CN116234574A

CN116234574A - 特异性结合vegf和ang-2的双特异性抗原结合分子

Info

Publication number: CN116234574A
Application number: CN202180054890.2A
Authority: CN
Inventors: 石金平; 应华; 朱曼曼; 陶维康; 胡齐悦
Original assignee: Jiangsu Hengrui Medicine Co Ltd; Shanghai Hengrui Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Jiangsu Hengrui Medicine Co Ltd; Shanghai Hengrui Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2020-09-17
Filing date: 2021-09-17
Publication date: 2023-06-06
Also published as: TW202221027A; WO2022057888A1

Abstract

涉及双特异性抗原结合分子，其包含特异性结合ANG‑2的第一抗原结合域和特异性结合VEGF的第二抗原结合域。同时，也涉及特异性结合ANG‑2的单克隆抗体，以及抗体的制备和应用。

Description

特异性结合VEGF和ANG-2的双特异性抗原结合分子

技术领域

本披露属于生物制药领域，具体地，本披露涉及抗ANG-2抗体以及抗ANG-2和抗VEGF的双特异性抗原结合分子的制备和应用。

背景技术

这里的陈述仅提供与本披露有关的背景信息，而不必然地构成现有技术。

新血管的生成为肿瘤细胞提供氧气和养料，使得肿瘤细胞获得生长优势，从无血管的慢速生长期到有血管的快速增长期。因此，通过抑制血管生成来抑制肿瘤的生长是一个较有潜力的有效策略。在众多促进血管生成的相关因子中，血管内皮生长因子VEGF是非常关键和重要的促进血管生成的因子。VEGF可以通过与VEGF受体结合促进细胞的增殖、迁移、增加血管通透性等促进肿瘤细胞的新生血管生成。因此通过阻断VEGF可抑制肿瘤血管的生成，进而达到抑制肿瘤生长和转移的目的。临床上有很多通过不同策略阻断VEGF的生物制剂，诸如针对VEGF的单抗阿瓦斯汀(Avastin)，中和VEGF的可溶性VEGF受体，针对VEGF受体的单抗等都显示出较好的活性。

但肿瘤血管的生成是由众多分子、多信号通路参与的复杂过程，通过阻断一条通路仍不能达到完全抑制肿瘤的目的，需要同时阻断其他血管生成相关因子。

Tie2是第二个被鉴定出的血管内皮细胞特异的酪氨酸激酶受体，其与配体血管生成素-1(ANG1)和血管生成素-2(ANG2)的结合对于血管生成也起着重要作用。ANG1与ANG2都结合Tie2，其中ANG1支持内皮细胞(EC)存活并促进血管的完整性和稳定性，而ANG2具有相反效应，可以使周边细胞从内皮细胞脱落下来，导致内皮细胞通透性提高，使VEGF发挥促进新生血管形成的作用。ANG2和VEGF在肿瘤的血管形成过程中互补协调，共同作用。因此，同时阻断VEGF和ANG2可以更有效抑制血管的生成，促进血管的正常化，达到抑制肿瘤生长和转移的目的。

目前，专利申请WO1998045332、WO2007095338A2、WO201004058、CN102250247A、WO2011117329等中公开了抗ANG-2和VEGF的双特异性抗体或VEGF抗体，但仍有待于开发新的高效的抗ANG-2和VEGF的双特异性抗体。

发明内容

本披露提供了一种靶向ANG-2和VEGF的双特异性抗体，其在体外，具有更好的阻断ANG-2与其受体Tie2结合的阻断活性，并可显著抑制VEGF引起的HUVEC细胞内磷酸化VEGFR水平的升高，抑制VEGF引起的HUVEC细胞的增殖。除此之外，本披露中的双特异性抗体，在小鼠体内具有更优异的抑制肿瘤生长的效果，并可用于治疗眼部疾病，如AMD。

在一些实施方案中，本披露提供一种双特异性抗原结合分子，其包含特异性结合ANG-2的第一抗原结合域和特异性结合VEGF的第二抗原结合域，其中所述的特异性结合ANG-2的第一抗原结合域包含：

i)重链可变区，其包含分别如SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：39所示的HCDR1，HCDR2和HCDR3，和

轻链可变区，其包含分别如SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示的LCDR1，LCDR2和LCDR3；其中：

SEQ ID NO：38的序列为：TINX ₁X ₂SSYTYYPDNVKG；

SEQ ID NO：39的序列为：X ₃X ₄ATGX ₅FDY

其中，X ₁为D或E，X ₂为D或N，X ₃为D或N，X ₄为E或Q，X ₅为C，S或V；

或

ii)重链可变区，其包含分别如SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14所示的HCDR1，HCDR2和HCDR3，和

轻链可变区，其包含分别如SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：16所示的LCDR1，LCDR2和LCDR3。

在一些实施方案中，前述的双特异性抗原结合分子，其中所述的特异性结合ANG-2的第一抗原结合域包含：

重链可变区，其包含如SEQ ID NO：7所示的HCDR1，如SEQ ID NO：8、22或24所示的HCDR2，和如SEQ ID NO：9、23、25、26或27所示的HCDR3；和

轻链可变区，其包含分别如SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示的LCDR1，LCDR2和LCDR3。

a)重链可变区，其包含分别如SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23所示的HCDR1，HCDR2和HCDR3；和

轻链可变区，其包含分别如SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示的LCDR1，LCDR2和LCDR3；

b)重链可变区，其包含分别如SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：23所示的HCDR1，HCDR2和HCDR3；和

c)重链可变区，其包含分别如SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：25所示的HCDR1，HCDR2和HCDR3；和

d)重链可变区，其包含分别如SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：26所示的HCDR1，HCDR2和HCDR3；和

e)重链可变区，其包含分别如SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：25所示的HCDR1，HCDR2和HCDR3；和

f)重链可变区，其包含分别如SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：26所示的HCDR1，HCDR2和HCDR3；和

g)重链可变区，其包含分别如SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：25所示的HCDR1，HCDR2和HCDR3；和

h)重链可变区，包含分别如SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：26所示的HCDR1，HCDR2和HCDR3；和

j)重链可变区，其包含分别如SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：23所示的HCDR1，HCDR2和HCDR3；和

轻链可变区，其包含分别如SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示的LCDR1，LCDR2和LCDR3；或

k)重链可变区，其包含分别如SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：27所示的HCDR1，HCDR2和HCDR3；和

l)重链可变区，其包含分别如SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示的HCDR1，HCDR2和HCDR3；和

在一些实施方式中，前述双特异性抗原结合分子以等于或小于10 ^-7M解离平衡常数与人ANG-2结合，在一些实施方式中，以等于或小于10 ^-8M或10 ^-9M解离平衡常数与人ANG-2结合。

在一些实施方式中，前述双特异性抗原结合分子以等于或小于10 ^-7M解离平衡常数与人VEGF结合，在一些实施方式中，以等于或小于10 ^-8M、10 ^-9M、10 ^-10M、10 ^-11M、10 ^-12M或10 ^-13M解离平衡常数与人VEGF结合。

在一些实施方案中，前述双特异性抗原结合分子与猴的ANG-2和VEGF可交叉结合。

在一些实施方案中，前述的双特异性抗原结合分子以小于24.82nM，小于20nM，小于15nM，小于10nM，小于5nM，小于3nM，小于1nM，或小于0.5nM的IC50阻断ANG-2与ANG-2受体Tie2结合，其中所述的阻断活性通过测试例2所述的ELISA实验检测。

在一些实施方案中，前述的双特异性抗原结合分子以小于21.27nM，小于15nM，小于10nM，小于8nM或小于5nM的IC50抑制经Tie2转染的CHO细胞中ANG-2诱导的Tie2磷酸化。

在一些实施方案中，前述的双特异性抗原结合分子可显著抑制VEGF引起的HUVEC胞内磷酸化VEGFR水平升高。

在一些实施方案中，前述的双特异性抗原结合分子以小于18nM，小于10nM，或小于5nM的IC50抑制VEGF诱导的HUVEC细胞增殖。

i)重链可变区，包含SEQ ID NO：3、20、21、28-37、72或73中任一氨基酸序列，或包含与SEQ ID NO：3、20、21、28-37、72或73中任一序列分别具有至少95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性的氨基酸序列；和/或

轻链可变区，包含SEQ ID NO：4、17、18、19或74的氨基酸序列，或包含与SEQ ID NO：4、17、18、19或74分别具有至少95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性的氨基酸序列；或

ii)重链可变区，包含SEQ ID NO：5、44、45、46或75的氨基酸序列，或包含与SEQ ID NO：5、44、45、46或75分别具有至少95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性的氨基酸序列；和/或

轻链可变区，包含SEQ ID NO：6、40、41、42、43或76的氨基酸序列，或包含与SEQ ID NO：6、40、41、42、43或76分别具有至少95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性的氨基酸序列。

i)重链可变区，其氨基酸序列如SEQ ID NO：3、20、21、28-37、72或73中任一所示，或与SEQ ID NO：3、20、21、28-37、72或73分别具有至少95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性；和/或

轻链可变区，其氨基酸序列如SEQ ID NO：4、17、18、19或74所示，或与SEQ ID NO：4、17、18、19或74分别具有至少95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性；或

ii)重链可变区，其氨基酸序列如SEQ ID NO：5、44、45、46或75所示，或与SEQ ID NO：5、44、45、46或75分别具有至少95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性；和/或

轻链可变区，其氨基酸序列如SEQ ID NO：6、40、41、42、43或76所示，或与SEQ ID NO：6、40、41、42、43或76分别具有至少95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性。

a)重链可变区，包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列；和轻链可变区，包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列；

b)重链可变区，包含SEQ ID NO：20或21的氨基酸序列；和轻链可变区，包含SEQ ID NO：17、18或19的氨基酸序列；

c)重链可变区，包含SEQ ID NO：28-37中任一所示的氨基酸序列；和轻链可变区，包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列；

d)重链可变区，包含SEQ ID NO：72或73的氨基酸序列；和轻链可变区，包含SEQ ID NO：74的氨基酸序列；

e)重链可变区，包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列；和轻链可变区，包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列；

f)重链可变区，包含SEQ ID NO：44、45或46的氨基酸序列；和轻链可变区，包含SEQ ID NO：40、41、42或43的氨基酸序列；或

g)重链可变区，包含SEQ ID NO：75的氨基酸序列；和轻链可变区，包含SEQ ID NO：76的氨基酸序列。在一些实施方案中，前述的双特异性抗原结合分子，其中所述的特异性结合ANG-2的第一抗原结合域包含：

a)如SEQ ID NO：3所示的重链可变区；和如SEQ ID NO：4所示的轻链可变区；

b)如SEQ ID NO：20或21所示的重链可变区；和如SEQ ID NO：17、18或19所示的轻链可变区；

c)如SEQ ID NO：28-37中任一所示的重链可变区；和如SEQ ID NO：17所示的轻链可变区；

d)如SEQ ID NO：72或73所示的重链可变区；和如SEQ ID NO：74所示的轻链可变区；

e)如SEQ ID NO：5所示的重链可变区；和如SEQ ID NO：6所示的轻链可变区；

f)如SEQ ID NO：44、45或46所示的重链可变区；和如SEQ ID NO：40、41、42或43所示的轻链可变区；或

g)如SEQ ID NO：75所示的重链可变区；和如SEQ ID NO：76所示的轻链可变区。

a)SEQ ID NO：20、21或33的重链可变区和SEQ ID NO：17的轻链可变区；

b)SEQ ID NO：44或45的重链可变区和SEQ ID NO：40的轻链可变区；

c)SEQ ID NO：72或73的重链可变区和SEQ ID NO：74的轻链可变区；或

d)SEQ ID NO：75的重链可变区和SEQ ID NO：76的轻链可变区。

重链可变区，包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列，和轻链可变区，包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列；或

重链可变区，包含SEQ ID NO：45的氨基酸序列，和轻链可变区，包含SEQ ID NO：40的氨基酸序列。在一些实施方案中，前述的双特异性抗原结合分子，其中所述的特异性结合ANG-2的第一抗原结合域包含：

如SEQ ID NO：33所示的重链可变区，和如SEQ ID NO：17所示的轻链可变区；或

如SEQ ID NO：45所示的重链可变区，和如SEQ ID NO：40所示的轻链可变区。

在一些实施方案中，前述的双特异性抗原结合分子，其中所述特异性结合VEGF的第二抗原结合域包含：

重链可变区，包含分别如SEQ ID NO：61，SEQ ID NO：62和SEQ ID NO：63所示的HCDR1，HCDR2和HCDR3；和

轻链可变区，包含分别如SEQ ID NO：64，SEQ ID NO：65和SEQ ID NO：66所示的LCDR1，LCDR2和LCDR3。

重链可变区，包含SEQ ID NO：58的氨基酸序列，和轻链可变区，包含SEQ ID NO：56的氨基酸序列。在一些实施方案中，前述的双特异性抗原结合分子，其中所述特异性结合VEGF的第二抗原结合域包含：

如SEQ ID NO：58所示的重链可变区，和如SEQ ID NO：56所示的轻链可变区。

在一些实施方案中，前述的双特异性抗原结合分子，其中所述特异性结合人VEGF的第二抗原结合域进一步包含重链恒定区和轻链恒定区。

在一些实施方案中，前述的双特异性抗原结合分子，其中所述特异性结合人VEGF的第二抗原结合域的重链恒定区包含L234A，L235A，I253A，H310A和H435A突变。

在一些实施方案中，前述的双特异性抗原结合分子，其中所述特异性结合人VEGF的第二抗原结合域的重链恒定区为IgG1恒定区，并包含L234A，L235A，I253A，H310A和H435A突变(EU编号)。

在一些实施方案中，前述的双特异性抗原结合分子，其中所述的特异性结合VEGF的第二抗原结合域包含：

重链，包含SEQ ID NO：59或60的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：59或60具有至少95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性的氨基酸序列；和

轻链，包含SEQ ID NO：57的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：57具有至少95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，前述的双特异性抗原结合分子，其中所述的特异性结合VEGF的第二抗原结合域包含：

重链，其氨基酸序列如SEQ ID NO：59或60所示，或与SEQ ID NO：59或60具有至少95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性；和

轻链，其氨基酸序列如SEQ ID NO：57所示，或与SEQ ID NO：57具有至少95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性。

抗原结合分子，其中所述的特异性结合VEGF的第二抗原结合域包含：

如SEQ ID NO：59所示的重链；和

如SEQ ID NO：57所示的轻链。

如SEQ ID NO：60所示的重链；和

如SEQ ID NO：57所示的轻链。

前述的双特异性抗原结合分子可具有本领域中公知的任意的双特异性抗体的分子结构。具体地，前述的双特异性抗原结合分子可以具有含Fc片段的双特异性抗体的分子结构，或者不含Fc片段的双特异性抗体的分子结构。更具体地，所述含Fc片段的双特异性抗体的分子结构包括但不限于TrioMab、Crossmab/KIH、DVD-Ig、IgG-scFv、FIT-Ig、mAb-Trap。不含Fc片段的双特异性抗体的分子结构包括但不限于BiTE、DART、TandAb、ImmTAC、TriKE。

在一些实施方案中，前述双特异性抗原结合分子是IgG-scFv形式。

在IgG-scFv形式的双特异性抗体示例性的实施方案中，所述的特异性结合ANG-2的第一抗原结合域为抗ANG-2单链抗体(scFv)，所述特异性结合VEGF 的第二抗原结合域为全长IgG抗体，其中所述抗ANG-2单链抗体直接地或通过连接子与特异性结合VEGF的全长IgG抗体重链或轻链的C端连接。

