WO2018092955A1 - 전복에서 유래한 항균 펩타이드 유사체 및 이를 포함하는 항균용 약학 조성물 - Google Patents

전복에서 유래한 항균 펩타이드 유사체 및 이를 포함하는 항균용 약학 조성물 Download PDF

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antimicrobial peptide
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peptide
analog
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서정길
이기영
조상만
이인아
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군산대학교 산학협력단
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    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to an antimicrobial peptide analog derived from Haliotis discus and an antimicrobial pharmaceutical composition comprising the same.
  • hdMolluscidin is an antimicrobial peptide consisting of 46 amino acids with a molecular weight of 4767.2 Da purified from the gills of Haliotis discus , showing strong antimicrobial activity against Gram (+) and Gram (-) bacteria with little hemolytic activity .
  • Albicans is an antimicrobial peptide that shows no activity.
  • the development of new antimicrobial peptides such as designing analogues with increased antimicrobial activity of fragmented length is urgent.
  • Patent Document 1 Korean Patent Registration No. 10-1384578 (Patent Document 1) is disclosed, and Patent Document 1 relates to an antibiotic peptide having a novel amino acid sequence, and more specifically, from abalone.
  • the present invention relates to an isolated antibiotic peptide and a peptide having antimicrobial activity against Escherichia coli or Staphylococcus aureus.
  • Patent Document 1 it is composed of up to 15 amino acids and is commercially available, and does not disclose an abalone-derived antimicrobial peptide analogue that exhibits stronger antimicrobial activity against more various strains.
  • An object of the present invention is to design and provide an antimicrobial peptide analog having excellent antimicrobial activity while reducing the number of amino acids to commercialization using hdMolluscidin, which is a peptide derived from Haliotis discus and having excellent antimicrobial activity.
  • a hydrophobic group consisting of 1 to 3 amino acid residues selected from Alanine (A), Leucine (Leucine, L) and Tryptophan (W); And a hydrophilic group consisting of one or two lysine (Lysine, K) residues, and providing three or four of the hydrophobic groups and two or three of the hydrophilic groups, respectively, by alternating binding.
  • A Alanine
  • Leucine Leucine
  • W Tryptophan
  • the peptide analog may be one that forms an ⁇ -helix structure.
  • the peptide analog may be composed of 8 to 15 amino acid residues.
  • the peptide analog may be one comprising an amino acid sequence consisting of at least one KLLK.
  • the peptide analogue is that if a hydrophobic group is located between hydrophilic groups, and at least one hydrophilic group bound to the hydrophobic group is composed of two lysine (Lysine, K) residues, the amino acid residues of the hydrophobic group is two Can be.
  • the peptide analog may be one having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 11.
  • the antimicrobial peptide analogue may be one in which the C-terminus is amidated or methylated.
  • the antimicrobial peptide analog may be N-terminal acetylation (acylation), acylation (acylation) or palmitoylation (palmitoylation).
  • the peptide analog may be one having an antimicrobial activity to any one or more selected from the group consisting of Gram-positive bacteria, Gram-negative bacteria and yeast.
  • the peptide analogues are Bacillus subtilis , Staphylococcus epidermidis , Staphylococcus mutans , Propionibacterium acnes , E. coli ( E. coli ) D31, E. coli ML35p, Shigella flexneri , Pseudomonas aeruginosa , Vibrio parahaemolyticus and Candida albicans At least one selected from the group can exhibit antimicrobial activity.
  • the present invention provides an antimicrobial pharmaceutical composition comprising the antimicrobial peptide analog as an active ingredient.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of infectious diseases caused by bacteria, comprising the antimicrobial peptide analog as an active ingredient.
  • the present invention provides an antimicrobial cosmetic composition comprising the antimicrobial peptide analog as an active ingredient.
  • the cosmetic composition may be in the form of a solution, powder, emulsion, lotion, spray, ointment, aerosol, cream or foam.
  • the present invention provides an antimicrobial food additive comprising the antimicrobial peptide analog as an active ingredient.
  • a feed additive comprising the antimicrobial peptide analog as an active ingredient.
  • a hygiene article comprising the antimicrobial peptide analog as an active ingredient.
  • the antimicrobial peptide analogue according to the present invention was designed based on the parental peptide hdMolluscidin derived from gills of abalone, and was designed to be commercially available by reducing the number of amino acids.
  • the designed peptide analogs have very good antimicrobial activity despite the reduced amino acid number, high membrane permeability, and low hemolytic activity.
  • Figure 1 shows the sequence of the amino acid sequence of the abalone-derived antibacterial peptide hdMolluscidin and oyster-derived antibacterial peptide cgMolluscidin.
  • Figure 2 shows the amino acid sequence of the abalone-derived antimicrobial peptide hdMolluscidin and the parent peptide portion (fragment 1 and fragment 2) for the design of the antimicrobial peptide analogue according to the present invention.
  • FIG. 2 shows that the peptide analogs form an ⁇ -helix structure.
  • Figure 3 shows the antimicrobial activity of the antimicrobial peptide analogues according to the present invention.
  • Figure 4 shows the results of the measurement of hemolytic activity against human erythrocytes of the antimicrobial peptide analog and piscidin 1 according to the present invention.
  • Figure 5 shows the results of the measurement of the membrane resistance against E. coli of the antimicrobial peptide analog and piscidin 1 according to the present invention.
  • Figure 6 shows the results of the Chromogenic bacteriolytic plate assay of the antimicrobial peptide analogues according to the present invention.
  • Figure 7 shows the results of measuring the MBC (Minimum Bactericidal Concentration) after the MIC measurement for the antimicrobial peptide analog and E. coli of piscidin 1 according to the present invention.
  • FIG. 8 shows the results of a killing kinetics study for E. coli at 1 ⁇ MIC and 5 ⁇ MIC of the antimicrobial peptide analog and piscidin 1 according to the present invention.
  • the present inventors have completed the present invention as a result of earnest research efforts to develop an antimicrobial peptide analog that is excellent in antimicrobial activity and commercialized as derived from haliotis discus .
  • the antimicrobial peptide analogue according to the present invention comprises a hydrophobic group consisting of 1 to 3 amino acid residues selected from alanine (Alanine, A), leucine (Leucine, L) and tryptophan (Tryptophan, W); And a hydrophilic group consisting of one or two lysine (Lysine, K) residues, wherein the three or four hydrophobic groups and the two or three hydrophilic groups are alternately bonded.
  • the peptide analogue according to the present invention is derived from the peptide (hdMolluscidin) extracted and purified from the gills of Haliotis discus , this hdMolluscidin is a peptide with excellent antibacterial activity.
  • hdMolluscidin consists of a total of 46 amino acids, there was a problem that it is difficult to commercialize. Accordingly, the present inventors have developed an antimicrobial peptide analog that is commercially available while maintaining excellent antimicrobial activity as derived from hdMolluscidin, which is a peptide derived from the abalone.
  • the antimicrobial peptide analogue according to the present invention may be to form an ⁇ -helix ( ⁇ -helix) structure.
  • ⁇ -helix ⁇ -helix
  • amphiphilic having both hydrophilicity and hydrophobicity appears. Therefore, it is preferable because the bonding strength is excellent in the hydrophilic part and the permeability is excellent in the hydrophobic part.
  • the predicted second structure of hdMolluscidin is a mixture of random coil structure, ⁇ -helix structure, and ⁇ -sheet structure. Based on the predicted secondary structure, a portion showing an amphiphilic ⁇ -helix structure, which is known as the ideal structure to preferentially exhibit antimicrobial activity, was selected from the hdMolluscidin. In addition, a portion of the N-terminal direction of hdMolluscidin was selected as the parent peptide portion for analog design.
  • each fragment forms an ⁇ -helix structure.
  • amino acid sequence amino acid sequence: AATKPKKAGAEAAP
  • fragment 2 amino acid sequence: KPAKKQTKKKKP
  • each fragment forms an ⁇ -helix structure.
  • amphiphilicity it is not suitable for showing antimicrobial activity, and it is preferable to perform appropriate amino acid substitution so as to be amphiphilic having both hydrophobicity and hydrophilicity.
  • the antimicrobial peptide analog is amphiphilic due to the amino acid substitution, binding to the cell membrane or DNA at the hydrophilic site is facilitated, and the penetration force is facilitated due to the hydrophobic site.
  • lysine (Lysine, K) is a hydrophilic (positive charge) residue and alanine (Alanine, A) is preferably hydrophobic residue.
  • Proline (P), Threonine (T), and Glutamine (Q), on the other hand, are polar but insignificant residues that are not preferred for their antimicrobial activity, so they are substituted with hydrophobic residues or leucine if possible.
  • L) is preferably substituted.
  • tryptophan (W) has high membrane permeability and high resistance to proteolytic enzymes, so if residues such as lysine (K), which are weak to enzymes, are placed next to each other, they are prone to cleavage by proteolytic enzymes. It is preferable to see the reducing effect.
  • Antimicrobial peptide analogue of the present invention is designed by using the fragment 1 or fragment 2 as the parent peptide (parent peptide), which is selected from alanine (Alanine, A), leucine (Lucine, L) and tryptophan (W) It is preferred that the peptide analog is composed of alternating hydrophobic groups consisting of one to three amino acid residues and hydrophilic groups consisting of one or two lysine (K) residues.
  • hydrophobic groups exist in the peptide analogue, and two or three hydrophilic groups exist.
  • the hydrophobic group is preferably bonded to two or more positions selected from the group consisting of the C-terminal, N-terminal and hydrophilic group of the hydrophilic group.
  • a hydrophobic group consists of 2 or less types of amino acid residues.
  • Such antimicrobial peptide analogues according to the invention preferably consist of 8 to 15 amino acid residues. It is also preferred to include an amino acid sequence consisting of at least one KLLK. When the peptide analog comprises an amino acid sequence consisting of the above 'KLLK', it is very advantageous to increase the antimicrobial activity.
  • the antimicrobial peptide analogue of the present invention when a hydrophobic group is located between the hydrophilic group, at least one hydrophilic group bound to the hydrophobic group is composed of two lysine (Lysine, K) residues, the amino acid residue of the hydrophobic group is It is preferable to consist of two.
  • an amino group (-NH 2 ) is added to the C-terminus or a methyl group (-CH 3 ) is added.
  • a methyl group (-CH 3 ) is added.
  • the peptide analog is preferably N-terminal acetylation (palmitoylation) or acetylation (palmitoylation).
  • N-terminal acetylation palmitoylation
  • acetylation palmitoylation
  • the N-terminus of the antimicrobial peptide analog is acetylated, it not only exhibits much better antimicrobial activity than it would otherwise, and protects the peptide from proteolytic degradation, and when palmitoylated, increases permeability into cells. It is preferable because it will.
  • the antimicrobial peptide analogue according to the present invention is excellent in antimicrobial activity, short amino acid sequence is capable of commercialization.
