TWI454481B

TWI454481B - 結合ＴＧＦ－α及表皮調節素（ＥＰＩＲＥＧＵＬＩＮ）之抗體

Info

Publication number: TWI454481B
Application number: TW101110200A
Authority: TW
Inventors: Catherine Brautigam Beidler; Josef George Heuer; Ramona Judita Petrovan
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 2011-04-06
Filing date: 2012-03-23
Publication date: 2014-10-01
Also published as: CN103459423B; UA110051C2; MX2013011596A; EP2694547A1; KR20130133274A; US20120258109A1; RS54000B1; CY1116332T1; EP2694547B1; CN103459423A; NZ614198A; PT2694547E; CA2832256C; WO2012138510A1; AR085484A1; HRP20150468T1; IL228101A0; AU2012240508A1; TW201300414A; AU2012240508B2

Description

結合TGF-α及表皮調節素(EPIREGULIN)之抗體

本發明係關於結合人類TGF-α及表皮調節素之抗體及其用途。

TGF-α及表皮調節素為表皮生長因子受體(「EGFR」)之七個配體中之兩者，其通常在損傷後之傷口癒合方面起作用。糖尿病性腎病變(「DN」)為一種主要糖尿病併發症且為末期腎病(「ESRD」)之主要病因。蛋白尿為伴隨DN之腎功能性衰退之臨床標記且與疾病進展及增加之心血管風險(諸如心臟衰竭、血管疾病、節律障礙(dysrhythmia))相關。用於DN之照護標準物包括僅減緩疾病進展且留下可觀殘餘風險之ACE抑制劑及血管收縮素(angiotensin)受體阻斷劑(「ARB」)。

在腎病之臨床前動物模型中阻斷EGFR不僅會減弱蛋白尿，而且亦會減弱腎病變。然而，儘管諸如ERBITUX®之EGFR抑制劑核准用於癌症，但其伴有副作用，諸如面部及肩部上之與皮膚中之目標抑制相關之重度皮疹。因此，仍然需要針對DN之替代性療法。此外，需要更有效針對DN之治療療法。

已描述結合TGF-α之抗體(例如參見US 5190858)。此外，已描述結合表皮調節素之抗體(例如參見US 2009/0324491)。

本發明提供用於治療DN之針對TGF-α及表皮調節素之抗體。此外，本發明提供針對TGF-α及表皮調節素之抗體，其在活體內嚙合目標且隨後導致蛋白尿減輕且伴有疾病進展及心血管風險降低。

本發明提供結合TGF-α與表皮調節素兩者之具有許多所需性質之治療適用抗體。本發明抗體針對人類TGF-α及人類表皮調節素具有高親和力且具有選擇性完全中和活性。當投與時，本發明抗體亦在活體內導致白蛋白尿(albuminuria)及腎小管蛋白質、間質纖維化、腎小球膜基質增生及腎盂擴張之腎病變減輕。此外，較佳本發明抗體導致未觀測到與完全EGFR抑制相關之皮膚毒性。

本發明提供一種結合TGF-α及表皮調節素之抗體，其包含輕鏈及重鏈，其中該輕鏈包含輕鏈可變區(LCVR)且該重鏈包含重鏈可變區(HCVR)，其中該LCVR包含胺基酸序列LCDR1、LCDR2及LCDR3，且該HCVR包含胺基酸序列HCDR1、HCDR2及HCDR3，其中LCDR1為SEQ ID NO：4，LCDR2為SEQ ID NO：5，LCDR3為SEQ ID NO：6，HCDR1為SEQ ID NO：1，HCDR2為SEQ ID NO：2，且HCDR3為SEQ ID NO：3。

本發明亦提供一種包含如本文所述之本發明抗體及至少一種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑的醫藥組合物。

本發明提供一種用於治療糖尿病性腎病變之如本文所述之本發明抗體。

在整篇本發明中，如本文所述之本發明抗體結合TGF-α及表皮調節素且包含輕鏈及重鏈，其中該輕鏈包含輕鏈可變區(LCVR)且該重鏈包含重鏈可變區(HCVR)，其中該LCVR包含胺基酸序列LCDR1、LCDR2及LCDR3，且該HCVR包含胺基酸序列HCDR1、HCDR2及HCDR3，其中LCDR1為SEQ ID NO：4，LCDR2為SEQ ID NO：5，LCDR3為SEQ ID NO：6，HCDR1為SEQ ID NO：1，HCDR2為SEQ ID NO：2且HCDR3為SEQ ID NO：3。

本發明提供一種如本文所述之抗體，其中該抗體對人類TGF-α及人類表皮調節素具有選擇性。另外，本發明提供一種如本文所述之抗體，其中該抗體對人類TGF-α及人類表皮調節素具有完全中和活性。進一步較佳地，本發明提供一種如本文所述之抗體，其中該抗體具有選擇性且對人類TGF-α及人類表皮調節素具有完全中和活性。

本發明提供一種如本文所述之抗體，其中該抗體對人類TGF-α(SEQ ID NO：18)之解離平衡常數Kd介於0.01×10^-9 M與1.0×10^-9 M之間。進一步較佳地，如本文所述之本發明抗體對人類TFG-α之解離平衡常數Kd介於0.05×10^-9 M與0.8×10^-9 M之間。Kd值係藉由在25℃下之結合平衡確定，如實例2中所述。

本發明亦提供一種如本文所述之抗體，其中該抗體對met-人類表皮調節素(SEQ ID NO：22)之解離平衡常數Kd介於0.1×10^-9 M與30×10^-9 M之間。進一步較佳地，如本文所述之本發明抗體對人類表皮調節素之解離平衡常數Kd介於 0.5×10^-9 M與10×10^-9 M之間。Kd值係藉由在25℃下之結合平衡確定，如實例2中所述。

本發明提供一種如本文所述之抗體，其中該抗體對人類TGF-α(SEQ ID NO：18)之解離平衡常數Kd介於0.01×10^-9 M與1.0×10^-9 M之間且對met-人類表皮調節素(SEQ ID NO：22)之Kd介於0.1×10^-9 M與30×10^-9 M之間。進一步較佳地，如本文所述之本發明抗體對人類TFG-α之解離平衡常數Kd介於0.05×10^-9 M與0.8×10^-9 M之間且對人類表皮調節素之Kd介於0.5×10^-9 M與10×10^-9 M之間。Kd值係藉由在25℃下之結合平衡確定，如實例2中所述。

本發明提供結合人類TGF-α及表皮調節素且在分別如實例5及實例6中所述之小鼠殘腎模型及小鼠單側腎切除db/db模型中導致活體內劑量依賴性減少白蛋白尿、降低血清肌酐(serum creatinine)及血尿素氮(「blood urea nitrogen；BUN」)之抗體。

