CN103459423B

CN103459423B - 结合TGF-α和EPIREGULIN的抗体

Info

Publication number: CN103459423B
Application number: CN201280016829.XA
Authority: CN
Inventors: C·B·贝德勒; J·G·霍伊尔; R·J·彼得罗万
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 2011-04-06
Filing date: 2012-03-28
Publication date: 2016-03-02
Anticipated expiration: 2032-03-28
Also published as: EA024921B1; KR20130133274A; HK1190410A1; HRP20150468T1; TWI454481B; SI2694547T1; ES2539503T3; PL2694547T3; DK2694547T3; EA201370196A1; CA2832256C; IL228101A0; PT2694547E; TW201300414A; WO2012138510A1; UA110051C2; BR112013023513A2; CA2832256A1; ME02063B; MX2013011596A

Abstract

本发明提供了结合人TGF-α和人Epiregulin的抗体，其特征是具有高亲和力、选择性和强中和性质。抗体可用于治疗糖尿病肾病。

Description

结合TGF-α和EPIREGULIN的抗体

本发明涉及结合人TGF-α和Epiregulin的抗体，及其用途。

TGF-α和Epiregulin是表皮生长因子受体(EGFR)的7种配体中的两种，通常在损伤后的创伤愈合中发挥功能。糖尿病肾病(DN)是主要的糖尿病并发症，是终末期肾脏疾病(ESRD)的主要诱因。蛋白尿是伴随DN的肾功能衰减的临床标志，与疾病发展和增加的心血管风险相关，所述心血管风险例如心力衰竭、血管疾病、节律障碍。DN的护理标准包括ACE抑制剂和血管紧张素受体阻断剂(ARB)，其仅减慢疾病发展，并遗留下明显的剩余风险。

阻断EGFR不仅减轻了蛋白尿，还减轻了肾病的临床前动物模型的肾脏病理学。然而，批准用于癌症的EGFR抑制剂(如)与副作用相关，所述副作用如与皮肤的靶向抑制相关的严重的面部和肩部皮疹。因此，仍然需要DN的替代疗法。此外，需要更有效的DN治疗疗法。

已描述了结合TGF-α的抗体(例如，参见US5190858)。此外，已描述了结合Epiregulin的抗体(例如，参见US2009／0324491)。

本发明提供了抗TGF-α和Epiregulin的抗体，用于治疗DN。此外，本发明提供了参与体内靶向和之后导致蛋白尿降低(伴随着疾病发展和心血管风险的降低)的抗TGF-α和Epiregulin抗体，。

本发明提供了同时结合TGF-α和Epiregulin的治疗有效的抗体，所述抗体同时具有多个想要的特性。本发明的抗体对人TGF-α和人Epiregulin具有高亲和力，并且是选择性的，具有完全的中和活性。当施用时，本发明的抗体还导致清蛋白尿和肾脏病理学减少，所述病理学是关于体内的肾小管蛋白、间质纤维化、小球膜基质扩张和骨盆扩张。此外，本发明的优选的抗体不导致可观察到的与完全的EGFR抑制相关的皮肤毒性。

本发明提供了结合TGF-α和Epiregulin的抗体，包含轻链和重链，其中轻链包含轻链可变区(LCVR)，重链包含重链可变区(HCVR)，其中LCVR包含氨基酸序列LCDR1、LCDR2和LCDR3，HCVR包含氨基酸序列HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中LCDR1是SEQIDNO：4、LCDR2是SEQIDNO：5、LCDR3是SEQIDNO：6，HCDR1是SEQIDNO：1，HCDR2是SEQIDNO：2，和HCDR3是SEQIDNO：3。

本发明还提供了药物组合物，包含如本文所述的本发明的抗体，和至少一种可药用的载体、稀释剂或赋形剂。

本发明提供了如本文所述的本发明的抗体，用于治疗糖尿病肾病。

在本公开内容中，如本文所述的本发明的抗体结合TGF-α和Epiregulin，并且包含轻链和重链，其中轻链包含轻链可变区(LCVR)，重链包含重链可变区(HCVR)，其中LCVR包含氨基酸序列LCDR1、LCDR2和LCDR3，HCVR包含氨基酸序列HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中LCDR1是SEQIDNO：4、LCDR2是SEQIDNO：5、LCDR3是SEQIDNO：6，HCDR1是SEQIDNO：1，HCDR2是SEQIDNO：2，和HCDR3是SEQIDNO：3。

本发明提供了如本文所述的抗体，其中抗体是对人TGF-α和人Epiregulin选择性的。本发明还提供了如本文所述的抗体，其中抗体对人TGF-α和人Epiregulin具有完全的中和活性。更优选的，本发明提供了如本文所述的抗体，其中抗体对人TGF-α和人Epiregulin是选择性的，并具有完全的中和活性。

本发明提供了如本文所述的抗体，其中抗体对人TGF-α(SEQIDNO：18)具有在0.01X10^-9M至1.0X10^-9M之间的解离平衡常数Kd。更优选的，如本文所述的本发明的抗体对人TGF-α具有在0.05X10^-9M至0.8X10^—9M之间的解离平衡常数Kd。Kd值是通过实施例2所述的在25℃的结合平衡确定的。

本发明还提供了如本文所述的抗体，其中抗体对met-人Epiregulin(SEQIDNO：22)具有在0.1X10^-9M至30X10^-9M之间的解离平衡常数Kd。更优选的，如本文所述的本发明的抗体对人Epiregulin具有在0.5X10^-9M至10X10^-9M之间的解离平衡常数Kd。Kd值是通过实施例2所述的在25℃的结合平衡确定的。