在一些实施方案中，前述的双特异性抗原结合分子，其中所述的特异性结合ANG-2的第一抗原结合域为抗ANG-2单链抗体。

在一些实施方案中，前述的双特异性抗原结合分子，其中所述的特异性结合ANG-2的第一抗原结合域为抗ANG-2单链抗体，其包含：

b)SEQ ID NO：44或45的重链可变区和SEQ ID NO：40的轻链可变区；

d)SEQ ID NO：75的重链可变区和SEQ ID NO：76的轻链可变区。

在一些实施方案中，前述的双特异性抗原结合分子，其中所述的抗ANG-2单链抗体包含SEQ ID NO：67、68、69、70、71、77、78或79的氨基酸序列。

在一些实施方案中，前述的双特异性抗原结合分子，其中所述的特异性结合ANG-2的第一抗原结合域直接，或通过连接子连接至所述的特异性结合VEGF的第二抗原结合域。

在一些实施方案中，前述的双特异性抗原结合分子，其中所述的特异性结合ANG-2的第一抗原结合域直接，或通过连接子连接至所述的特异性结合VEGF的第二抗原结合域的重链或轻链。

在一些实施方案中，前述的双特异性抗原结合分子，其中所述的抗ANG-2单链抗体的N端通过连接子，连接至所述的特异性结合VEGF的第二抗原结合域的重链C-端。

在一些实施方案中，前述的双特异性抗原结合分子，其中所述的连接子为(GG) _n，其中n为1-20中的整数。

在一些实施方案中，前述的双特异性抗原结合分子，其包含：

i)第一条链，包含SEQ ID NO：80、81、82或83的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：80、81、82或83分别具有至少95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性的氨基酸序列；和

ii)第二条链，其包含SEQ ID NO：57的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：57具有至少95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，前述的双特异性抗原结合分子为具有IgG-scFv形式的4肽结构，其包含两条相同的第一条链和两条相同的第二条链，其中：

在一些实施方案中，前述的双特异性抗原结合分子包含：

i)第一条链，其氨基酸序列如SEQ ID NO：80、81、82或83所示，或与SEQ ID NO：80、81、82或83分别具有至少95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性；和

ii)第二条链，其氨基酸序列如SEQ ID NO：57所示，或与SEQ ID NO：57具有至少95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性。

i)第一条链的氨基酸序列如SEQ ID NO：80、81、82或83所示，或与SEQ ID NO：80、81、82或83分别具有至少95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性；和

ii)第二条链的氨基酸序列如SEQ ID NO：57所示，或与SEQ ID NO：57具有至少95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性。

i)第一条链包含SEQ ID NO：80的氨基酸序列；和第二条链，其包含SEQ ID NO：57的氨基酸序列；

ii)第一条链，包含SEQ ID NO：81的氨基酸序列；和第二条链，其包含SEQ ID NO：57的氨基酸序列；

iii)第一条链，包含SEQ ID NO：82的氨基酸序列；和第二条链，其包含SEQ ID NO：57的氨基酸序列；或

iv)第一条链，包含SEQ ID NO：83的氨基酸序列；和第二条链，其包含SEQ ID NO：57的氨基酸序列。

i)第一条链的氨基酸序列如SEQ ID NO：80所述；和第二条链的氨基酸序列如SEQ ID NO：57所示；

ii)第一条链的氨基酸序列如SEQ ID NO：81所示；和第二条链的氨基酸序列如SEQ ID NO：57所示；

iii)第一条链的氨基酸序列如SEQ ID NO：82所示；和第二条链的氨基酸序列如SEQ ID NO：57所示；或

iv)第一条链的氨基酸序列如SEQ ID NO：83所示；和第二条链的氨基酸序列如SEQ ID NO：57所示。

在一些实施方案中，前述的双特异性抗原结合分子具有Crossmab形式的4肽结构。

在一些实施方案中，所述Crossmab形式的双特异性抗原结合分子包含：

a)特异性结合ANG-2的第一全长抗体的第一轻链和第一重链；

b)特异性结合VEGF的第二全长抗体的第二轻链和第二重链；其中恒定结构域CL和CH1相互替换。

在一些实施方案中，前述的双特异性抗原结合分子包含：

a)特异性结合ANG-2的第一全长抗体的第一轻链和第一重链；和

b)特异性结合VEGF的第二全长抗体的第二轻链和第二重链；其中：

所述第一轻链的恒定结构域CL与第一重链的恒定结构域CH1相互替换；

所述第二轻链的恒定结构域CL与第二重链的恒定结构域CH1相互替换；

所述第一轻链的轻链可变区VL与第一重链的重链可变区VH相互替换；或

所述第二轻链的轻链可变区VL与第二重链的重链可变区VH相互替换。

在一些实施方案中，前述的双特异性抗原结合分子包含：

a)特异性结合ANG-2的第一全长抗体的第一轻链和第一重链；和

b)特异性结合VEGF的第二全长抗体的第二轻链和第二重链；并且，

其中所述第一轻链的恒定结构域CL与第一重链的恒定结构域CH1相互替换。

在一些实施方案中，前述的双特异性抗原结合分子包含：

a)特异性结合ANG-2的第一轻链和第一重链；

b)特异性结合VEGF的第二轻链和第二重链；其中恒定结构域CL和CH1相互替换。

在一些实施方案中，前述的双特异性抗原结合分子包含：

a)特异性结合ANG-2的第一轻链和第一重链；和

b)特异性结合VEGF的第二轻链和第二重链；其中：

在一些实施方案中，前述的双特异性抗原结合分子包含：

a)特异性结合ANG-2的第一轻链和第一重链；和

b)特异性结合VEGF的第二轻链和第二重链；并且，

在一些实施方案中，在前述的双特异性抗原结合分子中：

a)所述第一轻链包含SEQ ID NO：17的轻链可变区，和所述第一重链包含SEQ ID NO：33的重链可变区；或

所述第一轻链包含SEQ ID NO：40的轻链可变区，和所述第一重链包含SEQ ID NO：45的重链可变区；

和

b)所述第二轻链包含SEQ ID NO：56的轻链可变区，和所述第二重链包含 SEQ ID NO：58的重链可变区。

在一些实施方案中，前述的双特异性抗原结合分子，其中：

a)所述的第一轻链包含SEQ ID NO：85的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：85具有至少95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性的氨基酸序列，和

所述第一重链包含SEQ ID NO：84氨基酸序列，或与SEQ ID NO：84具有至少95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性的氨基酸序列；或

所述的第一轻链包含SEQ ID NO：88的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：88具有至少95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性的氨基酸序列，和

所述第一重链包含SEQ ID NO：87氨基酸序列，或与SEQ ID NO：87具有至少95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性的氨基酸序列；和

b)所述的第一轻链包含SEQ ID NO：57的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：57具有至少95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性的氨基酸序列；和

所述第一重链包含SEQ ID NO：86的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：86具有至少95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，在前述的双特异性抗原结合分子中：

a)所述的第一轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO：85所示，或与SEQ ID NO：85具有至少95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性，和

所述第一重链的氨基酸序列如SEQ ID NO：84所示，或与SEQ ID NO：84具有至少95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性；或

所述的第一轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO：88所示，或与SEQ ID NO：88具有至少95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性，和

所述第一重链的氨基酸序列如SEQ ID NO：87所示，或与SEQ ID NO：87具有至少95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性；和

b)所述第二轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO：57所示，或与SEQ ID NO：57具有至少95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性；和

所述第二重链的氨基酸序列如SEQ ID NO：86所示，或与SEQ ID NO：86具有至少95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性。

在一些实施方案中，在前述的双特异性抗原结合分子中：

i)所述的第一轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO：85所示，和所述第一重链的氨基酸序列如SEQ ID NO：84所示；和

所述的第二轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO：57所示，和所述第二重链的氨基酸序列如SEQ ID NO：86所示；或

ii)所述的第一轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO：88所示，和所述第一重链的氨基酸序列如SEQ ID NO：87所示；和

所述的第二轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO：57所示，和所述第二重链的氨基酸序列如SEQ ID NO：86所示。

在一些实施方案中，本披露提供一种特异性结合ANG-2的抗体。

在一些实施方案中，前述的特异性结合ANG-2的抗体，其包含：

i)重链可变区，包含分别如SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：39所示的HCDR1，HCDR2和HCDR3，和

轻链可变区，包含分别如SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示的LCDR1，LCDR2和LCDR3；其中：

SEQ ID NO：38的序列为：TINX ₁X ₂SSYTYYPDNVKG；

SEQ ID NO：39的序列为：X ₃X ₄ATGX ₅FDY

或

ii)重链可变区，包含分别如SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14所示的HCDR1，HCDR2和HCDR3，和

轻链可变区，包含分别如SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：16所示的LCDR1，LCDR2和LCDR3。

重链可变区，包含如SEQ ID NO：7所示的HCDR1，如SEQ ID NO：8、22或24所示的HCDR2，和如SEQ ID NO：9、23、25、26或27所示的HCDR3；和

轻链可变区，包含分别如SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示的LCDR1，LCDR2和LCDR3。

在一些实施方式中，前述的特异性结合ANG-2的抗体以等于或小于10 ^-7M解离平衡常数与人ANG-2结合，在一些实施方式中，以等于或小于10 ^-8M或10 ^-9M解离平衡常数与人ANG-2结合。

在一些实施方案中，前述的特异性结合ANG-2的抗体与猴的ANG-2可交叉结合。

在一些实施方案中，前述的特异性结合ANG-2的抗体以小于24.82nM，小于 20nM，小于15nM，小于10nM或小于5nM的IC50阻断ANG-2与ANG-2受体Tie2结合，其中所述的阻断活性通过测试例2所述的ELISA实验检测。

在一些实施方案中，前述的特异性结合ANG-2的抗体以小于21.27nM，小于15nM，小于10nM或小于8nM的IC50抑制经Tie2转染的CHO细胞中ANG-2诱导的Tie2磷酸化。

在一些实施方案中，前述的特异性结合ANG-2的抗体，其为鼠源抗体，嵌合抗体，人源化抗体或全人抗体。

在一些实施方案中，前述的特异性结合ANG-2的抗体，其中所述的抗体包含框架区，其中：

i)所述重链框架区包含选自44R、77S或84S中的一个或更多个氨基酸回复突变；和/或

所述轻链框架区包含选自1N、43S、68A、85D、87H中的一个或更多个氨基酸回复突变；或

ii)所述重链框架区包含选自2L、44R、74V、82AS或83K中的一个或更多个氨基酸回复突变；和/或

所述轻链框架区包含选自1N、43S、46V、68A、85D、87H中的一个或更多个氨基酸回复突变。

i)重链可变区，其包含分别如SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：39所示的HCDR1，HCDR2和HCDR3，且其重链框架区包含选自44R、77S或84S中的一个或更多个氨基酸回复突变；和

轻链可变区，其包含分别如SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示的LCDR1，LCDR2和LCDR3；且其轻链框架区包含选自1N、43S、68A、85D、87H中的一个或更多个氨基酸回复突变；其中：

SEQ ID NO：38的序列为：TINX ₁X ₂SSYTYYPDNVKG；

SEQ ID NO：39的序列为：X ₃X ₄ATGX ₅FDY

其中，X ₁为D或E，X ₂为D或N，X ₃为D或N，X ₄为E或Q，X ₅为C，S或V；或

ii)重链可变区，其包含分别如SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14所示的HCDR1，HCDR2和HCDR3，且其重链框架区包含选自2L、44R、74V、82AS或83K中的一个或更多个氨基酸回复突变；和

轻链可变区，其包含分别如SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：16所示的LCDR1，LCDR2和LCDR3，且其轻链框架区包含选自1N、43S、46V、68A、85D、87H中的一个或更多个氨基酸回复突变。

重链可变区，其包含分别如SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：22和SEQ ID NO： 26所示的HCDR1，HCDR2和HCDR3，且其重链框架区包含选自44R、77S或84S中的一个或更多个氨基酸回复突变；和

轻链可变区，其包含分别如SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示的LCDR1，LCDR2和LCDR3，且轻链框架区包含选自1N、43S、68A、85D、87H中的一个或更多个氨基酸回复突变。

重链可变区，包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列，或在SEQ ID NO：20的氨基酸序列中包含选自44R、77S或84S中的一个或更多个氨基酸回复突变的氨基酸序列；和

轻链可变区，包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列，或在SEQ ID NO：17的氨基酸序列中包含选自1N、43S、68A、85D、87H中的一个或更多个氨基酸回复突变的氨基酸序列。

重链可变区，其氨基酸序列如SEQ ID NO：20所示，或在SEQ ID NO：20的氨基酸序列中包含选自44R、77S或84S中的一个或更多个氨基酸回复突变；和

轻链可变区，其氨基酸序列如SEQ ID NO：17所示，或在SEQ ID NO：17的氨基酸序列中包含选自1N、43S、68A、85D、87H中的一个或更多个氨基酸回复突变。

重链可变区，包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列；和

SEQ ID NO：33的重链可变区；和

重链可变区，包含SEQ ID NO：44的氨基酸序列，或在SEQ ID NO：44的氨基酸序列中包含选自2L、44R、74V、 82AS或83K中的一个或更多个氨基酸回复突变的氨基酸序列；和

轻链可变区，包含SEQ ID NO：40的氨基酸序列，或在SEQ ID NO：40的氨基酸序列中包含选自1N、43S、46V、68A、85D、87H中的一个或更多个氨基酸回复突变的氨基酸序列。

重链可变区，其氨基酸序列如SEQ ID NO：44所示，或在SEQ ID NO：44的氨基酸序列中包含选自2L、44R、74V、 82AS或83K中的一个或更多个氨基酸回复突变；和

轻链可变区，其氨基酸序列如SEQ ID NO：40所示，或在SEQ ID NO：40的氨基酸序列中包含选自1N、43S、46V、68A、85D、87H中的一个或更多个氨基酸回复突变。

g)重链可变区，包含SEQ ID NO：75的氨基酸序列；和轻链可变区，包含SEQ ID NO：76的氨基酸序列。

a)SEQ ID NO：3的重链可变区；和SEQ ID NO：4的轻链可变区；

b)SEQ ID NO：20或21的重链可变区；和SEQ ID NO：17、18或19的轻链可变区；

c)SEQ ID NO：28-37中任一所示的重链可变区；和SEQ ID NO：17的轻链可变区；

d)SEQ ID NO：72或73的重链可变区；和SEQ ID NO：74的轻链可变区；

e)SEQ ID NO：5的重链可变区；和SEQ ID NO：6的轻链可变区；

f)SEQ ID NO：44、45或46的重链可变区；和SEQ ID NO：40、41、42或43的轻链可变区；或

g)SEQ ID NO：75的重链可变区；和SEQ ID NO：76的轻链可变区。

b)SEQ ID NO：44或45的重链可变区和SEQ ID NO：40的轻链可变区；

d)SEQ ID NO：75的重链可变区和SEQ ID NO：76的轻链可变区。

重链可变区，包含SEQ ID NO：45的氨基酸序列，和轻链可变区，包含SEQ ID NO：40的氨基酸序列。

SEQ ID NO：33的重链可变区，和SEQ ID NO：17的轻链可变区；或

SEQ ID NO：45的重链可变区，和SEQ ID NO：40的轻链可变区。

在一些实施方案中，前述的特异性结合ANG-2的抗体，其包含恒定区。在另外一些实施方案中，所述重链恒定区选自人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4恒定区及其常规变体，所述轻链恒定区选自人抗体κ和λ链恒定区及其常规变体。

在一些实施方案中，前述的特异性结合ANG-2的抗体，其包含SEQ ID NO：47的重链恒定区和SEQ ID NO：48的轻链恒定区。

a)重链，包含SEQ ID NO：49、51或52的氨基酸序列，或包含与SEQ ID NO：49、51或52分别具有至少95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性的氨基酸序列，和/或

轻链，包含SEQ ID NO：50的氨基酸序列，或包含与SEQ ID NO：50具有至少95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性的氨基酸序列；或

b)重链，包含SEQ ID NO：53或55的氨基酸序列，或包含与SEQ ID NO：53或55分别具有至少95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性的氨基酸序列，和/或

轻链，包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列，或包含与SEQ ID NO：54具有至少95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性的氨基酸序列。

a)重链，其氨基酸序列如SEQ ID NO：49、51或52所示，或与SEQ ID NO：49、51或52分别具有至少95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性，和/或