  • the antimicrobial peptide analogue according to the present invention has a strong inner membrane permeability. That is, the antimicrobial peptide analogue according to the present invention is likely to be a mechanism of action that exhibits antimicrobial activity by directly penetrating the inner membrane of bacteria.
  • the antimicrobial peptide analogue according to the present invention does not show hemolytic activity and there is no problem of cytotoxicity.
  • the antimicrobial peptide analogue designed and prepared as described above may have an antimicrobial activity to any one or more selected from the group consisting of bacteria such as Gram-positive bacteria and Gram-negative bacteria and fungi such as yeast and mold.
  • the antimicrobial peptide analogues are four Gram-positive bacteria ( Bacillus subtilis , Staphylococcus epidermidis , Staphylococcus mutans , Propionibacterium arc) Propionibacterium acnes ), 5 Gram-negative bacteria ( E. coli D31, E. coli ML35p, Shigella flexneri , Pseudomonas aeruginosa , Vibrio parahemoli Ticus ( Vibrio parahaemolyticus )) and yeast one ( candida albicans ) can be one having an antimicrobial activity selected from the group consisting of.
  • composition for antibacterial comprises the antimicrobial peptide analogue according to the present invention as an active ingredient.
  • the method of administration of the pharmaceutical composition is not particularly limited, but may be preferably injected into an artery or vein, or subcutaneously, rectally, nasal, or any other parenteral, more preferably, artery or Intravenous or oral administration or directly into muscle cells is preferred.
  • the dosage level selected from the composition will depend on the activity of the compound, the route of administration, the severity of the condition being treated and the condition and previous history of the patient being treated. However, it is within the knowledge of the art to start with a dose of the compound at a lower level than required to achieve the desired therapeutic effect, and gradually increase the dosage until the desired effect is achieved, with the preferred dosage being age, sex , Body shape and weight.
  • the composition may be further processed before being formulated into a pharmaceutically acceptable pharmaceutical formulation, and may preferably be ground or ground into smaller particles.
  • the composition will also vary depending on the condition and the patient being treated, but this can be determined non-originally.
  • the effective dose of the antimicrobial peptide analog of the present invention is 1-2 mg / kg, preferably 0.5-1 mg / kg, and can be administered 1-3 times a day.
  • the dosage does not limit the scope of the invention in any aspect.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is prepared in unit dosage form by formulating with a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient according to a method which can be easily carried out by those skilled in the art. Or may be prepared by incorporation into a multi-dose container.
  • the formulation may be used in any form suitable for pharmaceutical preparations, including powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, oral formulations such as aerosols, external preparations such as ointments, creams, suppositories, and sterile injectable solutions. It may further comprise a dispersant or stabilizer.
  • the antimicrobial peptide analogs include Bacillus subtilis , Staphylococcus epidermidis , Staphylococcus mutans , and Propionibacterium acnes , which exhibit antimicrobial activity.
  • diseases such as food poisoning, Candidaism, typhoid fever, cholera, etc. representatively caused from diseases, including the antimicrobial peptide analogs as an active ingredient to prevent or prevent infectious diseases caused by the bacteria It can be used as a therapeutic pharmaceutical composition.
  • the antimicrobial peptide analog can be used as an active ingredient of the cosmetic composition for antibacterial.
  • the cosmetic composition may be in the form of a solution, powder, emulsion, lotion, spray, ointment, aerosol, cream or foam.
  • the cosmetic composition of the present invention may include an acceptable carrier in the cosmetic preparation.
  • acceptable carriers in cosmetic preparations are compounds or compositions already known and used that may be included in cosmetic preparations, or compounds or compositions that will be developed in the future, which have a toxicity, instability or irritation that is more than acceptable to the human body upon contact with the skin. Say nothing.
  • the carrier may be included in the cosmetic composition of the present invention in an amount of about 1% to about 99.99% by weight, preferably about 90% to about 99.99% by weight of the composition.
  • the carrier include alcohols, oils, surfactants, fatty acids, silicone oils, wetting agents, moisturizers, viscosity modifiers, emulsions, stabilizers, ultraviolet scatterers, ultraviolet absorbers, colorants, fragrances, and the like.
  • Alcohols, oils, surfactants, fatty acids, silicone oils, wetting agents, moisturizers, viscosity modifiers, emulsions, stabilizers, ultraviolet scatterers, ultraviolet absorbers, colorants, fragrances or compounds that can be used as fragrances are already known in the art. As such, those skilled in the art can select and use appropriate substances or compositions.
  • the cosmetic composition according to the present invention may include glycerin, butylene glycol, propylene glycol, polyoxyethylene hardened castor oil, ethanol, triethanolamine, etc., in addition to the peptide analogue, preservatives, fragrances, A coloring agent, purified water, etc. can be contained in a trace amount as needed.
  • the skin in the present invention is not only a face but also includes a scalp and a whole body.
  • a cosmetic composition that can be applied to such a scalp there are shampoos, rinses, treatments, hair regrowths, and the like, and a body cleanser that can be applied to the whole body. It can be prepared in various forms as the use of.
  • antimicrobial peptide analog can be used as an active ingredient of antimicrobial food additives or feed additives.
  • the antimicrobial peptide analogue according to the present invention has excellent antimicrobial activity against fungi as well as gram negative and gram positive bacteria, and can be usefully used as a food additive or feed additive for antibacterial because it is not cytotoxic. .
  • the kind of food There is no particular limitation on the kind of food.
  • foods to which the above substances can be added include dairy products including drinks, meat, sausages, breads, biscuits, rice cakes, chocolates, candy, snacks, pizzas, ramen noodles, other noodles, gums, ice creams, various soups, beverages, Alcoholic beverages and vitamin complexes and the like, and include all of the dietary supplements in the conventional sense.
  • the antimicrobial peptide analogs of the present invention may be added as is to foods or used with other foods or food ingredients and may be suitably used according to conventional methods.
  • the mixing amount of the active ingredient can be suitably determined according to the purpose of use (prevention or improvement).
  • the amount of the antimicrobial peptide analog in the food may be added at 0.1-20% by weight of the total food weight.
  • the amount may be below the above range, and since there is no problem in terms of safety, the active ingredient may be used in an amount above the above range. .
  • antimicrobial peptide analog may be usefully used as an active ingredient in hygiene products such as wet wipes, hand sanitizers, mouthwashes, mouthwashes, toothpaste additives.
  • TAB Tryptic soy broth
  • agarose type I Low EEO Agar
  • Merck Merk, Darmstadt, Germany
  • Sigma Sigma (St. Louis, MO, USA), respectively. It was purchased and used.
  • HPLC water and acetonitrile (CH 3 CN) were used from Tedia (Ohio, USA) for purification of the composite, and all other reagents were used for the express.
  • Each of the designed analogs was made up of 8 to 15 amino acids each, with C-terminal amidation or methylation, N-terminal acetylation or palmitoylation, or It was designed using methods such as amino acid addition, substitution and removal at specific positions.
  • the designed peptide analogs were synthesized and purified at least 95% purity from Peptron Co., Ltd. (Daejeon). Analogs were synthesized by F-moc solid phase synthesis using the peptide synthesizer ASP48S (Peptron, Daejeon Korea) and purified by RP-HPLC using a Shiseido Capcell-Pak C18 column (250 mm ⁇ 4.6 mm, 10 ⁇ m). Purification conditions were carried out with a solvent system of H 2 O-CH 3 CN containing 0.1% (v / v) trifluoroacetic acid at a flow rate of 1 mL / min at 220 nm under a concentration gradient of 3-40%.
  • the strains used in the experiment were four Gram-positive bacteria ( Bacillus subtilis ), Staphylococcus epidermidis , Staphylococcus mutans , and Propionibacterium acnes. ), 5 Gram-negative bacteria ( E. coli D31, E. coli ML35p, Shigella flexneri , Pseudomonas aeruginosa , Vibrio parahemoliticus ( Vibrio) parahaemolyticus )) and one yeast species ( Candida albicans ) were used. Antimicrobial activity was measured by ultrasensitive radial diffusion assay (URDA) using two layers of media containing different concentrations.
  • URDA ultrasensitive radial diffusion assay
  • Strains used for URDA were first pre-cultured for 18 hours at each medium and incubation temperature, followed by a bacterial concentration using a colorimeter (Product No. 52-1210, BioMerieux, Inc., USA). Adjusted to% T (1 ⁇ 10 8 CFU / mL). Subsequently, add 0.5 mL of the diluted solution to each concentration in an underlay gel containing 9.5 mL of 0.03% TSB, 1% Type agarose and 10 mM phosphate buffer (PB) (pH 6.5), mix well and flatten on plate Poured and hardened. A punch was used to stiffen the plate to 2.5 mm diameter wells and then 5 ⁇ L of each analog solution was introduced.
  • PB mM phosphate buffer
  • Hemolytic activity was measured using human red blood cells.
  • An equal amount of phosphate buffered saline (PBS, 50 mM sodium phosphate, 150 mM NaCl, pH 7.4) was added to human blood, mixed, and centrifuged at 8000 x g, 4 minutes for 1 min to remove the supernatant. After repeating this washing process three times, PBS was added so that the obtained red blood cells were 3% hematocrit.
  • 90 ⁇ L of 3% hematocrit was introduced into the e-tube and 10 ⁇ L of each analog solution was added at a concentration of 10 ⁇ L.
  • Each e-tube was reacted at 37 to 1 hour and then centrifuged at 13,000 x g for 4 to 10 minutes. 70 ⁇ L of each supernatant obtained was transferred to a 96-well microtiter plate and the degree of hemoglobin outflow was measured at 405 nm. Triton X-100 (0.1%) was used as an experimental control for 100% hemolysis of erythrocytes, and the hemolytic activity was calculated using the following equation.
  • % Hemolysis [(Abs 405 nm in the peptide solution-Abs 405 nm in buffer) / (Abs 405 nm in 0.1% Triton X-100-Abs 405 nm in buffer)] x 100
  • Bacterial endothelial permeability was measured using the nonmembrane permeative chromogenic substrate O-nitrophenyl- ⁇ -D-galactopyranoside (ONPG) to measure the activity of ⁇ -galactosidase in the cytoplasm of E. coli ML35p.
  • O-nitrophenyl- ⁇ -D-galactopyranoside O-nitrophenyl- ⁇ -D-galactopyranoside
  • E. coli ML35p containing the chromosomal IPTG-induced ⁇ -galactosidase gene was used to confirm the lytic activity of the analogs to bacterial membranes.
  • Chromogenic bacteriolytic plate assay (Mardones, G., Venegas, A. Chromogenic plate assay distinguishing bacteriolytic from bacteriostatic activity of an antibiotic agent. J Microbiol Methods. 2000, 40 (3), 199-). 206).
  • E. coli ML35p was inoculated in 2 mL of TSB and incubated for 16-18 hours at 37.
  • coli ML35p used for the measurement was incubated for 16 hours in the TSB medium to the mid-logarithmic phase, and finally diluted with TSB midium at a homogeneity of 10 6 CFU / mL.
