WO2020256387A1 - Romo1 유래 항균 펩타이드 및 그 변이체 - Google Patents

Romo1 유래 항균 펩타이드 및 그 변이체 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to an antimicrobial peptide derived from Romo1 protein, and specifically, antimicrobial against Gram-positive, Gram-negative, and multidrug-resistant bacteria in various peptides having an amino acid sequence of the second alpha-helix ( ⁇ -helix 2) region of Romo1 protein. It is to provide an antimicrobial composition including each of the peptides and each peptide by checking the activity.
  • WHO World Health Organization
  • carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii and carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa as bacteria that are at a critical priority in many multidrug resistant bacteria.
  • carbapenem-resistant Enterobacteriaceae sp. carbapenem-resistant Enterobacteriaceae sp.
  • gram-negative superbacteria which are resistant to carbapenem-based antibiotics known as the last antibiotic, should be solved first.
  • bacteremia refers to a case where bacteria are alive in the blood, and sepsis is caused by the direct or indirect effects of infection.
  • sepsis is a systemic inflammatory reaction syndrome that occurs when bacteria invading the human body are infected with blood, and the survival rate is less than 30% after 6 hours after infection.
  • Septicemia causative bacteria are very diverse, including streptococcus, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, pneumococcus, Pseudomonas aeruginosa, and fungi, and it is difficult to treat them due to the diversity of these sepsis-causing bacteria.
  • the treatment of sepsis is the best treatment for the purpose of alleviating symptoms, such as suppressing the immune response or inhibiting blood clotting, and for the fundamental treatment, it is necessary to identify bacteria to identify the bacteria that the patient is infected with.
  • the time required for bacterial identification is not secured due to an immediate systemic inflammatory reaction caused by sepsis.
  • the causative agent of sepsis has been successfully identified, there is a problem in that there is no drug suitable for treatment when the causative agent is a multidrug-resistant bacteria resistant to antibiotics. Accordingly, there is a need to develop antibiotics having antibacterial activity against a wide range of bacteria without identification of sepsis causative bacteria, and in particular, development of antibiotics having antibacterial activity against multidrug resistant bacteria is required.
  • Non-Patent Document 1 WHO, Global Priority List of Antibiotic-Resistant Bacteria to Guide Research, Discovery, and Development of New Antibiotics (2017. 2. 27)
  • Non-Patent Document 2 Lee et al., J. Cell Biol., 217, 2059-2071, 2018
  • An object of the present invention is to provide an antimicrobial peptide derived from Romo1 protein and a modified antimicrobial peptide obtained by substituting or deleting some of the amino acids of the peptide.
  • an object of the present invention is to provide an antibiotic comprising the antibacterial peptide as an active ingredient and food and feed additives, a cosmetic composition, a biological pesticide, and a quasi-drug composition for antibacterial comprising the antibacterial peptide.
  • One aspect includes a sequence of 7 to 28 amino acids contiguous in the carboxy (C-) terminal direction based on any amino acid selected from the 52 to 79 th amino acid region of the Romo1 protein sequence consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 It provides antibacterial peptides.
  • an antibacterial peptide in which one or more amino acid sequences constituting the antibacterial peptide are substituted or deleted.
  • the peptide may include any one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2 to 15, or may be a peptide consisting of the amino acid sequence.
  • the peptide may include any one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 16, 30, 40, and 45, or may be a peptide consisting of the amino acid sequence.
  • the peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16 may be formed of, for example, any one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 17 to 29.
  • the peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30 may be formed of, for example, any one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 31 to 39.
  • the peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40 may be formed of, for example, any one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 41 to 44.
  • the peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 45 may be formed of, for example, any one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 46 to 47.
  • it may be a peptide comprising any one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 17 to 25, 27, 34, 37, 39, 42, and 44 or consisting of the amino acid sequence, , More preferably, it may be a peptide comprising one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 22, 23, and 24 or consisting of the amino acid sequence.
  • the peptide comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13;
  • it may be an antimicrobial peptide consisting of a sequence comprising at least one amino acid substitution of the following (a) to (h) with respect to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13.
  • the antimicrobial peptide may be one in which at least one methionine is substituted with norleucine or isoleucine.
  • the antimicrobial peptide is any one of the 3, 4, 5, 7, 8, 9, 11, 17, 18, and 19th amino acids is deleted; Alternatively, the 3rd or 4th amino acid and the 7th or 8th amino acid may be deleted.
  • the antimicrobial peptide may further include an amino acid sequence linked to the C-terminus, and the amino acid sequence linked to the C-terminus may consist of a sequence in which 1 to 3 R or K repeats.
  • the peptide may be one or more amino acid sequences modified (modification).
  • the mutation may be PEGylation, acetylation, carboxylation, lipidation, or amidation.
  • the amino acids constituting the peptide may each independently be an L-type or D-type amino acid, and may be a radiation or fluorescently labeled amino acid analog.
  • the peptide may have antibacterial activity against one or more bacteria selected from the group consisting of Gram-positive bacteria, Gram-negative bacteria, and multi-drug resistant bacteria.
  • the Gram-positive bacteria are Staphylococcus sp. , Bacillus sp. , Enterococcus sp. , Streptomyces sp. , and Streptococcus sp. ( Streptococcus sp.
  • It may be a bacterium belonging to one genus selected from the group consisting of, and preferably, the Gram-positive bacteria are Staphylococcus aureus , Bacillus subtilis , Enterococcus faecium faecium ), Streptomyces Sindenensis , Enterococcus faecalis , and Streptococcus pneumoniae.It may be one or more bacteria selected from the group consisting of.
  • the Gram-negative bacteria are Escherichia sp. , Klebsiella sp. , Acinetobacter sp. , Pseudomonas sp. , and Enterobacter sp. It may be a bacterium belonging to one genus selected from the group consisting of the genus ( Enterobacter sp. ), and preferably, the gram-negative bacteria are Escherichia coli , Klebsiella pneumoniae , and Acineto It may be one or more bacteria selected from the group consisting of Bacter Baumannii ( Acinetobacter baumannii ), Pseudomonas aeruginosa , and Enterobacter aerogenes .
  • the multidrug resistant bacteria are penicillins, carbapenems, cephalosporins, quinolones, macrolides, and tetracyclins.
  • the multidrug resistant bacteria is methicillin-resistant Staphylococcus sp. ), multidrug resistant.
  • Multidrug-resistant Pseudomonas sp. Vancomycin-resistant Enterococcus sp.
  • multidrug-resistant Klebsiella sp. multidrug-resistant Acinetobacter sp. Resistant Acinetobacter sp. ), and vancomycin-resistant Staphylococcus sp. It may be a bacterium belonging to one genus selected from the group consisting of.
  • the multidrug resistant bacteria are methicillin-resistant S. aureus , multidrug-resistant P. aeruginosa , and multidrug-resistant A. aeruginosa . baumannii ), multidrug-resistant K. pneumoniae , vancomycin-resistant E. faecium , and vancomycin-resistant S. aureus . It may be one or more bacteria selected from the group consisting of.
  • the multidrug resistant Pseudomonas aeruginosa is piperacilin, piperacilin-tazobactam, ceftazidime, imipenem, meropenem, gentamicin ( gentamicin), amikacin, and ciprofloxacin may have resistance to at least one antibiotic selected from the group consisting of, and the multidrug-resistant Acinetobacter Baumani is piperacillin, piperacillin.
  • Tazobactam, ceftazidim, imipenem, meropenem, gentamicin, amikacin, ciprofloxacin, and cefepime may have resistance to at least one antibiotic selected from the group consisting of, and the multi-drug resistant cleb
  • Ciella pneumoniae may be one having resistance to one or more antibiotics selected from the group consisting of piperacillintazobactam, ceftazidim, cefepime, imipenem, gentamicin, and ciprofloxacin.
  • the vancomycin-resistant Enterococcus faecium is selected from the group consisting of rifampin, tetracycline, gentamicin, erythromycin, streptomycin, and ampicillin in addition to vancomycin. It may additionally have resistance to one or more antibiotics, and the vancomycin-resistant Staphylococcus aureus is selected from the group consisting of oxacillin, benzylpenicillin, ampicillin, and cefazolin in addition to vancomycin. It may have additional resistance to one or more antibiotics.
  • Another aspect provides an antibiotic comprising the antibacterial peptide as an active ingredient.
  • Another aspect provides a pharmaceutical composition for preventing or treating bacterial infections comprising the antibacterial peptide as an active ingredient.
  • Another aspect provides a method for preventing or treating bacterial infections comprising administering the antimicrobial peptide to an individual.
  • Another aspect provides the use of the antimicrobial peptide for the manufacture of a medicament for preventing or treating bacterial infections.