轻链，其氨基酸序列如SEQ ID NO：50所示，或与SEQ ID NO：50具有至少95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性；或

b)重链，其氨基酸序列如SEQ ID NO：53或55所示，或与SEQ ID NO：53或55分别具有至少95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性，和/或

轻链，其氨基酸序列如SEQ ID NO：54所示，或与SEQ ID NO：54具有至少95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性。

a)重链，包含SEQ ID NO：49、51或52的氨基酸序列，和

轻链，包含SEQ ID NO：50的氨基酸序列；或

b)重链，包含SEQ ID NO：53或55的氨基酸序列，和

轻链，包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列。

a)重链，其氨基酸序列如SEQ ID NO：49、51或52所示，和

轻链，其氨基酸序列如SEQ ID NO：50所示；或

b)重链，其氨基酸序列如SEQ ID NO：53或55所示，和

轻链，其氨基酸序列如SEQ ID NO：54所示。

在一些实施方案中，本披露提供一种分离的抗体，其与前述的特异性结合ANG-2的抗体竞争结合人ANG-2。

在一些实施方案中，本披露提供一种核酸分子，其编码根据前述的双特异性抗原结合分子，或前述的特异性结合ANG-2的抗体。

在一些实施方案中，本披露提供一种载体，其包含前述的核酸分子。

在一些实施方案中，本披露提供一种宿主细胞，其包含前述的载体。

在一些实施方案中，本披露提供一种药物组合物，其包含有效量的前述双特异性抗原结合分子，或前述特异性结合ANG-2的抗体，或前述的核酸分子，以及一种或更多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在一些实施方案中，所述治疗有效量为单位剂量的组合物中含有0.1-3000mg的如前所述的双特异性抗原结合分子或特异性结合ANG-2的抗体。

在一些实施方案中，本披露提供一种生产前述的双特异性抗原结合分子，或前述的特异性结合ANG-2的抗体的方法，所述方法包括培养前述的宿主细胞以表达所述双特异性抗原结合分子或特异性结合ANG-2的抗体。

在一些实施方案中，本披露提供一种预防或治疗癌症或血管生成性眼病的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的前述的双特异性抗原结合分子，或前述的特异性结合ANG-2的抗体，或前述的核酸分子，或前述的药物组合物。

在一些实施方案中，前述的治疗方法，其中所述的癌症选自乳腺癌、肾上腺肿瘤、输卵管癌、鳞状细胞癌、卵巢癌、胃癌、结直肠癌、非小细胞肺癌、胆管癌、膀胱癌、胰腺癌、皮肤癌和肝癌。在一些实施方案中，其中所述的血管生成性眼病选自新生血管性青光眼、年龄相关的黄斑变性(AMD)、糖尿病性黄斑水肿、角膜新血管生成、角膜移植新血管生成、角膜移植排斥、视网膜/脉络膜新血管生成、房角的新血管生成(虹膜发红)、眼部新生血管性疾病、血管再狭窄和动静脉畸形(AVM)。在一些实施方案中，前述的癌症或血管生成性眼病与VEGF或ANG-2相关。

在一些实施方案中，本披露提供前述的双特异性抗原结合分子，或前述的特异性结合ANG-2的抗体，或前述的核酸分子，或前述的药物组合物在制备用于治疗或预防癌症或血管生成性眼病的药物中的用途。

在一些实施方案中，前述的用途，其中所述的癌症选自乳腺癌、肾上腺肿瘤、输卵管癌、鳞状细胞癌、卵巢癌、胃癌、结直肠癌、非小细胞肺癌、胆管癌、膀胱癌、胰腺癌、皮肤癌和肝癌。在一些实施方案中，其中所述的血管生成性眼病选自新生血管性青光眼、年龄相关的黄斑变性(AMD)、糖尿病性黄斑水肿、角膜新血管生成、角膜移植新血管生成、角膜移植排斥、视网膜/脉络膜新血管生成、房角的新血管生成(虹膜发红)、眼部新生血管性疾病、血管再狭窄和动静脉畸形(AVM)。在一些实施方案中，前述的癌症或血管生成性眼病与VEGF或ANG-2相关。

在在一些实施方案中，本披露提供用作药物的前述的双特异性抗原结合分子，或前述的特异性结合ANG-2的抗体，或前述的核酸分子，或前述的药物组合物。

在一些实施方案中，本披露提供用作药物的前述的双特异性抗原结合分子，或前述的特异性结合ANG-2的抗体，或前述的核酸分子，或前述的药物组合物，可用作治疗或预防癌症或血管生成性眼病。在一些实施方案中，其中所述的癌症选自乳腺癌、肾上腺肿瘤、输卵管癌、鳞状细胞癌、卵巢癌、胃癌、结直肠癌、非小细胞肺癌、胆管癌、膀胱癌、胰腺癌、皮肤癌和肝癌。在一些实施方案中，其中所述的血管生成性眼病选自新生血管性青光眼、年龄相关的黄斑变性(AMD)、糖尿病性黄斑水肿、角膜新血管生成、角膜移植新血管生成、角膜移植排斥、视网膜/脉络膜新血管生成、房角的新血管生成(虹膜发红)、眼部新生血管性疾病、血管再狭窄和动静脉畸形(AVM)。在一些实施方案中，前述的癌症或血管生成性眼病与VEGF或ANG-2相关。

附图说明

图1示出双特异性抗体抑制ANG-2与Tie2的结合的结果；

图2示出双特异性抗体抑制诱导的Tie2磷酸化结果；

图3示出双特异性抗体显著抑制VEGF引起的HUVEC胞内磷酸化VEGFR水平升高；

图4示出双特异性抗体可以显著抑制VEGF引起的HUVEC的增殖；

图5示出本披露中的双特异性抗体均可显著抑制小鼠体内的PC-3肿瘤生长；

图6示出本披露中的双特异性抗体均可显著抑制小鼠体内的H460移植肿瘤生长；

图7示出本披露中的双特异性抗体可显著抑制小鼠体内的A431移植肿瘤生长；

图8A和图8B示出本披露的双特异性抗体恒河猴脉络膜新生血管的抑制结果；其中图8A示出，本披露中的双特异性抗体对恒河猴眼中荧光渗漏面积的改善率，图8B示出本披露中的双特异性抗体可显著减少恒河猴眼中的荧光斑点数；

图9示出本披露中的双特异性抗体可显著降低恒河猴眼睛房水中VEGF的表达量。

图10A和图10B示出本披露中示例性的双特异性抗体的分子结构；图10A显示IgG-scFv类型双特异性抗体的结构；图10B显示Crossmab类型双特异性抗体的结构。

具体实施方式

术语

为了更容易理解本披露，以下具体定义了某些技术和科学术语。除非在本文中另有明确定义，本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本披露所属领域的一般技术人员通常理解的含义。

本披露所用氨基酸三字母代码和单字母代码如J.biol.chem,243,p3558(1968)中所述。

术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些氨基酸，以及后来修饰的那些氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-邻磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指与天然存在的氨基酸具有相同基本化学结构(即与氢结合的α碳、羧基、氨基和R基团，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍)的化合物。此类类似物具有修饰的R基团(例如，正亮氨酸)或修饰的肽骨架，但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指具有如下结构的化合物，该结构与氨基酸的一般化学结构不同但是以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用。

术语“ANG-2”指血管生成素-2(ANGPT2或ANG2)，其记载于例如Maisonpierre,P.C.等,Science 277(1997)55-60和Cheung,A.H.等,Genomics 48(1998)389-91。发现血管生成素-1和-2为Tie(即，一种在血管内皮内选择性表达的酪氨酸激酶家族)的配体，Yancopoulos,G.D.等,Nature 407(2000)242-48。血管生成素家族有四种确定的成员，血管生成素-3和-4(ANG-3和ANG-4)可以代表小鼠和人中相同基因基因座的广泛区域的对应物。Kim,I.等,FEBS Let,443(1999)353-56；Kim,I.等,J Biol Chem 274(1999)26523-28。ANG1和ANG2最初是在组织培养实验中分别作为激动剂和拮抗剂鉴定的(对于ANG1，参见，Davis,S.等,Cell 87(1996)1161-69；对于ANG2，参见Maisonpierre,P.C.等,Science 277(1997)55-60)。所有已知的血管生成素主要结合Tie2，而ANG1和2两者都以3nM(Kd)的亲和力结合Tie2，Maisonpierre,P.C.等,Science 277(1997)55-60。

术语“VEGF”指人血管内皮生长因子(VEGF/VEGF-A)，其记载于例如Leung,D.W.等,Science 246(1989)1306-9；Keck,P.J.等,Science 246(1989)1309-12和Connolly，D.T.等,J.Biol.Chem.264(1989)20017-24。VEGF参与调节正常的和异常的血管发生和与肿瘤和眼内病症有关的新血管化(Ferrara,N.,Endocr.Rev.18(1997)4-25；Berkman,R.A.,J.Clin.Invest.91(1993)153-159；Brown,L.F.等,HumanPathol.26(1995)86-91；Brown,L.F.等,Cancer Res.53(1993)4727-4735；Mattern,J.等,Brit.J.Cancer.73(1996)931-934；及Dvorak,H.F.等,Am.J.Pathol.146(1995)1029-1039)。VEGF是一种同二聚体糖蛋白，VEGF可促进对内皮细胞的促有丝分裂。

本披露所述的“抗原结合分子”在本文中以最广意义指特异性结合抗原的分子，抗原结合分子的例子是抗体、抗体片段、抗体融合蛋白或融合蛋白。示例性的，本文中的双特异性抗原结合分子包含双特异性抗体和抗体融合蛋白。示例性的，本文的双特异性抗体或抗体融合蛋白可以包含第一条链与第二条链，该第一条链是抗体的重链或包含抗体重链的多肽，第二条链是抗体的轻链或包含抗体轻链的多肽。示例性的，在一些实施方案中，本文的双特异性抗原结合分子具有全长抗体的基本结构，是由两条相同的第一条链和两条相同的第二条链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构；其中，第一条链包含抗VEGF抗体重链和抗ANG-2的单链抗体，第二条链包含抗VEGF抗体的轻链。

如本披露所述的“双特异性抗原结合分子”是指能同时结合两个抗原或抗原决定簇的抗原结合分子，其包含结合第一抗原或抗原决定簇的第一抗原结合域和结合第二抗原或抗原决定簇的第二抗原结合域。在本披露的一些实施方案中，第一抗原结合域特异性结合ANG-2，第二抗原结合域特异性结合VEGF；或者，在在本披露的一些实施方案中，第一抗原结合域特异性结合VEGF，第二抗原结合域特异性结合ANG-2。

在一些实施方案中，本披露所述的双特异性抗原结合分子为双特异性二价抗体或双特异性四价抗体。

在本领域中公知，根据不同结构可将双特异性抗原结合分子分为2大类：含Fc片段的双特异性抗原结合分子与不含Fc片段的双特异性抗原结合分子。含Fc片段的双特异性抗原结合分子结构包括但不限于TrioMab、Crossmab/KIH、DVD-Ig、IgG-scFv、FIT-Ig、mAb-Trap等。不含Fc片段的双特异性抗原结合分子结构包括但不限于BiTE、DART、TandAb、ImmTAC、TriKE等。

如本披露所述的“Crossmab”是存在Fc区域的IgG样双特异性抗原结合分子结构，其通过在第一抗原结合域的Fab区内交换重链和轻链结构，从而导致VH-VL和CH1-CL之间界面的分子结构发生变化。经过交换的抗体轻链由于相互排斥的原理，即VH与VH相互排斥、CL与CL相互排斥，不易与未改造抗体的重链发生错配，从而产生轻重链的正确配对。

在另一些实施方案中，本披露的双特异性抗原结合分子是Crossmab形式，由第一重链，第一轻链，第二重链和第二轻链组成的四肽结构，其中，第一重链和第一轻链组成结合ANG-2的第一抗原结合域，第二重链和第二轻链组成结合VEGF的第二抗原结合域，并且第一重链的CH1与第一轻链的CL互相交换。

如本披露所述的“IgG-scFv”是存在Fc区域的IgG样双特异性抗原结合分子结构，其中一个抗原结合域的scFv融合到另一个抗原结合域IgG重链或轻链的C端，以构成IgG-scFv双特异性抗原结合分子。

在另一些实施方案中，本披露的双特异性抗原结合分子是IgG-scFv形式。在示例性的实施方案中，特异性结合ANG-2的scFv直接地或通过连接子与特异性结合VEGF的抗体重链C端连接，构成IgG-scFv形式双特异性抗原结合分子。

术语“价”指抗原结合分子中存在规定数目的结合位点。因此，术语“二价”、“四价”和“六价”分别指抗原结合分子中存在两个结合位点、四个结合位点和六个结合位点。

本披露所述的“能够特异性结合ANG-2的第一抗原结合域”或“能够特异性结合VEGF的第二抗原结合域”指抗原结合分子中包含与ANG-2或VEGF的全部或部分特异性结合的区域。例如，所述抗原结合域可以包含一个或多个抗体可变区。特别的，能够特异性结合抗原的抗原结合域包含抗体轻链可变区和抗体重链可变区，其可以形成scFv、Fab等构型。

术语“抗体融合蛋白”是指将目的蛋白质(多肽)与抗体连接形成的具有生物活性的融合蛋白，所述的融合蛋白具有所连接的蛋白质的生物学活性以及免疫球蛋白活性。

术语“抗体”以最广义使用，并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体，多克隆抗体，多特异性抗体(例如双特异性抗体)，和抗体片段，只要它们展现出期望的抗原结合活性。

“天然抗体”指具有不同结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是约150,000道尔顿的异四聚糖蛋白，由二硫化物键合的两条相同轻链和两条相同重链构成。从N至C端，每条重链具有一个可变区(VH)，又称作可变重域或重链可变域，接着是三个恒定域(CH1,CH2,和CH3)。类似地，从N至C端，每条轻链具有一个可变区(VL)，又称作可变轻域，或轻链可变域，接着是一个恒定轻(CL)域。根据其恒定域氨基酸序列，抗体轻链包括两种类型，卡帕(κ)和拉姆达(λ)。根据抗体重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，可将抗体分为五类，或称为抗体同种型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相应的重链分别为μ链、δ链、γ链、α链、和ε链。同一类Ig根据其铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别，又可分为不同的亚类，如IgG可分为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。五类Ig中每类Ig都可以有κ链或λ链。

抗体重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸的序列变化很大，为可变区；靠近C端的其余氨基酸序列相对稳定，为恒定区。每条重链由重链可变区(本文中缩写为VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。每条轻链由轻链可变区(本文中缩写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区包含一个结构域，CL。VH和VL区可进一步细分为高变区，称为互补性决定区(CDR)，其间穿插有称为框架区(FR)的较保守区。每条轻链的包含3个CDR区：LCDR1、LCDR2、和LCDR3；每条重链的包含3个CDR区：HCDR1、HCDR2和HCDR3。每个VH和VL由从氨基末端排到羧基末端按以下顺序排列的三个CDR和四个FR构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq))的结合。

术语“互补决定区”、“CDR”或“高变区”是指可变结构域内主要促成抗原结合的区域。通常，每个重链可变区中存在三个CDR(HCDR1、HCDR2、HCDR3)，每个轻链可变区中存在三个CDR(LCDR1、LCDR2、LCDR3)。可以各种公知方案来确定CDR的氨基酸序列边界，例如：“Kabat”编号规则(参见Kabat等(1991)，“Sequences of Proteins of Immunological Interest”，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD)、“Chothia”编号规则(参见Martin,ACR.Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains[J].2001)和ImMunoGenTics(IMGT)编号规则(Lefranc，M.P.等，Dev.Comp.Immunol.，27，55-77(2003)；Front Immunol.2018 Oct 16；9:2278等)。包括例如Kabat编号和IMGT独特编号系统在内的编号系统之间的关系是本领域技术人员熟知的。