本發明提供結合人類TGF-α及表皮調節素且在分別如實例5及實例6中所述之小鼠殘腎模型及小鼠單側腎切除db/db模型中導致活體內減輕腎小管蛋白質及間質纖維化之腎病變及減輕腎小球膜基質增生及腎盂擴張。

本發明提供結合人類TGF-α及表皮調節素且咸信會在人類中導致蛋白尿減輕且伴有疾病進展及心血管風險減輕之抗體。另外，本發明提供結合人類TGF-α及表皮調節素且咸信有效治療人類中之糖尿病性腎病變之抗體。

本發明提供結合人類TGF-α及表皮調節素且導致在如實例7中所述之食蟹獼猴(cynomolgus monkey)毒性研究中未觀測到皮膚毒性之抗體。

本發明提供一種結合TGF-α及表皮調節素之抗體，其包含輕鏈及重鏈，其中該輕鏈包含輕鏈可變區(LCVR)及且該重鏈包含重鏈可變區(HCVR)，其中該LCVR包含胺基酸序列LCDR1、LCDR2及LCDR3，且該HCVR包含胺基酸序列HCDR1、HCDR2及HCDR3，其中LCDR1為SEQ ID NO：4，LCDR2為SEQ ID NO：5，LCDR3為SEQ ID NO：6，HCDR1為SEQ ID NO：1，HCDR2為SEQ ID NO：2，且HCDR3為SEQ ID NO：3。

此外，本發明提供一種結合TGF-α及表皮調節素之抗體，其包含輕鏈及重鏈，其中該輕鏈包含輕鏈可變區(LCVR)且該重鏈包含重鏈可變區(HCVR)，其中該LCVR之胺基酸序列為SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10。

本發明亦提供一種結合TGF-α及表皮調節素之抗體，其包含輕鏈及重鏈，其中該輕鏈包含輕鏈可變區(LCVR)且該重鏈包含重鏈可變區(HCVR)，其中該HCVR之胺基酸序列為SEQ ID NO：7。

本發明亦提供一種結合TGF-α及表皮調節素之抗體，其包含輕鏈及重鏈，其中該輕鏈包含輕鏈可變區(LCVR)且該重鏈包含重鏈可變區(HCVR)，其中該LCVR之胺基酸序列及該HCVR之胺基酸序列係選自由以下組成之群：(i)該LCVR為SEQ ID NO：9且該HCVR為SEQ ID NO：7；及 (ii)該LCVR為SEQ ID NO：10且該HCVR為SEQ ID NO：7。

本發明提供一種結合TGF-α及表皮調節素之抗體，其包含輕鏈及重鏈，其中該輕鏈包含輕鏈可變區(LCVR)且該重鏈包含重鏈可變區(HCVR)，其中該LCVR之胺基酸序列為SEQ ID NO：9且該HCVR之胺基酸序列為SEQ ID NO：7。

本發明提供一種結合TGF-α及表皮調節素之抗體，其包含輕鏈及重鏈，其中該輕鏈包含輕鏈可變區(LCVR)且該重鏈包含重鏈可變區(HCVR)，其中該LCVR之胺基酸序列為SEQ ID NO：10且該HCVR之胺基酸序列為SEQ ID NO：7。

此外，本發明提供一種結合TGF-α及表皮調節素之抗體，其包含輕鏈及重鏈，其中該輕鏈之胺基酸序列為SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14。

本發明亦提供一種結合TGF-α及表皮調節素之抗體，其包含輕鏈及重鏈，其中該重鏈之胺基酸序列為SEQ ID NO：12。

此外，本發明提供一種結合TGF-α及表皮調節素之抗體，其包含輕鏈及重鏈，其中該重鏈之胺基酸序列及該輕鏈之胺基酸序列係選自由以下組成之群：(i)該重鏈為SEQ ID NO：12且該輕鏈為SEQ ID NO：13，及(ii)該重鏈為SEQ ID NO：12且該輕鏈為SEQ ID NO： 14。

本發明提供一種結合TGF-α及表皮調節素之抗體，其包含各輕鏈之胺基酸序列為SEQ ID NO：13之兩個輕鏈及各重鏈之胺基酸序列為SEQ ID NO：12之兩個重鏈。

本發明提供一種結合TGF-α及表皮調節素之抗體，其包含各輕鏈之胺基酸序列為SEQ ID NO：14之兩個輕鏈及各重鏈之胺基酸序列為SEQ ID NO：12之兩個重鏈。

此外，本發明提供一種如本文所述之抗體之抗原結合片段。

此外，本發明提供一種包含如本文所述之本發明抗體以及至少一種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑及視情況其他治療成分的醫藥組合物。

本發明亦提供一種治療患者之糖尿病性腎病變之方法，其包含向該患者投與如本文所述之本發明抗體。

此外，本發明提供一種如本文所述之本發明抗體，其用於療法中。較佳地，本發明提供一種如本文所述之本發明抗體，其用於治療糖尿病性腎病變。

此外，本發明提供如本文所述之本發明抗體的用途，其用於製造供治療糖尿病性腎病變之藥劑。

本發明亦提供一種治療患者之糖尿病性腎病變之方法，其包含同時或依序向該患者投與如本文所述之本發明抗體與照護標準物之組合。

此外，本發明提供一種如本文所述之本發明抗體，其用於療法中，其中該抗體欲同時或依序與照護標準物組合投與。較佳地，本發明提供一種如本文所述之本發明抗體，其用於治療糖尿病性腎病變，其中該抗體欲同時或依序與照護標準物組合投與。

此外，本發明提供如本文所述之本發明抗體的用途，其用於製造供治療糖尿病性腎病變之藥劑，其中該抗體欲同時或依序與照護標準物組合投與。

本發明亦提供一種包含如本文所述之本發明抗體之抗原結合片段及至少一種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑的醫藥組合物。

此外，本發明提供一種包含如本文所述之本發明抗體之抗原結合片段以及至少一種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑及視情況其他治療成分的醫藥組合物。

本發明亦提供一種治療患者之糖尿病性腎病變之方法，其包含向該患者投與如本文所述之本發明抗體之抗原結合片段。

此外，本發明提供一種如本文所述之本發明抗體的抗原結合片段，其用於療法中。較佳地，本發明提供一種如本文所述之本發明抗體的抗原結合片段，其用於治療糖尿病性腎病變。

此外，本發明提供如本文所述之本發明抗體之抗原結合片段的用途，其用於製造供治療糖尿病性腎病變之藥劑。

本發明亦提供一種治療患者之糖尿病性腎病變之方法，其包含同時或依序向該患者投與如本文所述之本發明抗體之抗原結合片段與照護標準物的組合。

此外，本發明提供一種如本文所述之本發明抗體的抗原結合片段，其用於療法中，其中該抗原結合片段欲同時或依序與照護標準物組合投與。較佳地，本發明提供一種如本文所述之本發明抗體的抗原結合片段，其用於治療糖尿病性腎病變，其中該抗原結合片段欲同時或依序與照護標準物組合投與。