  • the bacterial infection is selected from the group consisting of skin infections, food poisoning, otitis media, cystitis, peritonitis, urinary tract infections, mastitis, pneumonia, endocarditis, conjunctivitis, arthritis, endometritis, mesenchymal disease, bacteremia, sepsis, and acne. It may be one or more diseases, preferably pneumonia or sepsis.
  • Another aspect provides an antibacterial quasi-drug composition, a cosmetic composition, a food additive, and a feed additive comprising the antibacterial peptide.
  • the Romo1-derived peptide of the present invention and its variants have higher antibiotic ability against various kinds of bacteria than conventional antibiotics and antibiotic peptides, so that various causative bacteria can be simultaneously removed from the blood of patients with bacterial infectious diseases at the same time.
  • the peptide of the present invention can be provided as a prevention or therapeutic agent for infectious diseases caused by multi-drug-resistant bacteria by exerting high antimicrobial ability against bacteria having antibiotic resistance.
  • the Romo1-derived peptide of the present invention and its variants have a low probability of obtaining resistance, low toxicity, and in particular, have a higher antibacterial ability than existing antimicrobial peptides in the blood, so that the purpose of preventing or treating a wide range of bacterial infections As a result, it is expected to be used in various fields such as medicine, external use of medicine, food and feed addition, pesticide and cosmetics addition.
  • 1 is a diagram showing a comparison of antimicrobial activity against gram-positive and gram-negative bacteria between KU-5878 and conventional antibacterial peptides (LL-37, plugin 2, and daptomycin).
  • FIG. 2 is a diagram comparing antimicrobial activity of KU-5878 with conventional antibacterial peptides (LL-37, plugin 2, and daptomycin) against multidrug resistant bacteria.
  • FIG. 3 is a diagram showing a comparison of antimicrobial activity against gram-positive and gram-negative bacteria between KU-5878 and a conventional antibiotic (imipenem).
  • FIG. 4 is a diagram comparing antimicrobial activity of KU-5878 and a conventional antibiotic (imipenem) against multidrug-resistant bacteria.
  • FIG. 5 is a diagram comparing toxicity of KU-5878 and conventional antibacterial peptides (plugin 2 and melittin) to human vascular endothelial-derived cell lines (HUVEC cells).
  • Figure 6 shows KU-5878 and KU-5878 variants (KU-5878-K4 and KU-5878-K4-D) and conventional antimicrobial peptides (LL-37, plugin 2, and melittin) on red blood cells of mice. This is a diagram comparing toxicity through the degree of hemolysis of red blood cells.
  • Romo1 (Reactive oxygen species modulator 1) protein is a membrane protein located in the inner membrane of the mitochondria, and is involved in the production of active oxygen in mitochondria, TNF- ⁇ signaling, cell aging, cancer progression and invasion, and mitochondrial protein transport. Is known.
  • the structure of the Romo1 protein is a protein containing two alpha helixes. The first alpha helix ( ⁇ -helix 1) is mainly composed of hydrophobic amino acids, and the second alpha helix ( ⁇ -helix 2) is both hydrophilic and hydrophobic. Has.
  • the present inventors excluded from the study because the ⁇ -helix 1 region of the Romo1 protein is not well soluble in water, and synthesized peptides of various lengths having the amino acid sequence (52-79 aa) of the ⁇ -helix 2 region
  • the present invention was completed by confirming the activity and confirming the antimicrobial activity from the mutant of the peptide.
  • the present inventors synthesize several kinds of peptides containing consecutive amino acid sequences, but having different lengths, based on one amino acid selected from the 52-79 amino acid region of the Romo1 protein, and The antibacterial activity of each of the peptides against Staphylococcus aureus was confirmed using a bactericidal minimum concentration measurement method.
  • antimicrobial activity against Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus was confirmed in all of the peptides containing 18 consecutive amino acid sequences based on arbitrary amino acids in the 52-62 amino acid region of the Romo1 protein.
  • Excellent antimicrobial activity was confirmed in the KU-5878 peptide containing the 78 amino acid sequence (see Example 1).
  • the present inventors provide an antibacterial peptide derived from Romo1.
  • Romo1-derived peptide is a peptide containing a contiguous amino acid sequence within the 52-79 amino acid region of Romo1 protein composed of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and "peptide” refers to amino acid residues by peptide bond It refers to a linear molecule formed by bonding to each other.
  • the Romo1-derived peptide may be obtained by fragmenting the Romo1 protein, and may be prepared according to a chemical synthesis method known in the art, particularly a solid-phase synthesis technique or a liquid-phase synthesis technique.
  • the Romo1-derived peptide of the present invention includes an amino acid sequence that is continuous based on an arbitrary amino acid in the 52 to 79th amino acid region of the Romo1 protein sequence consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, it is limited to its length. No, it may be preferably 7 to 28 mer, more preferably 18 to 28 mer.
  • the antimicrobial peptide may include a sequence of 18 amino acids contiguous based on any amino acid in the 52-62 amino acid region of the Romo1 protein sequence, preferably the group consisting of SEQ ID NO: 2-15, more preferably For example, it may include any one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 5, 8, 9, 13, and 14.
  • amino acid sequences are listed in the order of N-terminus to C-terminus, and "contiguous amino acid sequence” refers to an amino acid selected in a specific region of the Romo1 protein sequence, which is continuous in the C-terminal direction of the reference amino acid. It means an amino acid sequence.
  • sequence of 7 to 28 amino acids consecutive based on any amino acid selected in a specific region of the Romo1 protein includes a reference amino acid selected in a specific region of the Romo1 protein, and the C-terminal of the reference amino acid It means a total of 7 to 28 amino acid sequences, including amino acid sequences that are continuous in the direction.
  • the present inventors selected as a representative a KU-5878 peptide comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13, and Staphylococcus aureus, Bacillus aureus, Enterococcus, Streptomyces syndenensis, Enterococcus faecalis, Streptococcus pneumoniae, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter Baumani, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter aerogenes, Methicillin-resistant Staphylococcus aureus, The antimicrobial activity of the peptide against multidrug resistant Pseudomonas aeruginosa, multidrug resistant Acinetobacter Baumani, multidrug resistant Klebsiella pneumoniae, vancomycin resistant Enterococcus faecium, and vancomycin
  • each amino acid constituting KU-5878 is selected according to its properties: X 1 X 1 MMX 1 X 1 GGX 1 FGX 1 FMAIGMGIR (SEQ ID NO: 16), KTX 2 X 2 QSGGTFGTFX 2 AX 2 GX 2 GX 2 R (SEQ ID NO: 30), KTMMQSGGTX 3 GTX 3 MAIGMGIR (SEQ ID NO: 40), and KTMMQSX 4 X 4 TFX 4 TFMX 4 IX 4 MX 4 IR (SEQ ID NO: 45), each X 1 to A peptide substituted with the amino acid of X 4 was synthesized and its antimicrobial activity was confirmed.
  • the present inventors confirmed a change in antimicrobial activity when an amino acid containing a hydrophilic residue is substituted with an amino acid containing a positive charge in the KU-5878 peptide.
  • the position of the amino acid including the hydrophilic residue in the KU-5878 peptide is represented by X 1 in SEQ ID NO: 16, and the amino acids at the X 1 position were each independently substituted.
  • Changes in antimicrobial activity when a hydrophilic amino acid in the ⁇ -helix 2 region of the Romo1 protein is substituted with an amino acid containing a positive charge (R, H or K) or another hydrophilic amino acid (T, S, Q, or N) was confirmed. As a result, it was found that the antibacterial activity was maintained or exhibited superior antibacterial activity (see Example 4-1).
  • the present inventors use methionine (M) or isoleucine (I) in the KU-5878 peptide to contain a hydrophobic residue and have similar amino acids (M, L, I, V, or Nle) and in the case of substitution with an amino acid (F, Y, or W) having a different structure but containing a hydrophobic residue, the change in antimicrobial activity was confirmed.
  • methionine (M) and isoleucine (I) are represented by X 2 in SEQ ID NO: 30, and the amino acids at the X 2 position were each independently substituted.
  • the present inventors use phenylalanine (F) containing a hydrophobic residue in the KU-5878 peptide as a hydrophilic amino acid or a hydrophobic amino acid having a similar structure (F, Y, or W) or its structure.
  • F phenylalanine
  • M hydrophobic amino acids
  • W tryptophan
  • the present inventors confirmed a change in antimicrobial activity when alanine (A) or glycine (G) in KU-5878 is substituted with glycine or alanine, respectively.
  • alanine and glycine are represented by X 4 in SEQ ID NO: 45, and the amino acids at the X 4 position were each independently substituted.
  • the Romo1-derived peptide of the present invention includes a sequence of 7-28 amino acids consecutive based on an arbitrary amino acid in the region 52-79 of Romo1, and one or more amino acid substitutions within a range showing its antibacterial activity. ) Can be included.