例如，对于经典格式，遵循Kabat规则，所述重链可变域(VH)中的CDR氨基酸残基编号为31-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)；轻链可变域(VL)中的CDR氨基酸残基编号为24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。

遵循Chothia规则，VH中的CDR氨基酸编号为26-32(HCDR1)、52-56(HCDR2)和95-102(HCDR3)；并且VL中的氨基酸残基编号为24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。

通过组合Kabat和Chothia两者的CDR定义，CDR由人VH中的氨基酸残基26-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)和人VL中的氨基酸残基24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)构成。

遵循IMGT规则，VH中的CDR氨基酸残基编号大致为27-38(CDR1)、56-65(CDR2)和105-117(CDR3)，VL中的CDR氨基酸残基编号大致为27-38(CDR1)、56-65(CDR2)和105-117(CDR3)。遵循IMGT规则，抗体的CDR区可以使用程序IMGT/DomainGap Align确定。

遵循AbM规则，VH中的CDR氨基酸编号为26-35(HCDR1)、50-58(HCDR2)和95-102(HCDR3)；并且VL中的氨基酸残基编号为24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。

除非另有说明，本披露实施例中的可变区和CDR序列均适用“Kabat”编号规则。

术语“抗体框架”或“FR区”，是指可变结构域VL或VH的一部分，其用作该可变结构域的抗原结合环(CDR)的支架。从本质上讲，其是不具有CDR的可变结构域。

“抗体恒定区结构域”指来源于抗体的轻链和重链的恒定区的结构域，包括CL和来源于不同类抗体的CH1、CH2、CH3和CH4结构域。本披露的恒定区还包括所述人抗体重链恒定区和人抗体轻链恒定区的“常规变体”，其指现有技术已公开的来源于人的不改变抗体可变区结构和功能的重链恒定区或轻链恒定区的变体，示例性变体包括对重链恒定区进行定点改造和氨基酸替换的IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链恒定区变体，具体替换如现有技术已知的YTE突变，L234A和/ 或L235A突变，S228P突变，和/或获得knob-into-hole结构的突变(使得抗体重链具有knob-Fc和hole-Fc组合)，这些突变已被证实使得抗体具有新的性能，但不改变抗体可变区的功能。

“抗体片段”指不同于完整抗体的分子，其包含完整抗体的部分，所述部分与完整抗体所结合的抗原相结合。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab′)2、Fd、dAb；驼类VHH结构域；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。

“单链可变片段(scFv)”，也称“单链抗体”，是通过接头连接的抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的融合蛋白。特别地，接头是10至25个氨基酸的短多肽且通常富含有关柔性的甘氨酸，以及有关溶解性的丝氨酸或苏氨酸，并且可将VH的N端与VL的C端连接，或反之亦然。尽管去除了恒定区并引入了接头，但这种蛋白质保留了原始抗体的特异性。关于scFv片段的综述，见例如Pluckthün,于ThePharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg和Moore编,(Springer-Verlag,New York),第269-315页(1994)；还可见WO 93/16185；和美国专利No.5,571,894和5,587,458。

“接头”或“连接子”指用于连接多肽(如蛋白质结构域)的多肽序列，通常具有一定的柔性，接头的使用不会使多肽原有结构和功能丧失。

术语“Fc区”在本文中用于定义免疫球蛋白重链的C端区域，其含有恒定区的至少部分。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。Fc区的C末端赖氨酸(Lys447)可以存在或不存在。除非本文另有说明，Fc区或恒定区中的氨基酸残基编号根据EU编号系统，也称为EU索引。

术语“结合位点”或“抗原结合位点”指抗体分子与抗原实际结合的区域。术语“抗原结合位点”包含抗体重链可变域(VH)和抗体轻链可变域(VL)，或仅包含抗体重链可变域或轻链可变结构域。

“嵌合”抗体指其中的重链和/或轻链的一部分自特定的来源或物种衍生，而重链和/或轻链的剩余部分自不同来源或物种衍生的抗体。

术语“人源化”抗体是保留非人抗体的反应性同时在人中具有较低免疫原性的抗体。例如，这可以通过保留非人CDR区并用其人对应物(即，恒定区以及可变区的框架部分)替换抗体的其余部分来实现。参见，例如，Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊],81:6851-6855,1984；Morrison和Oi,Adv.Immunol.[免疫学进展],44:65-92,1988；Verhoeyen等人,Science[科学],239:1534-1536,1988；Padlan,Molec.Immun.[分子免疫学],28:489-498,1991；以及Padlan,Molec.Immun.[分子免疫学],31:169-217,1994。人工程化技术的其他实例包括但不限于在US 5,766,886中披露的Xoma技术。

通常，将非人抗体人源化以降低对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。一般地，人源化抗体包含一个或多个可变域，其中HVR(重链可变区)，例如CDR(或其部分)自非人抗体衍生，而FR(或其部分)自人抗体序列衍生。任选地,人源化抗体还会至少包含人恒定区的一部分。在一些实施方案中，将人源化抗体中的一些FR残基用来自非人抗体(例如衍生HVR残基的抗体)的相应残基替代，例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。

术语“人抗体”旨在包括具有可变区的抗体，其中框架区和CDR区两者均衍生自人来源的序列。此外，如果抗体含有恒定区，则恒定区还衍生自此类人序列，例如人种系序列或突变形式的人种系序列。本披露的人抗体可以包括不是由人序列编码的氨基酸残基(例如，通过在体外随机诱变或位点特异性诱变或通过在体内体细胞突变来引入的突变)。

术语“全长抗体”，“完整抗体”和“全抗体”在本文中可互换使用，指与天然抗体结构具有基本上类似的结构或者具有含有如本文中所限定的Fc区的重链的抗体。

术语“抗原”是指能够由诸如抗原结合蛋白(包括例如抗体)的选择性结合剂结合且另外能够用于动物中以产生能够结合该抗原的抗体的分子或分子部分。抗原可具有一个或多个能够与不同的抗原结合蛋白(例如抗体)相互作用的表位。

术语“表位”指能够与抗体或其抗原结合片段特异性结合的抗原上的区域(area或region)。表位可以自连续氨基酸串(线性表位)形成或包含非连续氨基酸(构象表位)，例如因抗原的折叠(即通过蛋白质性质的抗原的三级折叠)而变成空间接近。构象表位和线性表位的差别在于：在变性溶剂的存在下，抗体对构象表位的结合丧失。例如，表位包含处于独特空间构象的至少3，至少4，至少5，至少6，至少7，或8-10个氨基酸。

筛选结合特定表位的抗体(即那些结合相同表位的)可以使用本领域例行方法来进行，例如但不限于丙氨酸扫描,肽印迹(见Meth.Mol.Biol.248(2004)443-463),肽切割分析，表位切除，表位提取，抗原的化学修饰(见Prot.Sci.9(2000)487-496),和交叉阻断(见“Antibodies,”Harlow and Lane(Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harb.,NY))。

还可以使用竞争性结合来鉴定抗体是否与参照抗抗体结合相同表位或竞争结合。例如，与参照抗体“结合相同表位的抗体”指在竞争测定法中将参照抗体对其抗原的结合阻断50％或更多的抗体，且相反，参照抗体在竞争测定法中将该抗体对其抗原的结合阻断50％或更多。还例如，为了测定待测抗体是否与参照抗体结合相同表位，在饱和条件下容许参照抗体结合抗原。在去除过量的参照抗体后，评估待测抗体结合抗原的能力。如果该待测抗体能够在参照抗体的饱和结合之后结合抗原，那么可以得出结论，该待测抗体与参照抗体结合不同表位。但是，如果该待测抗体在参照抗体的饱和结合之后不能够结合抗原，那么该待测抗体可结合与参照抗体结合相同的表位。为了确认待测抗体是否结合相同表位或仅仅受到空间原因阻碍结合，可以使用例行实验(例如，肽突变和使用ELISA、RIA、表面等离子共振、流式细胞术或本领域可获得的任何其它定量或定性抗体结合测定的结合分析)。这种测定法应当以两种设置中进行，即两种抗体均作为饱和抗体。如果在两种设置中，均只有第一(饱和)抗体能够结合抗原，那么可以得出结论，该待测抗体和参照抗体竞争结合该抗原。

在一些实施方案中，如在竞争性结合测定中所测量的(参见例如，Junghans等人，Cancer Res.50(1990)1495-1502)，如果一个抗体的1倍、5倍、10倍、20倍或100倍过量抑制另一个抗体的结合至少50％、至少75％、至少90％或甚至99％或更多，则认为两个抗体结合相同或重叠的表位。

如此处所述，抗体和/或其抗原结合片段之间的“竞争”意味着两种抗体(或其结合片段)结合相同或重叠的表位(例如，如通过竞争性结合测定，通过本领域技术人员所熟知的任一方法所确定的)。如果所述竞争性抗体或其抗原结合片段与本披露的抗体或抗原结合片段结合相同的表位或重叠的表位，则该抗体或其抗原结合片段还与本披露的抗体或抗原结合片段“竞争”。如本文所使用的，竞争性抗体或其抗原结合片段还可包括如下：(i)空间阻断本披露的抗体或抗原结合片段结合其靶标的竞争性抗体或其抗原结合片段(例如，如果所述竞争性抗体结合临近的、非重叠的和/或相同表位并且以物理的方式防止本披露的抗体或抗原结合片段结合其靶标)；和/或(ii)结合不同的、非重叠的表位并且诱导抗原发生如下构象变化的竞争性抗体或其抗原结合片段，所述构象变化使得所述抗原不再以无该构象变化时具有的方式结合本披露的抗体或抗原结合片段。

“特异性地结合”、“特异性结合”或“结合”是指抗体以比针对其他抗原或表位更高的亲和力结合至某个抗原或该抗原内的表位。通常，抗体以约1×10-7M或更小(例如约1×10-8M或更小、约1×10-9M或更小、约1×10-10M或更小、约1×10-11M或更小，或者约1×10-12M或更小)的平衡解离常数(KD)结合抗原或抗原内的表位，通常KD为该抗体结合至非特异性抗原(例如BSA、酪蛋白)的KD的至少百分之一。可使用标准程序来测量KD。然而，特异性结合至抗原或抗原内的表位的抗体可能对其它相关的抗原具有交叉反应性，例如，对来自其它物种(同源)(诸如人或猴，例如食蟹猕猴(Macaca fascicularis)(cynomolgus，cyno)、黑猩猩(Pan troglodytes)(chimpanzee，chimp)或狨猴(Callithrix jacchus)(commonmarmoset，marmoset)的相同抗原具有交叉反应性。

“亲和力”指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间全部非共价相互作用总和的强度。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以用解离常数(KD)来表述。亲和力可以通过本领域知道的常用方法来测量，包括本文中所描述的方法。

术语“kassoc”或“ka”意在是指特定抗体-抗原相互作用的缔合速率，而如本文所使用的术语“kdis”或“kd”意在是指特定抗体-抗原相互作用的解离速率。如本文所使用的，术语“KD”意在是指解离常数，其获得自kd与ka的比率(即 kd/ka)并且表示为摩尔浓度(M)。可以使用本领域良好建立的方法测定抗体的KD值。用于测定抗体KD的方法包括使用生物传感系统例如系统测量表面等离子体共振，或通过溶液平衡滴定法(SET)测量溶液中的亲和力。

术语“核酸”在本文中可与术语“多核苷酸”互换使用，并且是指呈单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。所述术语涵盖含有已知核苷酸类似物或修饰的骨架残基或连接的核酸，所述核酸是合成的、天然存在的和非天然存在的，具有与参考核酸相似的结合特性，并且以类似于参考核苷酸的方式代谢。此类类似物的实例包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性-甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)。

除非另有说明，否则特定的核酸序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)和互补序列以及明确指明的序列。具体地，如下详述，简并密码子取代可以通过产生如下序列而获得，在这些序列中，一个或多个所选的(或全部)密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代(Batzer等人,Nucleic Acid Res[核酸研究].19:5081,1991；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem[生物化学杂志].260:2605-2608,1985；和Rossolini等人,Mol.Cell.Probes[分子与细胞探针]8:91-98,1994)。

序列“同一性”指，当对两条序列进行最佳比对时，必要时引入间隙，以获取最大序列同一性百分比，且不将任何保守性取代视为序列同一性的一部分，两条序列的氨基酸/核酸在等价位置相同的程度(百分比)。为测定序列同一性百分比，比对可以通过属于本领域技术的范围内的多种方式来实现，例如使用公开可得到的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可确定适用于测量比对的参数，包括在所比较的序列全长上达成最大比对所需的任何算法。

“保守修饰的变体”或“保守性取代”指使用具有相似特征(例如，电荷、侧链尺寸、亲水性/疏水性、骨架构型和刚性等)的其他氨基酸置换蛋白中的氨基酸，使得通常可以做出这样的变化而不改变蛋白的生物活性。本领域技术人员知晓，在通常情况下，在多肽的非必需区域中的单氨基酸置换基本上不改变生物活性(参见例如，Watson等，(1987)Molecular Biology of the Gene,The Benjamin/Cummings Pub.Co.,p.224(4th Ed.))。此外，结构或功能上类似的氨基酸的置换不太可能破坏生物活性。示例性的保守性置换如下表中所示。

表1.示例性的保守性氨基酸置换

原始残基	保守性取代
Ala(A)	Gly；Ser
Arg(R)	Lys；His
Asn(N)	Gln；His
Asp(D)	Glu；Asn

Cys(C)	Ser；Ala
Gln(Q)	Asn
Glu(E)	Asp；Gln
Gly(G)	Ala
His(H)	Asn；Gln
Ile(I)	Leu；Val
Leu(L)	Ile；Val
Lys(K)	Arg；His
Met(M)	Leu；Ile；Tyr
Phe(F)	Tyr；Met；Leu
Pro(P)	Ala
Ser(S)	Thr
Thr(T)	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe
Tyr(Y)	Trp；Phe
Val(V)	Ile；Leu

术语“保守修饰的变体”当适用核酸序列时，保守修饰的变体是指那些编码相同或基本上相同的氨基酸序列的核酸，或在该核酸不编码氨基酸序列的情况下，是指基本相同的序列。由于遗传密码的简并性，任何给定的蛋白质均可以由多个功能相同的核酸编码。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在密码子指定丙氨酸的每个位置，该密码子可以改变为任何所述相应密码子而不改变编码的多肽。此类核酸变异是“沉默变异”，它们是保守修饰变异中的一种。本文中编码多肽的每个核酸序列也描述了核酸的每种可能的沉默变异。技术人员将认识到，核酸中的每个密码子(除了AUG--通常是甲硫氨酸的唯一密码子；和TGG--通常是色氨酸的唯一密码子)均可以被修饰以产生功能相同的分子。因此，在每个所述序列中均隐含了编码多肽的核酸的每一种沉默变异。

术语“载体”意指能够转运与其连接的另一多核苷酸的多核苷酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其是指环状双链DNA环，其中可以连接附加的DNA区段。另一种类型的载体是病毒载体，例如腺相关病毒载体(AAV或AAV2)，其中另外的DNA区段可以连接到病毒基因组中。某些载体能够在引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体)可以在引入宿主细胞中后整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。

术语“表达载体”或“表达构建体”是指适用于对宿主细胞进行转化且含有指导及/或控制(连同宿主细胞一起)与其可操作地连接的一个或多个异源编码区的表达的核酸序列的载体。表达构建体可以包括但不限于影响或控制转录、翻译且在存在内含子时影响与其可操作地连接的编码区的RNA剪接的序列。

如本文中所使用，“可操作地连接”意指该术语所适用的组分呈允许其在适合条件下执行其固有功能的关系。举例而言，载体中与蛋白质编码序列“可操作地连接”的控制序列是与其连结，从而在与该控制序列的转录活性兼容的条件下达成该蛋白质编码序列的表达。