本发明提供了如本文所述的抗体，其中抗体对人TGF-α(SEQIDNO：18)具有在0.01X10^-9M至1.0X10^-9M之间的解离平衡常数Kd，对met-人Epiregulin(SEQIDNO：22)具有在0.1X10^-9M至30X10^-9M之间的解离平衡常数Kd。更优选的，如本文所述的本发明的抗体对人TGF-α具有在0.05X10^-9M至0.8X10^-9M之间的解离平衡常数Kd，和对人Epiregulin具有在0.5X10^-9M至10X10^-9M之间的Kd。Kd值是通过实施例2所述的在25℃的结合平衡确定的。

本发明提供了结合人TGF-α和Epiregulin的抗体，所述抗体分别在实施例5和实施例6描述的小鼠残肾模型和小鼠单侧肾切除db／db模型中，

在体内导致清蛋白尿剂量依赖性的减少，血清肌酸酐和血尿素氮(BUN)降低。

在体内导致针对肾小管蛋白(tubularprotein)和间质纤维化的肾脏病理学降低，和小球膜基质扩张和骨盆扩张减少。

本发明提供了结合人TGF-α和Epiregulin的抗体，并认为所述抗体在人中导致蛋白尿减少，同时伴随疾病发展和心血管风险的降低。此外，本发明提供了结合人TGF-α和Epiregulin的抗体，并认为所述抗体在治疗人的糖尿病肾病中是有效的。

本发明提供了结合人TGF-α和Epiregulin的抗体，并在实施例7描述的食蟹猴(cynomolgusmonkeys)的毒性研究中没有导致观察到的皮肤毒性。

此外，本发明提供了结合TGF-α和Epiregulin的抗体，包含轻链和重链，其中轻链包含轻链可变区(LCVR)，重链包含重链可变区(HCVR)，其中LCVR的氨基酸序列是SEQIDNO：9或SEQIDNO：10。

本发明还提供了结合TGF-α和Epiregulin的抗体，包含轻链和重链，其中轻链包含轻链可变区(LCVR)，重链包含重链可变区(HCVR)，其中HCvR的氨基酸序列是SEQIDNO：7。

本发明还提供了结合TGF-α和Epiregulin的抗体，包含轻链和重链，其中轻链包含轻链可变区(LCVR)，重链包含重链可变区(HCVR)，其中LCVR的氨基酸序列和HCVR的氨基酸序列选自：

(i)LCVR是SEQIDNO：9，且HCVR是SEQIDNO：7；和

(ii)LCVR是SEQIDNO：10，且HCVR是SEQIDNO：7。

本发明提供了结合TGF-α和Epiregulin的抗体，包含轻链和重链，其中轻链包含轻链可变区(LCVR)，重链包含重链可变区(HCVR)，其中LCVR的氨基酸序列是SEQIDNO：9，HCVR的氨基酸序列是SEQIDNO：7。

本发明提供了结合TGF-α和Epiregulin的抗体，包含轻链和重链，其中轻链包含轻链可变区(LCVR)，重链包含重链可变区(HCVR)，其中LCVR的氨基酸序列是SEQIDNO：10，HCVR的氨基酸序列是SEQIDNO：7。

此外，本发明提供了结合TGF-α和Epiregulin的抗体，包含轻链和重链，其中轻链的氨基酸序列是SEQIDNO：13或SEQIDNO：14。

本发明还提供了结合TGF-α和Epiregulin的抗体，包含轻链和重链，其中重链的氨基酸序列是SEQIDNO：12。

此外，本发明提供了结合TGF-α和Epiregulin的抗体，包含轻链和重链，其中重链的氨基酸序列和轻链的氨基酸序列选自：

(i)重链是SEQIDNO：12，且轻链是SEQIDNO：13，和

(ii)重链是SEQIDNO：12，且轻链是SEQIDNO：14。

本发明提供了结合TGF-α和Epiregulin的抗体，包含两条轻链和两条重链，其中每条轻链的氨基酸序列是SEQIDNO：13，其中每条重链的氨基酸序列是SEQIDNO：12。

本发明提供了结合TGF-α和Epiregulin的抗体，包含两条轻链和两条重链，其中每条轻链的氨基酸序列是SEQIDNO：14，其中每条重链的氨基酸序列是SEQIDNO：12。

此外，本发明提供了如本文所述的抗体的抗原结合片段。

此外，本发明提供了药物组合物，包含如本文所述的本发明的抗体，和至少一种可药用的载体、稀释剂或赋形剂，和任选的其他治疗成分。

本发明还提供了治疗患者的糖尿病肾病的方法，包括向患者施用如本文所述的本发明的抗体。

此外，本发明提供了如本文所述的本发明的抗体，用于治疗。优选的，本发明提供了如本文所述的本发明的抗体，用于治疗糖尿病肾病。

此外，本发明提供了如本文所述的本发明的抗体的用途，用于制备治疗糖尿病肾病的药物。

本发明还提供了治疗患者的糖尿病肾病的方法，包括向患者施用如本文所述的本发明的抗体，与标准护理同时或相继的组合。

此外，本发明提供了用于治疗的如本文所述的本发明的抗体，其中抗体与标准护理同时或相继的组合施用。优选的，本发明提供了如本文所述的本发明的抗体，用于治疗糖尿病肾病，其中抗体与标准护理同时或相继的组合施用。