  • the present inventors selected KU-5878-K4 as a representative and confirmed antibacterial activity against various bacteria in order to confirm the scope of the KU-5878 variant. As a result, it was found that KU-5878-K4, like KU-5878, exhibited broad antimicrobial activity in all of Gram-positive bacteria, Gram-negative bacteria, and multi-drug resistant bacteria (see Example 4-2).
  • the inventors of the present invention in the case of a peptide in which some or all of the amino acids constituting KU-5878 and KU-5878-K4 are substituted with D-type amino acids through specific examples also exhibit antibacterial activity similar to that of KU-5878.
  • the antimicrobial activity of KU-5878 and KU-5878-K4 was significantly reduced, but it was found that the antimicrobial activity was reduced in the case of a variant substituted with a D-type amino acid (see Example 4-6).
  • the amino acids constituting the Romo1-derived peptide of the present invention may each independently be in an L-form or D-form, and each amino acid may be an amino acid analog, a radiation labeling amino acid, or a fluorescent tag amino acid.
  • the Romo1-derived peptide of the present invention can induce modification of the amino (N-) terminal or the carboxy (C-) terminal in order to select a portion of the amino acid sequence and increase its activity.
  • the peptide of the present invention can have an increased half-life when administered in vivo.
  • the present inventors confirmed that the antimicrobial activity was increased in the case of the KU-5878 variant in which the C-terminus was amidated through specific examples (see Example 5).
  • the amino terminal of the Romo1-derived peptide of the present invention may be bonded with an acetyl group, a fluorenyl methoxycarbonyl group, a formyl group, a palmitoyl group, a myristyl group, a stearyl group, and a protecting group such as polyethylene glycol (PEG).
  • the carboxy terminal of the peptide may be modified with a hydroxy group (-OH), an amino group (-NH 2 ), an azide (-NHNH 2 ), and the like.
  • fatty acids oligosaccharides chains, all nanoparticles (gold particles, liposomes, heparin, hydrogel, etc.), amino acids, carriers at the end of the peptide of the present invention or the R-group of amino acids It can bind carrier proteins and the like. Modification of the amino acid described above serves to improve the potency and stability of the peptide of the present invention.
  • the term "stability” means not only in vivo stability, but also storage stability (including storage stability at room temperature, refrigeration, and freezing).
  • the antimicrobial peptide derived from Romo1 of the present invention may be a peptide in which one or more amino acid sequences constituting it have been deleted. According to the above, antimicrobial activity was also confirmed in the peptides in which one or more amino acids constituting the Romo1-derived peptide of the present invention were substituted, modified, or deleted.
  • the present invention is a Romo1-derived peptide variant. Can be provided as an antibacterial peptide.
  • variant refers to a peptide in which one or more amino acids constituting the Romo1-derived peptide are substituted, modified, and/or deleted within a range showing antibacterial activity, and antimicrobial activity If indicated, it is not limited to a variant exhibiting superior antimicrobial activity than the Romo1-derived peptide of the present invention.
  • the antimicrobial peptide of the present invention comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13;
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 may be composed of a sequence including at least one amino acid substitution of the following (a) to (h).
  • (A) is the 1st amino acid K is substituted with R
  • (b) is the 2nd amino acid T is substituted with K or R
  • (c) is the 5th amino acid Q is substituted with K or R
  • (d) is the 6th Amino acid S is substituted with K, R, or H
  • (e) is the 9th amino acid T is substituted with K or R
  • (f) is the 10th amino acid F is substituted with W
  • (g) is the 16th amino acid I is L
  • (h) may be a substitution of G or L for the 20th amino acid I. According to Examples 8 and 9, the present inventors have confirmed that the antibacterial effect of the peptide is improved when the amino acid sequence of KU-5878 is substituted with any one of the above (a) to (h).
  • the antimicrobial peptide may be one in which at least one methionine is substituted with norleucine or isoleucine.
  • norleucine has the same structure except that sulfur (S) is substituted with carbon
  • isoleucine has a common point of having an alkyl substituent having the same number of carbons as compared to norleucine.
  • the present inventors have confirmed that the antibacterial activity is improved by substituting 1 to 4 of 4 methionines on the amino acid sequence of KU-5878 with norleucine. (See Table 13)
  • the antimicrobial peptide is any one of the 3, 4, 5, 7, 8, 9, 11, 17, 18, and 19th amino acids is deleted; Alternatively, the 3rd or 4th amino acid and the 7th or 8th amino acid may be deleted. According to Examples 6 and 7 of the present application, when any one of the 3, 4, 5, 7, 8, 9, 11, 17, 18, and 19th amino acids of KU-5878 is deleted, the antibacterial activity is increased, and KU-5878 The same effect can be expected for peptides in which some amino acids are substituted.
  • the antimicrobial peptide may further include an amino acid sequence linked to the C-terminus, and the amino acid sequence linked to the C-terminus may consist of a sequence in which 1 to 3 R or K repeats.
  • the present inventors confirmed that the addition of an amino acid sequence consisting of RRR or KK to the C-terminus of KU-5878 increases antibacterial activity.
  • the Romo1-derived peptide of the present invention and its variants have antibacterial activity against Gram-positive bacteria, Gram-negative bacteria, and multidrug-resistant bacteria.
  • the present invention is a pharmaceutical for the prevention or treatment of bacterial infectious diseases comprising the antibacterial peptide as an active ingredient.
  • the appropriate composition can be provided.
  • Non-limiting examples of the positive bacteria The Gram that Romo1-derived peptides and the variants of the present invention interfere with the proliferation and / or growth is Staphylococcus genus (Staphylococcus sp.), Bacillus genus (Bacillus sp.), Enterococcus genus (Enterococcus sp. ), Streptomyces sp. , and Streptococcus sp.
  • Staphylococcus aureus preferably Staphylococcus aureus , Bacillus subtilis , Enterococcus faecium faecium ), Streptomyces Sindenensis , Enterococcus faecalis , and/or Streptococcus pneumoniae .
  • non-limiting examples of the Gram-negative bacteria in which the Romo1-derived peptide of the present invention and its mutant interfere with the proliferation and/or growth thereof include Escherichia sp. , Klebsiella sp. , and Acineto. Bacter ( Acinetobacter sp. ), Sudomonas ( Pseudomonas sp. ), and Enterobacter sp. , etc., but preferably Escherichia coli ( Escherichia coli ), Klebsiella pneumoniae ( Klebsiella pneumoniae ), Acinetobacter baumannii , Pseudomonas aeruginosa , and/or Enterobacter aerogenes .
  • the Romo1-derived peptide of the present invention and its variants have antimicrobial activity against multi-drug resistant bacteria, and the multi-drug resistant bacteria that interfere with the proliferation and/or growth of the Romo1-derived peptide and its variants are penicillins, kava.
  • the multi-drug resistant bacteria that interfere with the proliferation and/or growth of the Romo1-derived peptide and its variants are penicillins, kava.
  • It may be the Gram-positive or Gram-negative bacteria having resistance, preferably methicillin-resistant Staphylococcus sp. , multidrug-resistant Pseudomonas sp. , and Vancomycin-resistant Enterococcus sp.
  • vancomycin-resistant Enterococcus sp. multidrug-resistant Klebsiella sp. , multidrug-resistant Acinetobacter sp. , and/or vancomycin-resistant staphylococcus sp. resistant Staphylococcus sp. ).
  • the present invention can provide a pharmaceutical composition comprising a Romo1-derived peptide and/or a variant thereof as an active ingredient, that is, an antibiotic, and the "bacterial infection disease" to which the pharmaceutical composition of the present invention is the object of prevention or treatment is described above.
  • It may be a disease caused by infection with Gram-positive bacteria, Gram-negative bacteria, and/or multidrug-resistant bacteria, and preferably skin infections, food poisoning, otitis media, cystitis, peritonitis, urinary tract infections, mastitis, pneumonia, endocarditis, caused by the bacterial infection, It may be conjunctivitis, arthritis, endometritis, adenitis, bacteremia, sepsis, and/or acne, and more preferably sepsis or pneumonia.
  • the present invention provides a method for preventing or treating bacterial infectious diseases comprising administering a Romo1-derived peptide and/or a variant thereof to an individual.
  • the term "individual” is not limited if it is a mammal, but may preferably be a human or livestock.
  • prevention refers to all actions of delaying the infection of the Gram-positive bacteria, Gram-negative bacteria, and/or multidrug-resistant bacteria by administration of the pharmaceutical composition according to the present invention, or delaying the onset of diseases caused by the infection. It means, and treatment refers to any action in which symptoms due to the bacterial infection are improved or beneficially changed by administration of the pharmaceutical composition according to the present invention.
  • the pharmaceutical composition may further include one or more known antibiotics in addition to the Romo1-derived peptide and/or its variants, and suitable carriers and excipients commonly used in the manufacture of pharmaceutical compositions , And a diluent may be further included.