此外，本發明提供如本文所述之本發明抗體之抗原結合片段的用途，其用於製造供治療糖尿病性腎病變之藥劑，其中該抗原結合片段欲同時或依序與照護標準物組合投與。

用於DN之照護標準物包括(但不限於)ACE抑制劑及血管收縮素受體阻斷劑(ARB)。

「抗體」之一般結構在此項技術中極為熟知。對於IgG類型之抗體，存在經由鏈內及鏈間雙硫鍵交聯之四個胺基酸鏈(兩個「重」鏈及兩個「輕」鏈)。當在某些生物系統中表現時，具有未經修飾之人類Fc序列之抗體的Fc區經糖基化。抗體亦在其他位置處經糖基化。抗體之次單元結構及三維組態在此項技術中為熟知的。各重鏈包含N端重鏈可變區(「HCVR」)及重鏈恆定區(「HCCR」)。IgG、IgD及IgA之重鏈恆定區包含三個域(CH1、CH2及CH3)；且IgM及IgE之重鏈恆定區包含4個域(CH1、CH2、CH3及 CH4)。各輕鏈包含輕鏈可變區(「LCVR」)及輕鏈恆定區(「LCCR」)。

各輕/重鏈對之可變區形成抗體結合位點。HCVR區及LCVR區可進一步再分成稱為互補決定區(「CDR」)之高變區，其間穿插有稱為構架區(「FR」)之更保守區。各HCVR及LCVR由按下列順序自胺基端排列至羧基端之三個CDR及四個FR構成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在本文中，重鏈之3個CDR稱為「CDRH1、CDRH2及CDRH3」且輕鏈之3個CDR稱為「CDRL1、CDRL2及CDRL3」。CDR含有與抗原形成特異性相互作用之大多數殘基。各域之胺基酸之指定係根據熟知規定[例如Kabat「Sequences of Proteins of Immunological Interest」National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)]。

本發明抗體可具有選自任何免疫球蛋白類別(IgA、IgD、IgG、IgM及IgE)之重鏈恆定區。此外，本發明抗體含有源於人類IgG4 Fc區之Fc部分，因為其相較於其他IgG次型，結合互補因子之能力降低。

抗體可源於單一複本或純系，包括例如任何真核、原核或噬菌體純系。較佳地，本發明抗體以均質或實質上均質之抗體分子群體形式存在。全長抗體包含全長或實質上全長恆定區，包括Fc區。該種抗體之「抗原結合片段」為全長抗體之包含抗原結合部分且保留抗原結合能力之任何縮短形式。此等縮短形式包括例如包括所揭示抗體之CDR或可變區之Fab片段、Fab'片段或F(ab')2片段。此外，此等縮短抗體形式可為可藉由用連接子序列接合編碼LCVR及HCVR之DNA產生的單鏈Fv片段。(參見Pluckthun,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg及Moore編，Springer-Verlag,New York，第269-315頁，1994)。除非另外指示，否則術語「抗體」不包括此等片段。本發明抗體可使用此項技術中熟知之技術，例如重組技術、噬菌體呈現技術、合成技術或此等技術之組合或此項技術中易知之其他技術產生。

本發明抗體為已經設計以具有與源於人類基因組序列之構架及恆定區一致或實質上一致(實質上人類)之人類來源構架、鉸鏈區及恆定區的工程改造抗體。完全人類構架、鉸鏈區及恆定區為彼等人類生殖系序列以及具有天然產生之體細胞突變之序列及具有工程改造突變之序列。本發明抗體可包含源於完全人類構架、鉸鏈或恆定區之其中含有一或多個胺基酸取代、缺失或添加的構架、鉸鏈或恆定區。另外，本發明抗體在人類中實質上為非免疫原性的。

多種不同人類構架序列可單獨或組合用作本發明抗體之基礎。較佳地，本發明抗體之構架區具有人類來源或實質上為人類構架區(人類來源佔至少95%、97%或99%)。人類來源之構架區之序列可獲自Marie-Paule Lafranc,Gerard Lefranc,The Immunoglobulin Factsbook,Academic Press 2001,ISBN 012441351。

本發明抗體之構架序列充當「供體」可變構架區且可用於使用此項技術中已知之方法產生具有本文指定之相同 CDR的其他抗體。此外，本發明抗體之構架序列可與其他已知人類構架序列進行比較以產生其他抗體。因此，此資訊可用於在此等位置處使另一所選同源人類構架區「回復突變(back-mutate)」成供體胺基酸殘基。另外，可偵測其他人類構架中之任何「稀有(rare)」胺基酸以使可在相關位置處使用共同或供體胺基酸殘基。

「TGF-α」或「人類TGF-α」係指人類TGF-α蛋白質(SEQ ID NO：18)。

「表皮調節素」或「人類表皮調節素」係指人類表皮調節素蛋白質(SEQ ID NO：33)。Met-人類表皮調節素(SEQ ID NO：22)用於本文活體外實驗中。提及如本文所述之本發明抗體結合或中和人類表皮調節素之能力亦係關於其在活體外實驗中結合及中和人類met-表皮調節素之能力。

「患者」為哺乳動物，較佳人類。

術語「治療(treating)」(或「治療(treat)」或「治療(treatment)」)意謂減緩、終止、降低或逆轉症狀、病症、病狀或疾病之進展或嚴重性。

術語「治療有效量」係指在向患者投與單次或多次劑量後提供所要治療之本發明抗體的量或劑量。

下列實例可基本上如下所述進行。

實例 實例1：產生抗體

可如下製備並純化抗體I及II。諸如HEK 293或CHO之適當宿主細胞經用於分泌抗體之使用最佳預定HC：LC載體比率的表現系統或編碼HC(諸如SEQ ID NO：15)與LC(諸如SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17)兩者之單一載體系統短暫或穩定轉染。使用許多通常使用之技術中之任一者純化抗體已分泌入其中之澄清培養基。舉例而言，培養基可宜施加於已用相容緩衝液，諸如磷酸鹽緩衝鹽水(pH 7.4)平衡之蛋白質A或G管柱。洗滌管柱以移除非特異性結合組分。例如藉由pH值梯度(諸如0.1 M磷酸鈉緩衝液(pH 6.8)至0.1 M檸檬酸鈉緩衝液(pH 2.5))溶離結合抗體。抗體溶離份諸如藉由SDS-PAGE偵測，且接著匯合。視預定用途而定，視情況進行進一步純化。可使用常用技術濃縮及/或無菌過濾抗體。可溶性聚集體及多聚體可藉由常用技術有效移除，該等技術包括尺寸排除、疏水性相互作用、離子交換或羥基磷灰石層析。在此等層析步驟之後，抗體純度大於99%。產物可即刻冷凍在-70℃下或可經凍乾。以下提供此等抗體之胺基酸序列。