此外，本发明提供了如本文所述的本发明的抗体的用途，用于制备治疗糖尿病肾病的药物，其中抗体与标准护理同时或相继的组合施用。

本发明还提供了药物组合物，包含如本文所述的本发明的抗体的抗原结合片段，和至少一种可药用的载体、稀释剂或赋形剂。

此外，本发明提供了药物组合物，包含如本文所述的本发明的抗体的抗原结合片段，和至少一种可药用的载体、稀释剂或赋形剂，和任选的其他治疗成分。

本发明还提供了治疗患者的糖尿病肾病的方法，包括向患者施用如本文所述的本发明的抗体的抗原结合片段。

此外，本发明提供了如本文所述的本发明的抗体的抗原结合片段，其用于治疗。优选的，本发明提供了如本文所述的本发明的抗体的抗原结合片段，其用于治疗糖尿病肾病。

此外，本发明提供了如本文所述的本发明的抗体的抗原结合片段的用途，用于制备治疗糖尿病肾病的药物。

本发明还提供了治疗患者的糖尿病肾病的方法，包括向患者施用如本文所述的本发明的抗体的抗原结合片段，与标准护理同时或相继的组合施用。

此外，本发明提供了如本文所述的本发明的抗体的抗原结合片段，其用于治疗，其中抗原结合片段与标准护理同时或相继的组合施用。优选的，本发明提供了如本文所述的本发明的抗体的抗原结合片段，其用于治疗糖尿病肾病，其中抗原结合片段与标准护理同时或相继的组合施用。

此外，本发明提供了如本文所述的本发明的抗体的抗原结合片段的用途，用于制备治疗糖尿病肾病的药物，其中抗原结合片段与标准护理同时或相继的组合施用。

DN的标准护理包括但不限于ACE抑制剂和血管紧张素受体阻断剂(ARB)。

“抗体”的一般结构是本领域普遍已知的。对于IgG型的抗体，有4条通过链内和链间二硫键交联的氨基酸链(两条“重链”和两条“轻链”)。当在某些生物系统中表达时，具有未修饰的人Fc序列的抗体在Fc区是糖基化的。抗体也可以在其他位置是糖基化的。抗体的亚基结构和三维构象是本领域普遍已知的。每条重链包含N-末端重链可变区(HCVR)和重链恒定区(HCCR)。IgG、IgD和IgA的重链恒定区包含3个结构域(CH1、CH2和CH3)；IgM和IgE的重链恒定区包含4个结构域(CH1、CH2、CH3和CH4)。每条轻链包含轻链可变区(LCVR)和轻链恒定区(LCCR)。

每条轻链／重链对的可变区形成抗体结合位点。HCVR和LCVR区进一步细分为超变区，也称为互补决定区(CDR)，中间散布有更保守的区域，被称为框架区(FR)。每个HCVR和LCVR由3个CDR和4个FR构成，从氨基端向羧基端按下列顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在本文中，重链的3个CDR被称为“CDRH1、CDRH2和CDRH3'’，轻链的3个CDR被称为“CDRL1、CDRL2和CDRL3”。CDR含有与抗原形成特异性相互作用的绝大多数残基。对每个结构域的氨基酸分配是根据普遍已知的规则(例如，Kabat“SequencesofProteinsofImmunologicalInterest”NationalInstitutesofHealth，Bethesda，Md.(1991))。

本发明的抗体可具有选自任何免疫球蛋白类别的重链恒定区(IgA、IgD、IgG、IgM和IgE)。此外，本发明的抗体含有源自人IgG4Fc区的Fc部分，因为其与补体因子结合的能力比其他IgG亚型低。

抗体可源自单拷贝或克隆，包含例如任何真核的、原核的或噬茵体克隆。优选的，本发明的抗体存在于均质的或基本均质的抗体分子群体中。全长抗体包含全长或基本上全长的恒定区，其包括Fc区。这类抗体的“抗原结合片段”是任何截短形式的全长抗体，其包含抗原结合部分并保留了抗原结合能力。这类截短的形式包括例如Fab片段、Fab'片段或F(ab')2片段，所述片段包含所公开抗体的CDR或可变区。此外，这类截短的抗体形式可以是单链Fv片段，所述片段可通过用接头序列连接编码LCVR和HCVR的DNA产生的(参见Pluckthun，ThePharmacologyofMonoclonalAntibodies，第113卷，Rosenburg和Moore编著，Springer-Verlag，NewYork，第269-315页，1994)。除非另外指出，否则术语“抗体”不包括这类片段。可以使用本领域普遍已知的技术生产本发明的抗体，例如重组技术、噬菌体展示技术、合成技术或这类技术的组合，或本领域已知的其他技术。

本发明的抗体是经过改造的抗体，其被设计为具有人来源的框架区、铰链区和恒定区，与源自人基因组序列的框架区和恒定区相同或基本相同(基本上人的)。完全的人框架、铰链区和恒定区是那些人种系序列和具有天然存在的体细胞突变的序列和具有改造的突变的序列。本发明的抗体可包含源自完全人的框架区、铰链区或恒定区，但其中含有一个或多个氨基酸取代、缺失或添加的框架区、铰链区或恒定区。此外，本发明的抗体在人中基本上是非免疫原性的。

