidner, N . , et al., N. Engl . J. Med. 324 Ref.: 220111 (1991) 1-8; Horak, E.R., et al., Lancet 340 (1992) 1120-1124; and Macchiarini, P., et al., Lancet 340 (1992) 145-146).
ANG-2 y anticuerpos anti-ANG-2 La angiopoyetina-2 humana (ANG-2) (también abreviada con ANGPT2 o ANG2) (SEQ ID NO: 107) se ha descrito en Maisonpierre, P.C., et al., Science 277 (1997) 55-60 y Cheung, A.H., et al, Genomics 48 (1998) 389-91. Las angiopoyetinas-1 y -2 (ANG-1 (SEQ ID NO: 108) y ANG-2 (SEQ ID NO: 107)) se descubrieron como ligandos de las Ties, un grupo de tirosina quinasas que se expresa selectivamente dentro del endotelio vascular, Yancopoulos, G. D., et al., Nature 407 (2000) 242-48. f Hay cuatro componentes definitivos del grupo de la angiopoyetina. La angiopoyetina-3 y la -4 (Ang-3 y Ang-4) pueden representar oponentes muy divergentes del mismo lugar genético del ratón y del hombre, ver Kim, I., et al., FEBS Let, 443 (1999) 353-56; Kim, I., et al., J Biol Chem 274 (1999) 26523-28. La ANG-1 y la ANG-2 se identificaron inicialmente en ensayos de cultivo de tejido como agonista y antagonista, respectivamente (véase en cuanto a la ANG-1: Davies, S., et al., Cell, 87 (1996) 1161-1169; y en cuanto a la ANG-2: P.C., et al., Science 277 (1997) 55-60). Todas las angiopoyetinas conocidas se unen primariamente a la Tie2 y tanto la Ang-1 y como la -2 se unen a la Tie2 con una afinidad de 3 nM (Kd) , ver Maisonpierre, P. C, et al., Science 277 (1997) 55-60. Se ha constatado que la Ang-1 apoya la supervivencia EC y favorece la integridad endotelial, ver Davis, S., et al., Cell, 87 (1996) 1161-1169; Kwak, H.J., et al., FEBS Lett 448 (1999) 249-53; Suri, C, et al., Science 282 (1998) 468-71; Thurston, G. , et al . , Science 286 (1999) 2511-14; Thurston, G. , et al., Nat. Med. 6 (2000) 460-63, mientras que la ANG-2 tiene el efecto opuesto y favorece la desestabilización y la regresión de los vasos sanguíneos en ausencia de los factores de supervivencia VEGF o del factor de crecimiento de fibroblastos básico, ver Maisonpierre, P. C, et al., Science 277 (1997) 55-60. Sin embargo, muchos estudios de la función de la ANG-2 sugieren un panorama más complejo. Es posible que la ANG-2 sea un regulador complejo de la remodelación vascular que desempeña un papel tanto en la ramificación vascular como en la regresión vascular. En confirmación de estos roles de la ANG-2 , los análisis de expresión revelan que la ANG-2 se induce rápidamente, junto con el VEGF, en los inicios de la ramificación angiogénica en los adultos, mientras que la ANG-2 se induce en ausencia del VEGF en los inicios de la regresión vascular, ver Holash, J., et al., Science 284 (1999) 1994-98; Holash, J., et al., Oncogene 18 (1999) 5356-62. Consistente con un rol dependiente de contexto, la ANG-2 se une específicamente al mismo receptor endotelial específico, la Tie-2, que se activa con la Ang-1, pero que tiene efectos dependientes del contexto en su activación, ver Maisonpierre , P. C, et al., Science 277 (1997) 55-60.
Los ensayos de angiogénesis corneal han puesto de manifiesto que tanto la ANG-1 como la ANG-2 tienen efectos similares, que actúan de forma sinergética con el VEGF para favorecer el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos, ver Asahara, T. , et al., Circ. Res., 83, (1998) 233-40. La posibilidad de que haya una respuesta endotelial dependiente de la dosis surge de la observación de que in vitro en una concentración alta, la ANG-2 puede ser también proangiogénica, Kim, I., et al., Oncogene 19 (2000) 4549-52.
En una concentración elevada, la ANG-2 actúa como factor de supervivencia de apóptosis de las células endoteliales durante la apóptosis de privación en suero por activación de la Tie2 a través del mecanismos de la quinasa PI-3 y Akt, ver Kim, L, et al., Oncogene 19 (2000) 4549-52.
Otros ensayos in vitro sugieren que durante una exposición persistente, los efectos de la ANG-2 pueden derivar progresivamente de antagonista a agonista de la Tie2 y en puntos temporales posteriores, puede contribuir directamente a la formación de tubos vasculares y a la estabilización de los nuevos vasos, ver Teichert-Kuliszewska, K., et al., Cardiovasc. Res. 49 (2001) 659-70. Además, si las EC se cultivan en un gel de fibrina, se observa también la activación de la Tie2 con la ANG-2, lo cual sugiere que tal vez la acción de la ANG-2 depende del estado de diferenciación de la EC, ver Teichert-Kuliszewska; K. , et al., Cardiovasc. Res. 49 (2001) 659-70. En las EC microvasculares en cultivo en un gel de colágeno tridimensional, la ANG-2 puede inducir también la activación de la Tie2 y favorecer la formación de estructuras de tipo capilar, ver ochizuki, Y., et al., J. Cell. Sci. 115 (2002) 175-83. El uso de un cultivo simultáneo esferoidal de 3-D como modelo in vitro de maduración vascular demuestra que el contacto directo entre las EC y las células mesenquinales reduce la capacidad de respuesta al VEGF, mientras que la presencia del VEGF y la ANG-2 induce la ramificación, ver Korff, T., et al., Faseb J. 15 (2001) 447-57. Etoh, T. , et al. han demostrado que en las EC que expresan constitutivamente la Tie2, la expresión de las MMP-1, -9 y u-PA se incrementa en gran manera con la ANG-2 en presencia del VEGF, ver Etoh, T. , et al., Cáncer Res. 61 (2001) 2145-53.
Con un modelo de membrana de pupila in vivo, Lobov, I.B., et al han demostrado que la ANG-2 en presencia del VEGF endógeno favorece el rápido aumento del diámetro capilar, remodelando la lámina basal, la proliferación y migración de células endoteliales y estimula la ramificación de nuevos vasos sanguíneos, ver Lobov, I.B., et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 99 (2002) 11205-10. En cambio, la ANG-2 favorece la muerte de las células endoteliales y la regresión vascular sin VEGF endógeno, ver Lobov, I.B., et al., Proc . Nati. Acad. Sci. USA 99 (2002) 11205-10. De modo similar, con un modelo tumoral in vivo, Vajkoczy, P. et al. han demostrado que los agregados multicelulares inician el crecimiento vascular por ramificación angiogénica mediante la expresión simultánea del VEGFR-2 y de la ANG-2 en el hospedante y en el endotelio tumoral, Vajkoczy, P., et al., J. Clin. Invest. 109 (2002) 777-85. Este modelo ilustra que la microvasculatura establecida de tumores en crecimiento se caracteriza por una remodelación constante, mediada putativamente por la expresión del VEGF y de la ANG-2, ver Vajkoczy, M.A., et al., J Clin. Invest. 09 (2002) 777-85.
Los estudios en ratones agénicos de Tie-2 y angiopoyetina-1 indican fenotipos similares y sugieren que la fosforilación de la Tie-2 estimulada por la angiopoyetina-1 media en la remodelación y estabilización del vaso en desarrollo, favoreciendo la maduración del vaso sanguíneo durante la angiogénesis y el mantenimiento de la adhesión entre la célula y el soporte endotelial de la misma (Dumont, D.J., et al., Genes & Development, 8 (1994) 1897-1909; Sato, T.N., Nature, 376 (1995) 70-74; (Thurston, G. , et al., Nature Medicine 6 (2000) 460-463) . Se cree que el rol de la angiopoyetina-1 se conserva en el adulto, en el que se expresa de modo amplio y constitutivo (Hanahan, D. , Science, 277 (1997) 48-50; Zagzag, D., et al., Exp Neurology, 159 (1999) 391-400) . En cambio, la expresión de la angiopoyetina-2 se limita primariamente a los sitios de remodelación vascular, en los que se cree que bloquea la estabilización constitutiva o la función de maduración de la angiopoyetina-i, permitiendo que los vasos vuelvan a o permanezcan en un estado plástico, que puede ser una causa mayor de las señales de ramificación (Hanahan, D., 1997; Holash, J. , et al., Orzcogerze 18 (1999) 5356-62; Maisonpierre, P.C., 1997). Los estudios de expresión de la angiopoyetina-2 en la angiogénesis patológica han demostrado la existencia de muchos tipos de tumores que presentan expresión vascular de la angiopoyetina-2 (Maisonpierre, P. C, et al., Science 277 (1997) 55-60) . Los estudios funcionales sugieren que la angiopoyetina-2 interviene en la angiogénesis tumoral y está asociada con la sobreexpresión de la angiopoyetina-2 con incremento del crecimiento tumoral en un modelo de injerto ajeno (xenograft) en ratón (Ahmad, S.A., et al., Cáncer Res., 61 (2001)1255-1259). Otros estudios han asociado la sobreexpresión de la angiopoyetina-2 con la hipervascularización tumoral (Etoh, T., et al., Cáncer Res. 61 (2001) 2145-53; Tanaka, F . , et al . , Cáncer Res. 62 (2002) 7124-29) .
En los años recientes se han propuesto la angiopoyetina-1, la angiopoyetina-2 y/o la Tie-2 como posibles dianas para la terapia anti-cancerosa. Por ejemplo, en US 6,166,185, US 5,650,490 y US 5,814,464 se describen en cada caso anticuerpos ligando y receptor anti-Tie-2. En los estudios que emplean la Tie-2 soluble se describe que esta disminuye el número y el tamaño de los tumores en roedores (Lin, P, 1997; Lin, P., 1998). Siemester, G. , et al. (1999) han generado líneas celulares de melanoma humano que expresan el dominio extracelular de la Tie-2, las han inyectado a ratones sin pelo y han publicado que la Tie-2 soluble produce una inhibición significativa del crecimiento tumoral y de la angiogénesis tumoral. Dado que tanto la angiopoyetina-1 como la angiopoyetina-2 se fijan sobre la Tie-2, no queda claro en estos estudios si la angiopoyetina-1, la angiopoyetina-2 o la Tie-2 podrían ser dianas atractivas para una terapia anticancerosa. Sin embargo, se cree que una terapia eficaz anti-angiopoyetina-2 sería beneficiosa para tratar enfermedades tales como el cáncer, cuya progresión depende de la angiogénesis aberrante, en ellas el bloqueo del proceso podría conducir a la prevención del progreso de la enfermedad (Folkman, J. , Nature Medicine. 1, (1995) 27-31.
Además, algunos grupos han publicado artículos sobre el uso de anticuerpos y péptidos que se fijan sobre la angiopoyetina-2, véase, por ejemplo, US 6,166,185 y US 2003/ 10124129; WO 03/030833, WO 2006/068953, WO 03/057134 o US 2006/0122370.
En el estudio de la expresión focal de la angiopoyetina-2 se ha demostrado que antagonizando la señal de la angiopoyetina-l/Tie-2 se afloja la estructura vascular cerrada, exponiendo las EC a las señales de activación de los inductores de la angipgénesis , p.ej. del VEGF (Hanahan, 1997) . Este efecto pro-angiogénico resultante de la inhibición de la angiopoyetina-1 indica que la terapia anti-angiopoyetina-1 no sería un tratamiento anti-canceroso eficaz .
La ANG-2 se expresa durante el desarrollo en sitios, en los que tiene lugar una remodelación de los vasos sanguíneos, véase Maisonpierre, P.C., et al., Science 277 (1997) 55-60. En los individuos adultos, la expresión de la ANG-2 se restringe a los sitios de remodelación vascular así como a los tumores muy vascularizados , incluidos el glioma Osada, H., et al., Int. J. Oncol. 18 (2001) 305-09; Koga, K. , et al., Cáncer Res. 61 (2001) 6248-54, carcinoma hepatocelular Tanaka, S., et al, J. Clin. Invest. 103 (1999) 341-45, carcinoma gástrico Etoh, T., et al., Cáncer Res. 61 (2001) 2145-53; Lee, J.H., et al, Int. J. Oncol. 18 (2001) 355-61, tumor de tiroides (Bunone, G., et al., Am J Pathol 155 (1999) 1967-76, cáncer de pulmón no de células pequeñas Wong, M. P., et al., Lung Cáncer 29 (2000) 11-22, cáncer de colon (Ahmad, S.A., et al., Cáncer 92 (2001) 1138-43, y cáncer de próstata (Wurmbach, J.H., et al., Anticancer Res. 20 (2000) 5217-20.). Se ha observado que algunas células tumorales expresan la ANG-2. Por ejemplo, Tanaka, S., et al., J. Clin. Invest. 103 (1999) 341-45 han detectado el ARNm de la ANG-2 en 10 de 12 muestras de carcinoma hepatocelular humano (HCC) . El grupo de Ellis ha publicado que la ANG-2 se expresa de forma omnipresente en el epitelio tumoral, ver Ahmad, S. A., et al., Cáncer 92 (2001) 1138-43. Otros investigadores han obtenido resultados similares, ver Chen, L. , et al., J. Tongji Med. Univ. 21 (2001) 228-30, 235 (2001) . Cuando detectaban los niveles de ARNm de la ANG-2 en muestras archivadas de cáncer de mama humano, Sfilogoi, C, . et al., Int. J. Cáncer 103 (2003) 466-74 encontraron que el ARNm de la ANG-2 está asociado de modo significativo con la invasión de nodulos linfáticos auxiliares, con períodos de tiempo cortos sin enfermedad e intervalos cortos de supervivencia global, ver Tanaka, F., et al . , Cáncer Res. 62 (2002) 7124-29 que revisaron un total de 236 pacientes de cáncer de pulmón no de células pequeñas (NSCLC) con estadios patológicos de I a IIIA, respectivamente. Aplicando la inmunohistoquímica encontraron que el 16.9% de los pacientes de NSCLC son positivos de la ANG-2. La densidad de los microvasos en el tumor positivo de ANG-2 es significativamente mayor que en el caso de los tumores negativos de ANG-2. Este efecto angiogénico de la ANG-2 se observa únicamente cuando la expresión del VEGF es elevada. Es más, la expresión positiva de la ANG-2 es un factor significativo para predecir una corta supervivencia postoperativa, ver Tanaka, F. , et al., Cáncer Res. 62 (2002) 7124-29. Sin embargo no encontraron una correlación significativa entre la expresión de la Ang-1 y la densidad de los microvasos, ver Tanaka, F. , et al., Cáncer Res. 62 (2002) 7124-29. Estos resultados sugieren que la ANG-2 es un indicador de pacientes de pronóstico "pobre" de varios tipos de cáncer.
En fechas recientes, aplicando un modelo de ratón agénico de A G-2, el grupo de Yancopoulos ha publicado que la ANG-2 se requiere para la angiogénesis postnatal, Gale, N. W., et al., Dev. Cell 3 (2002) 411-23. Han demostrado que la regresión programada para el desarrollo de la vasculatura hialoide del ojo no se produce en los ratones "knockout" de la ANG-2 y los vasos sanguíneos de sus retinas no consiguen ramificarse a partir de la arteria central de la retina, Gale, N. ., et al., Dev. Cell 3 (2002) 411-23. Han descubierto además que la deleción de la ANG-2 se traduce en defectos profundos de modelado y de funcionamiento de la vasculatura linfática, ver Gale, N. ., et al., Dev. Cell 3 (2002) 411-23. El rescate genético con la Ang-1 corrige los defectos linfáticos, pero no los de la angiogénesis, ver Gale, N.W., et al., Dev. Cell 3 (2002) 411-23.
Peters y sus colegas han publicado que la Tie2 soluble, cuando se libera en forma de proteína recombinante o en un vector de expresión vírico, inhibe in vivo el crecimiento del carcinoma de mama murino y del melanoma en modelos con ratones, Lin, P., et al., Proc . Nati. Acad. Sci. USA 95 (1998) 8829-34; Lin , P., et al., J. Clin. Invest. 100 (1997) 2072-78. Las densidades vasculares de los tejidos así tratados se reducen en gran manera. Además, la angiogénesis bloqueada con Tie2 soluble en la córnea de rata estimulada con medio acondicionado con células tumorales, ver Lin, P. , et al., J. Clin. Invest. 100 (1997) 2072-78. Además, Isner y su equipo han demostrado que la adición de la ANG-2 al VEGF favorece de modo significativo una neovascularizacion circunferencial mayor y más prolongada que el VEGF solo, ver Asahara, T., et al., Circ. Res., 83 (1998) 233-40. El exceso de receptor de Tie2 soluble impide la modulación de la neovascularización inducida por el VEGF causada por la ANG-2, ver Asahara, T. , et al., Circ. Res., 83, (1998) 233-40. Siemeister, G., et al., Cáncer Res. 59 (1999) 3185-91 han demostrado con injertos ajenos a ratón sin pelo que la sobreexpresión de los dominios extracelulares de fijación sobre ligando de la Flt-1 o de la Tie2 en los injertos ajenos se traduce en una inhibición significativa del mecanismo que no puede compensarse con el otro, lo cual sugiere que el mecanismo del receptor del VEGF y el mecanismo de la Tie2 deberían considerarse como dos mediadores independientes, esenciales para el proceso de la angiogénesis in vivo, ver Siemeister, G. , et al., Cáncer Res. 59 (1999) 3185-91. Esto se ha confirmado en una publicación más reciente de White, R.R., et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 100 (2003) 5028-33. En su estudio se ha demostrado que un aptámero de ARN resistente a la nucleasa, que se une específicamente e inhibe a la . ANG-2, inhibe de modo significativo la neovascularización inducida por el bFGF en el modelo de angiogénesis en la microbolsa de la córnea de la rata.