  • 90 ⁇ L of the final diluted bacteria solution was added to each well of a 96-well plate, and then a solution of each analog containing 10 ⁇ L of the desired concentration of x10 was added to each well.
  • the minimum inhibitory concentration was defined as the concentration of analogs added to the wells without any growth after confirming the growth of bacteria.
  • the bacterial solution was taken from each well corresponding to the minimum inhibitory concentration of each analogue, plated on a TSA plate, incubated, and cultured, followed by colony production or bactericidal mechanism. It was confirmed.
  • the killing rate of each analogue determined in the MIC assay was determined for 60 min at concentrations of 1xMIC and 5xMIC.
  • the analogs were added to an e-tube containing 10 6 CFU / mL of E. coli ML35p, followed by incubation at 37 (5, 10, 20, 30, 40, 50, 60 minutes after analog addition). 10 ⁇ L of the reaction solution was taken from each measuring tube and plated on TSA plate and cultured.
  • a state without addition of an analogue and the addition of piscidin 1, an antimicrobial peptide were used.
  • the percent killing of the analogs is expressed as a percentage of the resulting colony number in the absence of the analogs.
  • hdMolluscidin is an antimicrobial peptide, purified from gills of Haliotis discus , consisting of 46 amino acids and having a molecular weight of 4767.2 Da.
  • hdMolluscidin showed high sequence similarity with cgMolluscidin, an antimicrobial peptide derived from sesame gills (FIG. 1).
  • Figure 1 shows the alignment of the amino acid sequence of hdMolluscidin and cgMolluscidin. The conserved sequence in FIG. 1 is shown in black.
  • hdMolluscidin Secondary structural prediction of hdMolluscidin was performed using the GOR method of Expasy tools. As a result, hdMolluscidin was predicted to form a mixed structure in which ⁇ -helix and random structure were mixed (FIG. 2). Based on these results, two positions of the N-terminus (fragment 1 and fragment 2) representing the ⁇ -helix structure were selected as parent regions for analog design.
  • each peptide analogue designed based on the ⁇ -helix structure in the N-terminal direction of hdMolluscidin is shown in Table 1 below.
  • Each analog consists of 8 to 15 amino acid residues. Synthetic analogs were identified by molecular weight measurement.
  • the antimicrobial activity of piscidin 1 (an antimicrobial peptide derived from American hybrid bass), the antimicrobial peptides used as the analogues and the control group, was measured by using the URDA method against bacteria and one yeast.
  • the analogs of the present invention showed strong antimicrobial activity against the measured microorganisms, among which amino acids of SEQ ID NO: 4 (Ab2-5) and SEQ ID NO: 10 (Ab4-7) showed the best antimicrobial activity.
  • the antimicrobial activity of the antimicrobial peptide analogs having the sequence is shown in FIG. 3.
  • the antimicrobial activity against various microorganisms was measured (Tables 2 to 4).
  • the peptide analogs of the present invention showed an antimicrobial activity similar to that of piscidin 1, and in particular, C. albicans showed stronger activity than piscidin 1.
  • the parent peptide hdMolluscidin showed little antimicrobial activity against C. albicans , whereas the antimicrobial peptide analogs of the present invention showed strong antimicrobial activity against C. albicans .
  • hemolytic activity was measured on erythrocytes (blood type B) of humans of piscidin 1, an antimicrobial peptide used as analogues and controls, among which SEQ ID No. 4 and SEQ ID NO: 10 showed good activity.
  • Hemolytic activity of the peptide analog of is shown in FIG. 4 as a specific example.
  • hdMolluscidin analogues of the present invention may be a mechanism of action showing antimicrobial activity by directly penetrating the inner membrane of bacteria.
  • chromogenic bacteriolytic plate assay was performed using E. coli ML35p containing the chromosomal IPTG-inducible ⁇ -galactosidase gene (FIG. 6).
  • streptomycin an antibiotic known to exhibit chromogenic bacteriolytic activity against E. coli ML35p, exhibited a blue edge line, showing bacteriolytic activity, while tetrate, which was known to exhibit no bacteriolytic activity. Tetracycline did not show a blue edge line.
  • piscidin 1 used as a standard also exhibited bacteriolytic activity by showing an edge line
  • peptide analogues of SEQ ID NO: 4 (Ab2-5) and SEQ ID NO: 10 (Ab4-7), which are analogs of the present invention are also shown. It is shown that it has bacetriolytic activity by showing a blue edge line.
  • MIC minimum inhibitory concentration
  • MBC minimum bactericidal concentration
  • MIC Microbes Gram Minimum Inhibitory Concentration
  • MCC Microbes Gram Minimum Bactericidal Concentration
  • MCC Microbes Gram Minimum Bactericidal Concentration
  • MCC Microbes Gram Minimum Bactericidal Concentration
  • the present inventors designed peptide analogs based on hdMolluscidin, an antimicrobial peptide purified from gills of Korean abalone, in order to select a new antimicrobial peptide analogue having a fragmented length and improved activity from a parent antimicrobial peptide of primary structure. Synthesized. Peptide analogs of the present invention select a region located in the N-terminal direction of hdMolluscidin as a parent region to replace, add, or remove amino acids, amidate or methylate the C-terminus and / or acetylate or palmitate the N-terminus. It is designed in a way to toilize.
  • the peptide analogs of the present invention showed strong antimicrobial activity, and showed little hemolytic activity against erythrocytes in the concentration range of the antimicrobial activity.
  • the peptide analogs of the present invention were found to exhibit antimicrobial activity by making pores in the membrane by directly penetrating the inner membrane and then killing the bacteria. The experimental results of this study should be further researched, but can replace the existing antibiotics.
  • the airtight cloth was filled to prepare a powder.
  • tablets were prepared by tableting according to a conventional method for producing tablets.
  • the capsule was prepared by filling in gelatin capsules according to the conventional method for producing a capsule.
  • each component is added to the purified water to dissolve, the lemon flavor is added appropriately, the above components are mixed, and then purified water is added to adjust the total amount to 100 ml, and then filled into a brown bottle and sterilized. Prepared.
  • the peptide analog of the present invention was dissolved in an appropriate volume of main sodium chloride BP, the pH of the resulting solution was adjusted to pH7.6 with dilute hydrochloric acid BP, and the volume was adjusted with a main volume of sodium chloride BP and mixed well. .
  • the solution was filled into a 5 ml Type I ampoule of clear glass, dissolved under glass, enclosed under an upper grid of air, and autoclaved sterilization at 120 to 15 minutes to prepare an injection solution.
  • an antimicrobial nutrient for longevity comprising the peptide analog of the present invention
  • it can be combined according to the preparation method in the conventional cosmetic field as shown in Table 12 below.
  • an antibacterial face wash comprising the peptide analog of the present invention
  • it may be formulated according to the preparation method in the conventional cosmetic field by combining as described in Table 13 below.
  • an antimicrobial nutritional cream comprising a peptide analog of the present invention
  • it is prepared according to the preparation method in the conventional cosmetic field as described in Table 14 below.

Abstract

본 발명은 전복에서 유래한 항균 펩타이드 유사체 및 이를 포함하는 항균용 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 항균 펩타이드 유사체는 전복의 아가미로부터 유래하는 펩타이드인 hdMolluscidin을 가지고 디자인한 것이며, 아미노산의 수를 절감하여 상용화가 가능하게 디자인 하였다. 또한 절감된 아미노산에 불구하고 항균 활성이 우수한 항균 펩타이드 유사체이다. 뿐만 아니라 상기 항균 펩타이드 유사체는 막 투과성이 낮고, 용혈 활성 또한 낮다.

Description

전복에서 유래한 항균 펩타이드 유사체 및 이를 포함하는 항균용 약학 조성물
본 발명은 전복(Haliotis discus)에서 유래한 항균 펩타이드 유사체 및 이를 포함하는 항균용 약학 조성물에 관한 것이다.
hdMolluscidin은 전복(Haliotis discus)의 아가미에서 정제된 4767.2 Da의 분자량을 가진 46개의 아미노산으로 구성된 항균 펩타이드로서 용혈활성은 거의 없으면서 Gram(+)와 Gram(-) bacteria에 대해서 강한 항균활성을 보이지만 C. albicans에는 활성을 나타내지 않는 항균 펩타이드이다. 이러한 hdMolluscidin이 가진 활성의 제한성과 46개의 아미노산으로 구성된 길이의 한계성을 극복하기 위해 단편화된 길이의 항균 활성이 증가된 유사체를 디자인하는 것과 같은 새로운 항균 펩타이드의 개발이 절실하다.
최근의 연구에서는 굴과 홍합의 아가미 및 외투막에는 외부 감염원에 대한 효율적인 방어 기작의 하나로서 항균활성 펩타이드가 중요한 역할을 담당한다는 것이 보고가 되고 있다. 이러한 결과는 외부 환경에 대한 일차 방어 역할을 담당하는 아가미와 외투막은 조개류의 면역 기작에서 중요한 역할을 담당하는 기관으로서, 선천 면역의 기능을 수행하는 항균활성 물질의 탐색 및 정제에 대한 연구에 중요한 대상이 됨을 의미하는 것이지만, 이를 주요 대상으로 하여 신규 항균 펩타이드를 개발하려는 노력은 아직 많이 부족한 실정이다.
본 발명과 관련된 선행기술문헌으로는 대한민국 등록특허 제10-1384578호(특허문헌 1)가 개시되어 있으며, 상기 특허문헌 1은 신규한 아미노산 서열을 갖는 항생 펩타이드에 관한 것이고, 보다 상세하게는 전복으로부터 분리된 항생 펩타이드에 관한 것으로서 대장균 또는 황색포도상구균에 대하여 항균 활성이 있는 펩타이드에 관한 것이다. 이러한 특허문헌 1에서는 15개 이하의 아미노산으로 구성되어 상용화가 가능하고, 더욱 다양한 균주에 대하여 더욱 강한 항균 활성을 나타내는 전복 유래 항균 펩타이드 유사체에 관하여는 개시하고 있지 않다.
본 발명은 전복(Haliotis discus)으로부터 유래하며 항균 활성이 우수한 펩타이드인 hdMolluscidin을 이용하여, 상용화가 가능할 정도로 아미노산의 수를 절감하면서도 항균 활성이 우수한 항균 펩타이드 유사체를 디자인하여 제공하는 것에 목적이 있다.
본 발명은 바람직한 제1구현예로서, 알라닌(Alanine, A), 류신(Leucine, L) 및 트립토판(Tryptophan, W) 중에서 선택되는 1 내지 3개의 아미노산 잔기로 이루어진 소수성 그룹; 및 라이신(Lysine, K) 잔기 1개 또는 2개로 이루어진 친수성 그룹;을 포함하고, 3개 또는 4개의 상기 소수성 그룹과 2개 또는 3개의 상기 친수성 그룹이 각각 교대로 결합하여 이루어진 항균 펩타이드 유사체를 제공한다.
상기 펩타이드 유사체는 α-헬릭스(α-helix) 구조를 형성하는 것일 수 있다.
