JP2010526544A - 収率及び免疫原性を高めた組換えタンパク質発現系 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図1
Description
本質的に配列番号1のタンパク質形質導入ドメインをコードするヌクレオチド配列と、Hsp40−Jドメインをコードするヌクレオチド配列と、標的タンパク質をコードするヌクレオチド配列とから成る核酸セグメントを含む発現ベクターを構築すること(前記核酸セグメントが宿主細胞特異的な転写調節要素と翻訳調節要素とに操作可能に連結されている)、
前記発現ベクターで前記宿主細胞を形質転換すること、並びに
組換え標的タンパク質を宿主細胞から回収及び単離することを含む。
a.キメラタンパク質のN末端に、タンパク質形質導入ドメイン(PTD)又はHIV Tat PTD活性を有するその断片を含有する第1のポリペプチジル断片と、
b.第1のポリペプチジル断片のC末端に、Jドメイン又は熱ショックタンパク質70(Hsp70)非相互作用活性を有するその断片を含有する第2のポリペプチジル断片と、
c.第2のポリペプチジル断片のC末端に、標的タンパク質又はポリペプチドを含有する第3のポリペプチジル断片とを含む、キメラタンパク質を提供する。
a.タンパク質形質導入ドメイン(PTD)又はHIV Tat PTD活性を有するその断片をコードする第1のDNA配列と、
b.Jドメイン又は熱ショックタンパク質70(Hsp70)非相互作用活性を有するその断片をコードする、第1のDNA配列と翻訳フレームで連結した第2のDNA配列と、
c.標的タンパク質又はポリペプチドをコードする、第2のDNA配列と翻訳フレームで連結した第3のDNA配列とを含む、キメラ遺伝子を提供する。
a.タンパク質形質導入ドメイン(PTD)又はHIV Tat PTD活性を有するその断片をコードする第1のDNA配列と、
b.Jドメイン又は熱ショックタンパク質70(Hsp70)非相互作用活性を有するその断片をコードする、第1のDNA配列と翻訳フレームで連結した第2のDNA配列とを含む、さらに別のキメラ遺伝子を提供する。
本質的に配列番号1のタンパク質形質導入ドメインをコードするヌクレオチド配列と、Hsp40−Jドメインをコードするヌクレオチド配列と、標的タンパク質をコードするヌクレオチド配列とから成る核酸セグメントを含む発現ベクターを構築すること(核酸セグメントが宿主細胞特異的な転写調節要素と翻訳調節要素とに操作可能に連結される)、
前記発現ベクターで前記宿主細胞を形質転換すること、並びに
組換え標的タンパク質を宿主細胞から回収及び単離することを含む。
a.キメラタンパク質のN末端に、タンパク質形質導入ドメイン(PTD)又はHIV Tat PTD活性を有するその断片を含有する第1のポリペプチジル断片と、
b.第1のポリペプチジル断片のC末端に、Jドメイン又は熱ショックタンパク質70(Hsp70)非相互作用活性を有するその断片を含有する第2のポリペプチジル断片と、
c.第2のポリペプチジル断片のC末端に、標的タンパク質又はポリペプチドを含有する第3のポリペプチジル断片とを含む、キメラタンパク質を提供する。
a.タンパク質形質導入ドメイン(PTD)又はHIV Tat PTD活性を有するその断片をコードする第1のDNA配列と、
b.Jドメイン又は熱ショックタンパク質70(Hsp70)非相互作用活性を有するその断片をコードする、第1のDNA配列と翻訳フレームで連結した第2のDNA配列と、
c.標的タンパク質又はポリペプチドをコードする、第2のDNA配列と翻訳フレームで連結した第3のDNA配列とを含む、キメラ遺伝子を提供する。
a.タンパク質形質導入ドメイン(PTD)又はHIV Tat PTD活性を有するその断片をコードする第1のDNA配列と、
b.Jドメイン又は熱ショックタンパク質70(Hsp70)非相互作用活性を有するその断片をコードする、第1のDNA配列と翻訳フレームで連結した第2のDNA配列とを含む、さらに別のキメラ遺伝子を提供する。