Sumario de la Invención La invención comprende un anticuerpo que se une específicamente a la angiopoyetina-2 humana (ANG-2) , caracterizado porque como región CDR3 de dominio variable de cadena pesada contiene una región CDR3 de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 41, o SEQ ID NO: 49.
Preferiblemente el anticuerpo se caracteriza en que: a) el dominio variable de cadena pesada contiene una región CDR3 de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO : 41, o SEQ ID NO: 49, una región CDR2 de la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 42, o SEQ ID NO: 50, y una región CDR1 de la SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 43, O SEQ ID NO: 51 y b) el dominio variable de cadena ligera contiene una región CDR3 de la SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 44, O SEQ ID NO: 52, una región CDR2 de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 45, O SEQ ID NO: 53, y una región CDR1 de la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 46, o SEQ ID NO: 54.
Preferiblemente el anticuerpo se caracteriza preferiblemente porque comprende: a) el dominio variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 47, o SEQ ID NO: 55; y b) el dominio variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 48, O SEQ ID NO: 56.
El anticuerpo se caracteriza preferiblemente porque el anticuerpo no se une específicamente a la angiopoyetina 1 (ANG-1) .
Otra modalidad de la invención comprende una composición farmacéutica que contiene un anticuerpo de conformidad con la invención.
Otra modalidad de la invención es el uso de un anticuerpo de conformidad con la invención para la fabricación de una composición farmacéutica.
Otra modalidad de la invención es el uso de un anticuerpo de conformidad con la invención para la prevención de metástasis.
Otra modalidad de la invención es el uso de un anticuerpo de conformidad con la invención para el tratamiento del cáncer.
Otra modalidad de la invención es el uso de un anticuerpo de conformidad con la invención para el tratamiento de enfermedades vasculares .
Otra modalidad de la invención es el uso de un anticuerpo de conformidad con la invención para el tratamiento de la retinopatía.
Otra modalidad de la invención es un ácido nucleico que codifica al dominio variable de cadena pesada y/o al dominio variable de cadena ligera de un anticuerpo de conformidad con la invención.
La invención proporciona además vectores de expresión que contienen ácido nucleico de conformidad con la invención capaz de expresar el ácido nucleico en una célula hospedante procariota o eucariota y las células hospedantes que contienen los vectores para la producción recombinante de un anticuerpo de este tipo.
La invención se refiere además a una célula hospedante procariota o eucariota que contiene un vector de conformidad con la invención.
La invención se refiere además a un método para la producción de un anticuerpo recombinante humano o humanizado de conformidad con la invención, caracterizado porque se expresa un ácido nucleico de conformidad con la invención en una célula hospedante procariota o eucariota y se recupera el anticuerpo de la célula o el líquido sobrenadante del cultivo celular. La invención se refiere además al anticuerpo que puede obtenerse por tal método recombinante .
Los anticuerpos de conformidad con la invención son útiles en especial para la prevención de tumores secundarios/metástasis o para el tratamiento de enfermedades vasculares, por ejemplo las retinopatías .
La invención se refiere a un anticuerpo que se une específicamente a la angiopoyetina-2 humana (&NG-2) , caracterizado porque como región CDR3 de dominio variable de cadena pesada contiene una región CDR3 de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 41, o SEQ ID NO : 49.
En una modalidad de la invención, el anticuerpo se caracteriza porque a) el dominio variable de cadena pesada contiene una región CDR3 de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 41, o SEQ ID NQ: 49, una región CDR2 de la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO : 42, o SEQ ID NO: 50, y una región CDR1 de la SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NQ: 43, o SEQ ID NO: 51 y b) el dominio variable de cadena ligera contiene una región CDR3 de la SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 44, o SEQ ID NO: 52, una región CDR2 de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 45, o SEQ ID NO: 53, y una región CDR1 de la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 46, o SEQ ID NO: 54.
Preferiblemente el anticuerpo se caracteriza porque comprende a) el dominio variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 47, o SEQ ID NO: 55; y b) el dominio variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 48, o SEQ ID NO: 56.
Otra modalidad de la invención es un anticuerpo que se une específicamente a la ANG-2 humana, que se caracteriza porque el anticuerpo no se une específicamente a la angiopoyetina 1 humana (ANG-1) . Los anticuerpos típicos, que se unen específicamente a la ANG-2 humana,- pero no a la ANG-1 humana, son p.ej. el Ang2s_R3_LC03 , Ang2s_LC09, Ang2i_LC06, Ang2i_LC07, o los anticuerpos que se unen al mismo epítopo que el Ang2s_R3_LC03 , Ang2s_LC09, Ang2i_LC06, Ang2i_LC07, Ang2i_LC10, preferiblemente los que se unen al mismo epítopo que el Ang2i_LC06. Por tanto, en una modalidad de la invención, el anticuerpo se une específicamente a la angiopoyetina-2 humana (ANG-2) pero no se une a la ANG-1 humana por el mismo epítopo que el Ang2s_R3_LC03 , Ang2s_LC09, Ang2i_LC06, Ang2i_LC07, Ang2i_LC10, preferiblemente por el mismo epítopo que el Ang2i_LC06. Tales anticuerpos que se unen específicamente a la ANG-2, pero no a la ANG-1 pueden tener propiedades mejoradas, tal como eficacia, menor toxicidad, propiedades farmacocinéticas, si se comparan con los anticuerpos específicos de la ANG-2 y de la ANG-1.
Por lo tanto, en una modalidad de la invención, el anticuerpo, que se une específicamente a la angiopoyetina-2 humana (ANG-2) pero no a la ANG-1 humana, se caracteriza porque: a) el dominio variable de cadena pesada contiene una región CDR3 de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 33, o SEQ ID NO: 49, una región CDR2 de la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO : 34, o SEQ ID NO: 50, y una región CDR1 de la SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 35, o SEQ ID NO: 51 y b) el dominio variable de cadena ligera contiene una región CDR3 de la SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 36, o SEQ ID NO: 52, una región CDR2 de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 37, O SEQ ID NO: 53, y una región CDR1 de la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 38, o SEQ ID NO: 54.
Preferiblemente, el anticuerpo que se une específicamente a la angiopoyetina-2 humana (ANG-2) pero no a la ANG-1 humana, se caracteriza en que comprende a) el dominio variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 39, O SEQ ID NO: 55; y b) el dominio variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 40, O SEQ ID NO: 56.
En una modalidad, el anticuerpo de conformidad con la invención se caracteriza porque a) el dominio variable de cadena pesada contiene una región CDR3 de la SEQ ID NO: 1, o SEQ ID NO: 9, una región CDR2 de la SEQ ID NO: 2, o SEQ ID NO: 10, y una región CDR1 de la SEQ ID NO: 3, o SEQ ID NO: 11 y b) el dominio variable de cadena ligera contiene una región CDR3 de la SEQ ID NO: 4, o SEQ ID NO: 12, una región CDR2 de la SEQ ID NO: 5, o SEQ ID NO: 13, y una región CDR1 de la SEQ ID NO: 6, o SEQ ID NO: 14.
En una modalidad, el anticuerpo de conformidad con la invención se caracteriza porque comprende: a) el dominio variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 7, o SEQ ID NO: 15; y b) el dominio variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 8, o SEQ ID NO: 16.
En una modalidad, tal anticuerpo de conformidad con la invención se caracteriza porque a) el dominio variable de cadena pesada contiene una región CDR3 de la SEQ ID NO: 1, una región CDR2 de la SEQ ID NO: 2, y una región CDR1 de la SEQ ID NO: 3 y b) el dominio variable de cadena ligera contiene una región CDR3 de la SEQ ID NO: 4, una región CDR2 de la SEQ ID NO: 5, y una región CDR1 de la SEQ ID NO: 6.
En una modalidad, el anticuerpo de conformidad con la invención se caracteriza porque contiene: a) el dominio variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 7; y b) el dominio variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 8.
En una modalidad, el anticuerpo de conformidad con la invención se caracteriza porque a) el dominio variable de cadena pesada contiene una región CDR3 de la SEQ ID NO: 17, una región CDR2 de la SEQ ID NO: 18, y una región CDR1 de la SEQ ID NO: 19 y b) el dominio variable ~ de cadena ligera contiene una región CDR3 de la SEQ ID NO: 20, una región CDR2 de la SEQ ID NO: 21, y una región CDR1 de la SEQ ID NO: 22.
En una modalidad, el anticuerpo de conformidad con la invención se caracteriza porque comprende: a) el dominio variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 23; y b) el dominio variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 2 .
Preferiblemente el anticuerpo de conformidad con la invención se caracteriza preferiblemente porque el anticuerpo es del subgrupo IgGl humano o es del subgrupo IgG4 humano.
El término "anticuerpo" abarca las diversas formas de estructuras de anticuerpo, incluidos, pero sin limitarse a ellos: los anticuerpos totales y los fragmentos de anticuerpo. El anticuerpo de conformidad con la invención es preferiblemente un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico o incluso un anticuerpo de ingeniería genética, en el supuesto de que conserve las propiedades características de conformidad con la invención.
Los "fragmentos de anticuerpo" contienen una porción de un anticuerpo de longitud completa, preferiblemente el dominio variable del mismo, o por lo menos el sitio del mismo que se une al antígeno. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen a los diacuerpos, las moléculas de anticuerpo de cadena simple (scFv o scFab) y los anticuerpos multiespecíficos (p.ej. biespecíficos) formados a partir de fragmentos de anticuerpo. Los fragmentos scFv se han descrito, p.ej. en Houston, J. S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-88) . Además, los fragmentos de anticuerpo contienen polipéptidos de cadena simple que tienen las características del dominio VH, es decir, que son capaces de combinarse con el dominio VL, o las del dominio VL que se une a la ANG-2, es decir, que son capaces de combinarse con el dominio VH para formar un sitio de fijación funcional sobre el antígeno y, de este modo, aportar esta propiedad. Los scFv pueden estabilizarse p.ej. con a) estabilización con disulfuro (véase p.ej. en in WO 94/029350, Rajagopal, V., et al., Prot . Engin. (1997) 1453-59; Kobayashi, H. , et al., Nuclear Medicine & Biology, Vol . 25, (1998) 387-393; or Schmidt, M . , et al., Oncogene (1999) 18 1711-1721.) o con b) estructuras estabilizadas (p.ej. con mutaciones específicas de estructuras estabilizadas específicas, véase p.ej. WO 2007/109254, p.ej. US7,258,985, Furrer, F . , et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50 (2009), pp. 771-778 or Ottiger, M . , et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50 (2009), pp. 779-786.
Los términos "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal" se emplean aquí para indicar una preparación de moléculas de anticuerpo de una composición simple de aminoácidos.
El término "anticuerpo quimérico" indica un anticuerpo que contiene una región variable, es decir, una región de fijación, de una fuente o especie y por lo menos una porción de una región constante derivada de una fuente o especie diferente, obtenido habitualmente por técnicas de ADN recombinante . Son preferidos los anticuerpos quiméricos que contienen una región variable murina y una región constante humana. Otras formas preferidas de los "anticuerpos quiméricos" contemplados en la presente invención son aquellas, en las que la región constante se ha modificado o cambiado con respecto a la del anticuerpo original para generar las propiedades de conformidad con la invención, especialmente con respeto a la fijación sobre Clq y/o la fijación sobre el receptor de Fe (FcR) . Tales anticuerpos quiméricos se denominan también "anticuerpos cambiados de grupo" . Los anticuerpos quiméricos son el producto de genes de inmunoglobulina expresados que contienen segmentos de ADN que codifican regiones variables de inmunoglobulina y segmentos de ADN que codifican regiones constantes de inmunoglobulina. Los métodos para producir anticuerpos quiméricos ' incluyen las técnicas convencionales de ADN recombinante y de transfección genética, que los expertos conocen bien, véase p.ej. Morrison, S.L., et al., Proc . Nati. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855; US 5,202,238 and US 5, 204, 244.
El término "anticuerpo humanizado" se refiere a anticuerpos en las que las regiones de estructura o "regiones determinantes de complementariedad" (CDR) se han modificado para que contengan la CDR de una inmunoglobulina de especificidad diferente con respecto a la de la inmunoglobulina original. En una modalidad preferida, se injerta una CDR murina en la región de estructura de un anticuerpo humano para obtener el "anticuerpo humanizado" , véase p.ej. Riechmann, L., et al., Nature -332 (1988) 323-327; and Neuberger, M.S., et al., Nature 314 (1985) 268-270. Las CDR especialmente preferidas corresponden a las que representan secuencias que reconocen a los antígenos antes mencionados de los anticuerpos quiméricos. Otras formas de "anticuerpos humanizados" contemplados en la presente invención son aquellas, en las que la región constante se ha modificado o cambiado adicionalmente con respecto al anticuerpo original para generar propiedades de conformidad con la invención, en especial en lo que respecta a la unión con el Clq y/o a la unión con el receptor de Fe (FcR) .
El término "anticuerpo humano" se emplea aquí para indicar anticuerpos que tienen regiones variables y constantes derivadas de las secuencias de inmunoglobulina de linea germinal humana. Los anticuerpos humanos son bien conocidos en el estado de la técnica (van Dijk, M.A. , and van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Chem. Biol . 5 (2001) 368-374). Los anticuerpos humanos pueden obtenerse también en animales transgénico (p.ej., ratones) que, después de la inmunización, son capaces de producir un repertorio completo o una selección de anticuerpos humanos en ausencia de producción endógena de inmunoglobulina. La transferencia de la disposición genética de la inmunoglobulina de la línea germinal humana a tales ratones mutantes de línea germinal puede traducirse en la producción de anticuerpos humanos después del contacto con el antígeno (ver, p.ej., Jakobovits, A., et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90 (1993) 2551-2555; Jakobovits, A., et al., Nature 362 (1993) 255-258; Brueggemann, M., et al., Year Immunol . 7 (1993) 33-40). Los anticuerpos humanos pueden producirse también en bibliotecas de exposición de fagos (Hoogenboom, H. R. , and Winter, G. , J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388; Marks , J.D., et al., J. Mol. Biol. 222 (1991) 581-597). Se dispone también de las técnicas de Colé, S.P.C. et al. y de Boerner et al. para la obtención de anticuerpos monoclonales humanos (Colé, S.P.C, et al., Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Liss, A.R., (1985) 77-96; and Boerner, P., et al., J. Immunol. 147 (1991) 86-95) . Tal como se ha mencionado antes para los anticuerpos quiméricos y humanizados de conformidad con la invención, el término "anticuerpo humano" se emplea aquí para indicar los anticuerpos que se han modificado en la región constante para generar propiedades de conformidad con la invención, en especial en lo que respecta a la unión al Clq y/o a la unión al FcR, p.ej. por "cambio de grupo", es decir, cambio o mutación de partes del Fe (p.ej. de la IgGl a la IgG4 y/o mutación IgGl/lgG4) .
El término "anticuerpo humano recombinante" se emplea aquí para indicar todos los anticuerpos humanos que se obtienen, expresan, crean o aislan por medios recombinantes, como son los anticuerpos aislados de una célula hospedante por ejemplo una célula NSO o CHO o de un animal (p.ej. un ratón) que sea transgénico en cuanto a los genes de la inmunoglobulina humana o los anticuerpos expresados empleando un vector de expresión recombinante transfectado a una célula hospedante. Tales anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables y constantes en una forma reordenada. Los anticuerpos humanos recombinantes de conformidad con la invención se han sometido a una hipermutación somática in vivo. Por tanto, las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL del anticuerpo recombinante son secuencias que, en cuanto derivadas de y relacionadas con las secuencias VH y VL de línea germinal humana, no pueden existir de modo natural en del repertorio de líneas germinales de anticuerpos humanos in vivo.
El "dominio variable" (dominio variable de una cadena ligera (VL) , región variable de una cadena pesada (VH) se emplea aquí para indicar cada uno de los pares de cadenas cortas y largas que intervienen directamente en la fijación del anticuerpo sobre el antígeno. Los dominios de cadenas variables humanas, cortas y largas, tienen la misma estructura general y cada dominio contiene cuatro regiones de estructura (FR) , cuyas secuencias están muy conservadas, conectadas por tres "regiones hipervariables" (o regiones determinantes de complementariedad, CDR) . Las regiones estructurales adoptan una conformación de lámina ß y las CDR pueden formar bucles que conecten la estructura de lámina ß. Las CDR de cada cadena se mantienen en su estructura tridimensional gracias a las regiones de estructura y junto con las CDR de la otra cadena forman el sitio de fijación sobre el antígeno. Las regiones CDR3 de cadena pesada y corta del anticuerpo desempeñan un rol especialmente importante en la especificidad de unión/afinidad de los anticuerpos de conformidad con la invención y por ello constituyen otro objeto de la invención.