多种不同的人框架序列可以单独或组合使用，作为本发明的抗体的基础。优选的，本发明的抗体的框架区是人来源的或基本上人的(至少95％、97％或99％人来源的)。人来源的框架区序列可以自Marie-PauleLafranc的ImmunoglobulinFacSsbook，GerardLefranc，AcademicPress2001，ISBN012441351获得。

本发明抗体的框架序列可用作“供体”可变框架区，用于利用本领域已知的方法，生成具有本文所述相同CDR的其他抗体。此外，本发明抗体的框架序列可以与其他已知的人框架序列比较，产生其他抗体。因此，该信息可用于将另一种选定的同源人框架区“回复突变”为这些位置上的供体氨基酸残基。此外，可以在额外的人框架中检测到任何“稀有的”氨基酸，从而在相关的位置可以使用共有的或供体氨基酸残基。

“TGF-α”或“人TGF-α”指人TGF-α蛋白(SEQIDNO：18)。

“Epiregulin”或“人Epiregulin”指人Epiregulin蛋白(SEQIDNO：33)。Met-人Epiregulin(SEQIDNO：22)用于本文的体外实验。所提及的如本文所述的本发明抗体的结合或中和人Epiregulin的能力，也适合在体外实验中结合和中和人met-Epiregulin的能力。

“患者”是哺乳动物，优选人。

术语“治疗”及其各种词性形式意指减慢、停止、降低或逆转症状、病况、病症或疾病的发展或严重程度。

术语“治疗有效量”指单次或多次剂量施用给患者时提供想要的治疗的本发明抗体的量或剂量。

基本如下文所述实施下列实施例。

实施例

实施例1：生产抗体

可如下制备和纯化抗体I和II。使用预定的最佳HC：LC载体比例或单个载体系统，用分泌抗体的表达系统瞬时或稳定的转染恰当的宿主细胞(如HEK293或CHO)，所述单个载体系统编码HC(例如SEQIDNO：15)和LC(例如SEQIDNO：16或SEQIDNO：17)。使用许多常用技术中的任何，纯化其中已被分泌了抗体的澄清培养基。例如，可以将培养基常规的用于已经用相容的缓冲液平衡过的蛋白A或G柱子，例如磷酸缓冲的盐溶液(pH7.4)。洗涤柱子，去除非特异性结合的组分。洗脱结合的抗体，通过例如pH梯度(如0.1M磷酸钠缓冲液pH6.8至0.1M柠檬酸钠缓冲液pH2.5)。通过例如SDS-PAGE检测抗体级分，然后收集它们。根据预期用途，任选的进行进一步纯化。可以使用常规技术，浓缩和／或无菌过滤抗体。可以通过常规技术有效去除可溶性聚集体和多聚体，包括尺寸排阻、疏水性相互作用、离子交换或羟磷灰石层析。这些层析步骤后的抗体纯度大于99％。可以将产物立即在-70℃冷冻或冻干。下面提供了这些抗体的氨基酸序列。

SEOIDNO

抗体	重链	轻链	HCVR	LCVR
					I	12	13	7	9
II	12	14	7	10
					III	31	32	8	11

实施例2：通过表面等离振子共振(BIAcore)对抗体I进行亲和力结合测定

表面等离振子共振分析使用BiacoreT2000仪器(AB，Upsala，Sweden)、试剂和BiacoreT2000评测软件4.1版。使用生产商的EDC／NHS胺偶联方法，制备CM5芯片。通过10μL／min注射EDC／NHS的1：1混合物7分钟，使所有4个流动室(flowcell)的表面活化。在10mM乙酸pH4.0缓冲液中稀释山羊抗人Fcγ特异性抗体至50μg／ml，通过10μL／min的流速注射7分钟，在所有4个流动室上固定约10000RU。用10μL／min注射乙醇胺7分钟，阻断未反应的位点。用30μL／min进行3x20秒甘氨酸pH1.5的注射，去除非共价联结的蛋白质。运行缓冲液是HBS-EP(10mMHEPES，150mM氯化钠，3mMEDTA，0.005％Polysorbate20)。

在研究1中，在运行缓冲液中将抗体I稀释至50μg／mL，流动室2中捕获了约400-600RU。在运行缓冲液中将人TGF-α(SEQIDNO：18)、大鼠TGF-α(SEQIDNO：20)、met-人Epiregulin(SEQIDNO：22)和食蟹猴Epiregulin(SEQIDNO：24)从100μg／mL稀释至200nM，然后在运行缓冲液中2倍系列稀释至6.25nM。在运行缓冲液中将小鼠Epiregulin(SEQIDNO：23)从100μg／mL稀释至4μM，然后在运行缓冲液中2倍系列稀释至125nM。每种配体浓度以30μL／min注射300秒，重复注射2次，接着是解离相。人和大鼠TGF-α的解离相为1800秒，人和食蟹猴Epiregulin的解离相为1200秒，和小鼠Epiregulin的解离相为120秒。通过在整个流动室以30uL／min注射10mM甘氨酸pH1.5，3x20秒，进行再生。

在研究2中，在运行缓冲液中将抗体III稀释至100μg／mL，流动室2中捕获了约400-600RU。在运行缓冲液中将小鼠TGF-α(SEQIDNO：19)从100μg／mL稀释至200nM，然后在运行缓冲液中2倍系列稀释至6.25nM。在运行缓冲液中将小鼠Epiregulin(SEQIDNO：23)从100μg／mL稀释至4μM，然后在运行缓冲液中2倍系列稀释至125nM。每种配体浓度以30μL／min注射300秒，重复注射2次，接着是解离相。小鼠TGF-α的解离相为1800秒，小鼠Epiregulin的解离相为120秒。通过在整个流动室以30μL／min注射10mM甘氨酸pH1.5，30秒，进行再生。