實例2：藉由表面電漿子共振(BIAcore)量測抗體I之親和力結合

Biacore T2000儀器(BIAcore® AB,Upsala,Sweden)、試劑及Biacore T2000評估軟體第4.1版用於表面電漿子共振分析。使用製造商之EDC/NHS胺偶合方法製備CM5晶片。所有四個流槽之表面皆藉由在10 μL/min下注射EDC/NHS之1：1混合物7分鐘加以活化。山羊抗人類Fc γ特異性抗體於10 mM乙酸鹽(pH 4.0)緩衝液中稀釋至50 μg/ml且藉由在10 μL/min之流速下注射7分鐘來固定於所有四個流槽上以達成約10000 RU。未反應位點以在10 μL/min下注射乙醇胺7分鐘加以阻斷。在30 μL/min下注射甘胺酸(pH 1.5)3×20秒用於移除非共價締合蛋白質。操作緩衝液為HBS-EP[10 mM HEPES、150 mM氯化鈉、3 mM EDTA、0.005%聚山梨醇酯20(Polysorbate 20)]。

在研究1中，抗體I於操作緩衝液中稀釋至50 μg/mL，且於流槽2中捕捉約400-600 RU。人類TGF-α(SEQ ID NO：18)、大鼠TGF-α(SEQ ID NO：20)、met-人類表皮調節素(SEQ ID NO：22)及食蟹獼猴表皮調節素(SEQ ID NO：24)於操作緩衝液中自100 μg/mL稀釋至200 nM且接著於操作緩衝液中兩倍連續稀釋至6.25 nM。小鼠表皮調節素(SEQ ID NO：23)於操作緩衝液中自100 μg/mL稀釋至4 μM且接著於操作緩衝液中兩倍連續稀釋至125 nM。各配體濃度之一式兩份注射液在30 μL/min下注射300秒，繼而為解離階段。解離階段為1800秒(對於人類及大鼠TGF-α)、1200秒(對於人類及食蟹獼猴表皮調節素)及120秒(對於小鼠表皮調節素)。藉由在30 μL/min下在所有流槽上注射10 mM甘胺酸(pH 1.5)3×20秒來進行再生。

在研究2中，抗體III於操作緩衝液中稀釋至100 μg/mL，且於流槽2中捕捉約400-600 RU。小鼠TGF-α(SEQ ID NO：19)於操作緩衝液中自100 μg/mL稀釋至200 nM且接著於操作緩衝液中兩倍連續稀釋至6.25 nM。小鼠表皮調節素(SEQ ID NO：23)於操作緩衝液中自100 μg/mL稀釋至4 μM且接著於操作緩衝液中兩倍連續稀釋至125 nM。各配體濃度之一式兩份注射液在30 μL/min下注射300秒，繼而為解離階段。解離階段為1800秒(對於小鼠TGF-α)及120秒(對於小鼠表皮調節素)。藉由在30 μL/min下在所有流槽上注射10 mM甘胺酸(pH 1.5)30秒來進行再生。

減去參照之資料係以Fc2-Fc1形式收集。量測結果係在25℃下獲得。各配體之締合速率(k _on )及解離速率(k _off )係使用「1：1(朗繆爾(Langmuir))結合」結合模型加以評估。根據以下關係式由結合動力學計算親和力(K_D )：K_D =k _off /k _on 。

抗體I結合人類TGF-α及人類表皮調節素之親和力分別為約98 pM及1.3 nM。抗體I亦結合大鼠TGF-α及小鼠表皮調節素，親和力分別為約70 pM及340 nM。另外，抗體I結合食蟹獼猴表皮調節素之親和力為約1 nM。抗體III結合小鼠TGF-α及小鼠表皮調節素之親和力分別為約38 pM及220 nM。因此，本發明之抗體I及抗體III對人類TGF-α及人類表皮調節素具有高親和力。

實例3：EGF目標配體在人類結腸癌細胞株HT-29中之內化Alexa Fluor® 488與抗體之結合

根據製造商方案使Alexa Fluor® 488結合於抗體I及對照IgG。蛋白質於PBS中稀釋至2 mg/mL。向0.5 mL之此2 mg/mL溶液中添加50 μL之1 M碳酸氫鈉(pH 9)。蛋白質溶液接著轉移至染料小瓶中且在室溫攪拌1小時。使用標記套組包括之Bio-Rad BioGel P-30樹脂純化經標記之蛋白質。

活體外之內化分析

在研究1中，10,000個HT-29細胞(一種已知表現TGF-α及表皮調節素之結腸腺癌細胞株)接種於96孔盤之每孔中，且使其於完全培養基[達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)/F12(漢姆(Ham))培養基(1：1)(「DMEM/F12」)，其含有L-麩醯胺酸、10%熱不活化胎牛血清(「FBS」)、1×抗生素及2.438 g/L碳酸氫鈉]中培育隔夜。次日，細胞用含有0.1% BSA之PBS洗，且接著與Alexa Fluor® 488結合之抗體I或對照IgG於含0.1% BSA之PBS中在0至88 μg/mL範圍內之濃度在組織培養培育箱中在37℃培育2小時。在培育期之後，細胞於含0.1% BSA之PBS中洗數次且接著用4%甲醛固定以供分析。如下進行內化定量：用Cellomics Arrayscan VTI(Thermo Scientific)收集每孔500個細胞。用該系統之「隔室分析(Compartmental analysis)」生物應用程式進行影像分析。用赫希司特(Hoechst)染色劑(藍色)鑑別細胞核。設定兩個相關區域(ROI)以收集來自細胞內斑點之螢光信號(紅色)及自遮蔽影像獲得之總綠色螢光(紅色與藍色兩者)。計算各斑點及細胞之數目、面積及螢光強度。選擇細胞內斑點(紅色)之平均斑點總強度來測量抗體I誘導之內化。

在研究2中，如先前所述製備10,000個HT-29細胞，且在40 μg/mL下添加於含有0.1% BSA之PBS中的Alexa Fluor® 488結合之抗體I或對照IgG至細胞中。細胞在組織培養培育箱中在37℃下培育介於0-120分鐘範圍內之不同時間，接著用含有0.1% BSA之PBS洗滌數次且用4%甲醛固定以供分析。基本上如先前所述對信號進行定量。