El término "porción de un anticuerpo que se fija sobre el antígeno" se emplea aquí para indicar restos aminoácido de un anticuerpo que son los que efectúan la unión al antígeno. La porción de un anticuerpo que se fija sobre el antígeno comprende los restos aminoácido de las "regiones determinantes de complementariedad" o "CDR" . Las regiones de "estructura" o regiones "FR" son aquellas regiones de dominio variable distintas de los residuos de región hipervariable aquí definidos. Por tanto, los dominios variables de cadenas ligeras y cortas de un anticuerpo abarcan desde el N-terminal al C-terminal de los dominios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, y FR4. En especial, la CDR3 de cadena pesada es la región, que contribuye en mayor grado a la fijación sobre el antígeno y es la que define las propiedades del anticuerpo. Las regiones CDR y FR se determinan con arreglo a la definición estándar de Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) y/o aquellos restos de un "bucle hipervariable" .
Los términos "ácido nucleico" o "molécula de ácido nucleico" , se emplean aquí para incluir las moléculas de ADN y las de ARN. Una molécula de ácido nucleico puede ser de hebra simple o de hebra doble, pero es preferiblemente un ADN de hebra doble.
El término "aminoácido" se emplea en esta solicitud para indicar un grupo de a-carboxi-aminoácidos de origen natural, que comprenden la alanina (código de tres letras: ala, código de una letra: A) , arginina (arg, R) , asparagina (asn, N) , ácido aspártico (asp, D) , cisteína (cys, C) , glutamina (gln, Q) , ácido glutámico (glu, E) , glicina (gly, G) , histidina (his, H) , isoleucina (ile, I) , leucina (leu, L) , lisina (lys, K) , metionina (met, M) , fenilalanina (phe, F) , prolina (pro, P) , serina (ser, S) , treonina (thr, T) , triptófano (trp, ) , tirosina (tyr, Y) y valina (val, V) .
Un ácido nucleico está "unido operativamente" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN de una pre-secuencia o líder secretorio está unido operativamente con un ADN de un polipéptido si se expresa como pre-proteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o intensificador está unido operativamente con una secuencia codificadora si afecta la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión de un ribosoma está unido operativamente con una secuencia codificadora si está posicionado de tal manera que facilita la traducción. En general, "unido operativamente" significa que las secuencias de ADN que se van a unir son contiguas, y, en el caso de un líder secretorio, son contiguas y están dentro del marco de lectura. Sin embargo, los intensificadores no tienen que estar contiguos. La unión se realiza por ligación en sitios de restricción oportunos. Si no existen tales sitios, se emplearán adaptadores o engarces oligonucleótidos sintéticos con arreglo a la práctica convencional .
Tal como se emplean aquí, las expresiones "célula", "línea celular" y "cultivo celular" se emplean indistintamente y todas las denominaciones incluyen la progenie. Por tanto, las palabras "transformantes" y "células transformadas" incluyen la célula objeto primaria y los cultivos derivados de la misma con independencia del número de transferencias. Se da también por supuesto que toda la progenie puede que no sea exactamente idéntica en cuanto al contenido de ADN, debido a las mutaciones deliberadas o inadvertidas. Se incluye la progenie variante que tiene la misma función o actividad biológica que se ha explorado en la célula transformada original. Cuando existan distintas denominaciones, su significado resultará claro por el contexto.
Tal como se emplea aquí, el término "unión" o "fijación específica" indica la unión del anticuerpo a un epítopo del antígeno (la ANG-2) en un ensayo in vitro, preferiblemente en un ensayo de resonancia de plasmón (BIAcore, GE-Healthcare Upsala, Suecia) (ejemplo 3) con el antígeno ANG-2 de tipo salvaje purificado. La afinidad de la unión se define en términos ka (constante de velocidad de asociación del anticuerpo del complejo de anticuerpo/antígeno) , kD (constante de disociación) y KD (kD/ka) . La unión o fijación específica indica una afinidad de unión (KD) de 10"8 moles/1 o menos, preferiblemente de 10"9 M a 10"13 moles/1.
La unión del anticuerpo con el FCYRIII puede investigarse mediante un ensayo BIAcore (GE-Healthcare, Upsala, Suecia) . La afinidad de la unión se define mediante los términos ka (constante de velocidad de asociación del anticuerpo del complejo de anticuerpo/antígeno) , kD (constante de disociación) y KD (kD/ka) .
Tal como se emplea aquí, el término "que no se une a la ANG-1" o "que no se une específicamente a la ANG-1" indica que el anticuerpo tiene un valor EC50 superior a 8000 ng/ml en un ensayo ELISA in vitro de fijación sobre la A G-1 (de acuerdo con el ejemplo 2) .
El término "epitopo" incluye cualquier determinante polipeptídico capaz de la unión especifica con un anticuerpo. En ciertas formas de ejecución, el determinante epitopo incluye a grupos de moléculas de superficie químicamente activos, como son los aminoácidos, cadenas laterales de azúcar, fosforilo o sulfonilo y, en ciertas formas de ejecución, pueden tener características estructurales tridimensionales específicas y/o características específicas de carga. Un epitopo es una región de un antígeno que está unida a un anticuerpo.
La "parte Fe" de un anticuerpo no interviene directamente en la fijación de un anticuerpo sobre un antígeno, pero presenta varias funciones efectoras. La "parte Fe de un anticuerpo" es un término que los expertos ya conocen y se define en base a la descomposición de anticuerpos con papaína. En función de la secuencia de aminoácidos de sus cadenas ligeras, los anticuerpos o inmunoglobulinas se dividen en los siguientes grupos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varios de ellos pueden subdividirse a su vez en subgrupos (isotipos) , p.ej. IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4; IgAl e IgA2. De acuerdo con las regiones constantes de cadena pesada, los diferentes grupos de inmunoglobulinas se denominan , d, e, ? y µ, respectivamente. La parte Fe de un anticuerpo interviene directamente en la ADCC (citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo) y CDC (citotoxicidad dependiente de complemento) basada en la activación de complemento, la unión a Clq y la unión al receptor de Fe. La activación de complemento (CDC) se inicia con la unión del factor de complemento de Clq sobre la parte Fe de la mayoría de los subgrupqs de anticuerpos IgG. La influencia de un anticuerpo sobre el sistema de complemento depende de ciertas condiciones, mientras que la unión sobre el Clq se debe a sitios de unión definidos existentes en la parte Fe. Estos sitios de unión ya son conocidos en el arte previo y se han descrito p.ej. en Boakle, R. J. , et al., Nature 282 (1975) 742-743, Lukas, T.J., et al., J. Immunol . 127 (1981) 2555-2560, Brunhouse, R. , and Cebra, J. J. , Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917, Burton, D.R., et al., Nature 288 (1980) 338-344, Thommesen, J.E., et al., Mol. Immunol. 37 (2000) 995-1004, Idusogie, E.E., et al., J. Immunol.164 (2000) 4178-4184, Hezareh, M . , et al., J. Virology 75 (2001) 12161-12168, Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319-324, EP 0307434. Estos sitios de unión son p.ej. el L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 y P329 (numeración con arreglo al índice EU de Kabat, ver más abajo) . Los anticuerpos del subgrupo IgGl, IgG2 e IgG3 presentan normalmente activación de complemento y fijación sobre Clq y C3, mientras que la IgG4 no activa el sistema de complemento y no se fija sobre el Clq ni el C3.
El anticuerpo de conformidad con la invención comprende preferiblemente una parte Fe de origen humano, que es una parte Fe de un anticuerpo humano del subgrupo igGl.
El anticuerpo de conformidad con la invención se caracteriza porque las cadenas constantés son de origen humano. Estas cadenas constantes son bien conocidas en el arte previo y se han descrito p.ej. en Kabat, E.A. (ver por ejemplo Johnson, G. and Wu, T. T. , Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218) . Por ejemplo, una región constante de cadena pesada humana útil comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 57 o de la SEQ ID NO: 58. Por ejemplo, una región constante de cadena ligera humana útil comprende una secuencia de aminoácidos de una región constante de cadena ligera kappa de la SEQ ID NO: 59, o de una región constante de cadena ligera lambda de la SEQ ID NO: 60.
El término "región constante" se emplea en la presente solicitud para indicar la suma de los dominios de un anticuerpo distintos a la región variable. La región constante no participa directamente en la unión sobre un antígeno, pero posee varias funciones efectoras. En función de la secuencia de aminoácidos de la región constante de sus cadenas ligeras, los anticuerpos se dividen en los subgrupos: IgA, IgD, IgE, igG e IgM y varios de ellos pueden dividirse a su vez en subgrupos, por ejemplo el IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4; IgAl e IgA2. Las regiones constantes de cadena pesada que corresponden a los diferentes grupos de anticuerpos se denominan a, d, e, ? y µ, respectivamente. Las regiones constantes de cadena ligera, que pueden encontrarse en los cincos grupos de anticuerpo, se denominan (kappa) y ? (lambda) .
El término "región constante derivada de origen humano" se emplea en la presente solicitud para indicar una región constante de cadena pesada de un anticuerpo humano de los subgrupos IgGl, IgG2, IgG3 o IgG4 y/o una región constante de cadena ligera kappa o lambda. Tales regiones constantes son bien conocidas en el arte previo y se han descrito por Kabat, E.A., (véase p.ej. Johnson, G. and Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218; Kabat, E.A., et al., Proc . Nati. Acad. Sci. USA 72 (1975) 2785-2788).
Los anticuerpos del subgrupo IgG4 presentan una menor unión sobre el receptor de Fe (FcYRIIIa) , mientras que los anticuerpos de otros subgrupos IgG presentan una unión fuerte. Sin embargo, el Pro238, Asp265, Asp270, Asn297 (pérdida del hidrato de carbono de Fe), Pro329, Leu234, Leu235, Gly236, Gly237, Ile253, Ser254, Lis288, Thr307, Gln311, Asn434 y His435 son restos que, si se alteran, proporcionan también una unión reducida sobre el receptor del Fe (Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604; Lund, J. , et al . , FASEB J. 9 (1995) 115-119; Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319-324; EP 0 307 434).
En una modalidad, un anticuerpo de conformidad con la invención tiene una unión reducida sobre el FcR si se compara con un anticuerpo igGl y el anticuerpo original monoespecífico bivalente en lo que respecta a la unión sobre el FcR es del subgrupo IgG4 o del subgrupo IgGl o IgG2 con una mutación en S228, L234, L235 y/o D265, y/o contiene la mutación PVA236. En una modalidad, las mutaciones en el anticuerpo original monoespecífico bivalente son la S228P, L234A, L235A, L235E y/o PVA236. En otra modalidad, las mutaciones en el anticuerpo original monoespecífico bivalente son la S228P en la IgG4 y las L234A y L235A en la IgGl. Las regiones constantes de cadena pesada se representan en las SEQ ID NO: 57 y 58. En una modalidad, la región constante de cadena pesada del anticuerpo original monoespecífico bivalente es de la SEQ ID NO: 57 con las mutaciones L234A y L235A. En otra modalidad, la región constante de cadena pesada del anticuerpo original monoespecífico bivalente es de la SEQ ID NO: 58 con la mutación S228P. En otra modalidad, la región constante de cadena ligera del anticuerpo original monoespecífico bivalente es la región de cadena ligera kappa de la SEQ ID NO: 59 o la región de cadena ligera lambda de la SEQ ID NO: 60. Preferiblemente, la región constante de cadena pesada del anticuerpo original monoespecífico bivalente es de la SEQ ID NO: 57 o de la SEQ ID NO: 58 con la mutación S228P.
La región constante de un anticuerpo participa directamente en la ADCC (citotoxicidad mediada por la célula dependiente de anticuerpo) y en la CDC (citotoxicidad dependiente del complemento) . La activación del complemento (CDC) se inicia con la unión del factor de complemento Clq sobre la región constante de la mayor parte de los subgrupos de anticuerpos IgG. La unión del Clq sobre un anticuerpo viene provocada por interacciones proteína-proteína definidas en el sitio llamada de unión. Tales sitios de unión de región constante se conocen en el arte previo y se han descrito p.ej. en Lukas, T.J., et al., J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560; Brunhouse, R. y Cebra, JJ., Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917; Burton, D.R., et al., Nature 288 (1980) 338-344; Thommesen, J.E., et al., Mol. Immunol. 37 (2000) 995-1004; Idusogie, E.E., et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184; Hezareh, M. , et al., J. Virol . 75 (2001) 12161-12168; Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319-324; and EP 0 307 434. Tale sitios de unión de región constante se caracterizan p.ej. por los aminoácidos L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 y P329 (numeración de acuerdo con el índice Eü de Kabat) .
El término "citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) " indica la lisis de células diana humanas por acción de un anticuerpo de conformidad con la invención en presencia de células efectoras . La ADCC se mide preferiblemente mediante el tratamiento de una preparación de células que expresan al CCR5 con un anticuerpo de conformidad con la invención en presencia de células efectoras, por ejemplo las PBMC recién aisladas o las células efectoras purificadas a partir de ¡capas leucocitarias , como son los monocitos o las células asesinas naturales (NK) o una línea celular de NK de crecimiento permanente.
El término "citotoxicidad dependiente del complemento (CDC)" indica un proceso iniciado con la unión del factor de complemento Clq sobre la parte Fe de la mayoría de subgrupos de anticuerpos IgG. La unión del Clq a un anticuerpo es causada por interacciones proteína-proteína definidas en el sitio llamado de unión. Tales sitios de unión de la parte Fe son conocidos en el arte previo (ver más arriba) . Tales sitios de unión de la parte Fe se caracterizan p.ej. por los aminoácidos L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 y P329 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat) . Los anticuerpos de los subgrupos IgGl, lgG2 e IgG3 presentan normalmente activación del complemento incluida la unión sobre el Clq y C3, mientras que el IgG4 no activa el sistema de complemento y no se fija sobre el Clq y/o el C3.
El anticuerpo de conformidad con la invención se produce por métodos recombinantes . Por tanto, un aspecto de la presente invención es un ácido nucleico que codifica al anticuerpo de conformidad con la invención y otro aspecto es una célula que contiene el ácido nucleico que codifica a un anticuerpo de conformidad con la invención. Los métodos de producción recombinante son muy conocidos en el arte previo y consisten en la expresión de la proteína en células procariotas y eucariotas y el posterior aislamiento del anticuerpo y normalmente la purificación del mismo hasta una pureza farmacéuticamente aceptable. Para la expresión de los anticuerpos del modo antes mencionado en una célula hospedante, se insertan los ácidos nucleicos que codifican a las correspondientes cadenas cortas y largas modificadas en vectores de expresión por métodos estándar. La expresión se realiza en células hospedantes eucariotas o procariotas apropiadas, por ejemplo células CHO, células NSO, células SP2/0, células HEK293, células COS, células PER.C6, levaduras o células de E. coli y se recupera el anticuerpo de las células (del líquido sobrenadante o de las células después de la lisis) . Los métodos generales de producción recombinante de anticuerpos son bien conocidos en el arte previo y se han descrito por ejemplo en los artículos de revisión de Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202; Geisse, S., et al., Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282; Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol . 16 (2000) 151-161; Werner, R.G., J. Drug Res. 48 (1998) 870-880.
Los anticuerpos de conformidad con la invención se separan del medio de cultivo de modo conveniente por procedimientos convencionales de purificación de inmunoglobulina, por ejemplo, proteína A-sefarosa, cromatografía a través de hidroxilapatita, electroforesis a través de gel, diálisis o cromatografía de afinidad. El ADN y el AR que codifican a los anticuerpos monoclonales se aisla fácilmente y se secuencia aplicando procedimientos convencionales. Las células de hibridoma pueden servir como fuentes de dichos ADN y ARN . Una vez aislado, el ADN puede insertarse en vectores de expresión, que se transfectan a células hospedantes del tipo células HEK 293, células CHO o células de mieloma que de otro modo no producirían proteína de inmunoglobulina para realizar la síntesis de anticuerpos monoclonales recombinantes en células hospedantes.
Las variantes de secuencias de aminoácidos (o mutantes) del anticuerpo de conformidad con la invención se obtienen introduciendo los cambios apropiados de nucleótidos en el ADN del anticuerpo o por síntesis de nucleótidos. Sin embargo, estas modificaciones pueden realizarse solamente en un intervalo muy limitado, p.ej. del modo antes descrito. Por ejemplo, las modificaciones no alteran las características del anticuerpo antes mencionadas, por ejemplo el isotipo de IgG y la unión sobre el antígeno, pero pueden mejorar el rendimiento de la producción recombinante , la estabilidad de la proteína o facilitar la purificación.