pET22bプラスミド(Novagen, Madison, Wis.)を用いて、配列番号1のタンパク質形質導入ドメインをコードするヌクレオチド配列と、配列番号3のHsp40−Jドメインをコードするヌクレオチド配列と、標的タンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含むpET22b−PTD−J1ベクターを作製した。ここで、核酸セグメントは、宿主細胞において組換え標的タンパク質を発現するために、宿主特異的な転写調節要素と翻訳調節要素とに操作可能に連結している。大腸菌に対するPTDの最適化コドンをコードするオリゴヌクレオチドは、以下の表Iに列挙される配列番号5及び配列番号6のプライマーを使用して化学合成した。NdeIとBamHIとで同時に消化したpET22bプラスミドに挿入するために、二本鎖形態にアニーリングする前、これらの2つのオリゴヌクレオチドの5’末端をポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化し、ウシ腸アルカリホスファターゼ(CIAP)で脱リン酸化して、pET22b−PTD1を作製した。
オリゴヌクレオチドセットを用いて、コドンが最適化されたcDNAを合成した。0.5μMのF1及びR1と、0.05μMのF2、F3、R3、R2等を、PCR反応混合液中で調整した。反応条件は、94℃で2分、その後94℃で20秒/40℃で40秒/72℃で20秒を20サイクル、及び72℃で5分の伸長であった。プラスミドDNA単離及びDNAシークエンシングのために、PCR産物をpGEM−T Easyにクローン化した。
pET22b−PTD−J−Agベクターを大腸菌ロゼッタ株(Novagen)のコンピテントセルに形質転換した。1mMのIPTGを導入する前にOD600=0.3になるまで、アンピシリンとクロラムフェニコールとに耐性がある大腸菌コロニーをTYD培地(1L当たり10g トリプトン/20g 酵母エキス/5g NaCl/2g デキストロース、pH7.2)中で、培養及び増幅させた。細胞試料を列挙する時間割で回収した。
マウスを、TiterMAX Goldアジュバントで乳化したポリペプチド50μgにより皮下で免疫付与した。2週間ごとに追加免疫(Boosts)を実施した。マウスの血清を回収し、ポリペプチドに対する抗体を産生させた。
段階希釈した組換えタンパク質又は合成ポリペプチドをPVDF膜上にスポットした(spotted)。5%脱脂乳のTBSN(25mMのトリスHCl、pH7.4/150mMのNaCl/0.02% Tween20)で1時間、膜をブロッキングした。TBSNで4回洗浄した後、一晩インキュベートするために1000倍に希釈したマウス抗血清中に膜を浸した。TBSNで4回洗浄することによって、結合されていない一次抗体(Ab)を取り除いた後、HRP結合ヤギ抗マウス二次Ab(2000倍希釈)を4時間適用した。製造業者の取扱説明書に記載されるように、化学発光キット(Pierce)によって、洗浄膜上でタンパク質の標識を実施した。
アセンブリPCRで使用するオリゴヌクレオチドを表IIIに列挙した。これらのオリゴヌクレオチドを用いて、配列番号18(SSSTQASLEI DSLFEGIDFY TSITRARFEE LCSDLFRSTL EPVEKALRDA KLDKAQI)のHAPA1AペプチドIをコードする配列番号17のコドンが最適化されたcDNAを合成した。コドンが最適化されたcDNA配列を、実施例1に従って構築した発現ベクターpET22b−PTD−Jに挿入した。
アセンブリPCRで使用するオリゴヌクレオチドを表IVに列挙した。これらのオリゴヌクレオチドを用いて、配列番号26(NVTATDKSTG KANKITITND KGRLSKEEIE RMVQEAEKYK AEDEVQRERV SAKNALESYA F)のHAPA1AペプチドIIをコードする配列番号25のコドンが最適化されたcDNAを合成した。コドンが最適化されたcDNA配列を、実施例1に従って構築した発現ベクターに挿入した。