术语“宿主细胞”，“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且指已经导入外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“经转化的细胞”，其包括原代的经转化的细胞及自其衍生的后代而不考虑传代的次数。后代在核酸内容物上可以与亲本细胞不完全相同，而是可以含有突变。本文中包括具有与在初始转化细胞中筛选或选择的相同功能或生物学活性的突变体后代。宿主细胞包括原核和真核宿主细胞，其中真核宿主细胞包括但不限于哺乳动物细胞、昆虫细胞系(例如，草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)或粉纹夜蛾(Trichoplusia ni))、两栖动物细胞、细菌细胞、植物细胞和真菌细胞。哺乳动物宿主细胞包括人、小鼠、大鼠、犬、猴、猪、山羊、牛、马和仓鼠细胞，包括但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NSO、SP2细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如，Hep G2)、A549细胞、3T3细胞和HEK-293细胞。真菌细胞包括酵母和丝状真菌细胞，包括例如巴氏毕赤酵母(Pichiapastoris)、芬兰毕赤酵母(Pichia finlandica)、海藻毕赤酵母(Pichia trehalophila)、科克拉马毕赤酵母(Pichia koclamae)、膜状毕赤酵母(Pichia membranaefaciens)、小毕赤酵母(Pichia minuta)(Ogataea minuta、Pichia lindneri)、仙人掌毕赤酵母(Pichiaopuntiae)、耐热毕赤酵母(Pichia thermotolerans)、柳毕赤酵母(Pichia salictaria)、Pichia guercuum、皮杰普毕赤酵母(Pichia pijperi)、具柄毕赤酵母(Pichia stiptis)、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)、毕赤酵母属、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、酿酒酵母属、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、克鲁维酵母属、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、白色念珠菌(Candida albicans)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、勒克氏菌(Chrysosporium lucknowense)、镰刀菌属(Fusarium sp.)、禾谷镰刀菌(Fusarium gramineum)、菜镰刀菌(Fusarium venenatum)、小立碗藓(Physcomitrella patens)和粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)。毕赤酵母属、任何酿酒酵母属、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、任何克鲁维酵母属、白色念珠菌(Candida albicans)、任何曲霉属、里氏木霉(Trichoderma reesei)、勒克霉菌(Chrysosporium lucknowense)、任何镰刀菌属、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)和粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)。在一些实施方案中，所述宿主细胞是非人细胞。

如在本申请中所使用的，表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可以互换使用，并且所有这样的名称均包括子代。因而，词语“转化体”和“转化的细胞”包括原代受试者细胞和来源于其的培养物，而与传代的次数无关。还应理解的是，由于有意或无意的突变，使得并非所有子代均具有完全相同的DNA内容物。包括与筛选出其的原始转化细胞具有相同功能或生物活性的突变子代。

“任选”或“任选地”意味着随后所描述地事件或环境可以但不必发生，该说明包括该事件或环境发生或不发生的场合。

“药物组合物”表示含有一种或多种本文所述的抗体或其抗原结合片段与其他化学组分的混合物，所述其他组分例如生理学/可药用的载体和赋形剂。

术语“药学上可接受的载体”意指生理学上相容的任何溶剂、分散介质、涂层、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收增强或延迟剂等。药学上可接受的载体的一些实例为水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、具有氯化钠的乙酸盐缓冲液、右旋糖、甘油、聚乙二醇、乙醇等以及其组合。在许多情况下，组合物中优选包含等渗剂，例如糖、多元醇(例如甘露醇、山梨糖醇)或氯化钠。药学上可接受的物质的其他实例为表面活性剂、湿润剂或少量辅助物质例如湿润剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，其增强抗体的保质期或有效性。

本披露的药物组合物可通过本领域已知的各种方法施与。施与途径和/或方式根据所希望的结果而变化。优选地，施与可以是玻璃体内、静脉内、肌肉内、腹膜内或皮下或在靶标部位附近施与。药学上可接受的载体应适合于玻璃体内、静脉内、肌肉内、皮下、肠胃外、脊柱或表皮施与(例如，通过注射或输注)。根据施与途径，活性化合物(即抗体，双特异性和多特异性分子)可以包被在材料中以保护化合物免受酸和可能使化合物失活的其他自然条件的作用。

术语“受试者”包括人类和非人类动物。非人动物包括所有脊椎动物(例如哺乳动物和非哺乳动物)例如非人灵长类(例如，食蟹猴)、绵羊、狗、牛、鸡、两栖动物和爬行动物。除非指出时，否则所述术语“患者”或“受试者”在本文中可互换地使用。如本文所使用的，术语“食蟹猴(cyno)”或“食蟹猴(cynomolgus)”是指食蟹猴(Macaca fascicularis)。在某些实施方案中，个体或受试者是人。

“施用”、“给予”和“处理”，当其应用于动物、人、实验受试者、细胞、组织、器官或生物流体时，是指外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物与动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体的接触。

“样本”是指从受试者分离的类似流体、细胞、或组织的采集物，以及存在于受试者体内的流体、细胞或组织。示例性样本为生物流体，诸如血液、血清和浆膜液、血浆、淋巴液、尿液、唾液、囊液、泪液、排泄物、痰、分泌组织和器官的粘膜分泌物、阴道分泌物、腹水、胸膜、心包、腹膜、腹腔和其它体腔的流体、由支气管灌洗液收集的流体、滑液、与受试者或生物来源接触的液体溶液，例如细胞和器官培养基(包括细胞或器官条件培养基)、灌洗液等，组织活检样本、细针穿刺、手术切除的组织、器官培养物或细胞培养物。

“治疗/处理”(及其语法变型)指试图改变所治疗个体的天然过程的临床干预，并且可以为了预防或者在临床病理学的过程期间实施。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或再发生，减轻症状，减轻/减少疾病的任何直接或间接病理后果，预防转移，降低疾病进展速率，改善或减轻疾病状态，和消退或改善的预后。在一些实施方案中,使用本披露的抗体来延迟疾病的形成或减缓疾病的进展。

“有效量”一般是足以降低症状的严重程度及/或频率、消除这些症状及/或潜在病因、预防症状及/或其潜在病因出现及/或改良或改善由疾病状态引起或与其相关的损伤(例如肺病)的量。在一些实施例中，有效量是治疗有效量或预防有效量。“治疗有效量”是足以治疗疾病状态或症状、尤其与该疾病状态相关的状态或症状，或者以其他方式预防、阻碍、延迟或逆转该疾病状态或以任何方式与该疾病相关的任何其他不理想症状的进展的量。“预防有效量”是当给予受试者时将具有预定预防效应，例如预防或延迟该疾病状态的发作(或复发)，或者降低该疾病状态或相关症状的发作(或复发)可能性的量。完全治疗或预防效应未必因给予一个剂量便发生，而且可能仅在给予一系列剂量之后发生。因而，治疗或预防有效量可以一次或多次给予的方式给予。“治疗有效量”和“预防有效量”可取决于以下因素变化：诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重，以及治疗剂或治疗剂组合在个体中引发期望的应答的能力。有效治疗剂或治疗剂组合的示例性指标包括例如患者改善的健康状况。

术语“癌(症)”和“癌(性)的”指向或描述哺乳动物中典型的以不受调节的细胞生长为特征的生理疾患。此定义中包括良性和恶性癌症。“早期癌症”或“早期肿瘤”指非侵入性的或转移性的，或者归为0期、I期、或II期癌症的癌症。癌症的例子包括但不限于淋巴瘤、母细胞瘤(包括髓母细胞瘤和视网膜母细胞瘤)、肉瘤(包括脂肪肉瘤和滑膜细胞肉瘤)、神经内分泌肿瘤(包括类癌瘤、胃泌素瘤和胰岛细胞癌)、间皮瘤、施旺氏细胞瘤(包括听神经瘤)、脑膜瘤、腺癌、黑素瘤、肾上腺肿瘤、和白血病或淋巴样恶性肿瘤。此类癌症的更具体例子包括但不限于鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)；肺癌包括小细胞肺癌(SCLC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺的腺癌和肺的鳞癌；腹膜癌；肝细胞癌；胃癌(gastric or stomach cancer)包括胃肠癌；胰腺癌；成胶质细胞瘤；宫颈癌；卵巢癌；肝癌(liver cancer or hepatic carcinoma)、膀胱癌；肝瘤(hepatoma)；乳腺癌(包括转移性乳腺癌)；结肠癌；直肠癌；结肠直肠癌；子宫内膜癌或子宫癌；唾液腺癌；肾癌(kidney or renal cancer)；前列腺癌；外阴癌；甲状腺癌；肛门癌；阴茎癌；睾丸癌；食道癌；胆管肿瘤；输卵管癌；卵巢癌；胆管癌；膀胱癌；胰腺癌；皮肤癌；及头和颈癌和多发性骨髓瘤。

实施例和测试例

以下结合实施例和测试例进一步描述本披露，但这些实施例和测试例并非限制着本披露的范围。本披露实施例或测试例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如冷泉港的抗体技术实验手册，分子克隆手册；或按照原料或商品制造厂商所建议的条件；未注明具体来源的试剂材料，为市场购买获得。

实施例1.ANG-2和ANG-2受体Tie2的表达

编码带人IgG1-Fc标签的人ANG-2和人ANG-2受体Tie2胞外区序列插入phr载体中，构建成表达质粒，然后转染HEK293。具体转染步骤为：前一天将HEK293E细胞以1×10 ⁶/mL接种于freestyle表达培养基(含有1％FBS，Gibco，12338-026)，放置于37度恒温摇床(120rpm)继续培养24小时。24小时后，将转染质粒和转染试剂PEI混合物缓慢加入200mL HEK293E的细胞中，放入8％CO ₂、120rpm、37℃的摇床中培养。转染第3天，补充10％体积的补料培养基(20mM葡萄糖+2mM L-谷氨酸)。待转染第6天，取样4500rpm离心10分钟收集细胞上清，将重组的ANG-2和Tie2受体蛋白按照实施例2所述的方法进行纯化。

其中人ANG-2氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，Tie2胞外区Fc融合蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

相关序列如下所示：

(1)带人Fc标签的人ANG-2氨基酸序列(huANG-2-Fc)

注释：横线部分为ANG-2蛋白全长序列，点线为接头，斜体部分为人IgG1Fc标签。

(2)带人Fc标签的Tie2氨基酸序列(huTie2-Fc)

注释：下划线部分为Tie2的胞外区，斜体部分为人IgG1Fc标签。

实施例2.Protein A亲和层析纯化带Fc标签的重组蛋白或抗体

将表达抗体或huANG-2-Fc、huTie2-Fc的细胞上清样品高速离心去除杂质，通过Protein A柱进行纯化。用PBS冲洗柱子，至A280读数降至基线。用100mM乙酸pH 3.5洗脱目的蛋白，用1M Tris-HCl，pH8.0中和。洗脱样品适当浓缩后利用PBS平衡好的凝胶层析Superdex200(GE)进一步纯化，将得到的蛋白经电泳，肽图，LC-MS鉴定为正确后分装备用。

实施例3.表达重组ANG-2受体Tie2的细胞系的构建和鉴定

为筛选有功能的抗体，本披露构建了表达Tie2的CHO-K1/Tie2细胞株。

将人Tie2全长基因克隆到哺乳动物细胞表达载体pBABE上，用pVSV-G，pGag-pol和pBABE-Tie2三种质粒共同转染HEK293T细胞(ATCC,CRL-3216)包装病毒，转染48小时后，收集病毒感染CHOK1细胞(ATCC,CRL-9618)。感染72小时后用10μg/mL嘌呤霉素加压筛选，待克隆团扩增生长后，消化细胞用FACS检测表达量，阳性率约40％，然后分选单克隆细胞，得到表达人Tie2的单克隆1B11。

实施例4.抗人ANG-2杂交瘤抗体的筛选和鉴定

本披露通过杂交瘤技术制备了针对人ANG-2的单克隆抗体，所得抗体与人ANG-2以较高的亲和力，并且可以与食蟹猴ANG-2有交叉反应，能够阻断ANG-2与其受体结合，且可以抑制ANG-2诱导的Tie2的磷酸化。

用重组蛋白huANG-2-Fc(100/50/50μg)，与TiterMax/Alum/CpG佐剂免疫SJL小鼠。ANG-2的特异性免疫反应通过检测血清效价的ELISA和配体受体阻断实验来测定。选取有较好特异性免疫反应的小鼠，处死后，取脾细胞，与骨髓瘤细胞融合。

初次筛选用针对人和鼠ANG-2的ELISA结合实验，阻断人ANG-2结合其受体Tie2的实验进行筛选。当将杂交瘤细胞转移到24孔板后，用针对人和鼠ANG-2的ELISA结合实验，基于ELISA的阻断ANG-2结合其受体Tie2的受体阻断实验对其细胞上清进行复筛。筛选出的阳性克隆经过两轮亚克隆后，得到杂交瘤克隆，用于抗体生产，并通过亲和方法纯化。

筛选出活性好的单克隆杂交瘤细胞株HR54和CP33，分别收集对数生长期杂交瘤细胞，用NucleoZol(MN)提取RNA(按照试剂盒说明书步骤)，并进行反转录(PrimeScript ^TM Reverse Transcriptase，Takara,cat#2680A)。将反转录得到的cDNA采用鼠Ig-Primer Set(Novagen,TB326 Rev.B 0503)进行PCR扩增后送测序公司测序。经测序得到鼠源抗ANG-2抗体：HR54和CP33，其可变区氨基酸序列如下：

>HR54鼠源重链可变区序列：

>HR54鼠源轻链可变区序列：

>CP33鼠源重链可变区序列：

>CP33鼠源轻链可变区序列：

其中，划线表示CDR，斜体部分表示连接子，其余部分为FR。

根据Kabat编号规则获得的CDR区氨基酸序列如下表所示：

表2.杂交瘤克隆来源抗体重链及轻链的CDR区序列

将上述鼠源抗体的轻重链可变区与人源抗体的轻、重链恒定区(如SEQ ID NO：47所示的重链恒定区和如SEQ ID NO：48所示的轻链恒定区)连接后形成嵌合抗体，HR54克隆对应的嵌合抗体命名为CHR54，其他抗体类推。

实施例5.抗人ANG-2单克隆抗体的人源化

鼠源单克隆抗体人源化，可以根据本领域许多文献公示的方法进行。简言之，在所获得的鼠源抗体VH/VL CDR典型结构的基础上，从人源germline数据库中搜索轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)的同源序列，选取FR同源性高的germline作为模板，将鼠源抗体的CDR区移植到人源模板上，并对FR区的某些氨基酸进行回复突变，将鼠源抗体的恒定区替换为人恒定区，得到最终的人源化分子。

5.1 HR54鼠源抗体的人源化

HR54的人源化VH模板为IGHV3-7*01，人源化VL的模板为IGKV4-1*01，将HR54鼠源抗体的CDR移植到人源模板上，并对框架区氨基酸进行回复突变，具体回复突变如下表：

表3.HR54抗体的回复突变

注：Grafted代表鼠抗体CDR植入人种系FR区序列，N84S表示依照Kabat编号系统，将84位N突变回S。

鼠源抗体HR54人源化抗体的可变区序列如下：

>huHR54VL1(hu HR54 VL-CDR grafted)

>huHR54VL2

>huHR54VL3

>huHR54VH1(huHR54 VH-CDR Grafted)

>huHR54VH2

其中，划线表示CDR，斜体部分表示连接子，其余部分为FR。

将上述轻、重链可变区与人种系轻链、重恒定区序列组合形成最终的完整轻、重链序列，进而得到全长序列的抗体。在本披露中如无明确说明时，形成全长抗体时重链可变区与SEQ ID NO：47所示恒定区连接形成抗体重链，轻链可变区与SEQ ID NO：48所示的恒定区连接形成抗体轻链链，得到的HR54的人源化抗体(huHR54)，不同huHR54抗体的重、轻链可变区见下表。