  • carrier is also called a vehicle, and means a compound that facilitates the addition of proteins or peptides into cells or tissues.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • diot is defined as a compound diluted in water that not only stabilizes the biologically active form of the protein or peptide of interest, but also dissolves the protein or peptide.
  • Salts dissolved in buffer solutions are used as diluents in the art.
  • a commonly used buffer solution is phosphate buffered saline, because it mimics the salt state of human solutions. Since buffer salts can control the pH of a solution at low concentrations, buffer diluents rarely alter the biological activity of the compound.
  • the compounds containing azelaic acid as used herein may be administered to a human patient as such, or as a pharmaceutical composition mixed with other ingredients, such as in combination therapy, or with a suitable carrier or excipient.
  • the pharmaceutical composition for the prevention or treatment of bacterial infectious diseases comprising the Romo1-derived peptide and/or its variant according to the present invention as an active ingredient, respectively, according to a conventional method, powders, granules, tablets, capsules, suspensions, It can be formulated and used in the form of external preparations such as emulsion, syrup, aerosol, and sterile injectable solutions, and the antimicrobial composition of the present invention is administered orally or parenterally according to a desired method (e.g., intravenous, subcutaneous, Intraperitoneal or topical application), and the dosage varies depending on the condition and weight of the patient, the degree of disease, the form of the drug, the route and duration of administration, but may be appropriately selected by those skilled in the art.
  • a desired method e.g., intravenous, subcutaneous, Intraperitoneal or topical application
  • the antimicrobial composition of the present invention may be administered once to several times a day as necessary, and may be used alone or in combination with surgery, hormone treatment, drug treatment, and methods of using a biological response modifier.
  • the Romo1-derived peptide of the present invention and/or a variant thereof can provide a quasi-drug composition for the purpose of preventing or improving bacterial infectious diseases
  • the quasi-drug composition of the present invention can be used together with other quasi-drug or quasi-drug components, It can be suitably used according to a conventional method.
  • the quasi-drug composition may be used as a disinfectant cleaner, shower foam, gagrin, wet tissue, detergent soap, hand wash, humidifier filler, mask, ointment, or filter filler, but is not limited thereto.
  • the Romo1-derived peptide of the present invention and/or a variant thereof may be provided in the form of a cosmetic composition.
  • Formulations of the cosmetic composition according to the present invention include skin lotion, skin softener, skin toner, astringent, lotion, milk lotion, moisture lotion, nutrition lotion, massage cream, nutrition cream, moisture cream, hand cream, foundation, essence, nutrition essence, It may be in the form of a pack, soap, cleansing foam, cleansing lotion, cleansing cream, body lotion, or body cleanser.
  • the cosmetic composition of the present invention in addition to the essential ingredients, it may be blended with other ingredients commonly used in cosmetics as needed.
  • the present invention provides a food composition or feed composition comprising a Romo1-derived peptide and/or a variant thereof as an active ingredient.
  • a food composition or feed composition comprising a Romo1-derived peptide and/or a variant thereof as an active ingredient.
  • the Romo1-derived peptide of the present invention and/or its variant may be added as it is or used with other foods, feeds, or components thereof, and conventional It can be used appropriately depending on the method.
  • the mixing amount of the active ingredient may be appropriately determined according to the purpose of use (prevention of infectious diseases, health or therapeutic treatment through inhibition of proliferation and growth of bacteria).
  • the Romo1-derived peptide of the present invention and/or a variant thereof is added in an amount of 15% by weight or less, preferably 10% by weight or less based on the raw material.
  • the amount may be below the above range, and there is no problem in terms of safety, so the active ingredient may be used in an amount above the above range.
  • the types of the food and feed There is no particular limitation on the types of the food and feed.
  • amino acid sequence is abbreviated as follows according to the IUPAC-IUB nomenclature.
  • Arginine (Arg, R), lysine (Lys, K), histidine (His, H), serine (Ser, S), threonine (Thr, T), glutamine (Gln, Q), asparagine (Asp, N), Methionine (Met, M), leucine (Leu, L), isoleucine (Ile, I), valine (Val, V), phenylalanine (Phe, F), tryptophan (Trp, W), tyrosine (Tyr, Y), Alanine (Ala, A), glycine (Gly, G), proline (Pro, P), cysteine (Cys, C), aspartic acid (Asp, D) glutamic acid (Glu, E), noleucine (Nle)
  • the Romo1 protein contains two alpha helixes ( ⁇ -helix).
  • the present inventors synthesized a second alpha-helix ( ⁇ -helix 2) region having both hydrophilic and hydrophobic properties, and confirmed its antibacterial activity using a minimum bactericidal concentration (MBC), which was KU- It was named 5279 (the 52-79 amino acid region of Romo1 protein).
  • MBC minimum bactericidal concentration
  • 5279 the 52-79 amino acid region of Romo1 protein.
  • several kinds of peptides containing consecutive amino acid sequences based on arbitrary amino acids in the 52-79 amino acid region of Romo1 protein are synthesized to measure the minimum concentration of bacteria sterilization.
  • the antimicrobial activity of each peptide was compared and confirmed through (see Table 1 below for information on each peptide). Confirmation of the antibacterial activity using the bactericidal minimum concentration measurement method of each of the peptides was specifically performed as follows.
  • Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853) and Staphylococcus aureus (ATCC 29213) were incubated in 3% (w/v) TSB (Tryptic Soy Broth) liquid medium at 37°C and 200 rpm for 4 hours, and then again under the same conditions.
  • the secondary culture was performed for 3 hours to a concentration of ⁇ 10 6 CFU/ml.
  • a strain solution was prepared by diluting with SP (Sodium phosphate buffer: 10 mM Sodium phosphate, 1% TSB) solution so that the final concentration of each strain of the secondary culture was 2 ⁇ 10 5 CFU/ml.
  • each peptide was dispensed at different concentrations (0 ⁇ g/ml to 300 ⁇ g/ml peptide) in each well of a 96-well microplate, and 100 ⁇ l (1 ⁇ 10 5 CFU/ml) of the prepared strain solution Then, the mixture was mixed and reacted in a 37°C incubator for 1 hour.
  • TS Tryptic Soy
  • 15 g/L of agar were dissolved in distilled water, sterilized, and then 25 ml of a 100 mm circular plate was poured and solidified at room temperature for more than one day.
  • the solution was plated at a constant size of 10 ⁇ l, and incubated for 18 hours in a 37°C incubator, and colony formation was confirmed on the plate.
  • the minimum bactericidal concentration was defined as the minimum concentration of peptides in which no colonies were generated, and the experimental results are shown in Table 1 below.
  • pCM19 and KU-5279 peptides showed similar bactericidal power, but in the case of pCM12, because of the low sterilizing power, it was impossible to measure the antimicrobial activity using the minimum bactericidal concentration measurement method. On the other hand, it was confirmed that the antimicrobial activity of the KU-5878 peptide composed of 21 amino acid residues was the most excellent, and the antimicrobial activity of KU-5878 was three times better than that of KU-5279.
  • Example 1 In order to confirm the kind of bacteria in which the peptide containing the 52-79 amino acid region or a partial region of the Romo1 protein whose antimicrobial activity was confirmed in Example 1 above exerts bactericidal power, KU-5878 among the synthetic peptides shown in Table 1 was used. As a representative, the antibacterial activity against the bacteria shown in Table 2 was measured using the bactericidal minimum concentration measurement method. The method for measuring the minimum bactericidal concentration of bacteria is the same as that of Example 1.
  • each bacterium was cultured in 3% (w/v) TSB liquid medium at 37° C. and 200 rpm for 4 hours, and then cultured again for 3 hours to a concentration of 5 ⁇ 10 6 CFU/ml under the same conditions. I did.
  • the strain solution was prepared by diluting with SP solution so that the final concentration of each strain in the secondary culture was 2 ⁇ 10 5 CFU/ml.
  • KU-5878 peptide was dispensed at different concentrations in each well of the 96-well microplate (0 ⁇ g/ml to 300 ⁇ g/ml peptide), and 100 ⁇ l (1 ⁇ 10 5 CFU/ml) of each of the prepared strains ) And mixed and reacted for 1 hour in a 37°C incubator.
  • multi-drug-resistant Pseudomonas aeruginosa, multi-drug-resistant acinetobacter, and multi-drug-resistant Klebsiella are bacteria isolated from patients at Korea University Anam Hospital, and in the case of multi-drug-resistant Pseudomonas aeruginosa, piperacilin, piperacillin ostrich Resistant to piperacilin-tazobactam, ceftazidime, imipenem, meropenem, gentamicin, amikacin, and ciprofloxacin antibiotics, multidrug Resistant acinetobacter is resistant to piperacillin, piperacillintazobactam, ceftazidim, imipenem, meropenem, gentamicin, amikacin, ciprofloxacin, and cefepime antibiotics, and multidrug resistant Klebsiella Piperacillin tazobactam, cef
  • Staphylococcus aureus as Gram-positive bacteria
  • Pseudomonas aeruginosa and Multidrug-resistant bacteria as Gram-negative bacteria
  • metacillin-resistant Staphylococcus aureus and multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa were selected as representatives, and the following experiment was performed.