El término "célula hospedante" se emplea en la presente solicitud para indicar cualquier tipo de sistema celular que puede diseñarse para generar los anticuerpos de conformidad con la presente invención. En una modalidad, las células HEK293 y las células CHO se emplean como células hospedantes. Tal como se emplea aquí, las expresiones "célula", "línea celular" y "cultivo celular" se emplean indistintamente y todas las denominaciones incluyen a la progenie. Por tanto, las palabras "transformantes" y "células transformadas" incluyen la célula objeto primaria y los cultivos derivados de la misma con independencia del número de transferencias. Se da también por supuesto que toda la progenie puede que no sea exactamente idéntica en cuanto al contenido de ADN, debido a las mutaciones deliberadas o inadvertidas. Se incluye la progenie variante que tiene la misma función o actividad biológica que se ha explorado en la célula transformada original .
La expresión en células NSO se ha descrito p.ej. en Barnes, L.M., et al., Cytotechnology 32 (2000) 109-123; Barnes, L.M., et al., Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270. La expresión transitoria se ha descrito p.ej en Durocher, Y., et al., Nucí. Acids. Res. 30 (2002) E9. La clonación de los dominios variables se ha descrito en Orlandi, R. , et al., Proc. Nati. Acad. Sci . USA 86 (1989) 3833-3837; Cárter, P., et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289; y Norderhaug, L., et al., J. Immunol. Methods 204 (1997) 77-87.
Un sistema de expresión transitoria preferido (HEK 293) se ha descrito en Schlaeger, E.-J., and Christensen, K., in Cytotechnology 30 (1999) 71-83 y en Schlaeger, E.-J., en J. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199.
Las secuencias de control idóneas para procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia de operador y un sitio de unión a un ribosoma. Se sabe que las células eucariotas utilizan promotores, intensificadores y señales de poliadenilación.
Un ácido nucleico está "unido operativamente" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN de una pre-secuencia o líder secretorio está unido operativamente con un ADN de un polipéptido si se expresa como pre-proteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o intensificador está unido operativamente con una secuencia codificadora si afecta la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión de un ribosoma está unido operativamente con una secuencia codificadora si está posicionado de tal manera que facilita la traducción. En general, "unido operativamente" significa que las secuencias de ADN que se van a unir son contiguas, y, en el caso de un líder secretorio, son contiguas y están dentro del marco de lectura. Sin embargo, los intensificadores no tienen que estar contiguos. La unión se realiza por ligación en sitios de restricción oportunos. Si no existen tales sitios, se emplearán adaptadores o enlaces oligonucleótidos sintéticos con arreglo a la práctica convencional .
La purificación de anticuerpos se realiza con el fin de eliminar componentes celulares u otros contaminantes, p.ej. otros ácidos nucleicos o proteínas celulares, por técnicas estándar, incluido el tratamiento alcalino/SDS , el contraste con CsCl, la cromatografía de columna, la electroforesis a través de gel de agarosa y otros métodos bien conocidos de la técnica, véase Ausubel, F., et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987) . Los diferentes métodos se han consolidado y se emplean con frecuencia para la purificación de proteínas, por ejemplo la cromatografía de afinidad con proteínas microbianas (p.ej. cromatografía de afinidad de proteína A o proteína G) , cromatografía de intercambio iónico (p.ej. intercambio catiónico (resinas de carboximetilo) , intercambio aniónico (resinas de aminoetilo) y de intercambio mixto) , la adsorción tiófila (p.ej. con beta-mercaptoetanol y otros ligandos SH) , la interacción hidrófoba o la cromatografía de adsorción aromática (p.ej. con fenil-sefarosa, resinas azaarenófilas o con ácido m-aminofenilborónico) , cromatografía de afinidad con quelatos metálicos (p.ej. con material de afinidad Ni(II) y Cu(II)), la cromatografía de exclusión de tamaños y los métodos electroforéticos (por ejemplo la electroforesis a través de gel, la electroforesis capilar) (Vijayalakshmi , M.A. Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102) .
La invención comprende un método para el tratamiento de un paciente que necesite la terapia, caracterizado por administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo de conformidad con la invención.
La invención comprende el uso de un anticuerpo de conformidad con la invención para la terapia.
La invención comprende el uso de un anticuerpo de conformidad con la invención para la fabricación de un medicamento destinado a la prevención de metástasis.
La invención comprende el uso de un anticuerpo de conformidad con la invención para la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento del cáncer.
Un aspecto de la invención es una composición farmacéutica que contiene un anticuerpo de conformidad con la invención. Otro aspecto de la invención es el uso de un anticuerpo de conformidad con la invención para la fabricación de una composición farmacéutica. Otro aspecto de la invención es un método para la fabricación de una composición farmacéutica que contiene un anticuerpo de conformidad con la invención. En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición, p.ej. una composición farmacéutica, que contiene un anticuerpo de conformidad con la presente invención, formulado junto con un vehículo farmacéutico .
Una modalidad de la invención es la composición farmacéutica para la prevención de las metástasis.
Una modalidad de la invención es un anticuerpo de conformidad con la invención para la prevención de metástasis .
Otro aspecto de la invención es el uso de un anticuerpo de conformidad con la invención para la fabricación de un medicamento destinado a la prevención de metástasis.
Otro aspecto de la invención es un método de prevención de metástasis de un paciente que sufre un cáncer primario, que consiste en administrar un anticuerpo de conformidad con la invención a un paciente que necesite tal tratamiento preventivo.
Hemos podido demostrar la prevención altamente eficaz de las metástasis espontáneas/tumores secundarios in vivo en un modelo de cáncer ortotópico y otro subcutáneo (véase el ejemplo 9) (a diferencia del modelo experimental, en el que las células tumorales se inyectan por vía i.v.). Esto es similar a la situación clínica, en la que las células se diseminan a partir de un tumor primario y efectúan la metástasis hacia órganos secundarios, por ejemplo el pulmón o el hígado (donde se desarrollan los tumores secundarios) .
El término "metástasis" de conformidad con la invención se emplea para indicar la transmisión de células cancerosas del tumor primario hacia uno o más sitios diferentes de un paciente, en los que se desarrollan los tumores secundarios. Los medios para determinar si un cáncer ha efectuado metástasis ya son conocidos en la técnica e incluyen el escaneo de los huesos, los rayos X del tórax, el escaneo CAT, el escaneo MRI y los ensayos con marcadores tumorales.
Los términos "prevención de metástasis" y "prevención de tumores secundarios" se emplean aquí con el mismo significado para indicar un agente profiláctico contra las metástasis en un paciente que sufra un cáncer reincidente positivo de HER2, que de este modo inhibe o reduce la transmisión ulterior de las células cancerosas del tumor primario hacia uno o más sitios situados en otras zonas del paciente. Esto significa que se previene, retrasa o reduce la metástasis del tumor primario o del cáncer y, de este modo, se previene, se retrasa o se reduce el desarrollo de tumores secundarios. Se previenen o se reducen preferiblemente las metástasis, es decir, los tumores secundarios de pulmón, lo cual significa que se previene o se reduce la transmisión metastásica de células cancerosas del tumor primario hacia el pulmón.
Otro aspecto de la invención es la composición farmacéutica para el tratamiento del cáncer.
Otro aspecto de la invención es un anticuerpo de conformidad con la invención para el tratamiento del cáncer.
Otro aspecto de la invención es el uso de un anticuerpo de conformidad con la invención para la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento del cáncer. ptro aspecto de la invención es el método de tratamiento de un paciente que sufre de cáncer, que consiste en la administración de un anticuerpo de conformidad con la invención a un paciente que necesite tal tratamiento.
Tal como se emplea aquí, "vehículo farmacéutico" incluye a todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos , agentes isotónicos y retardantes de absorción y similares que sean fisiológicamente compatibles. Preferiblemente, el vehículo es idóneo para la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, parenteral, espinal o epidérmica (p.ej. por inyección o infusión).
Una composición de la presente invención puede administrarse por una gran variedad de métodos ya conocidos en el arte previo. Las personas experimentadas en la técnica sabrán apreciar que la vía y/o el modo de administración pueden variar en función de los resultados deseados. Para administrar un compuesto de la invención por ciertas vías de administración, puede ser necesario revestir el compuesto con, o co-administrar el compuesto con, un material para impedir su inactivación. Por ejemplo, el compuesto puede administrarse a un sujeto en un vehículo apropiado, por ejemplo, liposomas, o un diluyente. Los diluyentes farmacéuticamente aceptables incluyen la solución salina y las soluciones acuosas amortiguadas. Los vehículos farmacéuticos incluyen las soluciones o dispersiones acuosas estériles y los polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones estériles inyectables . El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas ya es conocido en el arte previo.
Las frases "administración parenteral" y "administrado por vía parenteral" se emplea aquí para indicar los modos de administración diferentes de la administración enteral y tópica, normalmente por inyección e incluyen, sin limitación, la inyección intravenosa, intramuscular, intra-arterial , intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardiaca, intradermal, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intra-articular, subcapsular, subaracnoide, intraespinal , epidural e intraesternal e infusión.
El término "cáncer" se emplea aquí para indicar enfermedades proliferativas , por ejemplo linfornas, leucemias linfocíticas , cáncer de pulmón, cáncer de pulmón no de células pequeñas (NSCL) , cáncer de pulmón de células bronquioloalveolares, cáncer óseo, cáncer pancreático, cáncer de piel, cáncer de cabeza o cuello, melanoma cutáneo o intraocular, cáncer de útero, cáncer de ovarios, cáncer de recto, cáncer de la región anal, cáncer de estómago, cáncer gástrico, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de útero, carcinoma de los tubos de Falopio, carcinoma del endometrio, carcinoma del cérvix, carcinoma de la vagina, carcinoma de la vulva, enfermedad de Hodgkin, cáncer de esófago, cáncer del intestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de glándula tiroides, cáncer de glándula paratiroides , cáncer de cápsula suprarrenales, sarcoma de tejido blando, cáncer de uretra, cáncer de pene, cáncer de próstata, cáncer de vejiga, cáncer de ríñones o de uréter, carcinoma de células renales, carcinoma de pelvis renal, mesotelioma, cáncer hepatocelular, cáncer biliar, neoplasmas del sistema nervioso central (SNC) , tumores del eje espinal, glioma del tronco cerebral, glioblastoma multiforme, astrocitomas , schwanomas, ependimonas, meduloblastomas, meningiomas, carcinomas de células escamosas, adenoma pituitario y sarcoma de Ewing, incluidas las versiones refractarias de cualquiera de los cánceres recién mencionados o las combinaciones de uno o más de los cánceres anteriores .
Otro aspecto de la invención es la composición farmacéutica como agente anti-angiogénico. Tal agente anti-angiogénico puede utilizarse para el tratamiento del cáncer, en especial tumores sólidos y otras enfermedades vasculares.
Otro aspecto de la invención es el uso de un anticuerpo de conformidad con la invención para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades vasculares.
Una modalidad de la invención es el anticuerpo de conformidad con la invención para el tratamiento de enfermedades vasculares .
Una modalidad de la invención es el anticuerpo de conformidad con la invención para el tratamiento de la retinopatía .
Otro aspecto de la invención es el uso de un anticuerpo de conformidad con la invención para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de retinopatía.
Otro aspecto de la invención es un método de tratamiento de un paciente que sufra enfermedades vasculares, que consiste en la administración un anticuerpo de conformidad con la invención a un paciente que necesite tal tratamiento.
El término "enfermedades vasculares" incluye cáncer, enfermedades inflamatorias, aterosclerosis, isquemia, trauma, sepsis, COPD, asma, diabetes, AMD, retinopatía, apoplejía, adiposidad, lesión pulmonar aguda, hemorragias, derrame vascular, p.ej. inducido por citoquinas, alergia, enfermedad de Graves, tiroiditis autoinmune de Hashimoto, púrpura trombocitopénica idiopática, arteritis de células gigantes, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico (SLE) , nefritis por lupus, enfermedad de Crohn, esclerosis múltiple, colitis ulcerante, en especial los tumores sólidos, síndromes neovasculares intraoculares, por ejemplo retinopatías proliferativas o la degeneración macular debida a la edad (AMD) , artritis reumatoide y psoriasis (Folkman, J., et al., J. Biol. Chem. 267 (1992) 10931- 10934; Klagsbrun, M. , et al., Annu. Rev. Physiol. 53 (1991) 217-239; and Garner, A., Vascular diseases, In: Pathobiology of ocular disease, A dynamic approach, Garner, A., and Klintworth, G. K. (eds.), 2nd edition, Marcel Dekker, New York (1994) , pp 1625-1710) .
Estas composiciones pueden contener también adyuvantes como son los conservadores, agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes dispersantes. La prevención de la presencia de microorganismos puede asegurarse tanto con procedimientos de esterilización, ver más arriba, como por la inclusión de varios agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, paraben, clorobutanol, fenol, ácido sórbico y similares. Puede ser también deseable la inclusión de agentes isotónicos, por ejemplo azúcares, cloruro sódico y similares a las composiciones. Además, la absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable puede conseguirse mediante la inclusión de agentes que retarden la absorción, como son el monoesterato de aluminio y la gelatina.
Con independencia de la vía de administración elegida, los compuestos de la presente invención, que pueden utilizarse en una forma hidratada adecuada, y/o las composiciones f rmacéuticas de la presente invención, se formulan en formas de dosificación farmacéuticamente aceptables por métodos convencionales, que las personas experimentadas en la técnica ya conocen.
Los niveles actuales de dosificación de los ingredientes activos en las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden variarse con el fin de obtener una cantidad de ingrediente activo que sea eficaz para lograr la respuesta terapéutica deseada en un paciente, una composición y un modo de administración concretos, sin ser tóxicos para el paciente. El nivel de dosificación elegido dependerá de un gran número de factores farmacocinéticos , incluida la actividad de las composiciones concretas de la presente invención que se empleen, la vía de administración, el tiempo de administración, la velocidad de excreción del compuesto concreto que se emplee, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales que se utilicen en combinación con las composiciones concretas empleadas, la edad, el sexo, el peso, el estado patológico, el estado general de salud y el historial médico previo del paciente a tratar así como los factores bien conocidos en las técnicas médicas .
La composición tiene que ser estéril y líquida en un grado tal que la composición pueda administrarse con una jeringuilla. Además del agua, el vehículo es preferiblemente una solución salina amortiguada isotónica.
La fluidez correcta puede mantenerse, por ejemplo, con el uso de recubrimiento, tal como la lecitina, manteniendo el tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y con el uso de surfactantes . En muchos casos es preferible incorporar a la composición agentes isotónicos, por ejemplo azúcares, polialcoholes, tales como manita o sorbita y cloruro sódico.
. Las expresiones "célula", "línea celular" y "cultivo celular" se emplean aquí indistintamente y todas las denominaciones incluyen la progenie. Por tanto, las palabras "transformantes" y "células transformadas" incluyen la célula objeto primaria y los cultivos derivados de la misma con independencia del número de transferencias. Se da también por supuesto que toda la progenie puede que no sea exactamente idéntica en cuanto al contenido de ADN, debido a las mutaciones deliberadas o inadvertidas. Se incluye la progenie variante que tiene la misma función o actividad biológica que se ha explorado en la célula transformada original. Cuando existan distintas denominaciones, su significado resultará claro por el contexto.
El término "transformación" se emplea aquí para indicar un proceso de transferencia de un vector/ácido nucleico a una célula hospedante. Si se emplean como células hospedantes células sin barrera de pared celular formidable, la trans-fección se puede llevar a cabo p.ej. por el método de precipitación con fosfato de calcio descrito por Graham, F. L . , y van der Eb, Virology 52 (1973) 456-467. Sin embargo pueden emplearse también otros métodos de introducción del ADN en las células, como son la inyección nuclear o la fusión de protoplastos . Si se emplean células procariotas o células que contienen construcciones sustanciales de pared celular, p.ej. un método de transfeccion el tratamiento con calcio empleando el cloruro de calcio, descrito por Cohén, F. N, et al, PNAS. 69 (1972) 711 Qff.
Tal como se emplea aquí, "expresión" indica el proceso por el que un ácido nucleico se transcribe al ARNm y/o el proceso por el que el ARNm transcrito (también llamado transcrito) se traduce seguidamente en péptidos, polipéptidos o proteínas. Los transcritos y los polipéptidos codificados se denominan colectivamente productos genéticos. Si el polinucleótido deriva del ADN genómico, la expresión en una célula eucariota puede incluir el empalme del ARNm.
Un "vector" es una molécula de ácido nucleico, en particular una molécula autorreplicante, que transfiere una molécula de ácido nucleico insertada a y/o entre células hospedantes . El término incluye a los vectores que funcionan primariamente para la inserción de ADN o ARN en una célula (p.ej., integración cromosómica) , la replicación de vectores que funcionan primariamente para la replicación de ADN o ARN y vectores de expresión que funcionan para la transcripción y/o traducción del ADN o ARN. Se incluyen también los vectores que proporcionan más de una de las funciones descritas.
Un "vector de expresión" es un polinucleótido que, cuando se introduce en una célula hospedante apropiada, puede transcribirse y traducirse en un polipéptido. Un "sistema de expresión" se emplea normalmente para indicar una célula hospedante apropiada que consta de un vector de expresión que puede funcionar para generar un producto de expresión deseado .
Los ejemplos, listado de secuencias y figuras siguientes se facilitan para ayudar la comprensión de la presente invención, cuyo verdadero alcance se define en las reivindicaciones anexas. Se da por supuesto que se pueden introducir modificaciones en los procedimientos presentados sin apartarse del espíritu de la invención.