또한, 상기 펩타이드 유사체는 8 내지 15개의 아미노산 잔기로 이루어진 것일 수 있다.
상기 펩타이드 유사체는 적어도 하나 이상의 KLLK로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
또한, 상기 펩타이드 유사체는 친수성 그룹의 사이에 소수성 그룹이 위치하고, 상기 소수성 그룹과 결합된 적어도 하나 이상의 친수성 그룹이 라이신(Lysine, K) 잔기 2개로 이루어진 경우, 상기 소수성 그룹의 아미노산 잔기는 2개인 것일 수 있다.
또한, 상기 펩타이드 유사체는 서열번호 1 내지 서열번호 11으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 항균 펩타이드 유사체는 C-말단이 아미드화(amidation) 또는 메틸화(methylation) 된 것일 수 있다.
상기 항균 펩타이드 유사체는 N-말단이 아세틸화(acetylation), 아실화(acylation) 또는 팔미토일화(palmitoylation) 된 것일 수 있다.
또한, 상기 펩타이드 유사체는 그람 양성균, 그람 음성균 및 효모(yeast)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상에 항균 활성을 갖는 것일 수 있다.
상기 펩타이드 유사체는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스타필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis), 스타필로코커스 뮤탄스(Staphylococcus mutans), 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes)), 대장균(E. coli) D31, 대장균(E. coli) ML35p, 시겔라 플렉스네리(Shigella flexneri), 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 비브리오 파라헤몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus) 및 칸디다 알비칸스(Candida albicans)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상에 항균 활성을 나타낼 수 있다.
본 발명은 바람직한 제2구현예로서, 상기 항균 펩타이드 유사체를 유효성분으로 포함하는 항균용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 바람직한 제3구현예로서, 상기 항균 펩타이드 유사체를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 세균으로 인한 감염성 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 바람직한 제4구현예로서, 상기 항균 펩타이드 유사체를 유효성분으로 포함하는 항균용 화장료 조성물을 제공한다.
상기 화장료 조성물은 용액, 분말, 에멀션, 로션, 분사, 연고, 에어로졸, 크림 또는 거품의 형태일 수 있다.
본 발명은 바람직한 제5구현예로서, 상기 항균 펩타이드 유사체를 유효성분으로 포함하는 항균용 식품 첨가제를 제공한다.
본 발명은 바람직한 제6구현예로서, 상기 항균 펩타이드 유사체를 유효성분으로 포함하는 사료첨가제를 제공한다.
본 발명은 바람직한 제7구현예로서, 상기 항균 펩타이드 유사체를 유효성분으로 포함하는 위생용품을 제공한다.
본 발명에 따른 항균 펩타이드 유사체는 전복의 아가미로부터 유래하는 펩타이드인 hdMolluscidin을 모체로 하여 디자인한 것이며, 아미노산 수를 절감하여 상용화가 가능하게 디자인하였다. 상기 디자인된 펩타이드 유사체는 절감된 아미노산 수에도 불구하고 항균 활성이 매우 우수할 뿐만 아니라 막 투과성이 높고, 용혈 활성이 낮다.
도 1은 전복 유래 항균 펩타이드인 hdMolluscidin과 참굴 유래 항균 펩타이드인 cgMolluscidin의 아미노산 서열을 서열정렬(alignment)하여 나타낸 것이다.
도 2는 전복 유래 항균 펩타이드인 hdMolluscidin의 아미노산 서열 및 본 발명에 따른 항균 펩타이드 유사체의 디자인을 위한 모체 펩타이드(parent peptide) 부분(단편 1 및 단편 2)을 나타내는 것이다. 또한, 상기 도 2는 상기 펩타이드 유사체들이 α-헬릭스(α-helix) 구조를 형성함을 보여주는 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 항균 펩타이드 유사체들의 항균 활성을 보여주는 것이다.
도 4는 본 발명에 따른 항균 펩타이드 유사체와 piscidin 1의 인간 적혈구에 대한 용혈활성 측정 결과를 보여주는 것이다.
도 5는 본 발명에 따른 항균 펩타이드 유사체와 piscidin 1의 대장균에 대한 내막투과성 측정 결과를 보여주는 것이다.
도 6은 본 발명에 따른 항균 펩타이드 유사체들의 Chromogenic bacteriolytic plate assay 수행 결과를 보여주는 것이다.
도 7은 본 발명에 따른 항균 펩타이드 유사체와 piscidin 1의 대장균에 대한 MIC 측정 후 MBC(Minimum Bactericidal Concentration)를 측정한 결과를 보여주는 것이다.
도 8은 본 발명에 따른 항균 펩타이드 유사체와 piscidin 1의 1×MIC와 5×MIC에서의 대장균에 대한 사멸 동역학 실험(killing kinetics study) 수행 결과를 보여주는 것이다.
이에 본 발명자들은 전복(haliotis discus)에서 유래한 것으로서 항균 활성이 우수하면서 상용화가 가능한 항균 펩타이드 유사체를 개발하기 위하여 예의 연구 노력한 결과 본 발명을 완성하였다.
구체적으로 본 발명에 따른 항균 펩타이드 유사체는 알라닌(Alanine, A), 류신(Leucine, L) 및 트립토판(Tryptophan, W) 중에서 선택되는 1 내지 3개의 아미노산 잔기로 이루어진 소수성 그룹; 및 라이신(Lysine, K) 잔기 1개 또는 2개로 이루어진 친수성 그룹;을 포함하고, 3개 또는 4개의 상기 소수성 그룹과 2개 또는 3개의 상기 친수성 그룹이 각각 교대로 결합하여 이루어진 것을 특징으로 한다.
상기 본 발명에 따른 펩타이드 유사체는 전복(haliotis discus)의 아가미로부터 추출 및 정제한 펩타이드(hdMolluscidin)로부터 유래한 것이며, 이 hdMolluscidin는 항균력이 매우 우수한 펩타이드이다. 하지만, 상기 hdMolluscidin는 총 46개의 아미노산으로 이루어져 있기 때문에 상용화가 어렵다는 문제점이 있었다. 이에 본 발명자들은 상기 전복으로부터 유래한 펩타이드인 hdMolluscidin에서 유래한 것으로서 항균 활성이 우수하게 유지되면서 상용화가 가능한 항균 펩타이드 유사체를 개발하게 되었다.
상기 본 발명에 따른 항균 펩타이드 유사체는 α-헬릭스(α-helix) 구조를 형성하는 것일 수 있다. 상기 펩타이드 유사체가 α-헬릭스(α-helix) 구조를 형성하는 경우에 친수성과 소수성을 동시에 가지는 양친매성(Amphiphilic)이 나타나게 된다. 그리하여 친수성을 띄는 부분에서는 결합력이 우수하게 되고, 소수성을 띄는 부위에서는 침투성이 우수하게 되므로 바람직하다.
본 발명자들은 펩타이드 유사체의 디자인을 위해서 먼저 2차 구조예측 프로그램을 사용해서 hdMolluscidin의 2차 구조를 예측하였다. 예측된 hdMolluscidin의 2차 구조는 random coil 구조, α-헬릭스(α-helix) 구조 및 β-쉬트(β-sheet) 구조가 혼합된 구조로 나타났다. 상기의 예측된 2차 구조를 바탕으로 우선적으로 항균활성을 나타내는데 가장 이상적인 구조로 알려져 있는 양친매성 α-헬릭스(α-helix) 구조를 나타내는 부분을 상기 hdMolluscidin으로부터 선택하였다. 또한, hdMolluscidin의 N-말단 방향의 일부분을 유사체 디자인을 위한 모체 펩타이드(parent peptide) 부분으로 선택을 하였다.
상기 펩타이드 유사체의 디자인에 대하여 보다 구체적으로 설명하기 위하여, 도 2에서 전복 유래 항균 펩타이드인 hdMolluscidin의 아미노산 서열 및 본 발명의 항균 펩타이드의 유사체 디자인을 위한 모체 펩타이드(parent peptide) 부분(단편 1 및 단편 2)을 나타내었다.
상기의 모체 펩타이드 부분인 단편 1(아미노산 서열: AATKPKKAGAEAAP) 및 단편 2(아미노산 서열: KPAKKQTKKKP)만을 이용하여 각각의 2차 구조를 예측한 결과, 각 단편은 α-헬릭스(α-helix) 구조를 형성하고 있으나 양친매성을 나타내지 않으므로, 항균 활성을 나타내기에는 적합하지 않아 소수성과 친수성을 동시에 가지는 양친매성이 되도록 적절한 아미노산 치환을 하는 것이 바람직하다.
그리고, 이러한 아미노산 치환으로 인해 항균 펩타이드 유사체가 양친매성을 나타내게 되면, 친수성 부위에서 세포막 또는 DNA와의 결합이 용이하게 되며, 소수성 부위로 인해 침투력이 용이하게 된다.
상기 단편 1 또는 단편 2를 이용하여 항균 펩타이드 유사체를 디자인할 때, 라이신(Lysine, K)은 친수성(양전하) 잔기이고 알라닌(Alanine, A)은 소수성 잔기이므로 되도록이면 유지시키는 것이 바람직하다. 반면, 프롤린(Proline, P), 트레오닌(Threonine, T) 및 글루타민(Glutamine, Q)은 극성이지만 전하를 띄지 않는 잔기로서 항균 활성과 관련하여서는 별로 바람직하지 않아 소수성 잔기로 치환하거나 가능하면 류신(Leucine, L) 잔기로 치환하는 것이 바람직하다.
또한, 트립토판(Tryptophan, W)은 막 투과성이 높고 단백질 분해효소에 대한 저항성이 높으므로, 효소에 약한 라이신(Lysine, K)과 같은 잔기들을 나란히 옆에 배치하면 단백질 분해 효소에 의해 절단되는 경향이 줄어드는 효과를 볼 수 있어 바람직하다.
본 발명의 항균 펩타이드 유사체는 상기의 단편 1 또는 단편 2를 모체 펩타이드(parent peptide)로 하여 디자인된 것으로, 알라닌(Alanine, A), 류신(Leucine, L) 및 트립토판(Tryptophan, W) 중에서 선택되는 1 내지 3개의 아미노산 잔기로 이루어진 소수성 그룹과 라이신(Lysine, K) 잔기 1개 또는 2개로 이루어진 친수성 그룹이 교대로 결합되어 구성된 펩타이드 유사체인 것이 바람직하다.
그리고, 상기 펩타이드 유사체 내에 소수성 그룹은 3개 또는 4개 존재하는 것이 바람직하고, 친수성 그룹은 2개 또는 3개 존재하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 소수성 그룹은 상기 친수성 그룹의 C-말단, N-말단 및 친수성 그룹의 사이로 이루어진 군에서 선택된 2 이상의 위치에 결합되는 것이 바람직하다. 그리고, 소수성 그룹은 2종 이하의 아미노산 잔기로 이루어지는 것이 바람직하다.