  • Staphylococcus aureus, methicillin-resistant Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, or multi-drug-resistant Pseudomonas aeruginosa were cultured in 3% (w/v) TSB liquid medium at 37° C. and 200 rpm for 4 hours, and then again under the same conditions.
  • the secondary culture was performed for 3 hours to a concentration of ⁇ 10 9 CFU/ml.
  • the strain solution was prepared by diluting with PBS solution so that the final concentration of each strain in the secondary culture was 1 ⁇ 10 5 CFU/ ⁇ l.
  • a point approximately 1 cm from the end of the rat's tail was cut using surgical scissors, and 10 ⁇ l of blood at the end of the cut was collected and diluted in PBS.
  • the diluted blood samples were plated on a TSB agar plate prepared in advance, incubated for 18 hours in a 37°C incubator, and then the resulting colonies were counted and compared.
  • Example 2-2 in order to confirm the antimicrobial activity of KU-5878 peptide in vivo, Staphylococcus aureus as Gram-positive bacteria, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, and Acinetobacter Bau
  • Staphylococcus aureus as Gram-positive bacteria
  • Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aeruginosa
  • Klebsiella pneumoniae and Acinetobacter Bau
  • the following experiments were performed by selecting mani, multi-drug-resistant Pseudomonas aeruginosa, methicillin-resistant Staphylococcus aureus, multi-drug-resistant Klebsiella pneumoniae, and multidrug-resistant Acinetobacter Baumani.
  • the experimental method is the same as in Example 2-2. However, the final concentrations of each strain administered to mice are shown in Table 3 below, and the positive control group injected each of the bacteria into mice, and after 24 hours, 30 mg/kg of imipenem, a carbapenem-based antibiotic, was intraperitoneally injected (IP , Intraperitoneal injection), followed by intraperitoneal administration of the same amount of imipenem 4 times at intervals of 12 hours. The survival rates of each control group and experimental group were measured at 24 hour intervals.
  • mice injected with only Gram-positive or Gram-negative bacteria was 0-20%, 60% in the case of mice injected with KU-5878, and about 60% in the mice injected with imipenem. It showed a survival rate of 80%.
  • mice injected with only multidrug-resistant bacteria have a survival rate of 0-7%, mice injected with KU-5878 60-67%, and mice injected with imipenem 7-27% Shown.
  • Hubeck cells a cell line derived from human vascular endothelial cells, were cultured in a 96-well microplate, and the MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliurn bromide) reagent was at a concentration of 2 mg/ml. After dissolving in PBS, sterile filtered through a 0.2 ⁇ m membrane filter was prepared. PBS was used as a control.
  • the Huvec cell medium was freshly replaced, and KU-5878, melitin, or stopper 2 were dispensed at different concentrations (0 ⁇ g/ml to 300 ⁇ g/ml). Subsequently, 100 ⁇ l of MTT reagent was treated in each well and incubated at 37°C for 2 hours. Subsequently, the medium and peptide were carefully removed so as not to separate the cells, and 100 ⁇ l of DMSO (dimethyl sulfoxide) was added, and absorbance was measured at a wavelength of 570 nm with a spectrophotometer. The relative cell viability was calculated as a percentage of the viability of the control untreated cells.
  • Blood red blood cells were diluted with PBS, centrifuged at 900 g for 10 minutes, and washed three times. 100 ⁇ l of the diluted red blood cell solution (10% v/v PBS) was dispensed into a 96-well microplate, KU-5878, KU-5878-K4, KU-5878-K4-D, melittin, and plugin 2 , Or daptomycin was added, filled with PBS so that it became 200 ⁇ l, and incubated for 1 hour in 37° C. incubation to react. Subsequently, the supernatant of the reaction solution was separated and absorbance was measured at 550 nm wavelength using a spectrophotometer. As a control, PBS and 0.1% Triton X-100 solution were used.
  • % intact RBC 100 (%)- [(Peptide-treated red blood cell solution absorbance-PBS-treated red blood cell solution absorbance)/(Triton X-100-treated red blood cell solution-PBS-treated red blood cell solution absorbance) ⁇ 100 (%)]
  • KU-5878 hardly exhibited a hemolysis phenomenon even at a high concentration.
  • KU-5878-K4 and KU-5878-K4-D showed very little hemolysis of red blood cells compared to stopper 2, daptomycin, and melittin, and thus their toxicity to red blood cells was very low. And it was found.
  • the KU-5878 peptide confirming the non-toxic in the In vitro in vivo, in particular animal (object) in order to verify that exhibit toxicity to the object when injected in the blood vessels, into the tail vein of 10-week-old male mice (C57BL / 6) KU of -5878 was administered at a concentration of 100 mg/kg. At this time, the maximum volume of the injection volume was 150 ⁇ l. The behavior of the mice was observed for 1 hour after the injection, and then, the change in weight of the mice was measured for 12 days at 24 hour intervals.
  • the amino acid containing the hydrophilic residue of KU-5878 is substituted with lysine (K) or arginine (R) containing positive charges, and the antibacterial activity of the variant is sterilized by bacteria. Comparison was confirmed using the minimum concentration measurement method. The experiment was carried out in the same manner as in Example 1. Specific information of the KU-5878 variant and MBC values for each bacterium are shown in Table 4 below.
  • KU-5878-K4 was selected as a representative among the KU-5878 variants shown in Table 4, and the following table The antibacterial activity against bacteria shown in 5 was measured using the bactericidal minimum concentration measurement method. The method for measuring the minimum bactericidal concentration of bacteria was carried out in the same manner as in Example 1.
  • phenylalanine (F) containing a hydrophobic residue in KU-5878 was converted to a hydrophilic or amino acid having a different residue structure. After substitution, the antibacterial activity was compared and confirmed using the sterilization minimum concentration measurement method. The experiment was carried out in the same manner as in Example 1. Specific information of the KU-5878 variant and MBC values for each bacterium are shown in Table 7 below.
  • Example 4-4 alanine (A) or glycine (G) in KU-5878 was replaced with glycine or alanine, respectively, and then the antimicrobial activity was compared and confirmed using a bactericidal minimum concentration measurement method.
  • the experiment was carried out in the same manner as in Example 1. Specific information of the KU-5878 variant and MBC values for each bacterium are shown in Table 8 below.
  • peptides (KU-5878-D(all) and KU-5878-K4-D) in which the amino acids constituting KU-5878 and KU-5878-K4 were substituted with D-type amino acids. It was synthesized and its antimicrobial activity was compared and confirmed.
  • KU-5878-K4-D is a peptide in which lysine amino acid residues 59, 62, 63 and 66 in KU-5878-K4 are substituted with D-type amino acids
  • KU-5878-D(all) is KU It is a peptide obtained by substituting all amino acids of -5878 with D-type amino acids.
  • the first sterilization concentration of each peptide was measured in the same manner as in Example 1 by varying the presence or absence of bovine serum, and the results are shown in Table 9 below.
  • Bovine serum X Bovine serum O Staphylococcus aureus MBC value ( ⁇ g/ml) Pseudomonas aeruginosa MBC value ( ⁇ g/ml) Staphylococcus aureus MBC value ( ⁇ g/ml) Pseudomonas aeruginosa MBC value ( ⁇ g/ml) KU-5878 100 100 300 300 KU-5878-D(all) 300 300 >500 >500 KU-5878-K4 3 4 40 32 KU-5878-K4-D 3 3 25 20
  • Peptide Amino acid sequence Staphylococcus aureus MBC value ( ⁇ g/ml) Pseudomonas aeruginosa MBC value ( ⁇ g/ml) KU-5878-NH 2 KTMMQSGGTFGTFMAIGMGIR 70 60
  • Antibacterial activity evaluation is disclosed in Table 11 below.
  • antimicrobial activity increased when amino acids 60, 61, 62, 64, 65, 66, 68, 74, 75, or 76 were deleted.
  • the 61st M deletion is the same as the 60th M deletion
  • the 65th G deletion is the same as the 64th G deletion.