Descripción de las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 1 CDR3 de cadena pesada, <A G-2>Ang2i_LC06 SEQ ID NO: 2 CDR2 de cadena pesada, <ANG-2> Ang2i_LC06 SEQ ID NO: 3 CDR1 de cadena pesada, <ANG-2>Ang2i_LC06 SEQ ID NO: 4 CDR3 de cadena ligera, <ANG-2>Ang2i_LC06 SEQ ID NO: 5 CDR2 de cadena ligera, <ANG-2>Ang2i_LC06 SEQ ID NO: 6 CDR1 de cadena ligera, <ANG-2>Ang2i_LC06 SEQ ID NO: 7 dominio variable de cadena pesada, <ANG-2>Ang2i_LC06 SEQ ID NO: 8 dominio variable de cadena ligera, <ANG-2>Ang2i_LC06 SEQ ID NO: 9 CDR3 de cadena pesada, <ANG-2>Ang2i_LC07 SEQ ID NO: 10 CDR2 de cadena pesada, <ANG- 2 >Ang2i_LC07 SEQ ID NO: 11 CDR1 de cadena pesada, <ANG- 2>Ang2Í_LC07 SEQ ID NO: 12 CDR3 de cadena ligera, <ANG-2 >Ang2Í_LC07 SEQ ID NO: 13 CDR2 de cadena ligera, <ANG- 2>Ang2i_LC07 SEQ ID NO: 14 CDR1 de cadena ligera, <ANG-2 >Ang2i_LC07 SEQ ID NO: 15 dominio variable de cadena pesada, <ANG- 2>Ang2i_LC07 SEQ ID NO: 16 dominio variable de cadena ligera, <ANG- 2>Ang2i_LC07 SEQ ID NO: 17 CDR3 de cadena pesada, <ANG-2>Ang2k_LC08 SEQ ID NO: 18 CDR2 de cadena pesada, <ANG-2> Ang2k_LC08 SEQ ID NO: 19 CDR1 de cadena pesada, <ANG-2> Ang2k_LC08 SEQ ID NO: 20 CDR3 de cadena ligera, <ANG-2> Ang2k_LC08 SEQ ID NO: 21 CDR2 de cadena ligera, <ANG-2> Ang2k_LC08 SEQ ID NO: 22 CDR1 de cadena ligera, <ANG-2> Ang2k_LC08 SEQ ID NO: 23 dominio variable de cadena pesada, <A G-2> Ang2k_LC08 SEQ ID NO: 24 dominio variable de cadena ligera, <ANG-2> Ang2k_LC08 SEQ ID NO: 25 CDR3 de cadena pesada, <ANG-2> Ang2s_LC09 SEQ ID NO: 26 CDR2 de cadena pesada, <ANG-2> Ang2s_LC09 SEQ ID NO: 27 CDR1 de cadena pesada, <ANG-2> Ang2s_LC09 SEQ ID NO: 28 CDR3 de cadena ligera, <ANG-2> Ang2s_LC09 SEQ ID NO: 29 CDR2 de cadena ligera, <ANG-2> Ang2s_LC09 SEQ ID NO: 30 CDR1 de cadena ligera, <ANG-2> Ang2s_LC09 SEQ ID NO: 31 dominio variable de cadena pesada, <ANG-2: Ang2s_LC09 SEQ ID NO: 32 dominio variable de cadena ligera, <ANG-2: Ang2s_LC09 SEQ ID NO: 33 CDR3 de cadena pesada, <ANG-2> Ang2i_LC10 SEQ ID NO: 34 CDR2 de cadena pesada, <ANG-2> Ang2i_LC10 SEQ ID NO: 35 CDR1 de cadena pesada, <ANG-2> Ang2i_LC10 SEQ ID NO: 36 CDR3 de cadena ligera, <ANG-2> Ang2i_LC10 SEQ ID NO: 37 CDR2 de cadena ligera, <ANG-2> Ang2i_LC10 SEQ ID NO: 38 CDR1 de cadena ligera, <ANG-2> Ang2i_LC10 SEQ ID NO: 39 dominio variable de cadena pesada, <ANG-2 Ang2i_LC10 SEQ ID NO: 40 dominio variable de cadena ligera, <ANG-2 Ang2i_LC10 SEQ ID NO: 41 CDR3 de cadena pesada, <ANG-2> Ang2k_LCll SEQ ID NO: 42 CDR2 de cadena pesada, <ANG-2> Ang2k_LCll SEQ ID NO: 43 CDR1 de cadena pesada, <ANG-2> Ang2k_LCll SEQ ID NO: 44 CDR3 de cadena ligera, <ANG-2> Ang2k_LCll SEQ ID NO: 45 CDR2 de cadena ligera, <ANG-2> Ang2k_LCll SEQ ID NO: 46 CDR1 de cadena ligera, <ANG-2> Ang2k_LCll SEQ ID NO: 47 dominio variable de cadena pesada, <ANG-2 Ang2k_LCll SEQ ID NO: 48 dominio variable de cadena ligera, <ANG-2 Ang2k_LCll SEQ ID NO: 49 CDR3 de cadena pesada, <ANG-2> Ang2s_R3_LC03 SEQ ID NO: 50 CDR2 de cadena pesada, <ANG-2> Ang2s_R3_:LC03 SEQ ID NO: 51 CDRl de cadena pesada, <ANG-2> Ang2s_R3_LC03 SEQ ID NO: 52 CDR3 de cadena ligera, <ANG-2> Ang2s_R3_LC03 SEQ ID NO: 53 CDR2 de cadena ligera, <ANG-2> Ang2s_R3_LC03 SEQ ID NO: 54 CDRl de cadena ligera, <ANG-2> Ang2s_R3_LC03 SEQ ID NO: 55 dominio variable de cadena pesada, <ANG-2> Ang2s_R3_LC03 SEQ ID NO: 56 dominio variable de cadena ligera, <ANG-2> Ang2s_R3_LC03 SEQ ID NO: 57 región constante de cadena pesada humana derivada de la IgGl SEQ ID NO: 58 región constante de cadena pesada humana derivada de la IgG4 SEQ ID NO: 59 región constante de cadena ligera kappa SEQ ID NO: 60 región constante de cadena ligera lambda SEQ ID NO: 61 receptor de Tie-2 humano SEQ ID NO: 62 angiopoyetina-2 humana (ANG-2) con líder y His-tag SEQ ID NO: 63 angiopoyetina-1 humana (ANG-1) con líder y His- tag Breve Descripción de las Figuras Figuras 1A a IB: clonación de las IgG para (Fig. 1A) : la expresión transitoria en vectores de expresión Ang2i-LC06 y para (Fig. IB) : la expresión en vectores Ang2i-LC06.
Figura 2: gel SDS-PAGE de anticuerpos anti-A G-2 purificados Ang2i-LC06, Ang2i-LC07 y Ang2k-LC08 Figura 3 : interacción angiopoyetina-Tie2 según ELISA Figura 4: inhibición de la unión de ANG-2 sobre el Tie2 causada por el Ang2i-LC06 y Ang2k-LC08 Figura 5: inhibición de la unión de ANG-1 sobre el Tie2 causada por el Ang2i-LC06 y Ang2k-LC08 Figura 6: modelo de injerto ajeno (xenograft) Colo205 para demostrar la eficacia in vivo de los anticuerpos anti-ANG-2 Figura 7: modelo de injerto ajeno de KPL-4 para demostrar la eficacia in vivo de los anticuerpos anti-ANG-2 Figura 8: unión sobre la ANG-1 mediante un sensograma Biacore Figuras 9A y 9B: prevención de la metástasis/tumores secundarios pulmonares mediante anticuerpos de conformidad con la invención en el injerto ajeno de tumor de colon primario (Fig. 9A) y en el injerto ajeno de tumor de mama primario (Fig. 9B) .
Figuras 10A y 10B: inhibición de la retinopatía mediante anticuerpos de conformidad con la invención.
Descripción Detallada de la Invención Procedimiento experimental 1 Materiales y métodos generales La información general respecto a las secuencias de nucleótido de las cadenas cortas y largas de inmunoglobulinas humanas se encontrará en: Kabat, E.A. , et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) .
Los aminoácidos de las cadenas de anticuerpo se numeran y nombran según la numeración EU (Edelman, G. M. , et al., Proc.
Nati. Acad. Sci. USA 63 (1969) 78-85; Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, (1991) ) .
Técnicas de ADN recombinante Para manipular el ADN se aplican los métodos estándar descritos en Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989. Los reactivos de biología molecular se emplean con arreglo a las instrucciones del fabricante .
Síntesis genética Los segmentos deseados de los genes se obtienen a partir de los oligonucleótidos formados por síntesis química. Los segmentos de los genes, flanqueados por sitios de rotura de endonucleasa de restricción concreta, se ensamblan por fusión y ligación de los oligonucleótidos, incluyendo la amplificación PCR y posteriormente se clonan mediante los sitios de restricción indicados, p.ej. Kpnl/SacI o AscI/PacI en un vector de clonación pGA4 basado en el pPCRScript (Stratagene) . Las secuencias de ADN de los fragmentos de genes subclonados se confirman por secuenciación del ADN. Los fragmentos de la síntesis genética se ordenan con arreglo a las especificaciones indicadas por Geneart (Regensburg, Alemania) .
Determinación de la secuencia de ADN Se determinan las secuencias de ADN por secuenciación de doble hebra realizada en MediGenomix GmbH ( artinsried, Alemania) o en Sequiserve GmbH (Vaterstetten, Alemania) .
Análisis de las secuencias de ADN y proteína y gestión de los datos de secuencia Se emplea el paquete informático de GCG (Genetics Computer Group, Madison, isconsin) versión 10.2 y la suite Vector NT1 Advance de Infomax, versión 8.0, para la creación, mapeo, análisis, anotación e ilustración de las secuencias. Vectores de expresión Para la expresión de anticuerpos descritos se aplican variantes de plásmidos de expresión para células de expresión transitoria (p.ej. en células HE 293 EBNA o HEK293-F) o de expresión estable (p.ej. en células CHO) basada en una organización de ADNc con un promotor de CMV-intrón A o en una organización genómica con un promotor CMV (p.ej. figuras 1A y IB) .
Además del cassette de expresión del anticuerpo, los vectores contienen: - un origen de replicación que permite la replicación de este plásmido en E. coli y - un gen de ß-lactamasa que confiere resistencia a la ampicilina en E. coli.
La unidad de transcripción del gen del anticuerpo se compone de los elementos siguientes: - sitio o sitios de restricción únicos en el extremo 5' el intensificador inmediatamente anterior y el promotor del citomegalovirus humano, - seguido por la secuencia del intrón A en el caso de la organización de ADNc, - una región 5' sin traducir de un gen de anticuerpo humano, una secuencia de señal de cadena pesada de inmunoglobulina, - la cadena de anticuerpo humano (cadena pesada, cadena pesada modificada o cadena ligera) ya sea como organización de ADNc, ya sea como organización genómica con una organización exón-intrón de inmunoglobulina - una región 3' sin traducir con una secuencia de señal de poliadenilación y - un sitio o sitios de restricción únicos en el extremo 3' .
Los genes de fusión que comprenden las secuencias de cadena pesada del anticuerpo seleccionado descritas a continuación se generan por PCR y/o síntesis genética y se ensamblan por métodos y técnicas recombinantes conocidos mediante conexión de los correspondientes segmentos de ácido nucleico, p.ej. empleando sitios Nsil y EcoRI únicos en los vectores genómicos de cadena pesada. Las secuencias ácido nucleico subclonado se verifican por secuenciación del A£)N. Para las trdnsfecciones transitorias y estables se preparan cantidades considerables de plásmidos mediante producción de plásmidos a partir de cultivos de E. coli transformados (Nucleobond AX, Macherey-Nagel) .
Técnicas de cultivo celular Se aplican las técnicas estándar de cultivo celular descritas en Current Protocols Cell Biology (2000) , Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz , J. and Yamada, K. . (eds.) , John iley & Sons, Inc.
Transfecciones transitorias en el sistema HEK293-F Se generan los anticuerpos por transfección transitoria de los dos plásmidos que codifican a la cadena pesada y a la cadena pesada modificada, respectivamente y a la cadena ligera correspondiente, empleando el sistema HEK293-F (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Resumiendo, se transfectan las células HEK293-F (Invitrogen) cultivadas en suspensión, ya sea en matraz de agitación o en un fermentado agitado en medio de expresión FreeStyle 293 exento de suero (Invitrogen) con una mezcla de los dos plásmidos de expresión respectivos y 293fectina o fectina (Invitrogen) . Por ejemplo, para un matraz agitador de 2 1 (Corning) se siembran las células HEK293-F con una densidad de de l.OxlO6 células/ml en 600 mi y se incuban a 120 rpm, con un 8% de C02. Al día siguiente se transfectan las células en una densidad de aprox. 1.5xl06 células/ml con aprox. 42 mi de una mezcla de A) 20 mi de Opti-MEM (Invitrogen) con 600 µg de ADN plásmido total (1 g/ml) que codifica a la cadena pesada o la cadena pesada modificada, respectivamente y la correspondiente cadena ligera en una proporción equimolar y B) 20 mi de Opti-MEM" + 1.2 mi de 293-fectina o fectina (2 µ?/ml) . A medida que se consume la glucosa se agrega solución de glucosa solución durante el curso de la fermentación. Después de 5-10 días se recolecta el líquido sobrenadante que contiene el anticuerpo secretado y se purifican los anticuerpos directamente del líquido sobrenadante o bien se congela el líquido sobrenadante y se almacena.
Determinación de las proteínas Se determina la concentración de proteína de los anticuerpos purificados y de los derivados determinando la densidad óptica (OD) a 280 nm, empleando un coeficiente de extinción molar calculado en base a la secuencia de aminoácidos de acuerdo con Pace, C.N., et. al., Protein Science, 4 (1995), 241 1-1423.
Determinación de la concentración de anticuerpos en líquidos sobrenadantes La concentración de anticuerpos y derivados en el líquido sobrenadante de los cultivos celulares se estimula por inmunoprecipitación con esferillas de proteína A-agarosa (Roche) . Se lavan tres veces 60 µ? de esferillas de proteína A-agarosa con TBS-NP40 (50 mM Tris, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1% Nonidet-P40) . A continuación se aplican 1-15 mi de líquido sobrenadante del cultivo celular sobre las esferillas de proteína A-agarosa pre-equilibradas con TBS-NP40. Después de 1 h de incubación a temperatura ambiente se lavan las esferillas en una columna filtro uitrafree-MC (Amicon) una vez con 0.5 mi de TBS-NP40, dos veces con 0.5 mi 2x de solución salina amortiguada con fosfato (2xPBS, Roche) y brevemente cuatro veces con 0.5 mi de 100 mM Na-citrato de pH 5,0. Se eluye el anticuerpo fijado por adición de 35 µ? de solución amortiguadora de muestras NuPAGE LDS (Invitrogen) .
Se reúne la mitad de la muestra con agente reductor de muestra NuPAGE o se deja sin reducir, respectivamente y se calienta a 70°C durante 10 min. A continuación se aplican 20 µ? a un NuPAGE® Bis-Tris SDS-PAGE (Invitrogen) del 4-12% (con solución amortiguadora MOPS para el SDS-PAGE sin reducir y solución amortiguadora MES con aditivo amortiguador de trabajo antioxidante NuPAGE (Invitrogen) para el SDS-PAGE reducido) y se tiñen con azul Coomassie.
Se mide la concentración de anticuerpos y derivados en el líquido sobrenadante de los cultivos celulares por cromatografía HPLC en proteína A. Resumiendo, se aplican el líquido sobrenadante de los cultivos celulares que contiene anticuerpos y derivados a fijar sobre la proteína A en la parte superior de una columna HiTrap de proteína A (GE Healthcare) en 50 m K2HP04, 300 mM NaCl, pH 7.3 y se eluye de la matriz con 550 mM ácido acético, de pH 2,5 en un sistema HPLC Dionex. Se cuantifica la proteína eluida por absorbancia UV e integración de las áreas de los picos. Se emplea como patrón un anticuerpo IgGl patrón purificado.
Como alternativa, se mide la concentración de anticuerpos y derivados en el liquido sobrenadante de los cultivos celulares en un ensayo sandwich- IgG-ELISA. Resumiendo, se recubren placas de microvaloración StreptaWell High Bind estreptavidina A de 96 pozos (Roche) con 100 µ?/???? de la molécula de captura IgG anti -humana biotinilada F (ab' ) 2<h-FcY> BI (Dianova) a razón de 0.1 µg/ml a temperatura ambiente durante 1 h o como alternativa a 4°C durante una noche y después se lava tres veces con 200 µ?/???? de PBS, 0.05% Tween (PBST, Sigma). Se agregan a los pozos 100 µ?/???? de una serie de diluciones en PBS (Sigma) del anticuerpo correspondiente que contienen el líquido sobrenadante de los cultivos celulares y se incuban durante 1-2 h en un agitador de placas de microvaloración a temperatura ambiente. Se lavan los pozos tres veces con 200 µ?/???? de PBST y se detecta el anticuerpo fijado con 100 µ? de F(ab' ) 2<hFcgamma>POD (Dianova) a 0.1 yLg/ml como anticuerpo de detección en un agitador de placas de microvaloración a temperatura ambiente durante 1-2 h. Se elimina por lavado el anticuerpo de detección no fijado tres veces con 200 µ?/???? de PBST y se detecta el anticuerpo de detección fijado por adición de 100 µ? de ABTS/pozo. La determinación de la absorbancia se realiza en un espectrómetro del tipo Tecan Fluor en una longitud de onda de medición de 405 nm (longitud de onda de referencia: 492 nm) .