表4.huHR54抗体的可变区

可变区	huHR54VH1	huHR54VH2
huHR54VL1	huHR54-01	huHR54-04
huHR54VL2	huHR54-02	huHR54-05
huHR54VL3	huHR54-03	huHR54-06

注：huHR54-01抗体，其重链可变区为huHR54VH1、轻链可变区为huHR54VL1，重链恒定区为SEQ ID NO：47，轻链恒定区为SEQ ID NO：48，其他类推。

通过ELISA实验检测HR54人源化抗体或嵌合抗体与人ANG-2的结合活性。方法如下：

用链霉亲和素(abcam,ab123480)，浓度1ng/μL，每孔100μL，4℃过夜包被平板后，除去上清液，加250μL 5％脱脂奶粉37℃封闭1小时，洗板机洗板3遍。加0.5ng/μL生物素-hAng2-His(sinobiologican,10691-H07H)，37℃孵育1小时。洗板机洗板3遍，加100μL1:1稀释的噬菌体上清液，37℃孵育1小时。洗板机洗板3遍，每孔加100μL 1:10000稀释的抗M13-HRP(GE,27-9421-01)，37℃孵育1小时。洗板机洗板3遍，每孔加100μL TMB显色。5-10分钟后每孔加100μL 1M H ₂SO ₄终止显色，酶标仪测OD450值。其结果如下表所示：

表5.抗体与人ANG-2结合ELISA结果

抗体	EC50(nM)	抗体	EC50(nM)
huHR54-01	0.16	huHR54-04	0.27
huHR54-02	0.23	huHR54-05	0.27
huHR54-03	0.27	huHR54-06	0.32
ChHR54	0.33

结果显示，本披露中的HR54嵌合抗体和人源化抗体均可与人ANG-2特异性结合。

5.2 huHR54人源化抗体的改造

对huHR54-04抗体的HCDR2进行D 52AE或D53N突变，对HCDR3进行D95N、E96Q、C100S或C100V突变，突变后得到的huHR54-04突变体的CDR序列如下：

表6.huHR54突变体的CDR序列

示例性的，huR54的突变后的重链可变区如下：

>huHR54VH2a

>huHR54VH2b

>huHR54VH2c

>huHR54VH2d

>huHR54VH2e

>huHR54VH2f

>huHR54VH2g

>huHR54VH2k

>huHR54VH2m

>huHR54VH2n

其中，划线表示CDR，斜体部分表示连接子，其余部分为FR。

将上述huHR54-04突变体的重链可变区与重链恒定区组合形成完整重链序列，再与huHR54-04人源化抗体的轻链重组，进而得到全长抗体。在本披露中如无明确说明时，形成全长抗体时重链可变区与SEQ ID NO：47所示恒定区连接形成抗体重链，轻链可变区与SEQ ID NO：48所示的恒定区连接形成抗体轻链，得到的人源化抗体的重、轻链可变区组合见下表。

表7.huHR54a抗体的可变区组合

突变体VH	huHR54VL1
HuHR54VH2a	huHR54-07
HuHR54VH2b	huHR54-08
HuHR54VH2c	huHR54-09
HuHR54VH2d	huHR54-10
HuHR54VH2e	huHR54-11
HuHR54VH2f	huHR54-12
HuHR54VH2g	huHR54-13
HuHR54VH2k	huHR54-14
HuHR54VH2m	huHR54-15
HuHR54VH2n	huHR54-16

注：huHR54-07抗体，其重链可变区为huHR54VH2a、轻链可变区为huHR54VL1，重链恒定区为SEQ ID NO：47，轻链恒定区为SEQ ID NO：48，其他类推。

通过ELISA实验检测huHR54抗体突变体与人ANG-2的结合活性，其结果如下表所示：

表8.huHR54抗体突变体与人ANG-2的结合活性

抗体	EC50(nM)
huHR54-07	0.1996
huHR54-08	0.1558
huHR54-09	0.2225
huHR54-10	0.1589
huHR54-11	0.141
huHR54-12	0.1593
huHR54-13	0.1756
huHR54-14	0.2165
huHR54-15	0.1546
huHR54-16	0.2912
huHR54-04	0.2247

结果显示，在huHR54抗体的HCDR2，HCDR3上的点突变，并不会影响huHR54抗体与人ANG-2的结合活性。

huHR54人源化抗体的CDR区可如下表：

表9.huHR54人源化抗体的CDR区

其中X ₁为D或E，X ₂为D或N，X ₃为D或N，X ₄为E或Q，X ₅为C，S或V。

5.3 CP33鼠源抗体的人源化

CP33的人源化VH模板为IGHV3-7*01，VL的模板为IGKV4-1*01，将CP33的CDR移植到人源模板上，并对框架区氨基酸进行回复突变，具体回复突变见下表：

表10.CP33人源化抗体的回复突变

鼠源抗体CP33人源化抗体可变区序列如下：

>huCP33VL1(hu CP33 VL-CDR grafted)

>huCP33VL2

>huCP33VL3

>huCP33VL4

>huCP33VH1(huCP33VH-CDR Grafted)

>huCP33VH2

>huCP33VH3

其中，划线表示CDR，斜体部分表示连接子，其余部分为FR。

将上述轻、重链可变区与人轻链、重恒定区序列组合形成最终的完整轻、重链序列，进而得到全长序列的抗体。在本披露中如无明确说明时，形成全长抗体时重链可变区与SEQ ID NO：47所示恒定区连接形成抗体重链，轻链可变区与SEQ ID NO：48所示的恒定区连接形成抗体轻链链，得到的CP33的人源化抗体(huCP33)，不同huCP33抗体的重、轻链可变区见下表。

表11.huCP33抗体可变区

可变区	huCP33VH1	huCP33VH2	huCP33VH3
huCP33VL1	huCP33-01	huCP33-05	huCP33-09
huCP33VL2	huCP33-02	huCP33-06	huCP33-10
huCP33VL3	huCP33-03	huCP33-07	huCP33-11
huCP33VL3	huCP33-04	huCP33-08	huCP33-12

注：huCP33-01抗体，其重链可变区为huCP33VH1、轻链可变区为huCP33VL1，重链恒定区为SEQ ID NO：47，轻链恒定区为SEQ ID NO：48，其他类推。

通过ELISA实验检测huCP33抗体及嵌合抗体与人ANG-2的结合活性，其结果如下表所示：

表12.ANG-2抗体与人ANG-2结合ELISA检测结果

抗体	EC50(nM)	抗体	EC50(nM)	抗体	EC50(nM)
huCP33-01	0.17	huCP33-05	0.21	huCP33-09	0.22
huCP33-02	0.23	huCP33-06	0.32	huCP33-10	0.30
huCP33-03	0.21	huCP33-07	0.25	huCP33-11	0.30
huCP33-04	0.22	huCP33-08	0.36	huCP33-12	0.24
ChCP33	0.47

结果显示，CP33人源化抗体与人ANG-2具有亲和力与ChCP33相当，均可特异性识别人ANG-2。

5.4.抗ANG-2抗体的恒定区及全长抗体序列

示例性的抗体的抗体的重、轻链恒定区如下：

重链恒定区：

轻链恒定区：

示例性的huHR54全长抗体和huCP33全长抗体的序列如下：(a)huHR54-01抗体

huHR54-01重链：

huHR54-01轻链：

(b)huHR54-04抗体

huHR54-04重链：

huHR54-04轻链：

(c)huHR54-12抗体

huHR54-12重链：

huHR54-12轻链：

(d)huCP33-01抗体

huCP33-01抗体重链：

huCP33-01抗体轻链：

(e)huCP33-05抗体

huCP33-05重链：

huCP33-05轻链：

其中，划线表示CDR，其余部分为FR，点划线部分为恒定区。

实施例6.抗VEGF/ANG-2双特异性抗体的制备及鉴定

本披露构建了针对VEGF和ANG-2的不同形式的双特异性抗体，包括但不限于IgG-scFv、DVD和crosmab形式。

抗VEGF抗体可以是目前已知的针对VEGF的任何抗体，比如阿瓦斯汀(Avastin)、RAZUMAB(Axxiom Inc)、GNR-011(Affitech A/S)、R-TPR-024(Reliance Life Sciences Grou)、雷莫芦单抗(ramucirumab，ImClone Systems)等。

示例性的抗体为基因泰克已上市Fab抗体雷珠单抗(Lucentis)，其轻链可变区序列如SEQ ID NO：56所示(参见WO1998045332或CAS Registry Number:347396-82-1)。抗VEGF抗体的重链是将雷珠单抗的重链可变区(序列如SEQ ID NO：58所示)与不同的人IgG1恒定区组合成完整IgG1重链。其具体序列如下：

(1)雷珠单抗的轻链可变区

(2)雷珠单抗的轻链

(3)雷珠单抗的重链可变区

(4)雷珠单抗的重链可变区+IgG1恒定区(本文称为雷珠单抗重链1)

(5)雷珠单抗的重链可变区+IgG1恒定区变体(本文称为雷珠单抗重链2)

其中，划线表示CDR，斜体部分表示连接子，其余部分为FR。

表13.雷珠单抗CDR区序列

为了制备IgG-scFv构型的双特异性抗体，将筛选得到的抗ANG-2抗体的重链可变区和轻链可变区通过连接子连接，得到抗ANG-2单链抗体。其中，连接子可以是本领域公知任何连接子，示例性的连接子为(GGGGS)n，其中n为1-10中的整数。示例性的ANG-2单链抗体序列如下所示：

huHR54-01-scFv

huHR54-04-scFv

huHR54-12-scFv：

huCP33-01-scFv：

huCP33-05-scFv：

其中，划线表示CDR，斜体部分表示连接子，其余部分为FR。

此外，在抗ANG-2的单链抗体的重、轻链可变区中引入半胱氨酸突变，示例性的序列如下：

huHR54VH2-C

huHR54VH2f-C

huHR54VL1-C

huCP33VH2-C

huCP33VL1-C

其中，划线表示CDR，其余部分为FR。

示例性的，抗ANG-2单链抗体的序列如下：

huHR54-04-scFv-CC:

huHR54-12-scFv-CC

huCP33-05-scFv-CC

其中，划线表示CDR，斜体部分表示连接子，其余部分为FR。

通过基因重组技术将抗ANG-2单链抗体直接地(通过肽键)或间接地(通过接头)连接至抗VEGF抗体的重链或轻链，通过293表达系统进行表达，得到双特异性抗体。

示例性的，可将抗ANG-2单链抗体的N-端通过接头(如(GG)n，其中n为1-20)连接至抗VEGF抗体的重链C-端，得到双特异性抗体，其序列如下所示：

(1)双特异抗体1

>双特异性抗体1第一条链：

其中，波浪下划线部分表示抗VEGF抗体的HCDR，点下划线表示恒定区，双下划线表示连接子，斜体部分表示ANG2-scFv，划线部分表示ANG2-scFv的CDR。

>双特异抗体1第二条链：

其中，点下划线表示恒定区，划线部分表示CDR。

(2)双特异性抗体2

>双特异性抗体2第一条链：

>双特异性抗体2第二条链：

其中，点下划线表示恒定区，划线部分表示CDR。

(3)双特异性抗体3

>双特异抗体3第一条链：

>双特异抗体3第二条链：

其中，点下划线表示恒定区，划线部分表示CDR。

(4)双特异性抗体4

>双特异性抗体4第一条链：

>双特异性抗体4第二条链：

其中，点下划线表示恒定区，划线部分表示CDR。

同时，利用筛选得到的抗ANG-2抗体和VEGF抗体，本披露构建了Crossmab形式的双特异性抗体，示例性的Crossmab形式的双特异性抗体的序列如下：

(5)双特异性抗体5

>双特异性抗体5第一重链：抗ANG-2重链

>双特异性抗体5第一轻链：抗ANG-2轻链

>双特异性抗体5第二重链：抗VEGF重链

>双特异性抗体5第二轻链：抗VEGF轻链

其中，点下划线表示恒定区，划线部分表示CDR。

(6)双特异性抗体6

>双特异性抗体6第一重链：抗ANG-2重链

>双特异性抗体6第一轻链：抗ANG-2轻链

>双特异性抗体6第二重链：抗VEGF重链

>双特异性抗体6第二轻链：抗VEGF轻链

其中，点下划线表示恒定区，划线部分表示CDR。

按照实施例2中的纯化方式，使用proteinA亲和层析纯化即可得到纯度>98％的双特异性抗体分子。

本披露还使用RG7716，阿瓦斯汀和RG7221(vanucizumab)作为对照分子，其序列如下所示：

>RG7716抗-ANG-2重链:

>RG7716抗ANG-2轻链:

>RG7716抗VEGF重链

>RG7716抗VEGF轻链

>阿瓦斯汀重链

>阿瓦斯汀轻链

>RG7221抗ANG2重链

>RG7221抗ANG2轻链

>RG7221抗VEGF重链

>RG7221抗VEGF轻链

另外，本披露中使用的阴性对照(NC)是指针对HIV的一个IgG单克隆抗体。

体外活性生物学评价

测试例1.Biacore测定VEGF/ANG-2双特异性抗体与不同种属VEGF/ANG-2的亲和力

用Biacore T200(GE)测定VEGF/ANG-2双特异性抗体与人、猴和小鼠VEGF和ANG-2的亲和力。

用Protein A生物传感芯片亲和捕获抗体，然后于芯片表面流经抗原人VEGF(R&D，293-VE)，猴VEGF(sinobiological，11066)，小鼠VEGF(sinobiological,51059)，人ANG-2(sinobiological，10691-H08H)，猴ANG-2(sinobiological,90026-C07H)，小鼠ANG-2(sinobiological，50298-M07H)。用Biacore T200仪器实时检测反应信号，获得结合和解离曲线。在每个实验循环解离完成后，用10mM甘氨酸-盐酸再生溶液(pH 1.5)将生物传感芯片洗净再生。用BIA评估版本4.1， GE软件以(1:1)Langmuir模型拟合数据，得出亲和力数值，如表14所示。

表14.双特异性抗体与不同种属ANG-2的亲和力

结果显示，双特异性抗体1，双特异性抗体5，双特异性抗体2和双特异性抗体3与人和猴的VEGF和ANG-2均有较高的亲和力。

测试例2.基于ELISA的抗体阻断ANG-2结合Tie2受体实验

ANG-2与血管内皮细胞表面的ANG-2受体Tie2结合，引发Tie2细胞内酪氨酸激酶发生磷酸化，继而传导信号使外周细胞从血管内皮细胞脱落，使血管处于不稳定易于增殖的状态。因此，通过抗体阻断ANG-2与Tie2的结合可以使血管更稳定，抑制新生血管的生成。本实验鉴定结果表明双特异性抗体可以阻断ANG-2结合到重组表达的Tie2蛋白胞外区。

具体方法：用Tie2-Fc(SEQ ID NO：2，3μg/mL溶于PBS，100μL/孔，)包被ELISA板，4℃包被过夜，去除包被液后，加入用PBS稀释的5％脱脂牛奶封闭液200μL/孔，37℃孵育箱孵育2小时进行封闭。封闭结束后，弃去封闭液，并用PBST缓冲液(含0.05％吐温-20的PBS，pH7.4)洗板5次后，加入50μL用1％BSA稀释生物素标记试剂盒(东仁化学，LK03)标记的huANG-2-Fc(SEQ ID NO：1，bio-huANG-2-Fc，终浓度为0.15μg/mL)和50μL待测抗体(始浓度为10μg/mL，3倍比稀释)，混匀后37℃孵育15分钟，加至ELISA板，37℃孵育1小时。孵育结束后，弃去酶标板中的反应液，用PBST洗板5次后，加入100μL/孔1:4000稀释的链霉亲和素-过氧化物酶聚合物(Sigma,S2438-250UG)于37℃孵育1小时。用PBST洗板5次后，加入100μL/孔TMB显色底物(KPL，52-00-03)，于室温孵育3-10分钟，加入100μL/孔1M H ₂SO ₄终止反应，用NOVOStar酶标仪在450nm处读取吸收值，计算抗体阻断ANG-2与Tie2结合的IC50值。