이러한 본 발명에 따른 항균 펩타이드 유사체는 8 내지 15개의 아미노산 잔기로 이루어진 것이 바람직하다. 또한, 적어도 하나 이상의 KLLK로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 펩타이드 유사체가 상기와 같은 'KLLK'로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 경우 항균 활성의 증대에 매우 유리하다.
또한, 본 발명의 항균 펩타이드 유사체는 친수성 그룹의 사이에 소수성 그룹이 위치하고, 상기 소수성 그룹과 결합된 적어도 하나 이상의 친수성 그룹이 라이신(Lysine, K) 잔기 2개로 이루어진 경우, 상기 소수성 그룹의 아미노산 잔기는 2개로 이루어진 것이 바람직하다.
또한, 본 발명에 따른 항균 펩타이드 유사체는 C-말단에 아미노기(-NH2)가 부가되거나, 메틸기(methyl group, -CH3)가 부가되는 것이 바람직하다. 항균 펩타이드 유사체의 C-말단이 아미드화(amidation) 된 경우에는 프로테아제(protease)에 대한 저항성 향상과 positive net-charge를 향상시키는 효과가 보다 향상될 수 있고, 메틸화(methylation) 된 경우에는 펩타이드를 말단에서부터 분해하는 엑소펩티다아제에 대한 저항성을 부여하여 생체내 안정성을 증가시킬 수 있으므로 바람직하다.
그리고, 상기 펩타이드 유사체는 N-말단이 아세틸화(acetylation) 또는 팔미토일화(palmitoylation) 된 것이 바람직하다. 항균 펩타이드 유사체의 N-말단이 아세틸화 된 경우에는 그렇지 않은 경우보다 훨씬 우수한 항균 활성을 나타낼 뿐만 아니라 단백질분해적 분해로부터 펩타이드를 보호할 수 있게 되고, 팔미토일화 된 경우에는 세포 내로의 투과성을 증가시킬 것이므로 바람직하다.
상기한 본 발명에 따른 항균 펩타이드 유사체는 항균 활성이 우수하면서, 아미노산 서열이 짧아 상용화가 가능한 것이다. 또한 본 발명에 따른 항균 펩타이드 유사체는 내막 투과성이 강하다. 즉, 본 발명에 따른 항균 펩타이드 유사체는 세균의 내막을 직접적으로 투과함으로써 항균 활성을 나타내는 작용기작일 가능성이 높다. 또한 본 발명에 따른 항균 펩타이드 유사체는 용혈활성을 보이지 않아 세포 독성의 문제가 없다.
상기와 같이 디자인 및 제조된 항균 펩타이드 유사체는 그람 양성균 및 그람 음성균 등의 세균과 효모(yeast) 및 곰팡이 등의 진균으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상에 항균 활성을 가지는 것일 수 있다.
더욱 구체적으로는, 상기 항균 펩타이드 유사체는 그람 양성균 4종(바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스타필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis), 스타필로코커스 뮤탄스(Staphylococcus mutans), 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes)), 그람 음성균 5종(대장균(E. coli) D31, 대장균(E. coli) ML35p, 시겔라 플렉스네리(Shigella flexneri), 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 비브리오 파라헤몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus)) 및 yeast 1종(칸디다 알비칸스(Candida albicans))로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상에 항균 활성을 가지는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 특징에 따른 항균용 약학 조성물은 상기 본 발명에 따른 항균 펩타이드 유사체를 유효성분으로 포함한다.
상기 약학 조성물의 투여 방법은 특별한 제한이 있는 것은 아니지만, 바람직하게는 동맥 또는 정맥 내로 투입하거나, 피하로, 직장으로, 비강으로, 임의의 다른 비경구로도 투입될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 동맥 또는 정맥 내로 투입하거나 경구 투여하거나 또는 근육 세포에 직접 투입하는 것이 바람직하다.
또한 상기 조성물로부터 선택되는 투여 수준은 화합물의 활성, 투여 경로, 치료되는 병태의 중증도 및 치료되는 환자의 병태 및 이전 병력에 따를 것이다. 그러나 원하는 치료 효과의 달성을 위해 요구되는 것보다 낮은 수준의 화합물의 용량에서 시작하여, 원하는 효과가 달성될 때까지 투여량을 서서히 증가시키는 것은 당업계의 지식 내에 있으며, 바람직한 투여량은 나이, 성별, 체형, 체중에 따라 결정될 수 있다. 상기 조성물은 약제학상 허용 가능한 제약 제제로 제제화 되기 전에 추가로 가공될 수 있으며, 바람직하게는 더 작은 입자들로 분쇄 또는 연마될 수 있다. 또한 상기 조성물은 병태 및 치료되는 환자에 따라 달라질 것이지만, 이는 비-독창적으로 결정할 수 있다. 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 항균 펩타이드 유사체의 유효 용량은 1~2mg/kg이고, 바람직하게는 0.5~1mg/kg이며, 하루 1 내지 3회 투여될 수 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
상기 본 발명의 약학 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 산제, 과립제, 정제, 캅셀제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 연고, 크림 등의 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액 등을 비롯하여 약제학적 제제에 적합한 어떠한 형태로든 사용할 수 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
또한 상기 항균 펩타이드 유사체는 항균 활성을 보이는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스타필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis), 스타필로코커스 뮤탄스(Staphylococcus mutans), 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes), 대장균(E. coli) D31, 대장균(E. coli) ML35p, 시겔라 플렉스네리(Shigella flexneri), 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 비브리오 파라헤몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus) 또는 칸디다 알비칸스(Candida albicans)로부터 대표적으로 유발되는 질병인 식중독, 칸디다즘, 장티푸스, 콜레라 등의 질병을 예방 또는 치료하는 것이 가능하기 때문에, 상기 항균 펩타이드 유사체를 유효성분으로 포함하여 상기 세균으로 인한 감염성 질환들의 예방 또는 치료용 약학 조성물로 활용될 수 있다.
또한 상기 항균 펩타이드 유사체는 항균용 화장료 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있다. 이때, 상기 화장료 조성물은 용액, 분말, 에멀션, 로션, 분사, 연고, 에어로졸, 크림 또는 거품의 형태일 수 있다. 또한, 본 발명의 화장료 조성물에 있어서는, 화장품 제제에 있어서 수용가능한 담체를 포함할 수 있다. 여기서 "화장품 제제에 있어서 수용가능한 담체"란 화장품 제제에 포함될 수 있는 이미 공지되어 사용되고 있는 화합물 또는 조성물이거나 앞으로 개발될 화합물 또는 조성물로서 피부와의 접촉시 인체가 적응 가능한 정도 이상의 독성, 불안정성 또는 자극성이 없는 것을 말한다.
상기 담체는 본 발명의 화장료 조성물에 그것의 전체 중량에 대하여 약 1중량% 내지 약 99.99중량%, 바람직하게는 조성물의 중량의 약 90중량% 내지 약 99.99중량%로 포함될 수 있다. 상기 담체로서는 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선산란제, 자외선흡수제, 발색제, 향료 등이 예시될 수 있다. 상기 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선산란제, 자외선흡수제, 발색제, 향료로 사용될 수 있는 화합물 또는 조성물 등은 이미 당업계에 공지되어 있기 때문에 당업자라면 적절한 해당물질 또는 조성물을 선택하여 사용할 수 있다.
본 발명의 일 구현예로서, 본 발명에 따른 화장료 조성물은 상기 펩타이드 유사체 외에 글리세린, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 폴리옥시에틸렌 경화피마자유, 에탄올, 트리에탄올아민 등을 포함할 수 있으며, 방부제, 향료, 착색료, 정제수 등을 필요에 따라 미량 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서의 피부는 얼굴뿐만 아니라, 두피, 전신도 포함되는 개념으로, 이러한 두피에 적용될 수 있는 화장료 조성물로써, 샴푸, 린스, 트리트먼트, 발모제 등이 있고, 전신에 적용될 수 있는 바디클렌져 등의 용도로서 다양한 형태로 제조될 수 있다.
또한 상기 항균 펩타이드 유사체는 항균용 식품 첨가제 또는 사료첨가제의 유효성분으로 사용될 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명에 따른 항균 펩타이드 유사체는 그람 음성 및 그람 양성균뿐만 아니라 진균에 대해서도 우수한 항균 활성을 가지고, 세포독성이 없어서 항균용 식품첨가제 또는 사료첨가제로 유용하게 이용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 드링크제, 육류, 소시지, 빵, 비스켓, 떡, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다. 본 발명의 항균 펩타이드 유사체는 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 중의 상기 항균 펩타이드 유사체의 양은 전체 식품 중량의 0.1 내지 20중량%로 가할 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에, 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
또한 상기 항균 펩타이드 유사체는 물티슈, 손 소독제, 구강청정제, 구강소독제, 치약첨가제와 같은 위생용품의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.
이하 본 발명을 바람직한 실시예를 참고로 하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
<재료 및 방법>
시약 및 재료
항균활성 측정을 위한 트립틱 소이 브로스(tryptic soy broth, TSB)와 아가로스 타입 I(Low EEO Agar)은 Merck사(Merck, Darmstadt, Germany)와 Sigma사(St. Louis, MO, USA)에서 각각 구입하여 사용하였다. 합성물의 정제과정에서 사용된 HPLC용 물과 아세토니트릴(CH3CN)은 Tedia사(Ohio, USA)로부터 구입하였고, 그 이외의 모든 시약은 특급을 사용하였다.
항균 펩타이드 유사체의 디자인
hdMolluscidin의 유사체 디자인을 위해서 2차 구조예측 프로그램인 EMBOSS GUI의 Garnier 프로그램과 Expasy tools의 GOR프로그램을 사용하여 2차 구조를 예측하였다. 그 결과, 예측된 hdMolluscidin의 2차 구조를 바탕으로 N-말단 방향의 α-헬릭스(α-helix) 구조를 나타내는 2개의 단편을 선택하여 유사체 디자인에 활용하였다.
디자인된 각 유사체들은 각각 8개 내지 15개의 아미노산으로 구성되도록 하였고, C-말단의 아미드화(amidation) 또는 메틸화(methylation), N-말단의 아세틸화(acetylation) 또는 팔미토일화(palmitoylation), 또는 특정위치에서의 아미노산 첨가, 치환 및 제거 등의 방법을 활용하여 디자인되었다.
항균 펩타이드 유사체의 합성 및 정제
디자인된 펩타이드 유사체는 펩트론(주)(대전)으로부터 순도 95 % 이상으로 합성 및 정제되어 공급되었다. 유사체들은 펩타이드 합성기 ASP48S(펩트론, 대전 한국)를 사용한 F-moc 고상합성법에 의해서 합성되었고, Shiseido Capcell-Pak C18 column(250 mm × 4.6 mm, 10 μm)을 이용한 RP-HPLC로 정제되었다. 정제 조건은 0.1%(v/v) trifluoroacetic acid를 포함하는 H2O-CH3CN의 용매시스템으로 3-40 %의 농도구배조건으로 220 nm에서 유속 1 mL/min으로 수행되었다. 정제된 펩타이드 유사체들의 분자량 측정은 liquid chromatography/mass spectrometry(LC/MS; HP1100 series; Agilent, Santa Clara, CA, USA)를 이용하여 수행되었다. 정제된 펩타이드 유사체들은 0.01 % 초산에 1000 ㎍/mL의 농도로 녹여져서 이후의 실험에 사용되었다.