研究1之影像分析結果確定螢光信號內化入細胞中且依賴於抗體I而非對照IgG劑量(表3a及表3b)。

研究2之結果證明抗體I快速內化且截至添加至細胞後2小時，內化完成(表4)。抗體I在活體外誘導HT-29細胞上之目標以時間依賴性方式內化(表4)。

實例4：量測對肌纖維母細胞細胞株中EGFR配體刺激之細胞增殖之中和

純系小鼠肌纖維母細胞細胞株(「MFc7」)用於測試本發明抗體阻斷EGFR配體之增殖活性之能力。可活化EGFR之七個配體為TGF-α(TGFA)、表皮調節素(EREG)、EGF、肝素(Heparin)結合EGF(HB-EGF)、表皮細胞分裂原(Epigen)(EPGN)、雙調蛋白(Amphiregulin)(AREG)及β細胞調節素(Betacellulin)(BTC)。EGFR配體共有結構基元EGF樣域，其特徵在於具有由六個類似間隔之保守半胱胺酸殘基形成之三個分子內雙硫鍵。增殖活性係藉由溴脫氧尿苷(Bromodeoxyuridine，「BrDU」)併入測定且係根據製造商說明書，用比色BrDU ELISA套組量測。

首先，每孔2,000個MFc7細胞於0.1 mL含有L-麩醯胺酸、10%熱不活化FBS、1×抗生素及2.438 g/L碳酸氫鈉之達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基/F12(漢姆)培養基(1：1)(「DMEM/F12」)中接種於經組織培養物處理之96孔微盤中。使細胞附著6小時，且接著移除培養基並用0.1 mL含有0.1% BSA之無血清DMEM/F12置換以達成血清饑餓隔夜。次日，用含有0.1% BSA之無血清培養基以每孔0.12 mL之體積在96孔聚丙烯盤中製備EGFR配體之連續稀釋液，濃度在0.001至3000 ng/mL範圍內。在稀釋之後，自血清饑餓細胞移除培養基且接著用EGFR配體刺激24小時。在刺激之後，細胞用BrDU脈衝4小時且接著根據製造商說明書，用比色BrDU ELISA套組加以分析。

在測試抗體I對EGFR配體之特異性時，以每孔0.06 mL之體積在96孔聚丙烯盤中製備抗體之2×或3×連續稀釋液，濃度在3000 nM至0.059 nM範圍內。在連續稀釋抗體之後，每孔添加0.06 mL EGFR配體。盤接著在含濕氣組織培養培育箱中在37℃下培育30分鐘。在培育之後，每孔轉移0.1 mL溶液至細胞。刺激細胞24小時。在刺激之後，細胞用BrDU脈衝4小時且接著用比色BrDU ELISA套組加以分析。在SpectraMax 190盤讀取器(Molecular Devices)上產生吸光度值(450 nM-690 nM)並分析資料。

發現在分析中，小鼠表皮調節素及大鼠TGF-α以及除表皮細胞分裂原及雙調蛋白之外之所有人類EGFR配體皆為強力細胞增殖刺激劑(表5)。抗體I及抗體III對人類及大鼠TGF-α及人類表皮調節素活性具有高親和力(表5)。

表5概述所測試EGFR配體之計算EC50值及針對彼等配體之抗體之絕對IC50值。抗體I針對人類TGF-α之計算平均IC50為0.46±0.03 nM且針對人類表皮調節素之計算平均IC50為3.15±1.04 nM。抗體III針對人類TGF-α之計算IC50 平均值為0.52±0.04 nM且針對人類表皮調節素之計算IC50平均值為1.12±0.36 nM。抗體III針對大鼠TGF-α之計算平均IC50值為0.13±0.01 nM且針對小鼠表皮調節素之計算平均IC50值為214±49 nM。因此，抗體I及抗體III針對人類TGF-α及人類表皮調節素具有高親和力且具有選擇性完全中和活性。

實例5：高血壓性腎病之小鼠殘腎模型中之腎功能及病變

涉及手術減少75%總腎質量之小鼠殘腎模型用作臨床前高血壓性腎病模型。[Ma LJ,Fogo AB.Kidney Int.2003年7月；64(1)：350-5]在9-10週齡之雄性129 Svev小鼠中手術減少腎質量或進行假手術。在手術後2週根據尿白蛋白/肌酐比率(「ACR」)及體重進行隨機分組，每組12隻小鼠。在隨機化之後，同型對照IgG(10 mg/kg)或抗體III(1及10 mg/kg)經皮下給藥且持續每週一次直至手術後第16週。研究之終點為存活、收縮壓(systolic blood pressure)、白蛋白尿、血清肌酐、血清BUN、尿TGF-α、尿MIP-2及腎病變。

在研究結束時，對照IgG組中有3例死亡(25%死亡率)，而抗體III治療組中無死亡。

量測收縮壓

在手術後12週時藉由尾部環帶充氣法(tail cuff method)獲取血壓。在實際量測之前3-5天，藉由每日將來自各組之所選小鼠(N=每組3-4)置放於小鼠固持器中且附接尾部環帶5分鐘來使其適應限制。設備室溫度增加至24℃以在血壓收集過程期間提供附加溫暖。將小鼠置放於小鼠限制器中且安置在加溫墊裝置(31-33℃)之頂部上以對尾部血管結構提供擴張。尾部置放於尾部環帶上且限制各小鼠約30分鐘且不超過45分鐘之時間。此時間包括初始加溫及壓力量測，隨後即刻恢復一般性舍飼。不使用麻醉。對尾部環帶充氣，從而足夠緊密壓縮尾部以瞬間中斷動脈血流，且接著藉由放氣逐漸鬆開以觀測動脈搏之恢復。在恢復動脈搏時，環帶經完全放氣。

量測白蛋白尿

每4週歷經24小時時期在Nalgene代謝籠裝置中收集尿。各小鼠(單獨舍飼)在24小時收集過程期間接受食物及水。在24小時時期結束時，收集之尿置放在冰上，離心且進行白蛋白及肌酐分析。白蛋白尿定義為尿白蛋白與肌酐之比率(μg/mg)。