アセンブリPCRで使用するオリゴヌクレオチドを表Vに列挙した。これらのオリゴヌクレオチドを用いて、配列番号35(EDEGLKGKIS EADKKKVLDK CQEVISWLDA NTLAEKDEFE HKRKELEQVC NPIISGLYQG A)のHSPA1AペプチドIIIをコードする配列番号34のコドンが最適化されたcDNAを合成した。コドンが最適化されたcDNA配列を、実施例1に従って構築した発現ベクターに挿入した。
アセンブリPCRで使用するオリゴヌクレオチドを表VIに列挙した。これらのオリゴヌクレオチドを用いて、配列番号44(GPETLCGAEL VDALQFVCGD RGFYFSKPTG YGSSSAALHH KGIVDECCFQ SCDLRRLEMY CAPIKPPKSA)のニワトリIGF−Iをコードする配列番号43のコドンが最適化されたcDNAを合成した。コドンが最適化されたcDNA配列を、実施例1に従って構築した発現ベクターに挿入した。
PCRに使用するプライマー対を表VIIに列挙した。これらのプライマーを用いて、配列番号53のHA−RBDをコードする配列番号52の天然ウイルスcDNAを合成した。cDNA配列を、実施例1に従って構築した発現ベクターに挿入した。
PCRに使用するプライマー対を表VIIIに列挙した。これらのプライマーを用いて、配列番号57のHCVコアタンパク質をコードする配列番号56の天然ウイルスcDNAを合成した。cDNA配列を、実施例1に従って構築した発現ベクターに挿入した。
PCRに使用するプライマー組を表IXに列挙した。これらのプライマーを用いて、配列番号61のHpNCタンパク質をコードする配列番号60のヒトハプトグロビン融合ペプチドHpNCをコードするコドンが最適化されたcDNA配列を合成した。ヒトハプトグロビンα鎖の融合ペプチドHpNCは、ハプトグロビンの成熟分泌されたα1及びα2ペプチドに存在するN末端のDSGNDVTDIADDGペプチドと、リンカーGSGGのテトラペプチドと、未熟ハプトグロビンα鎖にしか存在しないC末端のRHYEGSTVPEKKTPKSペプチドとから成っていた。コドンが最適化されたcDNA配列を、実施例1に従って構築した発現ベクターpET22b−PTD−Jに挿入した。
NP−1(配列番号67)をコードするコドンが最適化されたcDNA配列を合成し、実施例1に記載の方法に従って構築した発現ベクターpET22b−PTD−Jに挿入した。実施例2に記載のように、組換えpET22b−PTD−J−NP−1をコードした核酸セグメントを有する発現ベクターを大腸菌に導入した。また、組換えNP−1(配列番号68)を大腸菌から回収及び単離した。
配列番号2:ヒト免疫不全ウイルスTat PTD1
配列番号3:HSP40Jドメイン(J1)
配列番号4:HSP40Jドメイン(J1)−コード配列
配列番号5:PTD1の合成の為のフォワードプライマーPTD1 f
配列番号6:PTD1の合成の為のフォワードプライマーPTD1 r
配列番号7:HSP40Jドメインの合成の為のフォワードプライマーJ1 nBF1
配列番号8:HSP40Jドメインの合成の為のフォワードプライマーnF2
配列番号9:HSP40Jドメインの合成の為のフォワードプライマーF3
配列番号10:HSP40Jドメインの合成の為のフォワードプライマーF4
配列番号11:HSP40Jドメインの合成の為のフォワードプライマーF5
配列番号12:HSP40Jドメインの合成の為のフォワードプライマーF6
配列番号13:HSP40Jドメインの合成の為のリバースプライマーEcoR1 R1
配列番号14:HSP40Jドメインの合成の為のリバースプライマーR2
配列番号15:HSP40Jドメインの合成の為のリバースプライマーR3
配列番号16:HSP40Jドメインの合成の為のリバースプライマーR4
配列番号17:ヒトHSPA1Aペプチド I−コード配列
配列番号18:ヒトHSPA1Aペプチド
配列番号19:HSPA1AペプチドIの合成の為のフォワードプライマーRI−I−f1
配列番号20:HSPA1AペプチドIの合成の為のフォワードプライマーI−f2
配列番号21:HSPA1AペプチドIの合成の為のフォワードプライマーI−f3
配列番号22:HSPA1AペプチドIの合成の為のリバースプライマーI−r3