Purificación de las proteínas Se purifican las proteínas del líquido sobrenadante filtrado de los cultivos celulares con arreglo a métodos estándar. Resumiendo, se aplican los anticuerpos a una columna de proteína A-sefarosa (GE Healthcare) y se lavan con PBS. Se efectúa la elución*, de los anticuerpos a pH ácido e inmediatamente después se neutraliza la muestra. Se separa la proteína agregada de los anticuerpos monoméricos por cromatografía de exclusión de tamaños (Superdex 200, GE Healthcare) en 20 mM histidina, 140 mM NaCl de pH 6.0. Se reúnen las fracciones de anticuerpo monomérico, se concentran, si fuera necesario empleando P-ej. un concentrador centrifugador MILLIPORE Amicon Ultra (30 MWCO) , y se almacenan a -80°C. Una parte de las muestras se emplea para el siguiente análisis de la proteína y para la caracterización analítica, p.ej. por SDS-PAGE, cromatografía de exclusión de tamaños, espectrometría de masas y determinación de endotoxinas (ver figura 2) .
SDS-PAGE ® Se emplea el sistema de gel NuPAGE Pre-Cast (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante. En concreto se emplean los geles 4-20 % NuPAGE® Novex® TRIS-glicina Pre-Cast y una solución amortiguadora de trabajo Novex® TRIS-glicina SDS (ver p.ej. figuras 1A y IB). Se efectúa la reducción de las muestras por adición del agente ® reductor de muestras NuPAGE antes de cromatografía a través del gel.
Cromatografía analítica de exclusión de tamaños La cromatografía de exclusión de tamaños para la determinación de la agregación y el estado oligomérico de los anticuerpos se realiza por cromatografía HPLC. Resumiendo, los anticuerpos purificados con proteína A se aplican a una columna Tosoh TSKgel G3000SW en 300 m NaCl, 50 mM KH2P04/ K2HP04 de pH 7.5 en un sistema Agilent HPLC 1100 o a una columna Superdex 200 (GE Healthcare) en 2 x PBS en un sistema HPLC Dionex. Se cuantifica la proteína eluida por absorbancia UV e integración de las áreas de los picos. Como patrón se emplea el BioRad Gel Filtration Standard 151-1901.
Espectrometría de masas Se determina la masa desglucosilada total de los anticuerpos eluidos y se confirma mediante espectrometría de masas con ionización de electrospray (EM-ESI) . Resumiendo, se desglucosilan 100 µg de anticuerpos purificados con 50 mU de N-glucosidasa F (PNGaseF, ProZyme) en 100 mM H2P04/K2HP04 , de pH 7 a 37°C durante 12-24 h con una concentración de proteína de hasta 2 mg/ml y después se desaliniza por HPLC en una columna Sephadex G25 (GE Healthcare) . Se determina la masa de las correspondientes cadenas ligeras y cortas por EM-ESI después de la desglucosilación y reducción. Resumiendo, se incuban 50 pg de anticuerpo en 115 µ? con 60 µ? de 1M TCEP y 50 µ? de clorhidrato de guanidina 8 M y después se desaniliza. Se determina la masa total y la masa de las cadenas ligeras y cortas reducidas por EM-ESI en un sistema EM Q-Star Elite equipado con una fuente NanoMate.
ELISA de fijación sobre la ANG-1 y la ANG-2 Se evalúan mediante un ensayo ELISA las propiedades de fijación de los anticuerpos dirigidos contra la proteína angiopoyetina-2-His de longitud completa (R&D Systems, n° 623-AN/CF o en material producido en la propia empresa) o contra la angiopoyetina-l-His (R&D Systems, n° 923 -AN) . Para ello se recubren placas de 96 pozos (placas de microvaloración mejorada de poliestireno transparente Falcon o Nunc Maxisorb) con 100 µ? de 1 g/ml de angiopoye ina-1 o angiopoyetina-2 recombinantes humanas (sin vehículo) en PBS (Sigma) a temperatura ambiente durante 2 h o a 4°C durante una noche. Se lavan los pozos tres veces con 300 µ? de PBST (0.2% Tween 20) y se bloquean con 200 µ? de 2% BSA, 0.1% Tween 20, a temperatura ambiente durante 30 min y después se lavan tres veces con 300 µ? de PBST. Se agregan a los pozos 100 µ?/???? de una serie de diluciones (40 pM-0.01 pM) de anticuerpo de ensayo purificado contra la <ANG-2> y, como referencia, un Mab536 (Qliner, j. , et al., Cáncer Cell. Nov 6 (2004) 507-16, US 2006/0122370) en PBS y se incuban en un agitador de placas de microvaloración a temperatura ambiente durante 1 h. Se lavan los pozos tres veces con 300 µ? de PBST (0.2% Tween 20) y se detecta el anticuerpo fijado con 100 µ?/???? de 0.1 µg/ml de F(ab') <hk>POD (Biozol, n° de cat. 206005) en 2% BSA, 0.1% Tween 20, como anticuerpo de detección, en un agitador de placas de microvaloración a temperatura ambiente durante 1 h. Se elimina por triple lavado el anticuerpo de detección no fijado con 300 µ?/???? de PBST y se detecta el anticuerpo de detección fijado por adición de 100 µ? de ABTS/pozo. Se efectúa la determinación de la absorbancia en un espectrómetro del tipo Tecan Fluor a una longitud de onda de medición de 405 nm (longitud de onda de referencia: 492 nm) .
BIACORE de fijación sobre la ANG-2 Se investiga la fijación de los anticuerpos sobre el antígeno, p.ej. la ANG-2 humana, por resonancia de plasmón de superficie empleando un instrumento BIACORE T100 (GE Healthcare Biosciences AB, Upsala, Suecia) . Resumiendo, para las mediciones de afinidad se inmovilizan los anticuerpos policlonales de cabra anti<hIgG-Fcgamma> sobre un chip CM4 mediante condensación de amina para la presentación de los anticuerpos contra la ANG-2 humana. Se mide la fijación en una solución amortiguadora HBS (HBS-P (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0.005% Tween 20, de pH 7.4), a 25°C. Se agrega en varias concentraciones entre 0 41 nM y 200 nM en solución la ANG-2-His (R&D Systems, o purificada en la propia empresa) . Se mide la asociación por una inyección de la ANG-2 de 3 minutos; se mide la disociación por lavado de la superficie del chip con solución amortiguadora HBS durante 3 minutos y se estima un valor KD empleando un modelo de fijación 1:1 de Langmuir. Debido al carácter heterogéneo de la preparación de la A G-2 no se observa fijación 1:1; por tanto, los valores KD son solamente estimaciones relativas. Los datos de control negativo (p.ej. curvas de solución amortiguadora) se restan de las curvas de muestra para corregir la deriva de la línea de base intrínseco del sistema y para reducir la señal de ruido. Para el análisis de los sensorgramas y para el cálculo de los datos de afinidad se emplea el programa informático Biacore T100 Evaluation Software, versión 1.1.1. Como alternativa, se puede capturar la Ang-2 con un nivel de captura de 2000-1700 RU mediante un anticuerpo penta-His (PentaHis-Ab sin BSA, Qiagen, n° 34660) que se inmoviliza sobre un chip CM5 mediante una condensación de amina (sin BSA) (ver más abajo) .
Inhibición de la fijación de la huANG-2 sobre la Tie-2 (ELISA) Se realiza el ELISA de interacción en placas de microvaloración de 384 pozos (MicroCoat, DE, n° de cat. 464718) a t.amb. Después de cada paso de incubación se lavan las placas 3 veces con PBST. Se recubren las placas ELISA con 0.5 g/ml de proteína Tie-2 (R&D Systems, UK, n° de cat. 313-TI) durante por lo menos 2 horas (h) . A continuación se bloquean los pozos con PBS suplementado con 0.2% Tween-20 y 2% BSA (Roche Diagnostics GmbH, DE) durante 1 h. Se incuban las diluciones de anticuerpos purificados en PBS junto con 0.2 g/ml de hu-angiopoyetina-2 (R&D Systems, UK, n° de cat. 623 -AN) a t.amb. durante 1 h. Después de lavar se agrega una mezcla de 0.5 pg/ml del clon BAM0981 biotinilado anti-angiopoyetina-2 (R&D Systems, UK) y se agrega una dilución 1:3000 de la estreptavidina HRP (Roche Diagnostics GmbH, DE, n° de cat. 11089153001) durante 1 h. A continuación se lavan las placas 6 veces con PBST. Se revelan las placas con un reactivo ABTS recién preparado (Roche Diagnostics GmbH, DE, amortiguador n° 204 530 001, tabletas n° 11 112 422 001) a t.amb. durante 30 minutos. Se mide la absorbancia a 405 nm. Inhibición de la fijación de la huANG-1 sobre la Tie-2 (ELISA) Se realiza el ELISA de interacción en placas de microvaloración de 384 pozos (MaxiSorb Nunc, n° de cat. 442768) a t.amb. Después de cada paso de incubación se lavan las placas 3 veces con PBST. Se recubren las placas ELISA con 0.5 g/ml de proteína Tie-2 (R&D Systems, UK, n° de cat. 313-TI o material producido en la propia empresa) durante por lo menos 2 horas (h) . A continuación se bloquean los pozos con PBS suplementado con 0.2% Tween-20 y 2% BSA (Roche Diagnostics GmbH, DE) durante 1 h. Se incuban las diluciones de anticuerpos purificados en PBS junto con 0.2 g/ml de huangiopoyetina-1 (R&D Systems, UK, n° de cat. 623-AN/CF) a t. amb. durante 1 h. Después de lavar se agrega una mezcla de 0.5 g/ml del clon biotinilado anti-angiopoyetina-1 (R&D Systems, n° BAF923) y se agrega una dilución 1:3000 de la estreptavidina HRP (Roche Diagnostics GmbH, DE, n° de cat . 11089153001) durante 1 h. A continuación se lavan las placas 6 veces con PBST. Se revelan las placas con un reactivo ABTS recién preparado (Roche Diagnostics GmbH, DE, amortiguador n° 204 530 001, tabletas n° 11 112 422 001) a t.amb. durante 30 minutos. Se mide la absorbancia a 405 nm.
Generación de la línea celular HEK293-Tie2 Con el fin de determinar la interferencia de los anticuerpos contra la angiopoyetina-2 en la fosforilación de la Tie2 estimulada por la A GPT2 y la fijación de la A GPT2 sobre la Tie2 en las células se genera una línea celular recombinante HEK293-Tie. Resumiendo, se transfecta un plásmido basado en el pADNc3 (RB22-pADNc3 Topo hTie2) que codifica a la Tie2 humana de longitud completa (SEQ ID 108) bajo el control de un promotor CMV y un marcador de resistencia a la neomicina empleando el Fugene (Roche Applied Science) como reactivo de transfección a las células HEK293 (ATCC) y se seleccionan las células resistentes en DMEM 10 % FCS, 500 µg/ml de G418. Se aislan los clones individuales en un cilindro de clonación y después se analizan para determinar la expresión de la Tie2 mediante un FACS . Se identifica el clon como el clon que tiene una expresión de Tie2 estable y elevado, incluso en ausencia del G418 (HEK293-Tie2 clon 22) . A continuación se emplea el HEK293-Tie2 clon 22 para los ensayos celulares: el ensayo de fosforilación de la Tie2 inducida por la ANGPT2 y el ensayo de fijación de ligando celular sobre la A GPT2.
Ensayo de fosforilación de la Tie2 inducida por la ANGPT2 La inhibición de la fosforilación de la Tie2 inducida por la ANGPT2 con los anticuerpos contra la ANGPT2 se mide con arreglo al siguiente principio de ensayo. Se estimula el HEK293-Tie2 clon 22 con ANGPT2 durante 5 minutos en ausencia o presencia del anticuerpo contra la ANGPT2 y se cuantifica la P-Tie2 con un ensayo sandwich ELISA. Resumiendo, se cultivan 2xl05 células HEK293-Tie2 clon 22 por pozo durante una noche en una placa de microvaloración de 96 pozos recubierta con poli-D-lisina en 100 µ? de DMEM, 10% FCS, 500 g/ml de geneticina. Al día siguiente se prepara una serie de valoraciones de anticuerpos ANGPT2 en una placa de microvaloración (concentración 4 veces mayor, volumen final/pozo: 75 µ?, duplicados) y se mezclan con 75 µ? de una dilución de ANGPT2 (R&D Systems, n° 623-AN) (3.2 g/ml en forma de solución de concentración 4 veces mayor) . Se preincuban los anticuerpos y la ANGPT2 a temperatura ambiente durante 15 min. Se agregan 100 µ? de la mezcla a las células del HEK293-Tie2 clon 22 (pre- incubadas durante 5 min con 1 mM NaV304, Sigma, n° S6508) y se incuban a 37°C durante 5 min. A continuación se lavan las células con 200 µ? de PBS enfriado con hielo + 1 mM NaV304 por pozo y se lisan por adición de 120 µ? de amortiguador de lisis (20 mM Tris, pH 8.0, 137 mM NaCl, 1% NP-40, 10% glicerina, 2 mM EDTA, 1 mM NaV304, 1 mM PMSF y 10 pg/ml de aprotinina) por pozo sobre hielo. Se lisan las células a 4°C durante 30 min en un agitador de placas de microvaloración y se trasvasan directamente 100 µ? de lisado a la placa de microvaloración ELISA de la p-Tie2 ( R&D Systems, R&D n° DY990) sin centrifugación previa y sin determinación de la proteína total. Se determinan las cantidades de la P-Tie2 con arreglo a las instrucciones del fabricante y se hallan los valores IC50 de inhibición empleando el programa informático de análisis XLfit4 analysis plug-in para Excel (dosis-respuesta, un sitio, modelo 205) . Los valores IC50 pueden compararse durante el ensayo, pero pueden variar de un ensayo a otro.
Ensayo de fosforilación de la Tie2 inducida por la ANGPT1 La inhibición de la fosforilación de la Tie2 inducida por la ANGPT1 con los anticuerpos contra la ANGPT1 se mide con arreglo al siguiente principio de ensayo. Se estimula el HEK293-Tie2 clon 22 con ANGPT1 durante 5 minutos en ausencia o presencia del anticuerpo contra la A GPTa y se cuantifica la P-Tie2 con un ensayo sandwich ELISA. Resumiendo, se cultivan 2x10s células HEK293-Tie2 clon 22 por pozo durante una noche en una placa de microvaloración de 96 pozos recubierta con poli-D-lisina en 100 µ? de DMEM, 10% FCS, 500 g/ml de geneticina. Al día siguiente se prepara una serie de valoraciones de anticuerpos contra la ANGPT1 en una placa de microvaloración (concentración 4 veces mayor, volumen final/pozo: 75 µ?, duplicados) y se mezclan con 75 µ? de una dilución de A GPT1 (R&D Systems, n° 923-AN) (0.8 pg/ml en forma de solución de concentración 4 veces mayor) . Se preincuban los anticuerpos y la ANGPT1 a temperatura ambiente durante 15 min. Se agregan 100 µ? de la mezcla a las células del HEK293-Tie2 clon 22 (pre-incubadas durante 5 min con 1 mM NaV304, Sigma, n° S6508) y se incuban a 37°C durante 5 min. A continuación se lavan las células con 200 µ? de PBS enfriado con hielo + 1 mM NaV304 por pozo y se lisan por adición de 120 µ? de amortiguador de lisis (20 mM Tris, pH 8.0, 137 mM NaCl, 1% NP-40, 10% glicerina, 2 mM EDTA, 1 mM NaV304 , 1 mM PMSF y 10 µg/ml de aprotinina) por pozo sobre hielo. Se lisan las células a 4°C durante 30 min en un agitador de placas de microvaloración y se trasvasan directamente 100 µ? de lisado a la placa de microvaloración ELISA de la p-Tie2 (R&D Systems, R&D ne DY990) sin centrifugación previa y sin determinación de la proteína total. Se determinan las cantidades de la P-Tie2 con arreglo a las instrucciones del fabricante y se hallan los valores IC50 de inhibición empleando el programa informático de análisis XLfit4 analysis plug-in para Excel (dosis-respuesta, un sitio, modelo 205) . Los valores IC50 pueden compararse durante el ensayo, pero pueden variar de un ensayo a otro.