血清肌酐及BUN

在研究結束時，分析藉由心臟穿刺獲得之血清之BUN及肌酐。

TGF-α及MIP-2 ELISA

使用3K MW截留膜，在14,000×g下離心30分鐘來使藉由24小時收集獲得之尿離心濃縮5倍。建立針對小鼠TGFα之夾心型(sandwich-type)酶聯免疫吸附分析(「ELISA」)。大鼠TGF-α用作標準物。聚苯乙烯96孔盤在4℃下用3 μg/mL抗體III塗佈隔夜。各盤經洗滌，用阻斷緩衝液阻斷，再次洗滌，且接著添加濃縮尿樣品。在室溫下2小時之後，洗滌各盤，且接著添加二次經生物素標記之多株抗hTGFα。在室溫下2小時之後，洗滌各盤且與抗生蛋白鏈菌素(streptavidin)-HRP一起培育30分鐘。用TMB受質產生信號，且用2 N H2SO4終止反應。針對小鼠巨噬細胞發炎性蛋白質2(MIP-2，人類IL-8之等效物)之商品化Quantikine®夾心式ELISA套組用於根據製造商說明書偵測尿MIP-2。兩種ELISA分析之吸光度資料均在SpectraMax 190盤讀取器(Molecular Devices)上獲得且分析資料。

腎病變

在研究結束時移除殘腎，固定於福馬林(formalin)中且根據標準方法進行石蠟切片處理。由病理學家評估腎臟切片之腎病變。使用下列量表對腎小管蛋白質、增加之腎小球膜基質及間質纖維化進行半定量計分：無(0)、微小(1)、輕度(2)、中度(3)、顯著(4)及重度(5)。使用蘇木精(hematoxylin)及伊紅(eosin)(「H&E」)及過碘酸-希夫(Periodic acid-Schiff，「PAS」)染色切片對腎小球膜基質增生及基膜變厚計分。評估馬森氏(Masson's)三色染色腎臟切片以確定纖維化(間質及腎小球)程度。

統計方法

所有資料皆用JMP v.8.0軟體(SAS Institute)分析。藉由列聯分析(contingency analysis)及費雪氏精確檢定(Fishers exact test)來統計學評估病變計分。所有其他資料皆藉由以對數變換資料進行之ANOVA以及史都登氏非配對t檢定(Students unpaired t test)加以評估。P值<0.05視為統計上的顯著。

相對於對照IgG組，抗體III使白蛋白尿劑量依賴性減小(表6)。相對於對照IgG組，在10 mg/kg下進行之抗體III治療導致在手術後第8及12週而非在第2、4或16週，白蛋白尿顯著減小(表6)。

抗體III顯示對收縮壓無影響，因為所有組皆在手術後12週顯示高血壓(表7)。此外，抗體III以10 mg/kg進行治療導致腎功能改善，如藉由血清肌酐及BUN相對於對照IgG組顯著減小所示(表7)。

相較於對照IgG組，在手術後第8及12週，10 mg/kg抗體III劑量可觀地使尿TGF-α及尿MIP-2統計上的顯著降低(表8)。此外，相較於對照IgG，10 mg/kg劑量之抗體III使腎小管蛋白質及間質纖維化之腎病變統計上的顯著減輕且腎小球膜基質增生減輕(表8)。

實例6：糖尿病性腎病之小鼠單側腎切除db/db模型中之白蛋白尿及腎病變

單側腎切除db/db小鼠模型表示一種糖尿病性腎病變模型。[Ninichuk等人，Eur J Med Res.2007年8月16日；12(8)：351-5]單側腎切除db/db模型用於確定抗體III對歸因於糖尿病之腎病參數之影響。對C57BLKS/J背景之4週齡db/db小鼠進行移除右腎之單側腎切除(「UniNx」)手術。在8週齡時根據尿ACR、血糖及體重進行隨機分組，每組12隻小鼠。所有小鼠在各研究開始時皆具有高血糖。同型對照IgG或抗體III在9週齡開始經皮下給藥且持續每週一次直至25週齡。研究1係以0.3及10 mg/kg劑量之抗體III及10 mg/kg劑量之同型對照IgG進行。研究1之終點為存活、HbA1c%、白蛋白尿、尿TGF-α、腎臟重量及腎病變。研究2含有30、10、3及0.3 mg/kg之抗體III之劑量組及30 mg/kg劑量之同型對照IgG。研究2之終點為存活及白蛋白尿。

在研究1中之對照IgG組中僅有1例死亡。在研究2中無死亡。

尿收集及量測白蛋白尿

藉由斑點收集方法收集尿以歷經2-4小時時期收集尿。將個別小鼠置放在96孔聚丙烯微盤之頂部上且接著由具有呼吸孔但無食物或水入口之塑膠玻璃(plexiglas)腔室覆蓋。在時期結束時，用微量吸移管自盤移除尿且置放在冰上，離心且進行白蛋白及肌酐分析。白蛋白尿定義為尿白蛋白與肌酐之比率(μg/mg)。

測定HbA1c%

HbA1c%用作研究結束時之高血糖之量度。在驗屍時藉由心臟穿刺獲得EDTA血漿。血液樣品在2000 g下離心20分鐘以移除血球且獲得血漿。分析血漿樣品之血色素(Hemoglobin)A1c及總血色素。由此等資料計算HbA1c%。

腎臟重量

在驗屍時移除腎臟以測定其重量。

藉由ELISA測定尿TGF-α

由斑點收集獲得之尿用含有ultracel 3K MW截留膜之0.5 mL Amicon超離心過濾器濃縮5倍。裝置在14,000×g離心30分鐘，且接著收集濃縮尿樣品。建立針對小鼠TGFα之夾心型ELISA。大鼠TGF-α用作TGF-α ELISA之標準物。聚苯乙烯96孔盤在4℃用3 μg/mL抗體III塗佈隔夜。各盤經洗，用阻斷緩衝液阻斷，再洗，且接著添加濃縮尿樣品。在室溫2小時之後，洗各盤，且接著添加二次經生物素標記之多株抗hTGF-α。在室溫2小時之後，洗各盤，且與抗生蛋白鏈菌素-HRP一起培育30分鐘。用TMB受質產生信號，且用2N H₂ SO₄ 終止反應。在Spectra Max 190盤讀取器(Molecular Devices)上獲得吸光度資料，且將資料輸入Microsoft Excel 2007及Sigmaplot v.9.01中以進行分析。

腎病變

在研究結束時移除腎臟，移除囊(capsules)，且接著固定於福馬林中，並根據標準方法進行石蠟切片。腎臟切片由病理學家評估腎病變。使用下列量表對腎小球膜基質、腎盂擴張及腎小球纖維化進行半定量計分：無(0)、微小(1)、輕度(2)、中度(3)、顯著(4)及重度(5)。使用H&E及PAS染色切片對腎小球膜基質增生及基膜變厚計分。評估馬森氏三色染色之腎臟切片以確定纖維化(腎小球)程度。