减去参照的数据收集为Fc2-Fc1。在25℃获得测量。使用“1：1(Langmuir)Binding”结合模型，评估每种配体的结合速率(k_on)和解离速率(k_off)。根据关系式：K_D=k_off/k_on，从结合动力学计算亲和力(K_D)。

表1

抗体I的结合参数

表2

抗体III的结合参数

抗体I结合人TGF-α和人Epiregulin，亲和力分别约为98pM和1.3nM。抗体I还结合大鼠TGF-α和小鼠Epiregulin，亲和力分别约为70pM和340nM。此外，抗体I结合食蟹猴Epiregulin，亲和力约为1nM。抗体III结合小鼠TGF-α和小鼠Epiregulin，亲和力分别约为38pM和220nM。因此，本发明的抗体I和抗体III对人TGF-α和人Epiregulin具有高亲和力。

实施例3：EGF靶向配体在人结肠癌细胞系HT-29中的内化

488与抗体缀合

根据生产商的规程，缀合488与抗体I和对照IgG。在PBS中稀释蛋白质至2mg／mL。向0.5mL该2mg／mL溶液中，加入50μL的1M碳酸氢钠pH9。然后将蛋白质溶液转移到染料瓶中，室温下搅拌1小时。使用包括在标记试剂盒中的Bio-RadBioGelP-30树脂，纯化被标记的蛋白质。

体外内化测定

在研究1中，在96孔板的每个孔中接种10,000个HT-29细胞(已知表达TGF-α和Epiregulin的结肠腺癌细胞系)，其被允许在完全培养基(Dulbecco’sModifiedEagle’sMedium／F12(Ham)培养基(1：1)(DMEM／F12)，含有L-谷氨酰胺、10％热失活的胎牛血清(FBS)、1x抗生素和2.438g／L碳酸氢钠)中孵育过夜。次日，用含有0.1％BSA的PBS洗涤细胞，然后在组织培养温箱中，用含有0.1％BSA的PBS中的488缀合的抗体I或对照IgG(浓度为0至88ug／mL)37℃孵育2小时。在孵育期之后，用含有0.1％BSA的PBS洗涤细胞若干次，然后将细胞用4％甲醛固定用于分析。如下定量内化：用CellomicsArrayscanVTI(ThermoScientifica)收集500个细胞／孔。用系统的生物应用“代谢室分析(Compartmentalanalysis)”，实施图像分析。用Hoechst染色(蓝)鉴别细胞核。设置两个目标区域(ROI)，用于从获得自蔽光框内图像(maskedimage)的胞内点(红)和总绿色荧光(红加蓝)收集荧光信号。计算每个点和细胞的数量、面积和荧光强度。选择胞内点(红)的平均点总强度用于测量抗体I诱导的内化。

在研究2中，如上所述制备10,000个HT-29细胞，向细胞加入在含有0.1％BSA的PBS中的40ug／mL的488缀合的抗体I或对照IgG。在组织培养温箱中，37℃孵育细胞，进行范围在0-120分钟的各种时间，然后，用含有0.1％BSA的PBS洗涤数次，用4％甲醛固定用于分析。基本如前所述实施信号定量。

表3a

研究1-荧光的平均环斑总强度

表3b

研究1-荧光的平均环斑总强度

来自研究1的成像分析的结果确定了荧光信号被内化到细胞内，且是对抗体I而非对照IgG剂量依赖性(表3a和表3b)。

表4

研究2-荧光的平均环斑总强度

研究2的结果证实：抗体I被快速内化，内化作用在加入至细胞2小时后完成(表4)。在体外，抗体I以时间依赖性的方式诱导靶在HT-29细胞上内化(表4)。

实施例4：在肌成纤维细胞系中，测量对EGFR配体刺激的细胞增殖的中和作用

使用克隆的小鼠肌成纤维细胞系(MFc7)测试本发明抗体阻断EGFR配体的增殖活性的能力。7种可以激活EGFR的配体是TGF-α(TGFA)、Epiregulin(EREG)、EGF、肝素结合EGF(HB-EGF)、Epigen(EPGN)、双调蛋白(Amphiregulin)(AREG)和Betacellulin(BTC)。EGFR配体共享结构基序--EGF样结构域，特征是由6个间隔相似的保守半胱氨酸残基形成的3个分子内二硫键。将增殖活性通过溴脱氧尿苷(BrDU)掺入确定，并根据生产商的说明，用比色的BrDUELISA试剂盒测量。

首先，在组织培养处理过的96孔微量培养板中，在0.1mL含有L-谷氨酰胺、10％热失活的FBS、1x抗生素和2.438g／L碳酸氢钠的Dulbecco’sModifiedEagle'sMedium／F12(Ham)培养基(1：1)(DMEM／F12)中，放置2,000个MFc7个细胞／孔。允许细胞吸附6小时，然后去除培养基，并用0.1mL含有0.1％BSA的无血清DMEM／F12替换，血清饥饿过夜。次日，在96孔聚丙烯平板中，用含有0.1％BSA的无血清培养基系列稀释EGFR配体，体积为0.12mL／孔，浓度范围从0.001至3000ng／mL。在稀释后，从血清饥饿的细胞中去除培养基，然后用EGFR配体刺激24小时。在刺激后，用BrDU脉冲细胞4hr，然后根据生产商的说明，用比色BrDUELISA试剂盒分析。