结果显示，双特异性抗体均可较强地抑制ANG-2与Tie2的结合(见表15和图1)。

表15.双特异性抗体抑制ANG-2与Tie2的结合结果

测试例3.双特异性抗体抑制ANG-2诱导的Tie2磷酸化

将过表达huTie2的稳转株CHO-Tie2#1B11-1消化重悬后，用完全培养基调整密度为2.5×10 ⁵细胞/mL，100μL/孔铺入96孔细胞培养板，即2.5×10 ⁴细胞/孔。4～5小时后换液(DME/F-12，HyClone，Cat#SH30023.01+0.1％BSA+20μg/mL嘌呤霉素，Gibco，Cat#A1113803)，饥饿过夜。4.0μg/mL，100μL/孔抗huTie2 capture(R&D Systems，Cat#DYC2720E)包板，常温过夜。去除包被液，250μL/孔1％BSA+0.05％NaN ₃封闭液，常温封闭2小时。将25μL huANG-2-Fc(终浓度2.5μg/mL)和25μL待测抗体(3倍比稀释抗体，最高浓度50.0nM)等体积混匀，37℃孵育15分钟后，再加入Na ₃VO ₄(1.0mM，Sigma，Cat#S6508)，混匀。过夜培养的细胞，弃去50μL培养上清后，加入50μL准备好的抗原抗体混合液，37℃孵育10分钟。200μL/孔洗液(PBS+2.0mM Na3VO4)洗两次。加入90μL裂解液((1×裂解缓冲液+10μg/mL Leupeptin hemisulfate(Tocris，Cat#1167)+10.0μg/mL APROTININ，Sigma，Cat#SRE0050))冰上裂解10～15分钟，4000g离心5分钟。收集细胞裂解液，加入已封闭好的ELISA板中，常温孵育2h。PBST洗板5次，加入1：1000稀释的二抗抗PY-HRP(R&D Systems，Cat#DYC2720E)，常温孵育1～2小时。PBST洗板5次，TMB显色15～30分钟，1M H ₂SO ₄终止显色。用Versa Max酶标仪读取OD450，计算IC50。

结果(见图2)显示，双特异性抗体显示出很强的抑制ANG-2介导的Tie2磷酸化的能力。

表16.双特异性抗体抑制诱导的Tie2磷酸化结果

测试例4.双特异性抗体抑制VEGF诱导的VEGFR的磷酸化

VEGF与血管内皮细胞上的VEGFR结合，使VEGFR胞内区生磷酸化，促进内皮细胞增殖形成新的血管，进而促进肿瘤细胞的生长和转移。本实验用来鉴定双特异性抗体可以阻止VEGF诱导的VEGFR的磷酸化。

具体为：将HUVEC细胞(PromoCell/妙通生物，C-12205)消化后用完全培养基将细胞密度调整为每500μL中含1.5×10 ⁵个细胞，加到24孔板中，每孔500μL。在37℃培养箱中培养过夜后，弃去培养基，用500μL冰DPBS(Gibco，14190-250)洗一遍，每孔加200μL含0.1％BSA的基本培养基饥饿培养30分钟。将待测抗体、阴性对照抗体用基本培养基稀释至10nM、1nM和0.1nM(RG7221和双特异性抗体5为20nM、2nM和0.2nM)，使用PBS作为对照(ctrl)。将VEGF(R&D system，Cat#293-VE)用基本培养基稀释至400ng/mL。取等体积稀释好的VEGF和抗体混匀后取200μL加到培养板对应的孔中，37℃孵育5分钟。将4×裂解缓冲液#1(cisbio，63ADK041PEG)用dd H ₂O稀释成1×。将封闭液用1×裂解缓冲液稀释100倍配制成裂解液。取出细胞培养板，弃去细胞培养板中的培养基，加入冰PBS 500μL，轻微晃动后，弃去PBS。立即加入50μL配制好的裂解液，放在振荡器上，室温孵育30分钟。2400g离心10分钟，收集上清。使用Phospho-VEGFR2(Tyr1175)试剂盒(cisbio，63ADK041PEG)检测上清中p-VEGFR。检测方法为取10μL磷酸-VEGFR2(Tyr1175)d2抗体，加入200μL检测缓冲液，配制成工作液。取10μL磷酸-VEGFR2(Tyr1175)Cryptate抗体，加入200μL检测缓冲液，配制成工作液。将d2抗体工作液与Cryptate抗体工作液等体积混合，在HTRF96孔微孔板中，加入16μL细胞裂解液，加入4μL d2抗体与Cryptate抗体混合液，用封板膜封好，微孔板离心机离心1分钟，室温避光孵育4-24小时，用PHERAstar多功能酶标仪读取340nm波长激发，665nm和620nm波长发射的荧光值。

数据处理：比＝信号665nm/信号620nm×10000，用Graphpad Prism 5绘制柱状图。结果如图3所示。

结果表明，双特异性抗体可以显著抑制VEGF引起的HUVEC胞内磷酸化VEGFR水平升高。

测试例5.双特异性抗体抑制VEGF诱导的HUVEC的增殖

VEGF与HUVEC上的VEGFR结合，使VEGFR胞内区发生磷酸化，促进HUVEC增殖，本实验用来鉴定双特异性抗体可以阻止VEGF诱导的HUVEC的增殖。

具体方法如下：

将对数生长期的HUVEC细胞用0.08％胰酶消化，室温大约1-2分钟，加10％FBS终止。收集上述消化后的HUVEC，800rpm/分钟，离心5分钟，用PBS洗三遍除去培养基中刺激HUVEC增殖的细胞因子(800rpm/分钟，离心5分钟)。将HUVEC细胞重悬于6％FBS培养基中，细胞计数后，按照4000细胞/50μL/孔接种在白色96孔细胞培养板中，培养箱中培养2小时。将VEGF起始浓度调整为300ng/mL，120μL/孔加入无菌96孔板中。将待测抗体梯度稀释：抗体起始浓度为600nM，4倍比进行梯度稀释，将稀释好的抗体等体积加入上述96孔板中，室温孵育30min。将孵育好的抗体、VEGF混合物100μL/孔加入贴壁后的HUVEC细胞中，培养箱中培养5天，培养结束后加入

(G7573,PROMEGA)，50μL/孔，室温避光孵育10min，用Cytation5细胞成像仪Luminescence程序检测。结果如图4所示。

结果显示，双特异性抗体可以显著抑制VEGF引起的HUVEC的增殖。

表17.双特异性抗体抑制HUVEC的增殖结果

体内活性生物学评价

测试例6：双特异性抗体在前列腺癌细胞小鼠皮下移植瘤模型上的药效

将5×10 ⁶PC-3细胞(ATCC)接种于Balb/c裸鼠右肋部皮下，当荷瘤小鼠肿瘤体积达到100mm ³左右时，将小鼠分别随机分为6组，每组8只。将分组当天定义第0天，分组当日开始腹腔注射等摩尔量的各抗体，每周2次，共给药6次。每周2次监测肿瘤体积、动物重量并记录数据。当肿瘤体积超过1000mm ³或多数肿瘤出现破溃或体重下降20％时，将荷瘤动物进行安乐死作为实验终点。所有数据使用Excel和GraphPad Prism 5软件进行作图及统计分析。

肿瘤体积(V)计算公式为：V＝1/2×a×b ²，其中a、b分别表示长、宽。

相对肿瘤增殖率T/C(％)＝(T-T0)/(C-C0)×100，其中T、C为实验结束时治疗组和对照组的肿瘤体积；T0、C0为实验开始时的肿瘤体积。

抑瘤率TGI(％)＝1-T/C(％)。

分组情况和给药方案如表18所示，肿瘤生长曲线和抑瘤率见图5和表19。

表18.分组、给药方案

组别	受试物	剂量(mg/kg)	给药方案
1	PBS(溶媒)	3	i.p.BIW*3周
2	阿瓦斯汀	3	i.p.BIW*3周
3	RG7221	6	i.p.BIW*3周
4	双特异性抗体5	6	i.p.BIW*3周
5	双特异性抗体2	3.75	i.p.BIW*3周

表19.抑瘤率结果

抗体	抑瘤率(％)
溶媒	/
阿瓦斯汀	8
RG7221	23
双特异性抗体5	51

双特异性抗体2

27

结果显示，本披露中的双特异性抗体5和双特异性抗体2均可显著抑制PC-3肿瘤的生长。双特异性抗体5的抑瘤效果显著优于与阿瓦斯汀单抗，以及RG7221双抗。

测试例7双特异性抗体在高转移非小细胞肺癌H460-Luc细胞株BALB/c裸鼠皮下移植瘤模型上的药效

本实验评价ANG-2/VEGF双特异抗体以腹腔注射给药后抑制人非小细胞肺癌H460移植瘤生长和转移的效果。

BALB/c裸鼠雌性，4-5周，18-20克，购自上海灵畅生物科技有限公司。人非小细胞肺癌H460-Luc(稳定转染荧光素酶基因)细胞在添加10％FBS的RPMI 1640培养基中培养。细胞连续培养5代，接种于小鼠皮下。接种前用3-4％异氟烷将小鼠麻醉。将约1×10 ⁶个H460-Luc细胞重悬于无血清培养基和基质胶(Matrigel)混悬液中(培养基：Matrigel＝50％：50％)，通过皮下注射接种小鼠，接种体积为200μL。当肿瘤生长到平均约100-150mm ³左右时，随机分成3组，每组8只。分组给药当天定义为第0天。分组情况和给药方案如表20所示。

表20.分组、给药方案及抑瘤率

分组后每周测量肿瘤体积两次，连续3周。肿瘤体积(V)的计算方法如下：

V＝(长×宽 ²)/2。

每只小鼠相对肿瘤体积(RTV)的计算方法是：

RTV＝Vt/V0，其中Vt为每天的测量体积，V0为治疗开始时的体积。

实验结束时，所有荷瘤动物拍照，将所有肿瘤取出，称重并拍照。

统计分析

结果将以平均值±S.E.M的方式呈现。两组间比较将用Dunnett多重比较检验进行检验。如果p<0.05则认为有统计学显著性差异。

测试结果如图6所示。

图6显示，本披露双特异性抗体1和双特异性抗体2抗体均可显著抑制肿瘤的生长。

测试例8：双特异性抗体在人皮肤癌细胞小鼠皮下移植瘤模型上的药效

将A431细胞(ATCC)2×10 ⁶细胞/小鼠/100μL接种于Balb/c裸鼠右肋部皮下，当荷瘤小鼠肿瘤体积达到100mm ³左右时将小鼠分别随机分为3组：载剂(PBS)、双特异性抗体2 4mpk和双特异性抗体5 6mpk，每组8只。将分组当天定义第0天，分组当日开始腹腔注射各抗体，每周2次，共给药6次，每周2次监测肿瘤体积、动物重量并记录数据。当肿瘤体积超过1000mm ³或多数肿瘤出现破溃或体重下降20％时，将荷瘤动物进行安乐死作为实验终点。所有数据使用Excel和GraphPad Prism 5软件进行作图及统计分析。肿瘤体积(V)计算公式为：

V＝1/2×a×b ²，其中a、b分别表示长、宽。

抑瘤率TGI(％)＝1-T/C(％)。

分组情况和给药方案如表21所示，肿瘤生长曲线如图7所示。

表21.分组、给药方案

组别	受试物	剂量(mg/kg)	给药方案
1	PBS	3	i.p.BIW*3周
2	双特异性抗体5	6	i.p.BIW*3周
3	双特异性抗体2	4	i.p.BIW*3周

结果见图7，显示本披露中的双特异性抗体2和双特异性抗体5均可显著抑制A431肿瘤的生长。

测试例9.双特异性抗体对激光致恒河猴脉络膜新生血管抑制功能的测试

通过眼玻璃体注射给药，检测对恒河猴激光致脉络膜新生血管渗漏和生长的影响，以验证双特异性抗体可玻璃体注射用于老年性黄斑变性(Age-related macular degeneration，AMD)等疾病的治疗。具体方法如下：

通过激光围绕恒河猴眼底黄斑中心凹光凝，诱导眼底脉络膜血管新生，建立与人类脉络膜新生血管类似的动物模型。光凝前及光凝后20天进行荧光素眼底血管造影判定造模情况，选择造模成功的16只恒河猴(四川格林豪斯生物科技有限公司，生产许可证号：SCXK(川)2014-013，实验动物质量合格证编号：No：0022202)，将恒河猴随机分为溶媒对照组、雷珠单抗-IgG1(Lucentis，96μg，2μM)组、RG7716(292μg，2μM)组、双特异性抗体3(396μg，2μM)组，共4组，每组4只猴。

光凝后21天，Lucentis组、RG7716组、双特异性抗体3组，分别按96μg、292μg、396μg/眼，双眼玻璃体注射给予50μL浓度为1.92mg/mL的Lucentis，5.84mg/mL的RG7716，7.92mg/mL的双特异性抗体3，溶媒对照组给与等体积溶剂。各组动物于给药后7、14、28天进行眼压检查、眼底彩色照相、荧光素眼底血管造影检查、光学相干断层扫描(OCT)，观察抗体对脉络膜新生血管的抑制情况。于给药后28天取房水100～200μL，分装100μL进行房水VEGF测定。于给药后29天实施安乐死后每组取3只眼球进行HE染色组织学检查。结果如下：

AMD造模

激光造模后20天，所纳入试验的16只猴双眼眼底彩色照相均可见黄斑周围各9个激光斑，眼底黄斑周围均可见有激光斑呈高荧光，明显的荧光素渗漏，且渗漏超过光斑边缘，激光造模后20天(给药前)，溶媒对照组、Lucentis组、RG7716组、双特异性抗体3组4级荧光斑点数分别为46、42、40、45个。上述改变类似临床脉络膜新生血管(Choroidal Neovascularization，CNV)改变，提示造模成功。

荧光造影检查

Lucentis组、RG7716组、双特异性抗体3组在给药后7、14、28天荧光斑面积均有一定程度的缩小，各组荧光渗漏面积改善率、荧光素渗漏面积减少量均优于溶媒对照组，各组4级荧光斑点数与溶媒对照组相比明显降低。

28天后，给药量为2μM双特异性抗体3组与给药量2μM的雷珠单抗组和给药量为2μM的RG7716组，均可降低荧光渗漏面积，并减少荧光斑点数，结果见图8A和8B。

房水VEGF

Lucentis组、RG7716组、双特异性抗体3组在给药后28天房水VEGF表达量均明显低于溶媒对照组。双特异性抗体3组房水VEGF表达量均明显低于Lucentis组和RG7716组，结果见图9。

综上所述，在本试验条件下，激光CNV模型的恒河猴经双眼玻璃体单次注射给予396μg/眼剂量的双特异性抗体3，经视网膜血管荧光造影、光学相干断层成像、房水VEGF及眼组织病理学检查，双特异性抗体3在396μg/眼剂量下对猴CNV具有明显的抑制作用。

Claims

一种双特异性抗原结合分子，其包含特异性结合ANG-2的第一抗原结合域和特异性结合VEGF的第二抗原结合域，其中所述的特异性结合ANG-2的第一抗原结合域包含：

i)重链可变区，其包含分别如SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：39所示的HCDR1，HCDR2和HCDR3，和

轻链可变区，其包含分别如SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示的LCDR1，LCDR2和LCDR3；其中：

SEQ ID NO：38的序列为：TINX ₁X ₂SSYTYYPDNVKG；

SEQ ID NO：39的序列为：X ₃X ₄ATGX ₅FDY；

其中，X ₁为D或E，X ₂为D或N，X ₃为D或N，X ₄为E或Q，X ₅为C，S或V；

或

ii)重链可变区，其包含分别如SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14所示的HCDR1，HCDR2和HCDR3，和

轻链可变区，其包含分别如SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：16所示的LCDR1，LCDR2和LCDR3。
根据权利要求1所述的双特异性抗原结合分子，其中所述的特异性结合ANG-2的第一抗原结合域包含：