配列番号23:HSPA1AペプチドIの合成の為のリバースプライマーI−r2
配列番号24:HSPA1AペプチドIの合成の為のリバースプライマーXho−I−r1
配列番号25:ヒトHSPA1Aペプチド II−コード配列
配列番号26:ヒトHSPA1Aペプチド II
配列番号27:HSPA1AペプチドIIの合成の為のフォワードプライマーRI−II−f1
配列番号28:HSPA1AペプチドIIの合成の為のフォワードプライマーII−f2
配列番号29:HSPA1AペプチドIIの合成の為のフォワードプライマーII−f3
配列番号30:HSPA1AペプチドIIの合成の為のフォワードプライマーII−f4
配列番号31:HSPA1AペプチドIIの合成の為のリバースプライマーII−r3
配列番号32:HSPA1AペプチドIIの合成の為のリバースプライマーII−r2
配列番号33:HSPA1AペプチドIIの合成の為のリバースプライマーXho−II−r1
配列番号34:ヒトHSPA1Aペプチド III−コード配列
配列番号35:ヒトHSPA1Aペプチド III
配列番号36:HSPA1AペプチドIIIの合成の為のフォワードプライマーRI−III−f1
配列番号37:HSPA1AペプチドIIIの合成の為のフォワードプライマーIII−f2
配列番号38:HSPA1AペプチドIIIの合成の為のフォワードプライマーIII−f3
配列番号39:HSPA1AペプチドIIIの合成の為のフォワードプライマーIII−f4
配列番号40:HSPA1AペプチドIIIの合成の為のリバースプライマーIII−r3
配列番号41:HSPA1AペプチドIIIの合成の為のリバースプライマーIII−r2
配列番号42:HSPA1AペプチドIIIの合成の為のリバースプライマーIII−r1
配列番号43:ニワトリIGF−1 コード配列
配列番号44:ニワトリIGF−1
配列番号45:cIGF−Iの合成の為のフォワードプライマーRI−F1
配列番号46:cIGF−Iの合成の為のフォワードプライマーF2
配列番号47:cIGF−Iの合成の為のフォワードプライマーF3
配列番号48:cIGF−Iの合成の為のフォワードプライマーF4
配列番号49:cIGF−Iの合成の為のフォワードプライマーF5
配列番号50:cIGF−Iの合成の為のリバースプライマーR2
配列番号51:cIGF−Iの合成の為のリバースプライマーXho−R1
配列番号52:トリインフルエンザHA(H5)RBD−コード配列
配列番号53:トリインフルエンザHA(H5)RBD
配列番号54:トリインフルエンザHA RBDの合成の為のフォワードプライマーRI HA−RBD f
配列番号55:トリインフルエンザHA RBDの合成の為のリバースプライマーXho HA−RBD r
配列番号56:C型肝炎ウイルスコアタンパク質−コード配列
配列番号57:C型肝炎ウイルスコアタンパク質
配列番号58:HCV−コアタンパク質の為のフォワードプライマーRI−コアf
配列番号59:HCV−コアタンパク質の為のリバースプライマーXho−コアr
配列番号60:ヒトハプトグロビン融合ポリペプチドHpNCをコードする融合遺伝子
配列番号61:ヒトハプトグロビン融合ポリペプチドHpNC
配列番号62:ヒトハプトグロビン融合ポリペプチドHpNCの為のフォワードプライマーRI−F1
配列番号63:ヒトハプトグロビン融合ポリペプチドHpNCの為のフォワードプライマーF2
配列番号64:ヒトハプトグロビン融合ポリペプチドHpNCの為のフォワードプライマーF3
配列番号65:ヒトハプトグロビン融合ポリペプチドHpNCの為のリバースプライマーR2
配列番号66:ヒトハプトグロビン融合ポリペプチドHpNCの為のリバースプライマーXho−R1
配列番号67:ウサギ好中球ペプチド−1(NP−1)をコードするcDNA
配列番号68:ウサギ好中球ペプチド−1(NP−1)
Claims (44)
- 宿主細胞における組換え標的タンパク質の発現系であって、本質的に配列番号1のタンパク質形質導入ドメインをコードするヌクレオチド配列と、Hsp40−Jドメインをコードするヌクレオチド配列と、標的タンパク質をコードするヌクレオチド配列とから成る核酸セグメントを含み、該核酸セグメントが前記宿主細胞において、前記組換え標的タンパク質を発現するために、宿主特異的な転写調節要素と翻訳調節要素とに操作可能に連結されている、発現系。