在测试抗体I对EGFR配体的特异性中，在96孔聚丙烯平板中，在3000nM至0.059nM的浓度范围中2X或3X系列稀释抗体，体积为0.06mL／孔。在系列稀释抗体后，每个孔加入0.06mLEGFR配体。然后，在湿润的组织培养温箱中37℃孵育平板30分钟。在孵育后，每个孔转移0.1mL溶液给细胞。刺激细胞24小时。在刺激后，用BrDU脉冲细胞4hr，然后用比色BrDUELISA试剂盒分析。在SpectraMax190读板器(MolecularDevices)上产生吸光值(450nM-690nM)，并分析数据。

表5

MFc7测定

在测定中，发现小鼠Epiregulin和大鼠TGF-α，以及除Epigen和双调蛋白以外的所有人EGFR配体是细胞增殖的强力刺激因素(表5)。抗体I和抗体III对人和大鼠TGF-α和人Epiregulin活性具有高亲和力(表5)。

表5概括了针对测试的EGFR配体的计算的ECS0值，和针对抗体对这些配体的绝对IC50值。计算的抗体I对人TGF-α的平均IC50是0.46±0.03nM，对人Epiregulin的平均IC50是3.15±1.04nM。计算的抗体III对人TGF-α的IC50平均值是0.52±0.04nM，对人Epiregulin的IC50平均值是1.12±0.36nM。计算的抗体III对大鼠TGF-α的平均IC50值是0.13±0.01nM，对小鼠Epiregulin的平均IC50值是214±49nM。因此，抗体I和抗体III具有高亲和力，并对人TGF-α和人Epiregulin是具有完全中和活性的选择性的。

实施例5：高血压性肾病的小鼠残肾模型的肾功能和病理学

涉及手术减少75％总肾质量的小鼠残肾模型被用作高血压性肾病的临床前模型(MaLJ，FogoAB.KidneyInt.2003Jul；64(1)：350-5)。在9-10周龄的雄性129Svev小鼠中进行肾质量的手术减少或假手术(shamsurgery)。在术后2周，通过尿清蛋白／肌酸酐比(ACR)和体重随机化为12只小鼠的组。在随机后，皮下给药同种型对照IgG(10mg／kg)或抗体III(1和10mg／kg)，并连续每周1次，直至术后16周。研究的终点是存活、收缩期血压、清蛋白尿、血清肌酸酐、血清BUN、尿TGF-α、尿MIP-2和肾病理学。

在研究结束时，对照IgG组有3例死亡(25％死亡率)，而抗体III治疗组没有死亡。

测量收缩期血压

通过尾套管(tailcuff)方法，在术后12周记录血压。在实际测量之前3-5天，每天将各组选定的小鼠(N=3-4只／组)放在连接了尾套管的小鼠固定器(mouseholder)中5分钟，使其适应约束。将设备室温增加至24℃，从而在血压收集过程中提供额外加热。将小鼠放入小鼠禁锢器(mouserestrainer)中，并放在加热垫装置上部(31-33℃)，使尾血管膨胀。将尾巴穿过尾套管，约束每只小鼠约30分钟，但不超过45分钟。该时间包括初始加热和压力测量，然后立刻放回一般鼠笼中。不用麻醉。将尾套管充气，紧密压迫尾部，使其足以立刻中断动脉血流，然后通过放气逐渐放松，观察动脉脉搏恢复情况。动脉脉搏恢复时，就将套管完全放气。

测量清蛋白尿

在NalgeneMetabolic笼装置中，每4周收集尿液，共计24小时。在24小时的收集期中，每只小鼠(单独笼养)接受食物和水。在24小时结束时，将收集的尿液放在冰上，离心并进行清蛋白和肌酸酐分析。清蛋白尿定义为尿清蛋白与肌酸酐的比例(ug／mg)。

血清肌酸酐和BUN

在研究结束时，分析通过心脏穿刺获得的血清的BUN和肌酸酐。

TGF-α和MIP-2ELISA

使用3KMW截留膜，在14,000xg旋转30分钟，将通过24小时收集获得的尿液离心浓缩5倍。建立小鼠TGFα的夹心酶联免疫吸附测定(ELISA)。使用大鼠TGF-α作为标准。用3μg／mL抗体III包被聚苯乙烯96孔板4℃过夜。洗涤平板，用封闭缓冲液封闭，再次洗涤，然后加入浓缩的尿样。在室温2小时后，洗涤平板，然后加入生物素化的多克隆抗hTGFα二抗。在室温2小时后，洗涤平板，用链霉亲和素-HRP孵育30分钟。用TMB底物生成信号，用2NH₂SO₄终止反应。根据生产商的说明，用小鼠巨噬细胞炎性蛋白2(MIP-2，人IL-8的等价物)的商业夹心ELISA试剂盒检测尿MIP-2。在SpectraMax190读板器(MolecularDevices)上获得两个ELISA测定的吸光值数据，并分析数据。

肾病理学

在研究结束时，移出残肾，固定在福尔马林中，根据标准方法加工进行石蜡切片。由病理学家评估肾脏切片的肾损伤。使用下列标度，对肾小管蛋白、增加的小球膜基质和间质纤维化进行半定量的评分：无(0)，极少(1)，轻微(2)，中度(3)，明显(4)和严重(5)。使用苏木精和伊红(H&E)和过碘酸-希夫(PAS)染色切片，给肾小球的小球膜基质扩张和基膜加厚评分。评估肾的Masson's三色染色的切片，确定纤维化程度(间质和肾小球)。