  • Peptide name Amino acid sequence MBC Increased activity Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus CRPA MRSA 5878 KTMMQSGGTFGTFMAIGMGIR 100 100 110 100 5878-d58K -TMMQSGGTFGTFMAIGMGIR 300 300 300 >300 5878-d59T K-MMQSGGTFGTFMAIGMGIR 150 150 150 5878-d60M KT-MQSGGTFGTFMAIGMGIR 90 90 90 100 O 5878-d61M KTM-QSGGTFGTFMAIGMGIR 90 90 100 O 5878-d62Q KTMM-SGGTFGTFMAIGMGIR 100 90 100 100 O 5878-d63S KTMMQ-GGTFGTFMAIGMGIR 200 200 200 200 5878-d64G KTMMQS-GTFGTFMAIGMGIR 100 100 110 100 O 5878-d65G KTMMQSG-TFGTFMAIGMGIR 100 100 110 100 110
  • Example 7 Evaluation of antimicrobial activity of peptides with deletion of two or more amino acids in KU-5878
  • the 60th M deletion is the same as the 61st M deletion
  • the 64th G deletion is the same as the 65th G deletion.
  • Peptide name Amino acid sequence MBC Increased activity Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus CRPA MRSA 5878-d60M, d64G KT-MQS-GTFGTFMAIGMGIR 100 100 100 110 O 5878-d71M, d75M KTMMQSGGTFGTF-AIG-GIR 300 250 300 300 5878-d60M, d72A, d75M KT-MQSGGTFGTFM-IG-GIR 300 280 300 300 5878-d64G, d71M, d76G KTMMQS-GTFGTF-AIGM-IR 200 200 200 200 5878-d60M, d64G, d72A, d75M KT-MQS-GTFGTFM-IG-GIR 120 100 120 120 5878-d60M, d64G, d71M, d72A, d75M KT-MQS-GTFGT
  • the first amino acid K is substituted with R
  • the second amino acid T is substituted with K or R
  • the fifth amino acid Q is substituted with K or R
  • the sixth amino acid S is substituted with K, R, or H.
  • substitution of 9th amino acid T with K or R, 10th amino acid F with W, 16th amino acid I with L, and 20th amino acid I with G or L increased antibacterial activity.
  • Peptide name Amino acid sequence MBC Increased activity Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus CRPA MRSA KU-5878 KTMMQSGGTFGTFMAIGMGIR 100 100 110 110 KU-5878-T59K KKMMQSGGTFGTFMAIGMGIR 50 40 50 50 O KU-5878-Q62K KTMMKSGGTFGTFMAIGMGIR 90 80 90 90 O KU-5878-S63K KTMMQKGGTFGTFMAIGMGIR 60 50 50 50 O KU-5878-T66K KTMMQSGGKFGTFMAIGMGIR 80 60 70 80 O KU-5878-T69K KTMMQSGGTFGKFMAIGMGIR 140 130 150 150 KU-5878-T59R KRMMQSGGTFGTFMAIGMGIR 30 25 30 30 O KU-5878-Q62R KTMMRSGGTFGTFMAIGMGIR 80 80 80 90 O KU-5878-S63R
  • Example 9 Identification of antimicrobial activity of polysubstituted peptides based on amino acid substitution at No. 59 in KU-5878
  • substitution positions of T59K, Q62K, S63K, and T66K correspond to amino acids 2, 5, 6, and 9 based on SEQ ID NO: 13.
  • Peptide name Amino acid sequence MBC Increased activity Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus CRPA MRSA KU-5878 KTMMQSGGTFGTFMAIGMGIR 100 100 110 110 KU-5878-T59K KKMMQSGGTFGTFMAIGMGIR 50 40 50 50 O KU-5878-K2(T59K,Q62K) KKMMKSGGTFGTFMAIGMGIR 8 8 6 8 O KU-5878-K3(T59K,Q62K,S63K) KKMMKKGGTFGTFMAIGMGIR 4 4 4 5 O KU-5878-K4(T59K,Q62K,S63K,T66K) KKMMKKGGKFGTFMAIGMGIR 4 3 3 4 O
  • Peptide name Amino acid sequence MBC Increased activity Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus CRPA MRSA 5878-3R KTMMQSGGTFGTFMAIGMGIR RRR 8 8 8 10 O 5878-KK KTMMQSGGTFGTFMAIGMGIRK K 15 16 16 16 O 5878-Q KTMMQSGGTFGTFMAIGMGIR Q 150 180 180 180

Abstract

본 발명은 Romo1 단백질 유래의 항균 펩타이드에 관한 것으로서, 구체적으로 Romo1 단백질의 두 번째 알파 헬릭스(α-helix 2) 영역의 아미노산 서열을 갖는 다양한 펩타이드에서 그람 양성, 그람 음성, 및 다제내성 박테리아에 대한 항균 활성을 확인하여 상기 각 펩타이드와 각 펩타이드를 포함하는 항균용 조성물 등을 제공하는 것이다. 본 발명의 Romo1 유래 펩타이드 및 그 변이체는 기존의 항생물질 및 항생 펩타이드보다 다양한 종류의 세균과 다제내성 박테리아에 대해 보다 우수한 항생능력을 가지고, 특히 혈관 내에서 다양한 박테리아에 대한 항균 활성을 가짐으로써, 새로운 항생제로 광범위한 세균 감염성 질환의 예방 또는 치료를 위한 물질로 제공될 수 있다. 이에, 본 발명의 항균 펩타이드를 포함하는 조성물은 감염성 질환의 예방 또는 치료를 목적으로 의약용, 의약부외용, 식품 및 사료 첨가용, 농약 및 화장품 첨가용 등 다양한 방면으로 이용될 것으로 기대된다.

Description

ROMO1 유래 항균 펩타이드 및 그 변이체
본 발명은 Romo1 단백질 유래의 항균 펩타이드에 관한 것으로서, 구체적으로 Romo1 단백질의 두 번째 알파 헬릭스(α-helix 2) 영역의 아미노산 서열을 갖는 다양한 펩타이드에서 그람 양성, 그람 음성, 및 다제내성 박테리아에 대한 항균 활성을 확인하여 상기 각 펩타이드와 각 펩타이드를 포함하는 항균용 조성물 등을 제공하는 것이다.
박테리아 감염에 대한 치료 수단으로 사용되고 있는 항생제의 가장 큰 문제점은 박테리아의 항생제 내성 획득이다. 영국정부의 웰컴트러스트 보고서에 의하면 2050년에는 기존 항생제로 치료할 수 없는 슈퍼박테리아에 의해 세계적으로 사망자 수가 1,000만 명을 초과하여, 사망 원인에 있어서 슈퍼박테리아 감염이 암을 추월하는 위협이 될 것으로 전망된다.
또한, 세계보건기구(WHO)는 수많은 다제내성균에서 위급 단계(critical priority)에는 있는 박테리아로는 카바페넴 내성 아시네토박터균(carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii), 카바페넴 내성 녹농균(carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa), 및 카바페넴 내성 장내세균 속(carbapenem-resistant Enterobacteriaceae sp.) 균종을 선정하고, 최후의 항생제로 알려진 카바페넴계 항생제에 내성을 보이는 그람 음성 슈퍼박테리아를 최우선으로 해결해야 한다고 발표하였다.
한편, 균혈증은 혈액 중에 세균이 살아 있는 경우를 말하며, 감염의 직접적 또는 간접적인 영향에 의하여 발생하는 것이 패혈증이다. 즉, 패혈증은 인체에 침입한 세균이 혈액에 감염됨으로써 나타나는 전신성 염증반응 증후군으로서 감염 후 6시간 경과 후에는 생존률이 30%가 안되는 질병이다. 패혈증 원인균은 연쇄상구균, 황색포도상구균, 대장균, 폐렴균, 녹농균, 진균을 비롯하여 매우 다양하며, 이러한 패혈증 유발 원인균의 다양성에 의해 그 치료에 어려움이 있다.
현재까지 패혈증의 치료는 주로 면역 반응을 억제하거나 혈액 응고를 저해하는 등 증상의 완화를 목적으로 하는 치료가 최선이며, 근본적인 치료를 위해서는 초기에 환자가 감염된 균종 확인을 위한 세균 동정이 필요하나, 상술한 바와 같이 패혈증에 의한 즉각적인 전신 염증 반응에 의해 세균 동정에 소요되는 시간이 확보되지 못한다는 점에 문제가 있다. 또한, 가령 패혈증 원인균을 성공적으로 동정하였더라도, 그 원인균이 항생제에 대해 내성을 갖는 다제내성 박테리아인 경우 그 치료에 적절한 약물이 없다는 점에 문제가 있다. 이에, 패혈증 원인균에 대한 동정 없이 광범위한 세균에 대한 항균활성을 갖는 항생제의 개발이 필요하며, 특히 다제내성 박테리아에 대한 항균활성을 갖는 항생물질의 개발이 요구되고 있다.