統計方法

所有資料用JMP v.8.0軟體(SAS Institute)分析。病變計分在統計上藉由列聯分析及費雪氏精確檢定評估。白蛋白尿(ACR)之統計分析係藉由擬合模型用非轉換資料及第8週之基線ACR作為共變數進行。藉由ANOVA及史都登氏非配對t檢定比較各組內之第24週資料與第16週資料分析ACR進展。藉由ANOVA及史都登氏非配對t檢定確定各組自第16週至第24週之ACR變化。P值<0.05視為在統計上顯著。所有其他資料係藉由以對數轉換資料之ANOVA以及史都登氏非配對t檢定評估。

在研究1中，相對於對照IgG組，抗體III使白蛋白尿劑量依賴性減小(表9)。相較於對照IgG組，在最後兩個月期間，兩個抗體III組之白蛋白尿進展均較小。歷經研究之最後兩個月之組內白蛋白尿變化指示自第16週至第24週，對照IgG組顯著增加，而抗體III組並不如此(表9)。在研究2中，相較於對照IgG，抗體III使隨時間之白蛋白尿進展劑量依賴性減緩(表9)。

歷經研究2之最後兩個月之白蛋白尿變化指示30 mg/kg抗體III導致白蛋白尿歷經研究之最後兩個月顯著減小，而對照IgG歷經相同時期使白蛋白尿增加(表10)。

相對於10 mg/kg對照IgG及0.3 mg/kg抗體III組，10 mg/kg抗體III組中之左腎重量顯著較低(表11)。歷經研究之過程，抗體III 10 mg/kg劑量組中之尿TGF-α顯著減小(表11)。此外，所有治療組之HbA1c%皆顯著高於對照瘦小鼠(表11)。相較於對照IgG組，抗體III治療不影響HbA1c%(表11)。此外，相較於對照IgG，10 mg/kg之抗體III使腎小球膜基質增生及腎盂擴張之腎病變計分顯著降低(表11)。

實例7：於持續6週每週給予靜脈內快速注射之食蟹獼猴中進行之毒性及毒物動力學研究

於猴中進行6週毒理學研究以評估抑制TGF-α及表皮調節素是否將導致皮膚毒性。持續6週每週用媒劑、10或100 mg/kg之抗體I靜脈內注射液(IV)對猴給藥。注射部位在右隱靜脈與左隱靜脈之間交替。每日兩次提供飼料(早晨一次及下午一次)。在給藥日給藥之後不久提供早晨食物定量配給。在研究期間不提供高鈣補充劑及小食(treat)。每週一次在星期六(適用時在96小時給藥後血液收集之後)提供兒童用綜合維生素(multivitamin)。

在整個研究期間，猴舍飼於「分隔成對(divided pair)」不鏽鋼條板/網籠中。在前3週期間，動物經個別舍飼。對於研究之其餘部分，治療組內之動物成對舍飼，在各個下午開始且持續直至次日早晨以提供額外社會化機會。

此研究之無可觀測不利效應之劑量(No-Observed- Adverse-Effect Level，「NOAEL」)為100 mg/kg抗體I。未觀測到經治療動物有皮膚變化。未觀測到其他病變變化。

SEQ ID列表 重鏈CDR

SEQ ID NO：1 GYTFTDAYIN

SEQ ID NO：2 WIWPGPVITYYNPKFKG

SEQ ID NO：3 REVLSPFAY

輕鏈CDR

SEQ ID NO：4 RSSQSIVHSTGNTYLE

SEQ ID NO：5 KVSNRFS

SEQ ID NO：6 FHGTHVPYT

重鏈可變區

SEQ ID NO：7(抗體I及抗體II)

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDAYINWVRQAPGQGLEWMGWIWPGPVITYYNPKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARREVLSPFAYWGQGTTVTVSS

SEQ ID NO：8(抗體III)

QVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFTDAYINWVKQRPGQGLEWIGWIWPGPVITYYNPKFKGKATLTVDKSSSTAYMLLSSLTSEDSAFYFCARREVLSPFAYWGQGTLVTVSA

輕鏈可變區

SEQ ID NO：9(抗體I)

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRSSQSIVHSTGNTYLEWYQQKPGQPPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCFHGTHVPYTFGGGTKVEIK

SEQ ID NO：10(抗體II)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSIVHSTGNTYLEWYQQKPGKAPKLLIYKVSNRFSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCFHGTHVPYTFGGGTKVEIK

SEQ ID NO：11(抗體III)

DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSTGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFHGTHVPYTFGGGTKLEIK

完全重鏈

SEQ ID NO：12(抗體I及抗體II)

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDAYINWVRQAPGQGLEWMGWIWPGPVITYYNPKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARREVLSPFAYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG

完全輕鏈

SEQ ID NO：13(抗體I)

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRSSQSIVHSTGNTYLEWYQQKPGQPPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCFHGTHVPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO：14(抗體II)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSIVHSTGNTYLEWYQQKPGKAPKLLIYKVSNRFSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCFHGTHVPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

核苷酸序列 重鏈可變區

SEQ ID NO：15

CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCATCTGGCTACACCTTCACTGACGCGTATATAAACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATTTGGCCTGGACCCGTTATTACTTACTACAATCCGAAGTTCAAGGGCAGAGTCACCATTACCGCGGACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAAGGGAAGTACTATCCCCGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGAACCACGGTCACCGTCTCCTCA

核苷酸序列 輕鏈可變區

SEQ ID NO：16

GACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGCCACCATCAACTGCAGATCTAGTCAGAGCATTGTACATAGTACTGGAAACACCTATTTAGAATGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGCCTCCTAAGCTGCTCATTTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCTGACCGATTCAGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGGCTGAAGATGTGGCAGTTTATTACTGTTTTCACGGCACTCATGTTCCGTACACGTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA

SEQ ID NO：17

GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCTCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCAGATCTAGTCAGAGCATTGTACATAGTACTGGAAACACCTATTTAGAATGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTTTTCACGGCACTCATGTTCCGTACACGTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA

成熟人類TGFα

SEQ ID NO：18

VVSHFNDCPDSHTQFCFHGTCRFLVQEDKPACVCHSGYVGARCEHADLLA

成熟小鼠(小家鼠(Mus musculus))TGFα

SEQ ID NO：19

VVSHFNKCPDSHTQYCFHGTCRFLVQEEKPACVCHSGYVGVRCEHADLLA

成熟大鼠(褐家鼠(Rattus norvegicus))TGFα

SEQ ID NO：20

VVSHFNKCPDSHTQYCFHGTCRFLVQEEKPACVCHSGYVGVRCEHADLLA

成熟獼猴(食蟹猴(Macaca fascicularis))TGFα

SEQ ID NO：21

VVSHFNDCPDSHTQFCFHGTCRFLVQEDKPACVCHSGYVGARCEHADLLA

成熟人類表皮調節素-添加有N端甲硫胺酸

SEQ ID NO：22

MVSITKCSSDMNGYCLHGQCIYLVDMSQNYCRCEVGYTGVRCEHFFL

成熟小鼠(小家鼠)表皮調節素-添加有N端甲硫胺酸

SEQ ID NO：23

MVQITKCSSDMDGYCLHGQCIYLVDMREKFCRCEVGYTGLRCEHFFL

成熟獼猴(食蟹猴)表皮調節素

SEQ ID NO：24

VSITKCNSDMNGYCLHGQCIYLVDMSQNYCRCEVGYTGVRCEHFYL

成熟人類表皮細胞分裂原

SEQ ID NO：25

AVTVTPPITAQQADNIEGPIALKFSHLCLEDHNSYCINGACAFHHELEKAICRCFTGYTGERCEHLTLTSYA

成熟小鼠(小家鼠)表皮細胞分裂原

SEQ ID NO：26

LKFSHPCLEDHNSYCINGACAFHHELKQAICRCFTGYTGQRCEHLTLTSYA

成熟人類EGF-添加有N端甲硫胺酸

SEQ ID NO：27

MNSDSECPLSHDGYCLHDGVCMYIEALDKYACNCVVGYIGERCQYRDLKWWELR

成熟人類HBEGF

SEQ ID NO：28

DLQEADLDLLRVTLSSKPQALATPNKEEHGKRKKKGKGLGKKRDPCLRKYKDFCIHGECKYVKELRAPSCICHPGYHGERCHGLSL

成熟人類β細胞調節素

SEQ ID NO：29

DGNSTRSPETNGLLCGDPEENCAATTTQSKRKGHFSRCPKQYKHYCIKGRCRFVVAEQTPSCVCDEGYIGARCERVDLFY

成熟人類雙調蛋白

SEQ ID NO：30

SVRVEQVVKPPQNKTESENTSDKPKRKKKGGKNGKNRRNRKKKNPCNAEFQNFCIHGECKYIEHLEAVTCKCQQEYFGERCGEKSMKTHSMIDSSLSK

完全重鏈抗體III-小鼠抗體

SEQ ID NO：31

QVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFTDAYINWVKQRPGQGLEWIGWIWPGPVITYYNPKFKGKATLTVDKSSSTAYMLLSSLTSEDSAFYFCARREVLSPFAYWGQGTLVTVSAAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK

完全輕鏈抗體III-小鼠抗體

SEQ ID NO：32

DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSTGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFHGTHVPYTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC

成熟人類表皮調節素

SEQ ID NO：33

VSITKCSSDMNGYCLHGQCIYLVDMSQNYCRCEVGYTGVRCEHFFL

<110> 美國禮來大藥廠

<120> 結合TGF-α及表皮調節素(EPIREGULIN)之抗體

<130> X18890

<140> 101110200

<141> 2012-03-23

<150> 61/472,338

<151> 2011-04-06

<160> 33

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 1

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 2

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 3

<210> 4

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 4

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 6

<210> 7

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 7

<210> 8

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 8

<210> 9

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 9

<210> 10

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 10

<210> 11

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 11

<210> 12

<211> 444

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 12

<210> 13

<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 13

<210> 14

<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 14

<210> 15

<211> 354

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 15

<210> 16

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 16

<210> 17

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 17

<210> 18

<211> 50

<212> PRT

<213> 智人

<400> 18

<210> 19

<211> 50

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 19

<210> 20

<211> 50

<212> PRT

<213> 褐家鼠

<400> 20

<210> 21

<211> 50

<212> PRT

<213> 食蟹猴

<400> 21

<210> 22

<211> 47

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 添加有N端甲硫胺酸之成熟人類表皮調節素

<400> 22

<210> 23

<211> 47

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 添加有N端甲硫胺酸之成熟小鼠(小家鼠)表皮調節素

<400> 23

<210> 24

<211> 46

<212> PRT

<213> 食蟹猴

<400> 24

<210> 25

<211> 72

<212> PRT

<213> 智人

<400> 25

<210> 26

<211> 51

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 26

<210> 27

<211> 54

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 添加有N端甲硫胺酸之成熟人類EGF

<400> 27

<210> 28

<211> 86

<212> PRT

<213> 智人

<400> 28

<210> 29

<211> 80

<212> PRT

<213> 智人

<400> 29

<210> 30

<211> 98

<212> PRT

<213> 智人

<400> 30

<210> 31

<211> 442

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 31

<210> 32

<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 32

<210> 33

<211> 46

<212> PRT

<213> 智人

<400> 33

Claims

一種結合TGF-α及表皮調節素之抗體，其包含輕鏈及重鏈，其中該輕鏈包含輕鏈可變區(LCVR)及該重鏈包含重鏈可變區(HCVR)，其中該LCVR包含胺基酸序列LCDR1、LCDR2及LCDR3，及該HCVR包含胺基酸序列HCDR1、HCDR2及HCDR3，其中LCDR1為SEQ ID NO：4，LCDR2為SEQ ID NO：5，LCDR3為SEQ ID NO：6，HCDR1為SEQ ID NO：1，HCDR2為SEQ ID NO：2，及HCDR3為SEQ ID NO：3。
如請求項1之抗體，其中該LCVR之胺基酸序列為SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10。
如請求項1或請求項2之抗體，其中該HCVR之胺基酸序列為SEQ ID NO：7。
如請求項1之抗體，其中該LCVR之胺基酸序列為SEQ ID NO：9及該HCVR之胺基酸序列為SEQ ID NO：7。
如請求項1之抗體，其中該輕鏈之胺基酸序列為SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14。
如請求項1之抗體，其中該重鏈之胺基酸序列為SEQ ID NO：12。
如請求項1之抗體，其包含兩個輕鏈，其中各輕鏈之胺基酸序列為SEQ ID NO：13；及兩個重鏈，其中各重鏈之胺基酸序列為SEQ ID NO：12。
如請求項1之抗體，其包含兩個輕鏈，其中各輕鏈之胺基酸序列為SEQ ID NO：14；及兩個重鏈，其中各重鏈之胺基酸序列為SEQ ID NO：12。
如請求項1之抗體，其係用於療法中。
如請求項1之抗體，其係用於治療糖尿病性腎病變。
一種醫藥組合物，其包含如請求項1至8中任一項之抗體及至少一種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。
一種如請求項1至8中任一項之抗體之用途，其係用於製造治療糖尿病性腎病變之藥劑。
一種如請求項1至8中任一項之抗體之抗原結合片段。
如請求項13之抗原結合片段，其係用於療法中。
如請求項13之抗原結合片段，其係用於治療糖尿病性腎病變。
一種醫藥組合物，其包含如請求項13之抗原結合片段及至少一種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。
一種如請求項13之抗原結合片段之用途，其係用於製造治療糖尿病性腎病變之藥劑。