统计学方法

用JMPv.8.0软件(SASInstitute)分析所有数据。通过偶然性分析和Fishers精确检验(Fishersexacttest)，统计学评估病理学分数。用对数转化的数据和Students未配对t检验，ANOVA评估所有其他数据。认为P值<0.05是统计学显著的。

表6

清蛋白尿随时间的发展

相对于对照IgG组，用抗体III具有清蛋白尿的剂量依赖性减少(表6)。相对于对照IgG组，10mg／kg的抗体III处理导致术后第8和第12周的清蛋白尿的显著减少，但第2、4或16周未减少(表6)。

表7

收缩期血压、血清肌酸酐和BUN

抗体III对收缩期血压未表现出任何影响，因为所有的组在术后第12周都表现出高血压(表7)。此外，如血清肌酸酐和BUN相对于对照IgG组显著减少所示，10mg／kg抗体III处理导致肾功能改善(表7)。

表8

尿TGF-α、尿MIP-2和肾病理学分数

与对照IgG组相比，用10mg／kg抗体III剂量使术后第8和第12周的尿TGF-α和尿MIP-2有相当统计学显著的降低(表8)。此外，相比对照IgG，10mg／kg抗体III剂量导致统计学显著的肾小管蛋白和间质纤维化的肾脏病理学的降低，和小球膜基质扩张的减少(表8)。

实施例6：糖尿病肾病的小鼠单侧肾切除db／db模型中的清蛋白尿和肾脏病理学

单侧肾切除db／db小鼠模型代表了糖尿病肾病的模型(Ninichuk等人，EurJMedRes.2007年8月16日；12(8)：351-5)。使用单侧肾切除的db／db模型确定抗体III对由于糖尿病造成的肾病参数的影响。对4周龄C57BLKS／J背景的db／db小鼠实施单侧肾切除(UniNx)手术，去除右肾。在8周龄时，按尿ACR、血葡萄糖(bloodglucose)和体重，随机化为12只小鼠的组。在开始每个研究时，所有的小鼠都是高血糖的。在第9周龄时，开始皮下给药同种型对照IgG或抗体III，并每周1次持续至第25周龄。用0.3和10mg／kg抗体III剂量和10mg／kg剂量的同种型对照IgG进行研究1。研究1的终点是存活、％HbA1c、清蛋白尿、尿TGF-α、肾重量和肾病理学。研究2含有30、10、3和0.3mg／kg的抗体III的剂量组，和30mg／kg剂量的同种型对照IgG。研究2的终点是存活和清蛋白尿。

在研究1中，对照IgG组中仅有1例死亡。研究2中没有死亡。

尿收集和测量清蛋白尿

在2-4小时的时间段内，以收集尿液的点收集法收集尿液。将单只小鼠放在96孔聚丙烯微量培养板上部，然后用带呼吸孔，但没有食物或水通路的Plexiglas室盖住。在时间段结束时，用微量移液器从平板移出尿液，放在冰上，离心并进行清蛋白和肌酸酐分析。清蛋白尿定义为尿清蛋白与肌酸酐的比例(ug／mg)。

确定％HbA1c

使用％HbA1c作为研究结束时的高血糖的测量值。在尸检时，通过心脏穿刺获得EDTA血浆。血样在2000g离心20分钟，去除血细胞，获得血浆。分析血浆样品的血红蛋白A1c和总血红蛋白。根据上述数据，计算％HbAIc。

肾重量

尸检时取出肾，确定其重量。

通过ELISA确定尿TGF-α

用含有ultracel3KMW截留(cutoff)膜的0.5mLAmicon超速离心滤纸，将点收集法获得的尿液浓缩5倍。装置在14,000xg离心30分钟，然后收集浓缩的尿液样品。建立小鼠TGFα的夹心型ELISA。使用大鼠TGF-α作为TGF-αELISA的标准。用3μg／mL抗体III包被聚苯乙烯96孔板4℃过夜。洗涤平板，用封闭缓冲液封闭，再次洗涤，然后加入浓缩的尿样。在室温2小时后，洗涤平板，然后加入生物素化的多克隆抗hTGF-α二抗。在室温2小时后，洗涤平板，用链霉亲和素-HRP孵育30分钟。用TMB底物生成信号，用2NH₂SO₄终止反应。在SpectraMax190读板器(MolecularDevices)上获得吸光值数据，并将数据输入MicrosoftExcel2007和Sigmaplotv.9.01用于分析。

肾病理学

在研究结束时，移出残肾，移除被膜，然后固定在福尔马林中，根据标准方法加工进行石蜡切片。由病理学家评估肾脏切片的肾损伤。使用下列标度，对小球膜基质、骨盆扩张和肾小球纤维化进行半定量评分：无(0)，极少(1)，轻微(2)，中度(3)，明显(4)和严重(5)。使用H&E和PAS染色切片，给肾小球的小球膜基质扩张和基膜加厚评分。评估Masson’s三色染色的肾切片，以确定纤维化程度(肾小球)。