상술한 바와 같이, 현재까지 인류가 사용하고 있는 항생제의 가장 큰 문제점은 박테리아의 내성 획득이고, 이를 해결하기 위한 많은 연구가 진행되고 있으며, 특히 박테리아의 항생제 내성 획득을 극복하기 위해 항균 펩타이드(antimicrobial peptide, AMP)의 개발이 활발하게 진행되고 있다. 동물 또는 인간의 방어 단백질(host defense protein) 유래의 다양한 항균 펩타이드가 개발되었으나, 인체 면역 체계 내에서 내성 획득의 가능성이 있고, 혈액 내에서 짧은 반감기와 인체에 나타내는 독성의 문제 및 기존 항생제와 비교하여 제한적인 약효를 나타내는 등의 문제가 있어 실용화되지 못하고 있는 실정이다. 일례로, 마개닌(magainin)은 1999년 미국에서 개발된 항균 펩타이드로 임상 3상 이후 FDA 승인을 요청하였으나 그 약효가 종래 항생제와 비교하여 우수하지 못해 승인이 거부되었다. 또한, 2003 년에 답토마이신(daptomycin), 2014 년에 오리타반신(oritavancin)이 미국 식약처에서 승인을 받았으나, 두개의 펩타이드 모두 그람 양성균에서만 항균 활성을 나타내었으며, 피부 감염 질환에만 적용될 수 있었다.
상술한 바와 같이 현재까지 그 약효와 적용의 제한에 의해, 균혈증 및 패혈증 등의 세균 감염 질환의 치료에 적용가능한 항균 펩타이드는 개발되지 못하였으며, 본 발명자들은 미토콘드리아 내막에 위치하는 Romo1 단백질의 두 번째 알파 헬릭스 구조가 그람 양성, 그람 음성, 및 다제내성 박테리아에서 항균활성을 나타내어 광범위한 세균 감염질환 치료에 적용할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
[선행기술문헌]
(비특허문헌 1)비특허문헌 1: WHO, Global Priority List of Antibiotic-Resistant Bacteria to Guide Research, Discovery, and Development of New Antibiotics (2017. 2. 27)
(비특허문헌 2)비특허문헌 2: Lee et al., J. Cell Biol., 217, 2059-2071, 2018
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 Romo1 단백질 유래의 항균 펩타이드 및 상기 펩타이드의 아미노산 일부를 치환(substitution) 또는 결손(deletion)시킨 변형된 항균 펩타이드를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명은 상기 항균 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항생제와 상기 항균 펩타이드를 포함하는 식품 및 사료 첨가제, 화장료 조성물, 생물농약, 및 항균용 의약외품 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
일 양상은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 구성된 Romo1 단백질 서열 중 52 내지 79 번째 아미노산 영역에서 선택되는 임의의 아미노산을 기준으로 카르복시(C-) 말단 방향으로 연속된 7 내지 28개 아미노산 서열을 포함하는 항균 펩타이드를 제공한다.
일 구현예로서, 상기 항균 펩타이드를 구성하는 하나 이상의 아미노산 서열이 치환(substitution) 또는 결손(deletion)된 항균 펩타이드를 제공한다.
다른 구현예로서, 상기 펩타이드는 서열번호 2 내지 15로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하거나, 상기 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드일 수 있다.
또 다른 구현예로서, 상기 펩타이드는 서열번호 16, 30, 40, 및 45로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하거나, 상기 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드일 수 있다.
또 다른 구현예로서, 상기 서열번호 16의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드는 예를 들면 서열번호 17 내지 29로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
또 다른 구현예로서, 상기 서열번호 30의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드는 예를 들면 서열번호 31 내지 39로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
또 다른 구현예로서, 상기 서열번호 40의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드는 예를 들면 서열번호 41 내지 44으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
또 다른 구현예로서, 상기 서열번호 45의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드는 예를 들면 서열번호 46 내지 47로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
또 다른 구현예로서, 바람직하게는 서열번호 17 내지 25, 27, 34, 37, 39, 42, 및 44로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 상기 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드일 수 있고, 더욱 바람직하게는 서열번호 22, 23, 및 24로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 상기 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드일 수 있다.
또 다른 구현예로서, 상기 펩타이드는 서열번호 13의 아미노산 서열; 또는 서열번호 13의 아미노산 서열에 대해 하기 (a) 내지 (h) 중 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는 서열로 이루어지는 항균 펩타이드일 수 있다. (a)는 1번째 아미노산 K를 R로 치환, (b)는 2번째 아미노산 T를 K 또는 R로 치환, (c)는 5번째 아미노산 Q를 K 또는 R로 치환, (d)는 6번째 아미노산 S를 K, R, 또는 H로 치환, (e)는 9번째 아미노산 T를 K 또는 R로 치환, (f)는 10번째 아미노산 F를 W로 치환, (g)는 16번째 아미노산 I를 L로 치환, (h)는 20번째 아미노산 I를 G 또는 L로 치환일 수 있다.
또 다른 구현예로서, 상기 항균 펩타이드는 적어도 하나의 메티오닌이 노루루신 또는 이소루신으로 치환된 것일 수 있다.
또 다른 구현예로서, 상기 항균 펩타이드는 3, 4, 5, 7, 8, 9, 11, 17, 18, 및 19 번째 아미노산 중 어느 하나가 결손되거나; 또는 3 또는 4번째 아미노산, 및 7 또는 8번째 아미노산이 결손된 것일 수 있다.
또 다른 구현예로서, 상기 항균 펩타이드는 C말단에 연결된 아미노산 서열을 더 포함하고, 상기 C말단에 연결된 아미노산 서열은 R 또는 K가 1 내지 3개 반복하는 서열로 이루어진 것일 수 있다.
또 다른 구현예로서, 상기 펩타이드는 하나 이상의 아미노산 서열이 변형(modification)된 것일 수 있다.
또 다른 구현예로서, 상기 변이는 페길레이션(PEGylation), 아세틸레이션(acetylation), 카르복실레이션(carboxylation), 리피데이션(lipidation), 또는 아미데이션(amidation)일 수 있다.
또 다른 구현예로서, 상기 펩타이드를 구성하는 아미노산은 각각 독립적으로 L-형 또는 D-형의 아미노산일 수 있으며, 방사선 또는 형광 라벨된 아미노산 유사체일 수 있다.
또 다른 구현예로서, 상기 펩타이드는 그람 양성균, 그람 음성균, 및 다제내성균으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 세균에 대해 항균 활성을 가질 수 있다.
또 다른 구현예로서, 상기 그람 양성균은 포도상구균 속( Staphylococcus sp.), 간균 속( Bacillus sp.), 엔테로코커스 속( Enterococcus sp.), 스트렙토마이세스 속( Streptomyces sp.), 및 스트렙토코커스 속( Streptococcus sp.)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 속(Genus)에 속하는 세균일 수 있으며, 바람직하게 상기 그람 양성균은 황색포도상구균( Staphylococcus aureus), 고초균( Bacillus subtilis), 엔테로코커스 패시움( Enterococcus faecium), 스트렙토마이세스 신데넨시스( Streptomyces sindenensis), 엔테로코커스 패칼리스( Enterococcus faecalis), 및 스트렙토코커스 뉴모니아( Streptococcus pneumoniae)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 세균일 수 있다.
또 다른 구현예로서, 상기 그람 음성균은 대장균 속( Escherichia sp.), 클렙시엘라 속( Klebsiella sp.), 아시네토박터 속( Acinetobacter sp.), 수도모나스 속( Pseudomonas sp.), 및 엔테로박터 속( Enterobacter sp.)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 속(Genus)에 속하는 세균일 수 있으며, 바람직하게 상기 그람 음성균은 대장균( Escherichia coli), 클렙시엘라 뉴모니아( Klebsiella pneumoniae), 아시네토박터 바우마니( Acinetobacter baumannii), 녹농균( Pseudomonas aeruginosa), 및 엔테로박터 에어로게네스( Enterobacter aerogenes)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 세균일 수 있다.
또 다른 구현예로서, 상기 다제내성균은 페니실린계(penicillins), 카바페넴계(carbapenems), 세팔로스포린계(cephalosporins), 퀴놀론계(quinolones), 마크로라이드계(macrolides), 테트라사이클린계(tetracyclins), 또는 글리코펩티드계(glycopeptides)에 속하는 1종 이상의 항생물질에 대한 내성을 갖는 상기 그람 양성균 또는 그람 음성균으로서, 바람직하게 상기 다제내성균은 메티실린 내성 포도상구균(methicillin-resistant Staphylococcus sp.), 다제내성 수도모나스 속(multidrug-resistant Pseudomonas sp.), 반코마이신 내성 엔테로코커스 속(vancomycin-resistant Enterococcus sp.), 다제내성 클렙시엘라 속(multidrug-resistant Klebsiella sp.), 다제내성 아시네토박터 속(multidrug-resistant Acinetobacter sp.), 및 반코마이신 내성 포도상구균(vancomycin-resistant Staphylococcus sp.)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 속(Genus)에 속하는 세균일 수 있다.