Ejemplos Ejemplo 1 Expresión y purificación de anticuerpos monoclonales contra la <ANG-2>: Ang2i-LC06, Ang2i-LC07 y Ang2k-LC08 Se construyen las cadenas ligeras y cortas de los correspondientes anticuerpos Ang2i-LC06, Ang2i-LC07 y Ang2k-LC08 en vectores de expresión del modo antes descrito. Se clona la cadena pesada y la cadena ligera kappa en un cassette de expresión genómico, mientras que la cadena ligera lambda se clona en forma de ADNc con el intrón A (figura IB) . Se amplifican los plásmidos en E. coli, se purifican y después se transfectan para la expresión transitoria de las proteínas recombinantes en células HEK293-F (empleando el sistema FreeStyle 293 de Invitrogen) . Pasados 7 días se recolectan los líquidos sobrenadantes que contienen las células HEK 293-F, se filtran y se purifican los anticuerpos por cromatografía de proteína A y de exclusión de tamaños. Se confirma la homogeneidad de todos los anticuerpos por SDS-PAGE en condiciones no reductoras y reductoras y por cromatografía analítica de exclusión de tamaños. En condiciones reductoras (figuras 1A y IB) , las cadenas ligeras de polipéptidos de los anticuerpos <ANG-2> después de la SDS-PAGE presentan tamaños moleculares aparentes de aprox. 50 kDa, similares a los pesos moleculares calculados; las cadenas cortas de polipéptidos presentan masas moleculares aparentes de 25 kDa acordes con su tamaño previsto. La espectrometría de masas confirma la identidad de los anticuerpos purificados. Los niveles de expresión de todos los constructos se analizan por HPLC de proteína A.
Análisis de cromatografía de exclusión de tamaño del material purificado. Todos los anticuerpos se obtienen y se caracterizan analíticamente de modo similar al procedimiento descrito. Los datos SEC de los anticuerpos correspondientes se recogen en la tabla siguiente. masa masa SEC (%) cadena de teórica experimental pico anticuerpo (Da) (Da) pral . 50325 (piro- HC 50343 <ANG-2>Ang- Glu) 99.7% 2i_LC07 22720 (piro- LC 22738 Glu) 50325 (piro- HC 50343 <ANG-2>Ang- Glu) 99.8% 2i_LC06 22605 (piro- LC 22620 Glu) 49527 (piro- HC 49544 <A G-2>Ang- Glu) 99.8% 2k_LC08 22667 (piro- LC 22685 Glu) Ejemplo 2 Ensayo ELISA de fijación sobre la ANG-1 y la ANG-2 humanas La fijación de los anticuerpos <ANG-2> Ang2i-LC06, Ang2i-LC07 y Ang2k-LC08 sobre la ANG-1 y la ANG-2 humanas se determina en un ensayo ELISA de fijación sobre la ANG-1 o la ANG-2 del modo descrito anteriormente. Resumiendo, el ensayo de ELISA se basa en la inmovilización de la angiopoyetina-1 ó 2 humana de tipo salvaje en una placa de microvaloración. Se mide la fijación de un anticuerpo dirigido contra la ANG-1 o la ANG-2 inmovilizadas mediante un anticuerpo <Fc humano> (anti-IgG) con un conjugado POD. Una serie de diluciones del anticuerpo <ANG-2> permite determinar una concentración de EC50. Como referencia se toma el anticuerpo anti-ANG-2 humana, el anticuerpo Mab536 <ANG-2> (Oliner et al., Cáncer Cell. Nov 6 (2004) 507-16, US 2006/0122370). Las concentraciones EC50 determinadas se resumen en la siguiente tabla.
Todos los anticuerpos mencionados se fijan sobre la ANG-2. El MAb536 y el Ang2k-LC08 muestran también una fijación específica sobre la A G-1, mientras que el Ang2i-LC06 y el Ang2i-LC07 no se unen específicamente a la ANG-1 ya que tienen un valor EC50 superior a 8000 ng/ml (límite de detección) .
Ejemplo 3 Fijación sobre la ANG-2 mediante Biacore Se examina la afinidad de fijación sobre la ANGPT2 humana con un ensayo Biacore del modo antes descrito. Resumiendo, en este ensayo se inmoviliza un anticuerpo capturador (anti-Fc) sobre la superficie de un chip Biacore, que captura y . presenta al anticuerpo correspondiente (por ejemplo el Ang2i-LC06) . Se captura el ligando (en este caso, la ANGPT2) de la solución. Se determina la afinidad de esta interacción suponiendo que se trata de una interacción 1:1. Los detalles de este ensayo se encontrarán en la sección de métodos generales. Se determinan las afinidades de la fijación sobre la ANGPT2 (KD) , que se resumen en la tabla siguiente.
Los anticuerpos Ang2i-LC06 y Ang2k se fijan sobre la ANGPT2 con mucha afinidad.
Ejemplo 4 Neutralización de la interacción ANGPTl/2 -Tie2 (humana) Se demuestra el bloqueo de la interacción de la ANGPTl/2 humanas/ Tie2 humana por un ensayo ELISA DE interacción con el receptor. Se recubren placas Maxisorp (Nunc) de 384 pozos con 0.5 g/ral de Tie2 humana (R&D Systems, UK, n° de cat. 313 -TI o material producido en la propia empresa) a temperatura ambiente durante 2 h y se bloquean con PBS suplementado con 0.2% de Tween-20 y 2% de BSA (Roche Diagnostics GmbH, DE) a temperatura ambiente durante 1 h con agitación. Paralelamente se incuban las diluciones de los anticuerpos purificados en PBS junto con 0.2 µg/ml de huAngiopoyetina-1/2 (R&D Systems, n° 923-A /CF, R&D Systems, UK, n° de cat. 623 -A o material preparado en la propia empresa) a t.amb. durante 1 h. Después de lavar una mezcla de 0.5 g/ml del clon de anti-Angiopoyetina-1/2 biotinilado (R&D Systems, UK, n° BAF923, BAM0981) y se agrega la estreptavidina-HRP diluida 1:3000 (Roche Diagnostics GmbH, DE, n° de cat. 11089153001) durante 1 h. A continuación se lavan las placas 6 veces con PBST. Se revelan las placas con reactivos ABTS recién preparado (Roche Diagnostics GmbH, DE, amortiguador n° 204 530 001, tabletas n° 11 112 422 001) a t.amb. durante 30. Se mide la absorbancia a 405 nm.
Las concentraciones inhibidoras halladas se resumen en la tabla siguiente.
En la tabla anterior se presentan los diferentes perfiles de selectividad de los dos anticuerpos Ang2i-LC06 y Ang2k-LC08. El Ang2i-LC06 es selectivo de la ANGPT2, mientras que el Ang2k-LC08 tiene reactividad cruzada con las ANGPTl/2 en un ensayo de inhibición de la interacción ANGPTl/2 Tie2.
Ejemplo 5 Fosforilación de la Tie2 Se examina la capacidad de los anticuerpos anti-ANGPT2 identificados para interferir en la fosforilación de la Tie2 mediada por la AGPT2 y la AGPT1 en ensayos de fosforilación de la Tie2 inducida por la ANGPT2 y la AGPT1 del modo descrito anteriormente. En la figura 3 se incluye una representación esquemática del procedimiento de ensayo.
Tanto el anticuerpo Ang2i-LC06 como el Ang2k-LC08 presentan una interferencia dependiente de la dosis en la fosforilación de la Tie2 estimulada por la ANGPT2 tal como se representa en la figura 4, con valores IC50 comparables. El Ang2i-LC06 interfiere en la fosforilación de la Tie2 estimulada por la ANGPT2 con un valor IC50 de aprox. 508 ng/ml y el Ang2k-LC08 interfiere en la fosforilación de la Tie2 estimulada por la ANGPT2 con un valor IC50 de aprox. 499 ng/ml. En cambio, solamente el Ang2k-LC08 interfiere en la fosforilación de la Tie2 estimulada por la ANGPT1 con un valor IC50 de aprox. 391 ng/ml, mientras que el Ang2i-LC06 no interfiere en la fosforilación de la Tie2 estimulada por la AGPT2 para el mismo intervalo de concentraciones estudiado (figura 5) .
Ejemplo 6: Eficacia in vivo Efecto de los anticuerpos anti-A GPT en el crecimiento del injerto ajeno de Colo205 Eficacia in vivo de los anticuerpos <A GPT2> Ang2i-LC06 y Ang2k-LC08 frente al Mab536 <ANGPT2> en un modelo de injerto ajeno de Colo205 inyectado por vía subcutánea Se comparan los anticuerpos purificados Ang2i-LC06 y Ang2k-LC08 con el anticuerpo Mab536 en modelo de injerto ajeno de Colo205 subcutáneo gradual (Ang2_PZ_Colo205_006) en ratones Scid hembras beige.
Anticuerpos: se emplea el Mab536 en forma de solución patrón congelada (c = 4.5 mg/ml) , se emplean el Ang2i-LC06 y el Ang2k-LC08 en forma de solución patrón congelada (c = 1 mg/ml) en 20 mM histidina, 140 mM NaCl, pH = 6.0. Se diluye la solución de anticuerpos de forma apropiada en PBS a partir de inyecciones previas del patrón, si fuera necesario, y se aplica el PBS como vehículo. Como control positivo se emplea en anticuerpo anti-IgE IgGl humanizado Xolair (omalizumab) , que se adquiere en la farmacia.
Líneas celulares y condiciones de cultivo: se obtienen originalmente las células de cáncer colorrectal humano Colo205 de la ATCC y después de la expansión se depositan en el banco celular interno de Roche en Penzberg. Se cultiva la línea celular tumoral de forma habitual en medio RPMI 1640 (PAA, Laboratories, Austria) suplementado con un 10% de suero fetal bovino (PAA Laboratories, Austria) y 2 mM L-glutamina, a 37°C en una atmósfera saturada de agua con un 5% de C02. Se emplea el pasaje 3 para el trasplante.
Animales : los ratones SCID hembras de color beige (obtenidos de Charles River, Alemania) se mantienen en condiciones específicas, libres de patógenos, con ciclos diarios de 12 h de luz/12 h de oscuridad, con arreglo a directivas convenidas (GV-Solas; Felasa; TierschG) . Se revisa el protocolo de estudio experimental y se somete a la aprobación del gobierno local. Después de la recepción, los animales se mantienen en la zona de cuarentena de la instalación animal durante una semana, para que se vayan acostumbrando al entorno y para someterlos a observación. Se efectúa un seguimiento continuo de su estado de salud sobre una base regular. Se les facilita pienso (Provimi Kliba 3337) y agua (acidificada a pH 2.5-3) a placer. En el momento de iniciar el estudio, los ratones tienen una edad aproximada de 12-14 semanas.
Seguimiento: se controlan a diario los síntomas clínicos de los animales y se detectan los efectos adversos. Para el seguimiento a lo largo del ensayo se anotan el peso corporal de los animales y se mide con un calibre el volumen del tumor después de la exposición.
Inyección de células tumorales: el día de la inyección se centrifugan las células Colo205, se lavan una vez y se suspenden de nuevo en PBS . Después de un lavado adicional con PBS se determinan la concentración celular y el tamaño celular empleando un contador de células y un sistema analizador (ViCELL, Beckman Coulter) . Para la inyección de las células Colo205 se ajusta la concentración final a 5.0 x 107 células/ml, de una viabilidad aprox. del 90%. A continuación se inyectan por vía s.c. a cada animal 100 µ? de esta suspensión, equivalentes a 2.5*106 células por animal, eligiendo para ello el flanco derecho de los ratones.
Tratamiento de los animales: el tratamiento de los animales se inicia el día de su división en grupos aleatorios, 16 días después del trasplante de las células (estudio Ang2_PZ_Colo205_006 ) , con un volumen tumoral medio de 178 mm3.
Régimen de dosificación del estudio Ang2_PZ_Colo205_006 : En la figura 6 se representan la inhibición del creci-miento tumoral hasta el día 50. Los datos indican que el anticuerpo Ang2i-LC06 selectivo de la ANGPT2 es el anticuerpo más activo (índice de control tumoral (TCR) = 0.39). El Ang2i-LC06 es más eficaz para inhibir el crecimiento tumoral que el anticuerpo MAb536 (valor TCR = 0.47) y que el anticuerpo Ang2k-LC08 selectivo de la ANGPT2, que reacciona también con la ANGPT1 (valor TCR = 0.46) .
Efecto de los anticuerpos anti-ANGPT en el crecimiento del injerto ajeno de KPL-4 Eficacia in vivo de los anticuerpos <ANGPT2> Ang2i-LC06 y Ang2k-LC08 comparados con el Mab536 <ANGPT2> en un modelo de injerto ajeno de KPL-4 inyectado ortotópico Se comparan los anticuerpos purificados Ang2i-LC06 y Ang2k-LC08 con el anticuerpo Mab536 en el modelo de injerto ajeno de KPL-4 inyectado ortotópico (Ang2_PZ_KPL-4_002) en ratones Scid hembras de color beige.
Anticuerpos: se emplea el Mab536 en . forma de solución patrón congelada (c = 4.5 mg/ml) , se emplean el Ang2i-LC06 y el Ang2k-LC08 en forma de solución patrón congelada (c = 1 mg/ml) en 20 mM histidina, 140 mM NaCl, pH = 6.0. Se diluye la solución de anticuerpo de modo apropiado en PBS a partir de inyecciones previas del patrón, si fuera necesario, y se aplica PBS como vehículo.
Líneas celulares y condiciones de cultivo: se obtienen originalmente las células KPL-4 de cáncer de mama humano a partir de la efusión pleural maligna de una paciente de cáncer de mama con metástasis inflamatoria cutánea. Las células KPL-4 nos han sido facilitadas gentilmente por el catedrático Prof. J. Kurebayashi (Kawasaki Medical School, Kurashiki, Japón) . Se cultivan las células tumorales del modo habitual en medio D EM (PAN Biotech, Alemania) suplementado con un 10% de suero fetal bovino (PAN Biotech, Alemania) y 2 mM L-glutamina (PAN Biotech, Alemania) a 37 °C en una atmósfera saturada de agua con un 5 % de C02. Se realiza el pasaje de cultivo dividiéndolo tres veces/semana con tripsina/EDTA lx (PAN) .
Animales: se mantienen los ratones SCID hembras de color beige (adquiridos a Charles River, Alemania) en condiciones específicas libres de patógenos con ciclos diarios de 12 h de lúz/12 h de oscuridad, con arreglo a directivas convenidas (GV-Solas; Felasa; TierschG) . Se revisa el protocolo de estudio experimental y se somete a la aprobación del gobierno local. Después de la recepción, los animales se mantienen en la zona de cuarentena de la instalación animal durante una semana, para que se vayan acostumbrando al entorno y para someterlos a observación. Se efectúa un seguimiento continuo de su estado de salud sobre una base regular. Se les facilita pienso (Provimi Kliba 3337) y agua (acidificada a pH 2.5-3) a placer. En el momento de iniciar el estudio, los ratones tienen una edad aproximada de 12 semanas .
Seguimiento: se controlan a diario los síntomas clínicos de los animales y se detectan los efectos adversos. Para el seguimiento a lo largo del ensayo se anotan el peso corporal de los animales y se mide con un calibre el volumen del tumor después de la exposición.
Inyección de células tumorales : el día de la inyección se recogen las células tumorales (tripsina-EDTA) de los frascos de cultivo (Greiner TriFlasks) y se transfieren a 50 mi de medio de cultivo, se lavan una vez y se suspenden de nuevo en PBS. Después de un paso adicional de lavado con PBS y filtración (tamiz celular, Falcon™, 100 µ??) , se ajusta la concentración celular final a 1.5 x 108/ml. Se mezcla cuidadosamente la suspensión de células tumorales con una pipeta de transferencia para evitar la agregación celular. Se realiza la anestesia empleando una unidad inhalativa de Stephen para animales pequeños con cámara de preincubación (plexiglás) , máscara inhaladora individual para ratones (silicona) y el compuesto de anestesia isoflurano no inflamable ni explosivo (Pharmacia-Upjohn, Alemania) en un sistema cerrado de circulación. Dos días antes de la inyección se afeita el pelaje de los animales. Para la inyección i.m.f.p. se inyectan las células por vía ortotópica en un volumen de 20 µ? (3*106/animal) en el penúltimo colchón graso mamario inguinal derecho de cada ratón anestesiado. Para la implantación ortotópica, se inyecta la suspensión celular a través de la piel debajo de la tetilla empleando una jeringuilla microlitro Hamilton y una aguja 30Gxl/2" .
El tratamiento de los animales se inicia el día de su división aleatoria en grupos, cuando los tumores alcanzan un tamaño de 60-180 mm 3.35 días después del trasplante de las células (estudio Ang2_PZ_KPL-4_002) con un volumen tumoral medio de aprox. 90 mm3.
Régimen de dosificación del estudio Ang2_PZ_ PL-4_002 : En la figura 7 se representa la inhibición del crecimiento tumoral hasta el día 64. Los datos indican que el anticuerpo Ang2i-LC06 selectivo de la A GPT2 es el anticuerpo más eficaz (valor TCR = 0.55) en el modelo KPL-4. El Ang2i-LC06 es más eficaz para inhibir el crecimiento tumoral que el anticuerpo MAb536 (valor TCR = 0.57) y que el anticuerpo Ang2k-LC08 selectivo de la ANGPT2 pero que reacciona también con la ANGPT1 (valor TCR = 0.57) .