항균활성측정방법 및 사용균주
실험에 사용된 균주는 그람 양성균 4종(바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스타필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis), 스타필로코커스 뮤탄스(Staphylococcus mutans), 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes)), 그람 음성균 5종(대장균(E. coli) D31, 대장균(E. coli) ML35p, 시겔라 플렉스네리(Shigella flexneri), 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 비브리오 파라헤몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus)) 및 yeast 1종(칸디다 알비칸스(Candida albicans))를 사용하였다. 항균활성 측정 방법으로는 서로 다른 농도를 포함한 두 층의 배지를 사용하는 ultrasensitive radial diffusion assay(URDA)법을 이용하였다. URDA에 사용된 균주는 우선 각각의 배지 및 배양 온도에서 18 시간 동안 프리-컬쳐(pre-culture) 후 컬러미터(Product No.52-1210, BioMerieux, Inc., USA)를 사용하여 균 농도를 84%T( 1 x 108 CFU/mL)가 되도록 맞추었다. 그 후, 9.5 mL의 0.03 % TSB, 1 % Type agarose 및 10 mM 포스페이트 버퍼(PB)(pH 6.5)를 포함하는 언더레이 젤에 각각의 농도로 희석된 균액 0.5 mL을 넣고 잘 섞은 후에 plate에 편평하게 부어 굳혔다. 굳은 플레이트에 펀치를 사용하여 직경 2.5 mm의 well을 뚫은 후에 5 μL의 각 유사체액을 도입시켰다. 모든 유사체는 0.01% acetic acid 5 μL를 사용하여 용매에 의한 영향이 없음을 확인하였다. 유사체가 배지에 스며들면 3시간 동안 1차 배양한 후, 그 위에 10 mL의 6% TSB, 1% Type agarose 및 10 mM phosphate buffer(pH 6.5)를 포함하는 overlay gel을 붓고 굳힌 후에 동일한 온도에서 18시간 동안 2차 배양하였다. 다음 날 well 주위에 생긴 clear zone의 크기(직경, diameter)를 측정하여 항균활성을 확인하였다. 대조군으로는 미국산 잡종 농어의 비만세포에서 유래한 항균 펩타이드인 piscidin 1을 사용하였다.
용혈활성(Hemolysis) 측정
인간의 적혈구를 이용하여 용혈활성을 측정하였다. 사람의 혈액에 동량의 포스페이트 버퍼드 살린(phosphate buffered saline; PBS, 50 mM 소듐 포스페이트, 150 mM NaCl, pH 7.4)을 넣고 혼합한 후 8000 x g, 4 , 1 분간 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 이러한 세척과정을 3 회 반복한 후 얻어진 적혈구를 3 % 헤마토크리트(hematocrit) 되도록 PBS를 첨가하였다. 용혈활성을 측정하기 위해서 3 % 헤마토크리트(hematocrit) 90 μL를 e- 튜브(tube)에 도입시키고 10 μL의 ×10농도의 각 유사체액을 첨가하였다. 각각의 e-튜브(tube)를 37 에서 1 시간 반응시킨 후, 4 에서 10 분간 13,000 x g로 원심분리를 하였다. 얻어진 각각의 상층액에서 70 μL를 취해서 96-웰 마이크로티터 플레이트(well microtiter plate)로 옮긴 후 405 nm에서 헤모글로빈 유출 정도를 측정하였다. 적혈구의 100 % 용혈을 위한 실험 대조구로는 트리톤(triton) X-100(0.1 %)을 사용하였으며, 다음 식을 사용하여 용혈활성 정도를 계산하였다.
% Hemolysis = [(Abs 405 nm in the peptide solution - Abs 405 nm in buffer) / (Abs 405nm in 0.1 % Triton X-100 - Abs 405 nm in buffer)] x 100
세균의 내막 투과성(Cytoplasmic membrane permeabilization) 측정
세균의 내막 투과성 측정은 nonmembrane permeative chromogenic substrate인 O-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside(ONPG)를 사용해서 E. coli ML35p에 세포질에 존재하는 β-갈락토시데이즈(β-galactosidase)의 활성을 측정함으로써 수행되었다. 배양된 Mid-logarithmic phase의 E. coli ML35p를 10 mM 소듐 포스페이트 버퍼(sodium phosphate buffer; NaPB, pH7.4)로 세척한 후에 1.5 mM의 ONPG를 포함하는 동일 버퍼에 용해시켰다. 그 후, 측정할 펩타이드 유사체를 첨가한 뒤 유출된 E. coli ML35p의 β-갈락토시데이즈(β-galactosidase)에 의한 ONPG의 O-nitrophenol로의 가수분해 정도를 420 nm에서 측정함으로써 수행되었다. Piscidin 1과 0.01 % 초산은 각각 대조군으로서 사용되었다.
발색성 용균 플레이트 검사(Chromogenic bacteriolytic plate assay)
유사체들의 박테리아 세포막(bacterial membrane)에 대한 용균 활성(lytic activity)을 확인하기 위해서 염색체의(chromosomal) IPTG-유도 β-갈락토시데이즈(β-galactosidase) 유전자를 포함하고 있는 E. coli ML35p를 사용해서 발색성 용균 플레이트 검사(chromogenic bacteriolytic plate assay)를 수행하였다(Mardones, G., Venegas, A. Chromogenic plate assay distinguishing bacteriolytic from bacteriostatic activity of an antibiotic agent. J Microbiol Methods. 2000, 40(3), 199-206). E. coli ML35p를 2 mL의 TSB에 접종한 후에 37에서 16~18시간 배양하고, 다음날 42의 0.8% agarose를 포함하는 TSB에 50 μL 배양균액, 1 mM IPTG 10 μL, 50 mg/mL X-gal 50 μL 을 포함하는 혼합액을 섞은 후에 plate에 부어 굳히고 well을 뚫은 후에 각각의 펩타이드 유사체액 5 μL 를 도입시키고 3시간 동안 1차 배양을 하였다. 1차 배양 후에 10 mL의 1.5% agarose를 포함하는 2×TSB를 plate 위에 부어서 굳힌 후에 16~18시간동안 2차 배양하였다. 배양 후에 clearing zone의 크기(직경)와 가장자리에 존재하는 푸른색의 띠(edge line)의 유무를 확인하였다.
최소저해농도(Minimum Inhibitory Concentration; MIC) 측정
유사체들의 최소저해농도를 Patrzykatet et al. 등의 방법에 따라서 수행하였다 (Patrzykat, A., Gallant, J.W., Seo, J.K., Pytyck, J., Douglas, S,E. Novel antimicrobial peptides derived from flatfish genes. Antimicrob Agents Chemother. 2003, 47(8), 2464-2470). 각각의 측정농도를 나타내는 펩타이드 유사체의 액은 100 ㎍/mL~3.13 ㎍/mL의 0.01% HAc를 사용하여 연속희석법으로 제조하였으며, 측정은 96-well polypropylene microtiter plates(Costar; Corning Incorporated, Corning, N.Y.)에서 수행하였다. 측정에 사용된 E. coli ML35p는 TSB medium에서 the mid-logarithmic phase까지 16시간동안 배양을 한 후에 106 CFU/mL의 균농도로 TSB midium을 사용하여 최종 희석하였다. 최소저해농도를 측정하기 위해서 최종 희석된 균액 90 μL를 96-well plate의 각 well에 첨가한 후에 10 μL의 목적 측정농도의 x10농도를 포함하는 각 유사체의 액을 각각의 well에 첨가하였다. 측정결과에 대한 negative와 positive control로는 유사체를 첨가하지 않은 상태와 항균 펩타이드인 piscidin 1을 첨가한 상태를 사용하였다. 최소저해 농도는 시각적인 방법으로 균의 성장을 확인한 후 균의 성장이 전혀 없는 well에 첨가된 유사체의 농도로 정의하였다. 또한 유사체들의 항균활성기작을 확인하기 위해서 각 유사체들의 최소저해농도에 해당하는 각 well에서 균액을 취해서 TSA plate에 도말하고 배양한 후에 colony 생성 유무로서 정균(bacteriostatic) 기작인지 또는 살균(bactericidal) 기작인지를 확인하였다.
사멸 동역학 실험(Killing kinetic study)
Bactericidal process가 확인된 유사체들의 killing kinetic study를 위해서 MIC 측정에서 결정된 각 유사체들을 1xMIC와 5xMIC의 농도에서 60분 동안 killing rate를 확인하였다. 이를 위해서 106 CFU/mL의 E. coli ML35p를 포함하는 e-tube에 유사체들을 첨가한 후에 37에서 배양하면서 정해진 시간(유사체 첨가 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60분 후)에 각각의 측정 tube에서 반응액 10 μL씩을 취해서 TSA plate에 도말하고 배양한 후에 형성된 colony 수를 확인하였다. 대조군으로는 유사체를 첨가하지 않은 상태와 항균 펩타이드인 piscidin 1을 첨가한 상태를 사용하였다. 유사체들의 사멸(killing) %는 유사체를 첨가하지 않은 조건에서의 생성된 colony 수에 대한 상대적인 비율로 나타내었다.
실험예
<실험예 1: 디자인된 hdMolluscidin의 유사체들>
1) hdMolluscidin
hdMolluscidin은 전복(Haliotis discus) 의 아가미에서 정제된 것으로, 46개의 아미노산으로 구성되어 있고 4767.2 Da 의 분자량을 가진 항균 펩타이드이다. hdMolluscidin는 참굴 아가미에서 유래된 항균 펩타이드인 cgMolluscidin과 높은 서열 유사성을 나타내었다(도 1). 도 1은 hdMolluscidin과 cgMolluscidin의 아미노산 서열을 서열정렬(alignment)하여 나타낸 것이다. 상기 도 1에서 보존된 서열은 검은색 부분으로 나타내었다.
길이가 짧아지고 항균 활성이 증가된 유사체를 디자인하기 위해서 hdMolluscidin의 구조 예측프로그램을 사용해서 2차 구조를 예측하였다(도 2).
2) hdMolluscidin의 이차구조 예측
hdMolluscidin의 2차 구조예측은 Expasy tools의 GOR method를 사용하여 수행되었다. 그 결과 hdMolluscidin은 α-helix와 random 구조가 섞여 있는 혼합구조를 이루고 있는 것으로 예측되었다(도 2). 이러한 결과를 바탕으로 α-helix 구조를 나타내는 N-말단의 두 위치(단편 1과 단편 2)를 유사체 디자인을 위한 parent region으로 선택을 하였다.
3) hdMolluscidin 유사체의 일차 구조
hdMolluscidin의 N-말단 방향의 α-helix 구조를 바탕으로 디자인된 각 펩타이드 유사체의 예시들을 하기 표 1에 나타내었다. 각 유사체들은 8개 내지 15개의 아미노산 잔기로 구성되어 있다. 합성된 유사체들은 분자량 측정을 통해서 확인되었다.