重链可变区，其包含如SEQ ID NO：7所示的HCDR1，如SEQ ID NO：8、22或24所示的HCDR2，和如SEQ ID NO：9、23、25、26或27所示的HCDR3；和

轻链可变区，其包含分别如SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示的LCDR1，LCDR2和LCDR3。
根据权利要求2所述的双特异性抗原结合分子，其中所述的特异性结合ANG-2的第一抗原结合域包含：

轻链可变区，其包含分别如SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示的LCDR1，LCDR2和LCDR3；和

重链可变区，其选自a)-l)中任一项所示的重链可变区：

a)重链可变区，包含分别如SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23所示的HCDR1，HCDR2和HCDR3；

b)重链可变区，包含分别如SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：23所示的HCDR1，HCDR2和HCDR3；

c)重链可变区，包含分别如SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：25所示的HCDR1，HCDR2和HCDR3；

d)重链可变区，包含分别如SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：26所示的HCDR1，HCDR2和HCDR3；

e)重链可变区，包含分别如SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：25所示的HCDR1，HCDR2和HCDR3；

f)重链可变区，包含分别如SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：26所示的HCDR1，HCDR2和HCDR3；

g)重链可变区，包含分别如SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：25所示的HCDR1，HCDR2和HCDR3；

h)重链可变区，包含分别如SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：26所示的HCDR1，HCDR2和HCDR3；

j)重链可变区，包含分别如SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：23所示的HCDR1，HCDR2和HCDR3；

k)重链可变区，包含分别如SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：27所示的HCDR1，HCDR2和HCDR3；

l)重链可变区，包含分别如SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示的HCDR1，HCDR2和HCDR3。
根据权利要求1至3中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中所述的特异性结合ANG-2的第一抗原结合域包含：

i)重链可变区，包含SEQ ID NO：3、20、21、28-37、72或73中任一氨基酸序列，或包含与SEQ ID NO：3、20、21、28-37、72或73中任一序列分别具有至少95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性的氨基酸序列；和/或

轻链可变区，包含SEQ ID NO：4、17、18、19或74的氨基酸序列，或包含与SEQ ID NO：4、17、18、19或74分别具有至少95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性的氨基酸序列；或

ii)重链可变区，包含SEQ ID NO：5、44、45、46或75的氨基酸序列，或包含与SEQ ID NO：5、44、45、46或75分别具有至少95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性的氨基酸序列；和/或

轻链可变区，包含SEQ ID NO：6、40、41、42、43或76的氨基酸序列，或包含与SEQ ID NO：6、40、41、42、43或76分别具有至少95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性的氨基酸序列。
根据权利要求4所述的双特异性抗原结合分子，其中所述的特异性结合ANG-2的第一抗原结合域包含：

a)重链可变区，包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列；和轻链可变区，包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列；

b)重链可变区，包含SEQ ID NO：20或21的氨基酸序列；和轻链可变区，包含SEQ ID NO：17、18或19的氨基酸序列；

c)重链可变区，包含SEQ ID NO：28-37中任一所示的氨基酸序列；和轻链可变区，包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列；

d)重链可变区，包含SEQ ID NO：72或73的氨基酸序列；和轻链可变区，包含SEQ ID NO：74的氨基酸序列；

e)重链可变区，包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列；和轻链可变区，包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列；

f)重链可变区，包含SEQ ID NO：44、45或46的氨基酸序列；和轻链可变区，包含SEQ ID NO：40、41、42或43的氨基酸序列；或

g)重链可变区，包含SEQ ID NO：75的氨基酸序列；和轻链可变区，包含SEQ ID NO：76的氨基酸序列。
根据权利要求1至5中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中所述的特异性结合VEGF的第二抗原结合域包含：

重链可变区，包含分别如SEQ ID NO：61，SEQ ID NO：62和SEQ ID NO：63所示的HCDR1，HCDR2和HCDR3；和

轻链可变区，包含分别如SEQ ID NO：64，SEQ ID NO：65和SEQ ID NO：66所示的LCDR1，LCDR2和LCDR3。
根据权利要求6所述的双特异性抗原结合分子，其中所述特异性结合VEGF的第二抗原结合域包含：

重链可变区，包含SEQ ID NO：58的氨基酸序列，和

轻链可变区，包含SEQ ID NO：56的氨基酸序列。
根据权利要求7所述的双特异性抗原结合分子，其中所述的特异性结合人VEGF的第二抗原结合域进一步包含重链恒定区和轻链恒定区；优选地，其中所述的重链恒定区包含L234A，L235A，I253A，H310A和H435A突变。
根据权利要求1至8中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中所述的特异性结合VEGF的第二抗原结合域包含：

重链，包含SEQ ID NO：59或60的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：59或60具有至少95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性的氨基酸序列；和

轻链，包含SEQ ID NO：57的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：57具有至少 95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性的氨基酸序列。
根据权利要求9所述的双特异性抗原结合分子，其中所述的特异性结合ANG-2的第一抗原结合域为抗ANG-2单链抗体；优选地，其中所述的抗ANG-2单链抗体包含：

a)SEQ ID NO：20、21或33的重链可变区和SEQ ID NO：17的轻链可变区；

b)SEQ ID NO：44或45的重链可变区和SEQ ID NO：40的轻链可变区；

c)SEQ ID NO：72或73的重链可变区和SEQ ID NO：74的轻链可变区；或

d)SEQ ID NO：75的重链可变区和SEQ ID NO：76的轻链可变区。
根据权利要求10所述的双特异性抗原结合分子，其中所述的抗ANG-2单链抗体包含SEQ ID NO：67、68、69、70、71、77、78或79的氨基酸序列。
根据权利要求11所述的双特异性抗原结合分子，其中所述的特异性结合ANG-2的第一抗原结合域直接，或通过连接子连接至所述的特异性结合VEGF的第二抗原结合域；

优选地，其中所述的抗ANG-2单链抗体的N端通过连接子连接至所述的特异性结合VEGF的第二抗原结合域的重链C端；

更优选地，其中所述的连接子为(GG) _n，其中n为1-20中的整数。
根据权利要求1至12中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其包含：

i)第一条链，包含SEQ ID NO：80、81、82或83的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：80、81、82或83分别具有至少95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性的氨基酸序列；和

ii)第二条链，其包含SEQ ID NO：57的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：57具有至少95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性的氨基酸序列；优选地，其包含两条相同的第一条链和第二条链，其中：

第一条链，包含SEQ ID NO：80、81、82或83的氨基酸序列；和

第二条链，其包含SEQ ID NO：57的氨基酸序列。
根据权利要求1至8中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其包含：

a)特异性结合ANG-2的第一轻链和第一重链；

b)特异性结合VEGF的第二轻链和第二重链；其中：

恒定结构域CL和CH1相互替换；优选地，

其中所述第一轻链的恒定结构域CL与第一重链的恒定结构域CH1相互替换。
根据权利要求14所述的双特异性抗原结合分子，其中：

a)所述第一轻链包含SEQ ID NO：17的轻链可变区，和所述第一重链包含SEQ ID NO：33的重链可变区；或

所述第一轻链包含SEQ ID NO：40的轻链可变区，和所述第一重链包含SEQ ID NO：45的重链可变区；

和

b)所述第二轻链包含SEQ ID NO：56的轻链可变区，和所述第二重链包含SEQ ID NO：58的重链可变区。
根据权利要求15所述的双特异性抗原结合分子，其中：

a)所述的第一轻链包含SEQ ID NO：85的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：85具有至少95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性的氨基酸序列，和

所述第一重链包含SEQ ID NO：84氨基酸序列，或与SEQ ID NO：84具有至少95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性的氨基酸序列；或

所述的第一轻链包含SEQ ID NO：88的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：88具有至少95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性的氨基酸序列，和

所述第一重链包含SEQ ID NO：87氨基酸序列，或与SEQ ID NO：87具有至少95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性的氨基酸序列；和

b)所述的第二轻链包含SEQ ID NO：57的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：57具有至少95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性的氨基酸序列；和

所述第二重链包含SEQ ID NO：86的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：86具有至少95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性的氨基酸序列。
一种特异性结合ANG-2的抗体，其包含：

i)重链可变区，包含分别如SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：39所示的HCDR1，HCDR2和HCDR3，和

轻链可变区，包含分别如SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示的LCDR1，LCDR2和LCDR3；其中：

SEQ ID NO：38的序列为：TINX ₁X ₂SSYTYYPDNVKG；

SEQ ID NO：39的序列为：X ₃X ₄ATGX ₅FDY；

其中，X ₁为D或E，X ₂为D或N，X ₃为D或N，X ₄为E或Q，X ₅为C，S或V；

或

ii)重链可变区，包含分别如SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14所示的HCDR1，HCDR2和HCDR3，和

轻链可变区，包含分别如SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：11和SEQ ID NO： 16所示的LCDR1，LCDR2和LCDR3。
根据权利要求17所述的特异性结合ANG-2的抗体，其包含：

重链可变区，包含如SEQ ID NO：7所示的HCDR1，如SEQ ID NO：8、22或24所示的HCDR2，和如SEQ ID NO：9、23、25、26或27所示的HCDR3；和

轻链可变区，包含分别如SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示的LCDR1，LCDR2和LCDR3。
根据权利要求18所述的特异性结合ANG-2的抗体，其包含：

轻链可变区，包含分别如SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示的LCDR1，LCDR2和LCDR3；和

如下a)-l)中任一项所示的重链可变区：

a)重链可变区，包含分别如SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23所示的HCDR1，HCDR2和HCDR3；

b)重链可变区，包含分别如SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：23所示的HCDR1，HCDR2和HCDR3；

c)重链可变区，包含分别如SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：25所示的HCDR1，HCDR2和HCDR3；

d)重链可变区，包含分别如SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：26所示的HCDR1，HCDR2和HCDR3；

e)重链可变区，包含分别如SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：25所示的HCDR1，HCDR2和HCDR3；

f)重链可变区，包含分别如SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：26所示的HCDR1，HCDR2和HCDR3；

g)重链可变区，包含分别如SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：25所示的HCDR1，HCDR2和HCDR3；

h)重链可变区，包含分别如SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：26所示的HCDR1，HCDR2和HCDR3；

j)重链可变区，包含分别如SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：23所示的HCDR1，HCDR2和HCDR3；

k)重链可变区，包含分别如SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：27所示的HCDR1，HCDR2和HCDR3；和

l)重链可变区，包含分别如SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示的HCDR1，HCDR2和HCDR3。
根据权利要求17至19中任一项所述的特异性结合ANG-2的抗体，其为鼠源抗体，嵌合抗体，人源化抗体或全人抗体。
根据权利要求20所述的特异性结合ANG-2的抗体，其中所述的抗体包含框架区，其中：

i)所述重链框架区包含选自44R、77S和84S中的一个或更多个氨基酸回复突变；和/或

所述轻链框架区包含选自1N、43S、68A、85D和87H中的一个或更多个氨基酸回复突变；或

ii)所述重链框架区包含选自2L、44R、74V、82AS和83K中的一个或更多个氨基酸回复突变；和/或

所述轻链框架区包含选自1N、43S、46V、68A、85D和87H中的一个或更多个氨基酸回复突变。
根据权利要求20所述的特异性结合ANG-2的抗体，其包含：

i)重链可变区，包含SEQ ID NO：3、20、21、28-37、72或73中任一氨基酸序列，或包含与SEQ ID NO：3、20、21、28-37、72或73中任一序列分别具有至少95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性的氨基酸序列；和/或

轻链可变区，包含SEQ ID NO：4、17、18、19或74的氨基酸序列，或包含与SEQ ID NO：4、17、18、19或74分别具有至少95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性的氨基酸序列；或

ii)重链可变区，包含SEQ ID NO：5、44、45、46或75的氨基酸序列，或包含与SEQ ID NO：5、44、45、46或75分别具有至少95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性的氨基酸序列；和/或

轻链可变区，包含SEQ ID NO：6、40、41、42、43或76的氨基酸序列，或包含与SEQ ID NO：6、40、41、42、43或76分别具有至少95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性的氨基酸序列。
根据权利要求22所述的特异性结合ANG-2的抗体，其包含：

a)重链可变区，包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列；和轻链可变区，包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列；

b)重链可变区，包含SEQ ID NO：20或21的氨基酸序列；和轻链可变区，包含SEQ ID NO：17、18或19的氨基酸序列；

c)重链可变区，包含SEQ ID NO：28-37中任一所示的氨基酸序列；和轻链可变区，包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列；

d)重链可变区，包含SEQ ID NO：72或73的氨基酸序列；和轻链可变区，包含SEQ ID NO：74的氨基酸序列；

e)重链可变区，包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列；和轻链可变区，包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列；

f)重链可变区，包含SEQ ID NO：44、45或46的氨基酸序列；和轻链可变区，包含SEQ ID NO：40、41、42或43的氨基酸序列；或

g)重链可变区，包含SEQ ID NO：75的氨基酸序列；和轻链可变区，包含SEQ ID NO：76的氨基酸序列。
根据权利要求23所述的特异性结合ANG-2的抗体，其进一步包含恒定区；优选地，其包含SEQ ID NO：47的重链恒定区和/或SEQ ID NO：48的轻链恒定区。
根据权利要求17至24中任一项所述的特异性结合ANG-2的抗体，其包含：

a)重链，包含SEQ ID NO：49、51或52的氨基酸序列，或包含与SEQ ID NO：49、51或52分别具有至少95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性的氨基酸序列，和/或

轻链，包含SEQ ID NO：50的氨基酸序列，或包含与SEQ ID NO：50具有至少95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性的氨基酸序列；或

b)重链，包含SEQ ID NO：53或55的氨基酸序列，或包含与SEQ ID NO：53或55分别具有至少95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性的氨基酸序列，和/或

轻链，包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列，或包含与SEQ ID NO：54具有至少95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性的氨基酸序列。
一种分离的特异性结合ANG-2的抗体，其与权利要求1至16中任一项所述的双特异性抗原结合分子，或权利要求17至25中任一项所述的特异性结合ANG-2的抗体竞争结合人ANG-2。
核酸分子，其编码根据权利要求1至16中任一项所述的双特异性抗原结合分子，或权利要求17至26中任一项所述的特异性结合ANG-2的抗体。
载体，其包含根据权利要求27所述的核酸分子。
宿主细胞，其包含根据权利要求28所述的载体。
一种药物组合物，其包含治疗有效量的根据权利要求1至16中任一项所述的双特异性抗原结合分子，或根据权利要求17至26中任一项所述的特异性结合ANG-2的抗体，或根据权利要求27所述的核酸分子，以及一种或更多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
一种生产根据权利要求1至16中任一项所述的双特异性抗原结合分子，或根据权利要求17至26中任一项所述的特异性结合ANG-2的抗体的方法，所述方法包括培养根据权利要求29所述的宿主细胞，以表达所述双特异性抗原结合分子或特异性结合ANG-2的抗体。
一种预防或治疗癌症或血管生成性眼病的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的根据权利要求1至16中任一项所述的双特异性抗原结合分子，或根据权利要求17至26中任一项所述的特异性结合ANG-2的抗体，或根据权利要求27所述的核酸分子，或根据权利要求30所述的药物组合物；优选地，其中所述的癌症选自乳腺癌、肾上腺肿瘤、输卵管癌、鳞状细胞癌、卵巢癌、胃癌、结直肠癌、非小细胞肺癌、胆管癌、膀胱癌、胰腺癌、皮肤癌和肝癌；其中所述的血管生成性眼病选自新生血管性青光眼、年龄相关的黄斑变性(AMD)、糖尿病性黄斑水肿、角膜新血管生成、角膜移植新血管生成、角膜移植排斥、视网膜/脉络膜新血管生成、房角的新血管生成(虹膜发红)、眼部新生血管性疾病、血管再狭窄和动静脉畸形(AVM)；更优选地，其中所述的癌症或血管生成性眼病与VEGF或ANG-2相关。