- 前記タンパク質形質導入ドメインをコードする前記ヌクレオチド配列が配列番号2のヌクレオチド配列を含む、請求項1に記載の発現系。
- 前記配列番号2のヌクレオチド配列を、配列番号5及び配列番号6のオリゴヌクレオチドを使用することによって合成する、請求項2に記載の発現系。
- 前記HSP40Jドメインが、亜型A、亜型B及び亜型CのHSP40Jドメインから成る群から選択される、請求項1に記載の発現系。
- 前記HSP40Jドメインが配列番号3のペプチドを含む、請求項4に記載の発現系。
- 前記HSP40Jドメインをコードする前記ヌクレオチド配列が配列番号4のヌクレオチド配列を含む、請求項5に記載の発現系。
- 前記配列番号4のヌクレオチド配列を、配列番号7〜配列番号16のオリゴヌクレオチドを使用することによって合成する、請求項6に記載の発現系。
- 前記宿主細胞が大腸菌を含む、請求項1に記載の発現系。
- 前記標的タンパク質が、HSPペプチド、成長因子、ウイルス受容体結合ドメイン、及びウイルスコアタンパク質の少なくとも1つを含む、請求項1に記載の発現系。
- 請求項1に記載の発現系を用いて製造される組換えタンパク質。
- 請求項10に記載の組換えタンパク質を含むワクチン。
- 宿主細胞において収率を高めて組換え標的タンパク質を製造する方法であって、
本質的に配列番号1のタンパク質形質導入ドメインをコードするヌクレオチド配列と、Hsp40−Jドメインをコードするヌクレオチド配列と、標的タンパク質をコードするヌクレオチド配列とから成る核酸セグメントを含む発現ベクターを構築すること(該核酸セグメントが宿主細胞特異的な転写調節要素と翻訳調節要素とに操作可能に連結される)、
前記発現ベクターで前記宿主細胞を形質転換すること、並びに
前記組換え標的タンパク質を前記宿主細胞から回収及び単離することを含む、方法。 - 前記タンパク質形質導入ドメインをコードする前記ヌクレオチド配列が配列番号2のヌクレオチド配列を含む、請求項12に記載の方法。
- 前記配列番号2のヌクレオチド配列を、配列番号5及び配列番号6のオリゴヌクレオチドを使用することによって合成する、請求項13に記載の方法。
- 前記HSP40Jドメインが、亜型A、亜型B及び亜型CのHSP40Jドメインから成る群から選択される、請求項12に記載の方法。
- 前記HSP40Jドメインが配列番号3のペプチドを含む、請求項15に記載の方法。
- 前記HSP40Jドメインをコードする前記ヌクレオチド配列が配列番号4のヌクレオチド配列を含む、請求項16に記載の方法。
- 前記配列番号4のヌクレオチド配列を、配列番号7〜配列番号16のオリゴヌクレオチドを使用することによって合成する、請求項17に記載の方法。
- 前記宿主細胞が大腸菌を含む、請求項12に記載の方法。
- 前記標的タンパク質が、HSPペプチド、成長因子、ウイルス受容体結合ドメイン、及びウイルスコアタンパク質の少なくとも1つを含む、請求項12に記載の方法。
- 免疫原性を高めた組換え標的タンパク質を製造する方法であって、
本質的に配列番号1のタンパク質形質導入ドメインをコードするヌクレオチド配列と、Hsp40−Jドメインをコードするヌクレオチド配列と、標的タンパク質をコードするヌクレオチド配列とから成る核酸セグメントを含む発現ベクターを構築すること(該核酸セグメントが宿主特異的な転写調節要素と翻訳調節要素とに操作可能に連結される)、
前記発現ベクターで前記宿主細胞を形質転換すること、並びに
前記組換え標的タンパク質を前記宿主細胞から回収及び単離することを含む、方法。 - 生物を前記組換えタンパク質により免疫付与することをさらに含む、請求項21に記載の方法。
- 前記タンパク質形質導入ドメインをコードする前記ヌクレオチド配列が配列番号2のヌクレオチド配列を含む、請求項21に記載の方法。
- 前記配列番号2のヌクレオチド配列を、配列番号5及び配列番号6のオリゴヌクレオチドを使用することによって合成する、請求項23に記載の方法。