표 1
서열번호 Peptide Sequence 개수
서열번호 1 Ab2-2 AAWKLLKALAKA-NH2 12
서열번호 2 Ab2-3 LLWKLLKLLLK-NH2 11
서열번호 3 Ab2-4 LLWKLLKKLLK-NH2 11
서열번호 4 Ab2-5 LLWKLLKKL-NH2 9
서열번호 5 Ab4-1 Ac-KLALKLLKLL-NH2 10
서열번호 6 Ab4-2 Ac-KAAAKAAKAA-NH2 10
서열번호 7 Ab4-3 KLLLKLLKLL-NH2 10
서열번호 8 Ab4-4 KLLLKLLKKLL-NH2 11
서열번호 9 Ab4-5 KLLKKLLKLL-NH2 10
서열번호 10 Ab4-7 KWLLKLLKKL-NH2 10
서열번호 11 Ab4-8 LKWLLKLLKLK-NH2 11
<실험예 2: hdMolluscidin 유사체들의 항균활성>
상기 유사체들과 대조군으로 사용된 항균 펩타이드인 piscidin 1(미국산 잡종 농어에서 유래된 항균 펩타이드)의 항균활성을 세균들과 1종의 yeast에 대해서 URDA법을 사용해서 측정하였다. 항균활성 측정 결과, 본 발명의 유사체들은 측정한 미생물에 대해서 강한 항균활성을 나타내었고, 그 중 가장 항균 활성이 우수한 것으로 나타난 서열번호 4(Ab2-5) 및 서열번호 10(Ab4-7)의 아미노산 서열을 갖는 항균 펩타이드 유사체의 항균활성을 도 3에 나타내었다.
또한, 유사체들의 항균 범위를 확인하기 위해서 다양한 미생물에 대한 항균활성을 측정하였다(표 2 내지 표 4). 그 결과 본 발명의 펩타이드 유사체들은 piscidin 1의 활성과 유사한 정도의 항균활성을 나타내었고, 특히 C. albicans에 대해서는 piscidin 1보다도 활성이 강한 것으로 나타났다.
또한, 모체 펩타이드인 hdMolluscidin은 C. albicans에 대해서 거의 항균활성을 나타내지 않았는데 반해, 본 발명의 항균 펩타이드 유사체들은 C. albicans에 대해서도 강한 항균활성을 나타내는 것으로 나타났다.
표 2
Microbe Gram Minimal Effectives Concentraion(㎍/mL)
서열번호 1 서열번호 2 서열번호 3 서열번호 4 Piscidin 1
B.subtilis KCTC1021 + 20.0 16.0 14.0 5.8 7.5
S.epidermidis KCTC1917 + 17.3 18.4 17.2 5.6 NT
S.mutans KCCM40105 + 20.3 16.3 15.8 5.5 3.2
Propionibacterium acnes KCTC11946 + 25.0 18.0 14.5 9.4 NT
E.coli D31 - 22.0 16.2 19.4 13.5 3.8
E.coli ML35p - 23.0 12.1 13.8 8.4 2.3
Shigella flexneri KCTC2009 - 28.0 11.6 10.0 8.7 8.0
P.aeruginosa KCTC2004 - 36.0 14.2 15.2 10.7 8.0
Vibrio parahaemolyticusKCCM42264 26.3 14.0 9.1 5.3 3.0
C.albicans KCTC7965 Yeast 42.0 17.0 15.0 10.0 >62.5
표 3
Microbe Gram Minimal Effectives Concentraion(㎍/mL)
서열번호 5 서열번호 6 서열번호 7 서열번호 8 Piscidin 1
B.subtilis KCTC1021 + 15.2 >50.0 11.2 10.3 7.5
S.epidermidis KCTC1917 + 16.4 >50.0 8.8 9.6 NT
S.mutans KCCM40105 + 10.5 >50.0 7.8 7.4 3.2
Propionibacterium acnes KCTC11946 + 16.6 >50.0 11.9 12.3 NT
E.coli D31 - 17.5 >50.0 13.2 14.2 3.8
E.coli ML35p - 10.5 >50.0 8.8 9.8 2.3
Shigella flexneri KCTC2009 - 17.9 >50.0 10.4 10.7 8.0
P.aeruginosa KCTC2004 - 19.9 >50.0 11.2 12.5 8.0
Vibrio parahaemolyticusKCCM42264 8.1 >50.0 6.8 7.1 3.0
C.albicans KCTC7965 Yeast 14.4 >50.0 12.1 11.8 >62.5
표 4
Microbe Gram Minimal Effectives Concentraion(㎍/mL)
서열번호 9 서열번호 10 서열번호 11 Piscidin 1
B.subtilis KCTC1021 + 15.7 9.6 12.1 7.5
S.epidermidis KCTC1917 + 14.0 4.6 16.0 NT
S.mutans KCCM40105 + 9.0 4.1 12.0 3.2
Propionibacterium acnes KCTC11946 + 18.5 6.2 13.1 NT
E.coli D31 - 18.9 12.2 14.1 3.8
E.coli ML35p - 17.2 9.9 15.0 2.3
Shigella flexneri KCTC2009 - 15.4 8.7 11.2 8.0
P.aeruginosa KCTC2004 - 17.8 7.2 8.7 8.0
Vibrio parahaemolyticusKCCM42264 9.5 4.7 9.0 3.0
C.albicans KCTC7965 Yeast 14.0 7.4 10.0 >62.5
<실험예 3: hdMolluscidin 유사체들의 용혈활성>
hdMolluscidin 유사체들의 독성을 확인하기 위해서 유사체들과 대조군으로 사용된 항균 펩타이드인 piscidin 1의 사람의 적혈구(혈액형 B형)에 대한 용혈활성을 측정하였고, 그 중 활성이 좋게 나타난 서열번호 4 및 서열번호 10의 펩타이드 유사체의 용혈활성을 구체적인 예시로서 도 4에 나타내었다.
용혈활성 측정결과, 본 발명의 펩타이드 유사체들은 모두 50 ㎍/mL까지의 농도에서는 거의 용혈활성을 나타내지 않았으며, 100㎍/mL 농도에서 서열번호 4(Ab2-5)는 약 10%, 서열번호 10(Ab4-7)은 약 50%정도의 사람의 적혈구에 대해서 용혈활성을 나타내었다. 반면 piscidin 1은 12.5 ㎍/㎖의 농도부터 강한 용혈활성을 나타내기 시작하였다. 이러한 결과는 강력한 용혈활성을 지닌 piscidin 1과는 대조적으로 본 발명의 유사체들은 유효 항균활성 농도 (<50 ㎍/mL)에서는 사람의 적혈구에 대해서 독성이 거의 없음을 의미하는 것이다.
<실험예 4: Cytoplasmic membrane permeabilization>
hdMolluscidin 유사체들과 대조군으로 사용된 항균 펩타이드인 piscidin 1의 박테리아 내막(bacteria inner membrane)에 대한 투과성을 확인하기 위해서, E. coli ML35p에 대한 내막투과성을 측정하였다(도 5). 그 결과, piscidin 1은 E. coli ML35p에 대해서 시간 의존적으로 강한 내막 투과성을 나타내었다. 또한 본 발명의 유사체들도 piscidin 1과 유사하게 E. coli ML35p에 대해서 시간 의존적으로 강한 내막 투과성을 나타내었다.
이러한 결과는 본 발명의 hdMolluscidin 유사체들은 세균의 내막을 직접적으로 투과함으로써 항균활성을 나타내는 작용 기작일 가능성이 있음을 의미하는 것이다.
<실험예 5: Chromogenic bacteriolytic plate assay>
유사체들의 항균활성 작용기작을 확인하기 위해서 chromosomal IPTG- inducible β-galactosidase gene을 포함하고 있는 E. coli ML35p를 사용해서 chromogenic bacteriolytic plate assay를 수행하였다(도 6). 그 결과 E. coli ML35p에 대해서 chromogenic bacteriolytic activity를 나타낸다고 알려진 항생제인 스트렙토마이신(streptomycin)은 푸른색의 가장자리 선(edge line)을 나타내어 용균활성(bacteriolytic activity)을 나타낸 반면, bacteriolytic activity를 나타내지 않는다고 알려진 테트라사이클린(tetracycline)은 푸른색 가장자리 선(edge line)을 나타내지 않았다. 또한 표준물질로 사용된 piscidin 1도 가장자리 선(edge line)을 나타냄으로써 bacteriolytic activity를 나타내었고, 본 발명의 유사체인 서열번호 4(Ab2-5)와 서열번호 10(Ab4-7)의 펩타이드 유사체도 푸른색의 가장자리 선(edge line)을 나타냄으로써 bacetriolytic activity를 가지는 것으로 나타났다.
이러한 결과는 본 발명의 두 유사체가 세균 막을 용균(lysis)시키는 작용 기작을 가지고 있다는 것을 의미하는 것이다.
<실험예 6: 최소저해농도(MIC) 및 최소살균농도(MBC) 측정>
유사체들이 항균활성을 위한 작용기작이 정균(bactericidal)인지 아니면 살균(bacteriostatic) 인지를 확인하기 위해서 MIC(최소저해농도)와 MBC(최소살균농도) 측정을 수행하였다. 그 결과 본 발명의 펩타이드 유사체들은 E. coli ML35p에 대해서 piscidin 1과 유사하게 낮은 MIC를 나타내었다(표 5 내지 표 7).
표 5
Microbes Gram Minimum Inhibitory Concentration(MIC)(㎍/mL)
서열번호 1 서열번호 2 서열번호 3 서열번호 4 Piscidin 1
E.coli ML35p - 50.0 25.0 25.0 12.5 12.5
표 6
Microbes Gram Minimum Inhibitory Concentration(MIC)(㎍/mL)
서열번호 5 서열번호 6 서열번호 7 서열번호 8 서열번호 9
E.coli ML35p - 25 >50 12.5 12.5 25
표 7
Microbes Gram Minimum Inhibitory Concentration(MIC)(㎍/mL)
서열번호 10 서열번호 11
E.coli ML35p - 6.25 25
얻어진 MIC 값을 바탕으로 MBC 측정실험을 수행한 결과, 유사체들과 piscidin 1은 MIC 값과 동일한 MBC 값을 나타내었다(도 7)(표 8 내지 표 10). 이러한 결과는 본 발명의 펩타이드 유사체들이 MIC(최소저해농도)와 MBC(최소살균농도)가 동일하고 bactericidal process를 통해서 항균활성을 나타낸다는 것을 의미하는 것이다.