Ejemplo 7 Fijación sobre la ANG-1 mediante un Biacore Se examina la afinidad de fijación sobre la ANG-1 humana en un ensayo Biacore: se inmoviliza la huAng-1 sobre un chip biosensor C 5 aplicando una reacción química de condensación de amina. Se inyecta la proteína durante 20 min en acetato de sodio, pH = 4.5, a razón de 10 g/ml con un caudal de 5 µ?/min. Esto produce una densidad superficial de aprox. 20000 RU. En el flujo celular de referencia se inmoviliza BSA en las mismas condiciones. Se diluyen los anticuerpos en HBS-P hasta 100 nM y se inyectan durante 3 min (fase de asociación) . Después de lavar con solución amortiguadora de trabajo durante 3 min (fase de disociación) , se regenera la superficie inyectando hidróxido de sodio 10 mM durante 1 min a razón de 5 µ?/min. Los resultados se presentan en la figura 8: el Ang2k_LC08 tiene una vida media de disociación de complejo de aproximadamente 50 s, el Ang2i_LC06 de aprox. 5 s y el Ang2i_LC10 no se fija a ANG-1.
Ejemplo 8: Prevención de metástasis/tumores secundarios in vivo en animales que llevan tumores primarios a) Prevención de metástasis/tumores secundarios en ratones que se han sometido a un injerto ajeno de tumores Colo205 primarios Líneas celulares y condiciones de cultivo: Se obtienen originalmente las células de cáncer colorrectal humano Colo205 de la ATCC y después de la expansión se depositan en el banco celular interno de Roche en Penzberg. Se cultiva la línea celular tumoral de forma habitual en medio RPMI 1640 (PAA, Laboratories, Austria) suplementado con un 10% de suero fetal bovino (PAA Laboratories, Austria) y 2 mM L-glutamina, a 37 °C en una atmósfera saturada de agua con un 5% de C02. Se emplea el pasaje 3 para el trasplante.
Animales : Los ratones SCID hembras de color beige (obtenidos de Charles River, Alemania) se mantienen en condiciones específicas, libres de patógenos, con ciclos diarios de 12 h de luz/12 h de oscuridad, con arreglo a directivas convenidas (GV-Solas; Felasa; TierschG) . Se revisa el protocolo de estudio experimental y se somete a la aprobación del gobierno local. Después de la recepción, los animales se mantienen en la zona de cuarentena de la instalación animal durante una semana, para que se vayan acostumbrando al entorno y para someterlos a observación. Se efectúa un seguimiento continuo de su estado de salud sobre una base regular. Se les facilita pienso (Provimi Kliba 3337) y agua (acidificada a pH 2.5-3) a placer. En el momento de iniciar el estudio, los ratones tienen una edad aproximada de 10 semanas.
Inyección de células tumorales: ' El día de la inyección se recogen las células tumorales ( tripsina-EDTA) de los matraces de cultivo (Greiner) y se transfieren a 50 mi de medio de cultivo, se lavan una vez y se suspenden de nuevo en PBS. Después de un paso adicional de lavado con PBS y filtración (tamiz celular, Falcon, 0 = 100 µ??) , se ajusta la concentración celular final a 2.5 x 107/ml. Se mezcla cuidadosamente la suspensión de células tumorales con una pipeta de transferencia para evitar la agregación celular. Se realiza la anestesia empleando una unidad inhalativa de Stephen para animales pequeños con cámara de preincubación (plexiglás) , máscara inhaladora individual para ratones (silicona) y el compuesto de anestesia isoflurano no inflamable ni explosivo (cp-pharma) en un sistema cerrado de circulación. Dos días antes de la inyección se afeita el pelaje de los animales y para la inyección se levanta cuidadosamente la piel de los animales anestesiados con un fórceps anatómico y se inyectan por vía subcutánea 100 µ? de suspensión celular (= 2.5 x 106 células) en el flanco derecho de los animales. Se hace el seguimiento del crecimiento de los tumores primarios (datos no presentados) .
Seguimiento de tumores secundarios p.ej. en el pulmón por cuantificación de las secuencias Alu humanas Al término del estudio (día 103) se extraen los pulmones de los animales de todos los grupos. Resumiendo, se transfieren inmediatamente las muestras a nitrógeno líquido. En un paso posterior se aisla el ADN total de las muestras con un instrumento MagNA Puré LC con arreglo a las instrucciones del fabricante. Se eligen cebadores específicos Alu humanos para la amplificación selectiva de las secuencias Alu por PCR cuantitativa (instrumento LightCycler) (T. Schneider et . al., Clin. Exp. Metas. 2002; 19: 571-582).
Tratamiento de los animales Se inicia el tratamiento de los animales con avastina (10 mg/kg i.p. una vez por semana) 14 días después del trasplantes de las células (estudio Ang2_PZ_Colo205_008) en un volumen tumoral promedio de 340 mm3. Pasadas 7 semanas se dividen los ratones aleatoriamente en grupos para el posterior tratamiento secundarios, que se inicia el día 51 con los compuestos que figuran en la siguiente tabla. Tratamiento secundario, que se inicia el día 51 del estudio Ang.2_PZ_Colo205_008. n° de dosis n" de dosis vía/modo de grupo Compuesto trataacumulada animales (mg/kg) administración mientos (mg/kg) i.p. vina vez por 1 10 avastina 10 mg/kg 11 110 semana LC06 + 10 mg/kg i.p. una vez por 6 60 avastina 10 mg/kg semana 11 110 2 10 i.p. una vez por semana LC06 10 mg/kg i.p. una vez por 6 60 3 10 semana En la tabla siguiente se resumen los resultados de la prevención de metástasis/tumores secundarios (en el pulmón) , que se representan en la figura 9A Tabla 1: La cuantificacion del ADN ALU humano en los pulmones de ratones que originalmente llevaban tumores Colo205 primarios, después del tratamiento con diferentes anticuerpos Los resultados indican una prevención notablemente mejorada de los tumores secundarios/metástasis cuando se compara el ANG2Í-LC06 con la avastina. b) Prevención de la metástasis/tumores secundarios en ratones a los que se ha sometido a un injerto ajeno de tumores KPL-4 primarios Línea celular tumoral Se ha definido la línea celular KPL-4 de cáncer de mama humano (células que el catedrático Prof. Kurebayashi nos ha cedido amablemente) a partir de la efusión pleural maligna de una paciente de cáncer de mama con metástasis inflamatoria cutánea. Las células tumorales se cultivan del modo habitual en medio DMEM (PAN Biotech, Alemania) suplementado con un 10% de suero fetal bovino (PAN Biotech, Alemania) y 2 mM L-glutamina (PAN Biotech, Alemania) a 37 °C en una atmósfera saturada de agua con un 5 % de 002. Se realiza el pasaje de cultivo dividiéndolo tres veces/semana con tripsina/EDTA lx (PAN) .
Ratones Después de su recepción, se mantienen los ratones SCID hembras de color beige (adquiridos a Charles River, Sulzfeld, Alemania) en la zona de cuarentena de la instalación animal durante una semana, para que se vayan acostumbrando al entorno y para someterlos a observación. Se efectúa un seguimiento continuo de su estado de salud. Se mantienen los ratones en condiciones SPF con arreglo a directivas internacionales (GV-Solas; Felasa; TierschG) con ciclos diarios de 12 h de luz/12 h de oscuridad. Se les facilita pienso (Provimi Kliba 3337) y agua (filtrada) a placer. Se revisa el protocolo de estudio experimental y se somete a la aprobación del gobierno local (gobierno de Baviera Superior; n° de registro: 211.2531.2-22/2003).
Inyección de células tumorales El día de la inyección se recogen las células tumorales ( tripsina-EDTA) de los matraces de cultivo (Greiner TriFlask) y se transfieren a 50 mi de medio de cultivo, se lavan una vez y se suspenden de nuevo en PBS . Después de un paso adicional de lavado con PBS y filtración (tamiz celular, Falcon, 0 = 100 µp?) , se ajusta la concentración celular final a 1.5 x 108/ml. Se mezcla cuidadosamente la suspensión de células tumorales con una pipeta de transferencia para evitar la agregación celular. Se realiza la anestesia enpleando una unidad inhalativa de Stephen para animales pequeños con cámara de preincubación (plexiglás) , máscara inhaladora individual para ratones (silicona) y el compuesto de anestesia isoflurano no inflamable ni explosivo (Pharmacia-Upj ohn, Alemania) en un sistema cerrado de circulación. Dos días antes de la inyección se afeita el pelaje de los animales. Para la inyección i.m.f.p. se inyectan las células por vía ortotópica en un volumen de 20 µ? en el penúltimo colchón graso mamario inguinal derecho de cada ratón anestesiado. Para la implantación ortotópica, se inyecta la suspensión celular a través de la piel debajo de la tetilla empleando una jeringuilla microlitro Hamilton y una aguja 30Gxl/2". Se hace el seguimiento del crecimiento de los tumores primarios (datos no presentados) .
Seguimiento de los tumores secundarios p.ej. en el pulmón por cuantificación de las secuencias Alu humanas Al término del estudio (día 103) se extraen los pulmones de los animales de todos los grupos. Resumiendo, se transfieren inmediatamente las muestras a nitrógeno líquido. En un paso posterior se aisla el ADN total de las muestras con un instrumento MagNA Puré LC con arreglo a las instrucciones del fabricante. Se eligen cebadores específicos Alu humanos para la amplificación selectiva de las secuencias Alu por PCR cuantitativa (instrumento LightCycler) (T. Schneider et. al., Clin. Exp. Metas. 2002; 19: 571-582).
Tratamiento de los animales Se inicia el tratamiento de los animales 35 días después del trasplante de las células en un volumen tumoral promedio de 60-160 mm3. Los compuestos y el régimen de dosificación figuran en la siguiente tabla.
En la tabla siguiente se listan los resultados de la prevención de metástasis/tumores secundarios (en el pulmón) , que se representan en la figura 9B Tabla 2: Cuantif icación del ADN ALU humano en los pulmones de ratones que originalmente llevaban tumores KPL4 primarios, después del tratamiento con diferentes anticuerpos Xo!Lair Ang2i_LC06 Ang2i_IC07 Ang2iJ-C08 1101 0.0098 2201 0.0157 4401 0.0273 5501 0.0069 1102 0.0090 2202 0.0516 3302 0.0076 4402 0.0060 5502 0.0261 1103 0.0119 2203 0.0108 3303 0.0413 4403 0.0046 5503 0.0067 1014 0.0405 2204 0.0148 3304 0.0042 4404 0.0164 5504 0.0044 2205 0.0020 3305 0.0041 4405 0.0040 5505 0.0039 1106 0.0381 2206 0.0340 3306 0.0093 4406 0.0044 5506 0.0051 1107 0.0281 2207 0.0141 3307 0.0038 4407 0.0060 5507 0.0037 2208 0.0422 3308 0.0044 4408 0.0174 5508 0.0037 1109 0.0-J21 2209 0.0227 3309 0.0036 4409 0.0314 5509 0.0051 1110 0.0143 2210 0.0383 3310 0.0094 4410 0.0083 5540 0.0200 mediana 0.0132 0.0192 0.0044 0.0072 0.0051 media 0.0205 0.0246 0.0098 0.0126 0.0086 Los resultados indican una prevención muy eficaz de tumores secundarios/metástasis empleando el A G2Í-LC06, ANG2Í-LC07 o ANG2k-LC08.
Ejemplo 9: Efectos en el tratamiento de retinopatía Métodos Se crían cachorros de C57/B16 en diques de cobijo CDl y se exponen a un 75% de oxígeno desde el P7 al P12 (cámara con control de oxígeno P O-OX 110, Biospherix Ltd., Redfield, NY) , lo cual induce la obliteración vascular y el cese de los capilares en el centro de la retina. Se colocan los cachorros y los diques de cobijo en aire normal, lo cual produce una hipoxia relativa y la inducción de la neovascularización. El día P13 se anestesian los cachorros con isofluorano (5 % para la inducción, 3 % para el mantenimiento, combinado con un 1.5 % de oxígeno) , se exponen los ojos y se realizan inyecciones intraoculares de 1 µ? empleando una jeringuilla Nanofil provista de una aguja de calibre 35 (WPI( Sarasota, FL) en el ojo izquierdo. El día P17, se diseccionan ambos ojos, se fijan sobre paraformaldehído del 4 % a 4°C durante 4 h y se diseccionan las retinas. Se permeabilizan las retinas en PBS que contiene un 0.5 % de Tritón X-100 y 1 % de albúmina de suero bovino, se tiñen con 20 g/ml de isolectina B4 biotinilada (Sigma Aldrich, Gillingham, UK) en PBS, de pH 6.8, 1% Triton-XlOO, 0.1 mM CaCl2, 0.1 taM MgCl2, y después con 20 pg/ml de ALEXA 488-estreptavidina (Molecular Probes, Eugene, OR) y se montan . planas en el Vectashield (Vector Laboratories, Burlingame, CA) . Se analizan por la imagen las retinas empleando un microscopio de epifluorescencia Nikon de 4x aumentos. Se realiza la cuantificación de las zonas neovasculares e isquémicas en modo ciego empleando el Photoshop CS3 junto con Image J (NIH) y se expresan en forma de porcentaje de la superficie total de la retina (= normal + isquémica + neovascular) .
Resultados En la figura 10A se muestran retinas representativas montadas planas, cuya vasculatura retinal se visualiza por tinción con isolectina. Las zonas isquémicas del centro inducen la neovascularización y la regneración de vasos retínales por regulación creciente de los inductores angiogénicos . El frente neovascular es hiperproliferativo, lo cual conduce a vasos tortuosos de un modelo vascular irregular. La mayor parte de las zonas externas contienen los vasos normales no afectados. La cuantificación de los montajes planos de la retina indican que la inhibición del VEGF con avastina reduce la neovascularización retinal (ver figura 10B, del 36.7+1.8% sin inyectar al 22.4+3.0% inyectado), como era de esperar. La inhibición de la Ang2 empleando anticuerpos LC06 o LC08 conduce también a una reducción de la neovascularización (del 31.5+1.1% al 18.8±1.3% y del 34.0±3.1% al 25.4±3.4%). La inyección de control empleando la IgG humana no tiene efecto en la neovascularización (ver figura 10B, del 38.3±1.1% al 38.3±0.8%) .
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (22)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :
1. Un anticuerpo que se une específicamente a la angiopoyetina-2 humana (ANG-2) , caracterizado porque comprende como región CDR3 de dominio variable de cadena pesada una región CDR3 de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 41, o SEQ ID NO: 49.
2. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque a) el dominio variable de cadena pesada comprende una región CDR3 de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 41, o SEQ ID NO: 49, una región CDR2 de la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 42, O SEQ ID NO: 50, y una región CDR1 de la SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 43, o SEQ ID NO: 51, y b) el dominio variable de cadena ligera comprende una región CDR3 de la SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO : 44, o SEQ ID NO: 52, una región CDR2 de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 45, O SEQ ID NO: 53, y una región CDR1 de la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO : 46, O SEQ ID NO: 54.
3. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación l, caracterizado porque comprende a) el dominio variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 47, O SEQ ID NO: 55; y b) el dominio variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 48, O SEQ ID NO: 56.
4. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque a) el dominio variable de cadena pesada comprende una región CDR3 de la SEQ ID NO: 1, una región CDR2 de la SEQ ID NO: 2, y una región CDR1 de la SEQ ID NO: 3, y b) el dominio variable de cadena ligera comprende una región CDR3 de la SEQ ID NO: 4, una región CDR2 de la SEQ ID NO: 5, y una región CDR1 de la SEQ ID NO: 6.
5. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque comprende a) el dominio variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 7; y b) el dominio variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 8.
6. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque a) el dominio variable de cadena pesada comprende una región CDR3 de la SEQ ID NO: 17, una región CDR2 de la SEQ ID NO: 18, y una región CDR1 de la SEQ ID NO: 19, y b) el dominio variable de cadena ligera comprende una región CDR3 de la SEQ ID NO: 20, una región CDR2 de la SEQ ID NO: 21, y una región CDR1 de la SEQ ID NO: 22.
7. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque comprende a) el dominio variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 23; y b) el dominio variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 24.
8. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el anticuerpo no se une a la angiopoyetina 1 (ANG-1) humana.
9. El anticuerpo de conformidad con las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque el anticuerpo es del subgrupo lgG4 humano o es del subgrupo IgGl humano.
10. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende un anticuerpo o un fragmento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
11. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque es para la prevención de metástasis.
12. El uso del anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para la fabricación de un medicamento destinado a la prevención de metástasis.
13. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque es para el tratamiento de cáncer.
14. El uso del anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento de cáncer.
15. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque es para el tratamiento de enfermedades vasculares.
16. El uso del anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento de enfermedades vasculares .
17. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 caracterizado porque es para el tratamiento de enfermedades vasculares.
18. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque es para el tratamiento de retinopatía.
19. El uso del anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento de retinopatía.
20. Un ácido nucleico que codifica a la cadena pesada de un anticuerpo que se une específicamente a la angiopoyetina-2 (ANG-2) humana, caracterizado porque comprende un dominio variable de conformidad con la reivindicación 1.
21. Un vector de expresión caracterizado porque comprende un ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 20 para la expresión de un anticuerpo que se une específicamente a la angiopoyetina-2 (ANG-2) humana en una célula hospedante procariota o eucariota.
22. La célula hospedante procariota o eucariota caracterizada porque comprende un vector de conformidad con la reivindicación 21.
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