统计学方法

用JMPv.8.0软件(SASInstitute)分析所有数据。通过偶然性分析和Fishers精确检验，统计学评估病理学分数。用以第8周的未转化数据和基线ACR作为协变量的拟合模型，进行清蛋白尿(ACR)的统计学分析。通过ANOVA和Student's未配对t检验，比较各组的第24周数据和第16周数据，分析ACR发展。通过ANOVA和Student's未配对t检验，进行组间的从第16周至第24周的ACR改变。认为P值<0.05是统计学显著的。用对数转化的数据和Students未配对t检验，通过ANOVA评估所有其他数据。

表9

研究1-清蛋白尿发展

在研究1中，相对于对照IgG组，用抗体III时有清蛋白尿的剂量依赖性减少(表9)。相比对照IgG组，在最后2个月中，两个抗体III组的清蛋白尿都发展较少。在研究的最后2个月中，组内的清蛋白尿改变表示从第16周至第24周，对照IgG组显著增加，而抗体III组则未增加(表9)。在研究2中，相比对照IgG，用抗体III的清蛋白尿发展随时间有剂量依赖性的减少(表9)。

表10

研究2-清蛋白尿发展

在研究2的最后2个月中，清蛋白尿的改变表示30mg／kg抗体III导致清蛋白尿在研究的最后2个月显著降低，而对照IgG则在同一时间段内增加(表10)。

表11

HbA1c、肾重量、尿TGFα和肾脏病理学分数

在10mg／kg抗体III组中，左肾重量显著低于10mg／kg对照IgG和0.3mg／kg抗体III组(表11)。在研究过程中，抗体III10mg／kg剂量组的尿TGF-α显著减少(表11)。此外，所有处理组的％HbA1c都显著高于对照的瘦小鼠(表11)。相比对照IgG组，抗体III处理不影响％HbA1c(表11)。此外，相比对照IgG，用10mg／kg抗体III的小球膜基质扩张和骨盆扩张的肾脏病理学分数显著降低(表11)。

实施例7：在进行6周的每周静脉内弹丸注射的食蟹猴中的毒性和毒动力学研究

在猴子中进行为期6周的毒理学研究，评估抑制TGF-α和Epiregulin是否会导致皮肤毒性。猴子用载体每周给药10或100mg／kg的抗体I静脉内注射(Iv)，进行6周。注射位点在右侧和左侧隐静脉之间交替。每天供应2餐饲料(早上一次下午一次)。在给药当天，给药后立即提供早上食物配给量。在研究期间，不提供高钙的添加物和零食。在每周六提供每周一次的儿童多种维生素(适当时，在给药后第96小时血液收集后)。

在整个研究过程中，猴子是“分开成对的”饲养在不锈钢板条(slat)／网眼(mesh)笼子中的。在前三周中，动物单独饲养。在剩余的研究中，治疗组的动物在每个午后开始成对饲养至次日早晨，从而提供额外的社会化机会。

对于该研究，未观察到副作用的水平(No-Observed-Adverse-EffectLevel，NOAEL)是100mg／kg抗体I。在治疗动物中未观察到皮肤改变。未观察到任何病理学改变。

Claims

1.结合TGF-α和Epiregulin的抗体，其包含轻链和重链，其中轻链包含轻链可变区(LCVR)，重链包含重链可变区(HCVR)，其中LCVR包含氨基酸序列LCDR1、LCDR2和LCDR3，HCVR包含氨基酸序列HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中LCDR1是SEQIDNO:4、LCDR2是SEQIDNO:5、LCDR3是SEQIDNO:6、HCDR1是SEQIDNO:1、HCDR2是SEQIDNO:2，和HCDR3是SEQIDNO:3。

2.权利要求1的抗体，其中LCVR的氨基酸序列是SEQIDNO:9或SEQIDNO:10。

3.权利要求1或2的抗体，其中HCVR的氨基酸序列是SEQIDNO:7。

4.权利要求1或2的抗体，其中LCVR的氨基酸序列是SEQIDNO:9，HCVR的氨基酸序列是SEQIDNO:7。

5.权利要求1或2的抗体，其中轻链的氨基酸序列是SEQIDNO:13或SEQIDNO:14。

6.权利要求1或2的抗体，其中重链的氨基酸序列是SEQIDNO:12。

7.权利要求1或2的抗体，其包含两条轻链和两条重链，其中每条轻链的氨基酸序列是SEQIDNO:13，其中每条重链的氨基酸序列是SEQIDNO:12。

8.权利要求1或2的抗体，其包含两条轻链和两条重链，其中每条轻链的氨基酸序列是SEQIDNO:14，其中每条重链的氨基酸序列是SEQIDNO:12。

9.药物组合物，其包含权利要求1-8的任一项的抗体，和至少一种可药用的载体、稀释剂或赋形剂。

10.权利要求1-8的任一项的抗体在制备用于治疗患者的糖尿病肾病的药物组合物中的用途。

11.权利要求1-8的任一项的抗体，其用于治疗。

12.权利要求1-8的任一项的抗体，其用于治疗糖尿病肾病。

13.权利要求1-8的任一项的抗体的抗原结合片段，其中所述片段包含如权利要求1所定义的LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3，并且选自Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段和单链Fv片段。

14.药物组合物，其包含权利要求13的抗原结合片段和至少一种可药用的载体、稀释剂或赋形剂。

15.权利要求13的抗原结合片段在制备用于治疗患者的糖尿病肾病的药物组合物中的用途。

16.权利要求13的抗原结合片段，其用于治疗。

17.权利要求13的抗原结合片段，其用于治疗糖尿病肾病。