표 8
Microbes Gram Minimum Bactericidal Concentration(MBC)(㎍/mL)
서열번호 1 서열번호 2 서열번호 3 서열번호 4 Piscidin 1
E.coli ML35p - 50.0 25.0 25.0 12.5 12.5
표 9
Microbes Gram Minimum Bactericidal Concentration(MBC)(㎍/mL)
서열번호 5 서열번호 6 서열번호 7 서열번호 8 서열번호 9
E.coli ML35p - 25 >50 12.5 12.5 25
표 10
Microbes Gram Minimum Bactericidal Concentration(MBC)(㎍/mL)
서열번호 10 서열번호 11
E.coli ML35p - 6.25 25.0
<실험예 7: 유사체들의 사멸 동역학 실험(killing kinetic study)>
살균활성(Bactericidal activity)이 확인된 유사체들의 시간에 따른 사멸속도를 확인하기 위해서 1xMIC와 5xMIC의 농도에서 60분동안 E. coli ML35p과 반응 시킨 후의 killing kinetic study를 수행하였다(도 8). 그 결과 본 발명의 펩타이드 유사체들은 1xMIC와 5xMIC의 농도에서 모두 E. coli ML35p를 5분 이내에 죽이는 것으로 나타났다. 비교물질로 사용된 piscidin 1은 1xMIC에서는 20분 이내에, 5xMIC에서는 5분 이내에 E. coli ML35p를 죽이는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 본 발명의 펩타이드 유사체들이 세균과 접촉을 한 후에 매우 빠른 시간(5분 이내)에 세균을 죽인다는 것을 의미하는 것이다. 따라서 각 유사체들은 세균의 막을 직접 공격하여 내막을 투과함으로써 막에 구멍(pore)을 만들어서 매우 빠른 시간에 세균을 살균하는 작용기작을 가진 것으로 판단된다.
<결과>
본 발명자들은 일차구조가 규명된 모체 항균 펩타이드로부터 길이의 단편화와 활성의 개선이 이루어진 새로운 항균 펩타이드 유사체를 선발하기 위해서 참전복의 아가미로부터 정제된 항균 펩타이드인 hdMolluscidin을 토대로 펩타이드 유사체들을 디자인하고 고상합성법으로 합성하였다. 본 발명의 펩타이드 유사체들은 hdMolluscidin의 N-말단 방향에 위치하고 있는 부위를 parent region으로 선택하여 아미노산을 치환, 첨가, 제거하고, C-말단을 아미드화 또는 메틸화 및/또는 N-말단을 아세틸화 또는 팔미토일화시키는 방법으로 디자인되었다. 유사체들의 항균활성과 용혈활성 측정 결과, 본 발명의 펩타이드 유사체들은 강한 항균활성을 나타내었고, 항균활성 범위의 농도에서 적혈구에 대한 용혈활성은 거의 나타내지 않았다. 또한 유사체들의 작용기작 연구 결과 본 발명의 펩타이드 유사체들은 세균의 막에 직접 결합을 한 후에 내막을 투과함으로써 막에 구멍(pore)을 만들어서 세균을 빠른 시간 내에 죽이는 방법으로 항균작용을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 본 연구의 실험결과는 추가적인 연구가 수행되어야 하겠지만 기존의 항생제를 대체할 수 있는
항생제 대체제로서 개발하기 위한 후보물질로서 활용 가능할 것으로 판단된다.
하기 본 발명의 펩타이드 유사체를 위한 제조예를 예시한다.
<제조예 3> 약학적 제제의 제조
<3-1> 산제의 제조
본 발명의 펩타이드 유사체 20mg
유당 20mg
상기의 성분을 혼합한 후, 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
<3-2> 정제의 제조
본 발명의 펩타이드 유사체 10mg
옥수수전분 100mg
유당 100mg
스테아린산 마그네슘 2mg
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.
<3-3> 캡슐제의 제조
본 발명의 펩타이드 유사체 10mg
결정성 셀룰로오스 3mg
락토오스 14.8mg
스테아린산 마그네슘 0.2mg
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
<3-4> 액제의 제조
본 발명의 펩타이드 유사체 20mg
이성화당 10g
만니톨 5g
정제수 적량
통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 후 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조하였다.
<3-5> 주사제의 제조
본 발명의 펩타이드 유사체 10㎍/㎖
묽은 염산 BP pH7.6이 될 때까지
주이용 염화나트륨 BP 최대 1㎖
적당한 용적의 주이용 염화나트륨 BP중에 본 발명의 펩타이드 유사체를 용해시키고, 생성된 용액의 pH를 묽은 염산 BP를 이용하여 pH7.6으로 조절하고, 주이용 염화나트륨 BP를 이용하여 용적을 조절하고 충분히 혼합하였다. 용액을 투명 유리로 된 5㎖ 타입Ⅰ 앰플 중에 충전시키고, 유리를 용해시킴으로써 공기의 상부 격자하에 봉입시키고, 120에서 15분 이상 오토클레이브 살균하여 주사액제를 제조하였다.
<제조예 4> 화장품의 제조
<4-1> 유연화장수(스킨)
본 발명의 펩타이드 유사체를 포함하는 항균용 유연화장수를 제조하기 위해 하기 표 11에 기재된 것처럼 배합하여 통상적인 화장품 분야에서의 제조방법에 따라 제조할 수 있다.
표 11
성분 함량(중량%)
본 발명의 펩타이드 유사체 0.1~30%
1,3-부틸렌글리콜 3.0
글리세린 5.0
폴리옥시에틸렌(60) 경화피마자유 0.2
에탄올 8.0
구연산 0.02
구연산나트륨 0.06
방부제 미량
향료 미량
정제수 To 100
<4-2> 영양화장수(로션)
본 발명의 펩타이드 유사체를 포함하는 항균용 영양화장수를 제조하기 위해 하기 표 12에 기재된 것처럼 배합하여 통상적인 화장품 분야에서의 제조방법에 따라 제조할 수 있다.
표 12
성분 함량(중량%)
본 발명의 펩타이드 유사체 0.1~30%
1,3-부틸렌글리콜 3.0
글리세린 5.0
스쿠알란 10.0
모노올레인산폴리옥시에틸렌소르비탄 2.0
유창목오일 0.1~30%
폴리옥시에틸렌(60) 경화피마자유 0.2
에탄올 8.0
구연산 0.02
구연산나트륨 0.06
방부제 미량
향료 미량
정제수 To 100
<4-3> 세안제(클렌징폼)
본 발명의 펩타이드 유사체를 포함하는 항균용 세안제(클렌징폼)를 제조하기 위해 하기 표 13에 기재된 것처럼 배합하여 통상적인 화장품 분야에서의 제조방법에 따라 제조할 수 있다.
표 13
성분 함량(중량%)
본 발명의 펩타이드 유사체 0.1~30%
N-아실글루타민산나트륨 20.0
글리세린 10.0
PEG-400 15.0
프로필렌글리콜 10.0
POE(15) 올레일알코올에테르 3.0
라우린유도체 2.0
메틸파라벤 0.2
EDTA-4Na 0.03
향료 0.2
정제수 To 100
<4-4> 영양크림
본 발명의 펩타이드 유사체를 포함하는 항균용 영양크림을 제조하기 위해 하기 표 14에 기재된 것처럼 통상적인 화장품 분야에서의 제조방법에 따라 제조한다.
표 14
성분 함량(중량%)
본 발명의 펩타이드 유사체 0.1~30%
바셀린 7.0
유동파라핀 10.0
밀납 2.0
폴리솔베이트60 2.5
솔비탄세스퀴올레이트 1.5
스쿠알란 3.0
프로필렌글리콜 6.0
글리세린 4.0
트리에탄올아민 0.5
산탄검 0.5
토코페닐아세테이트 0.1
향, 방부제 미량
정제수 To 100
상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 설명하였지만, 본 발명은 이에 한정되는 것은 아니고, 본 발명의 기술 사상 범위 내에서 여러 가지로 변형하여 실시하는 것이 가능하고, 이 또한 첨부된 특허 청구 범위에 속하는 것은 당연하다.

Claims (17)

  1. 알라닌(Alanine, A), 류신(Leucine, L) 및 트립토판(Tryptophan, W) 중에서 선택되는 1 내지 3개의 아미노산 잔기로 이루어진 소수성 그룹; 및
    라이신(Lysine, K) 잔기 1개 또는 2개로 이루어진 친수성 그룹;을 포함하고,
    3개 또는 4개의 상기 소수성 그룹과 2개 또는 3개의 상기 친수성 그룹이 각각 교대로 결합하여 이루어진 항균 펩타이드 유사체.
  2. 제1항에 있어서,
    α-헬릭스(α-helix) 구조를 형성하는 항균 펩타이드 유사체.
  3. 제1항에 있어서,
    8 내지 15개의 아미노산 잔기로 이루어진 항균 펩타이드 유사체.
  4. 제1항에 있어서,
    적어도 하나 이상의 KLLK로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 것인 항균 펩타이드 유사체.
  5. 제1항에 있어서,
    친수성 그룹의 사이에 소수성 그룹이 위치하고, 상기 소수성 그룹과 결합된 적어도 하나 이상의 친수성 그룹이 라이신(Lysine, K) 잔기 2개로 이루어진 경우, 상기 소수성 그룹의 아미노산 잔기는 2개인 것을 특징으로 하는 항균 펩타이드 유사체.
  6. 제1항에 있어서,
    서열번호 1 내지 서열번호 11로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 아미노산 서열을 갖는 항균 펩타이드 유사체.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 항균 펩타이드 유사체는 C-말단이 아미드화(amidation) 또는 메틸화(methylation) 된 것을 특징으로 하는 항균 펩타이드 유사체.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 항균 펩타이드 유사체는 N-말단이 아세틸화(acetylation) 또는 팔미토일화(palmitoylation) 된 것을 특징으로 하는 항균 펩타이드 유사체.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 펩타이드 유사체는 그람 양성균, 그람 음성균 및 효모(yeast)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상에 항균 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 항균 펩타이드 유사체.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 펩타이드 유사체는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스타필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis), 스타필로코커스 뮤탄스(Staphylococcus mutans), 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes)), 대장균(E. coli) D31, 대장균(E. coli) ML35p, 시겔라 플렉스네리(Shigella flexneri), 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 비브리오 파라헤몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus) 및 칸디다 알비칸스(Candida albicans)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상에 항균 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 항균 펩타이드 유사체.
  11. 제1항의 항균 펩타이드 유사체를 유효성분으로 포함하는 항균용 약학 조성물.
  12. 제1항의 항균 펩타이드 유사체를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 세균으로 인한 감염성 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물.
  13. 제1항의 항균 펩타이드 유사체를 유효성분으로 포함하는 항균용 화장료 조성물.
  14. 제13항에 있어서,
    용액, 분말, 에멀션, 로션, 분사, 연고, 에어로졸, 크림 또는 거품의 형태인 것을 특징으로 하는 조성물.
  15. 제1항의 항균 펩타이드 유사체를 유효성분으로 포함하는 항균용 식품 첨가제.
  16. 제1항의 항균 펩타이드 유사체를 유효성분으로 포함하는 사료 첨가제.
  17. 제1항의 항균 펩타이드 유사체를 유효성분으로 포함하는 위생용품.
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