- 前記HSP40Jドメインが、亜型A、亜型B及び亜型CのHSP40Jドメインから成る群から選択される、請求項24に記載の方法。
- 前記HSP40Jドメインが配列番号3のペプチドを含む、請求項25に記載の方法。
- 前記HSP40Jドメインをコードする前記ヌクレオチド配列が配列番号4のヌクレオチド配列を含む、請求項26に記載の方法。
- 前記配列番号4のヌクレオチド配列を、配列番号7〜配列番号16のオリゴヌクレオチドを使用することによって合成する、請求項27に記載の方法。
- 前記宿主細胞が大腸菌を含む、請求項21に記載の方法。
- 前記標的タンパク質が、HSPペプチド、成長因子、ウイルス受容体結合ドメイン、及びウイルスコアタンパク質の少なくとも1つを含む、請求項21に記載の方法。
- キメラタンパク質であって、
a.前記キメラタンパク質のN末端に、タンパク質形質導入ドメイン(PTD)又はHIV Tat PTD活性を有するその断片を含有する第1のポリペプチジル断片と、
b.前記第1のポリペプチジル断片のC末端に、Jドメイン又は熱ショックタンパク質70(Hsp70)非相互作用活性を有するその断片を含有する第2のポリペプチジル断片と、
c.前記第2のポリペプチジル断片のC末端に、標的タンパク質又はポリペプチドを含有する第3のポリペプチジル断片とを含む、キメラタンパク質。 - 前記第1のポリペプチジル断片が配列番号1に記載のアミノ酸配列を含む、請求項31に記載のキメラタンパク質。
- 前記第2のポリペプチジル断片が配列番号3に記載のアミノ酸配列を含む、請求項31に記載のキメラタンパク質。
- 前記Jドメインがヒト熱ショックタンパク質40由来である、請求項31に記載のキメラタンパク質。
- キメラ遺伝子であって、
a.タンパク質形質導入ドメイン(PTD)又はHIV Tat PTD活性を有するその断片をコードする第1のDNA配列と、
b.Jドメイン又は熱ショックタンパク質70(Hsp70)非相互作用活性を有するその断片をコードする、前記第1のDNA配列と翻訳フレームで連結した第2のDNA配列と、
c.標的タンパク質又はポリペプチドをコードする、前記第2のDNA配列と翻訳フレームで連結した第3のDNA配列とを含む、キメラ遺伝子。 - タンパク質形質導入ドメイン(PTD)をコードする前記第1のDNA配列が配列番号1に記載のアミノ酸配列を含む、請求項35に記載のキメラ遺伝子。
- Jドメインをコードする前記第2のDNA配列が配列番号3に記載のアミノ酸配列を含む、請求項35に記載のキメラ遺伝子。
- タンパク質形質導入ドメイン(PTD)をコードする前記第1のDNA配列が配列番号1に記載のアミノ酸配列を含むと共に、Jドメインをコードする前記第2のDNA配列が配列番号3に記載のアミノ酸配列を含む、請求項35に記載のキメラ遺伝子。
- 前記Jドメインがヒト熱ショックタンパク質40由来である、請求項35に記載のキメラ遺伝子。
- キメラ遺伝子であって、
a.タンパク質形質導入ドメイン(PTD)又はHIV Tat PTD活性を有するその断片をコードする第1のDNA配列と、
b.Jドメイン又は熱ショックタンパク質70(Hsp70)非相互作用活性を有するその断片をコードする、前記第1のDNA配列と翻訳フレームで連結した第2のDNA配列とを含む、キメラ遺伝子。 - タンパク質形質導入ドメイン(PTD)をコードする前記第1のDNA配列が配列番号1に記載のアミノ酸配列を含む、請求項40に記載のキメラ遺伝子。
- Jドメインをコードする前記第2のDNA配列が配列番号3に記載のアミノ酸配列を含む、請求項40に記載のキメラ遺伝子。
- タンパク質形質導入ドメイン(PTD)をコードする前記第1のDNA配列が配列番号1に記載のアミノ酸配列を含むと共に、Jドメインをコードする前記第2のDNA配列が配列番号3に記載のアミノ酸配列を含む、請求項40に記載のキメラ遺伝子。
- 前記Jドメインがヒト熱ショックタンパク質40由来である、請求項40に記載のキメラ遺伝子。
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