또 다른 구현예로서, 상기 다제내성균은 메티실린 내성 황색포도상구균(methicillin-resistant S. aureus), 다제내성 녹농균(multidrug-resistant P. aeruginosa), 다제내성 아시네토박터 바우마니(multidrug-resistant A. baumannii), 다제내성 클렙시엘라 뉴모니아(multidrug-resistant K. pneumoniae), 반코마이신 내성 엔테로코커스 패시움(vancomycin-resistant E. faecium), 및 반코마이신 내성 황색포도상구균(vancomycin-resistant S. aureus)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 세균일 수 있다.
또 다른 구현예로서, 상기 다제내성 녹농균은 피페라실린(piperacilin), 피페라실린타조박탐(piperacilin-tazobactam), 세프타지딤(ceftazidime), 이미페넴(imipenem), 메로페넴(meropenem), 젠타마이신(gentamicin), 아미카신(amikacin), 및 시프로플록사신(ciprofloxacin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 항생제에 대한 내성을 갖는 것일 수 있으며, 상기 다제내성 아시네토박터 바우마니는 피페라실린, 피페라실린타조박탐, 세프타지딤, 이미페넴, 메로페넴, 젠타마이신, 아미카신, 시프로플록사신, 및 세페핌(cefepime)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 항생제에 대한 내성을 갖는 것일 수 있고, 상기 다제내성 클렙시엘라 뉴모니아는 피페라실린타조박탐, 세프타지딤, 세페핌, 이미페넴, 젠타마이신, 및 시프로플록사신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 항생제에 대한 내성을 갖는 것일 수 있다.
또 다른 구현예로서, 상기 반코마이신 내성 엔테로코커스 패시움은 반코마이신 외에도 리팜핀(rifampin), 테트라사이클린, 젠타마이신, 에리트로마이신(erythromycin), 스트렙토마이신(streptomycin), 및 암피실린(ampicillin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 항생제에 대한 내성을 추가로 갖는 것일 수 있으며, 상기 반코마이신 내성 황색포도상구균은 반코마이신 외에도 옥사실린(oxacillin), 벤질페니실린(benzylpenicillin), 암피실린, 및 세파졸린(cefazolin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 항생제에 대한 내성을 추가로 갖는 것일 수 있다.
다른 양상은, 상기 항균 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항생제를 제공한다.
또 다른 양상은, 상기 항균 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 세균성 감염 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또 다른 양상은, 상기 항균 펩타이드를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 세균성 감염 질환 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또 다른 양상은, 세균성 감염 질환 예방 또는 치료용 약제의 제조를 위한 상기 항균 펩타이드의 용도를 제공한다.
일 구현예로서, 상기 세균성 감염 질환은 피부감염, 식중독, 중이염, 방광염, 복막염, 요로감염, 유방염, 폐렴, 심내막염, 결막염, 관절염, 자궁내막염, 선역, 균혈증, 패혈증, 및 여드름으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 질병일 수 있고, 바람직하게는 폐렴 또는 패혈증일 수 있다.
또 다른 양상은, 상기 항균 펩타이드를 포함하는 항균용 의약외품 조성물, 화장료조성물, 식품 첨가제, 및 사료 첨가제를 제공한다.
본 발명의 Romo1 유래 펩타이드 및 그 변이체는 기존의 항생물질 및 항생 펩타이드보다 다양한 종류의 세균에 대해 높은 항생능력을 가짐으로써, 세균 감염성 질환 환자의 혈액 내에서 다양한 원인균을 초기에 동시에 제거할 수 있다. 특히, 본 발명의 펩타이드는 항생제 내성을 갖는 박테리아에 대해 높은 항균 능력을 발휘하여 기존 항생제 적용의 한계를 넘어서 다제내성 박테리아에 의한 감염성 질환의 예방 또는 치료제로서 제공될 수 있다. 또한, 본 발명의 Romo1 유래 펩타이드 및 그 변이체는 내성 획득의 가능성이 낮고, 독성이 낮으며, 특히 혈액 내에서 기존의 항균 펩타이드보다 높은 항균 능력이 있다는 점에서 광범위한 세균성 감염질환의 예방 또는 치료를 목적으로 의약용, 의약부외용, 식품 및 사료 첨가용, 농약 및 화장품 첨가용 등 다양한 방면으로 이용될 것으로 기대된다.
도 1은 KU-5878과 종래 항균 펩타이드(LL-37, 마개닌 2, 및 답토마이신)와의 그람 양성 및 그람 음성 박테리아에 대한 항균 활성을 비교 확인한 도면이다.
도 2는 KU-5878과 종래 항균 펩타이드(LL-37, 마개닌 2, 및 답토마이신)와의 다제내성 박테리아에 대한 항균 활성을 비교 확인한 도면이다.
도 3는 KU-5878과 종래 항생물질(이미페넴)과의 그람 양성 및 그람 음성 박테리아에 대한 항균 활성을 비교 확인한 도면이다.
도 4는 KU-5878과 종래 항생물질(이미페넴)과의 다제내성 박테리아에 대한 항균 활성을 비교 확인한 도면이다.
도 5는 KU-5878과 종래 항균 펩타이드(마개닌 2 및 멜리틴)와의 인간 혈관 내피유래 세포주(HUVEC cell)에 대한 독성을 비교 확인한 도면이다.
도 6은 KU-5878 및 KU-5878 변이체(KU-5878-K4 및 KU-5878-K4-D)와 종래 항균 펩타이드(LL-37, 마개닌 2, 및 멜리틴)와의 생쥐의 적혈구 세포에 대한 독성을 적혈구 용혈 현상의 정도를 통해 비교확인한 도면이다.
도 7은 in vivo에서 KU-5878의 무독성을 생쥐 체중의 관찰 결과를 통해 확인한 도면이다.
Romo1(Reactive oxygen species modulator 1) 단백질은 미토콘드리아의 내막에 위치하는 막 단백질로서, 미토콘드리아의 활성산소 생성, TNF-α 신호전달, 세포 노화, 암의 진행 및 침윤, 및 미토콘드리아 내부 단백질 수송 등에 관여하는 것으로 알려져 있다. Romo1 단백질의 구조는 2개의 알파 헬릭스를 포함하는 단백질로서, 첫 번째 알파 헬릭스(α-helix 1)는 주로 소수성 아미노산으로 구성되어 있고, 두 번째 알파 헬릭스(α-helix 2)는 친수성 및 소수성의 양면성을 갖는다.
본 발명자들은 Romo1 단백질의 α-helix 1 영역은 물에 잘 녹지 않는 성질을 가져 연구에서 배제하고, α-helix 2 영역의 아미노산 서열(52-79 a.a.)을 갖는 다양한 길이의 펩타이드를 합성하여 그 항균활성을 확인하고, 상기 펩타이드의 변이체로부터 항균활성을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 Romo1 단백질의 52-79 아미노산 영역에서 선택되는 하나의 아미노산을 기준으로, 연속되는 아미노산 서열을 포함하되 서로 길이가 다른 수 종의 펩타이드를 합성하고, 녹농균 및 황색포도상구균에 대한 상기 각 펩타이드의 항균 활성을 박테리아 살균 최소 농도 측정법을 이용하여 확인하였다. 그 결과 Romo1 단백질의 52-62 아미노산 영역에서 임의의 아미노산을 기준으로 연속된 18개의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 모두에서 녹농균과 황색포도상구균에 대한 항균활성을 확인하였으나, 그 중에서도 특히 Romo1 단백질의 58-78 아미노산 서열을 포함하는 KU-5878 펩타이드에서 우수한 항균활성을 확인할 수 있었다(실시예 1 참조).
이에, 본 발명자들은 Romo1 유래 항균 펩타이드를 제공한다.
본 명세서에서 "Romo1 유래 펩타이드"는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 구성된 Romo1 단백질의 52-79 아미노산 영역에서 내의 연속되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드이고, "펩타이드"는 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미한다. 상기 Romo1 유래 펩타이드는 Romo1 단백질을 조각내어 획득할 수 있으며, 당업계에 공지된 화학적 합성 방법, 특히 고상 합성 기술 또는 액상 합성 기술에 따라 제조될 수 있다.
나아가, 본 발명의 Romo1 유래 펩타이드는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 구성된 Romo1 단백질 서열 중 52 내지 79 번째 아미노산 영역에서 임의의 아미노산을 기준으로 연속된 아미노산 서열을 포함하는 것이라면 그 길이에 제한되는 것은 아니나, 바람직하게는 7 내지 28 mer, 더욱 바람직하게는 18 내지 28 mer일 수 있다.
보다 구체적으로 상기 항균 펩타이드는 Romo1 단백질 서열 중 52-62 아미노산 영역에서 임의의 아미노산을 기준으로 연속된 18개 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 2-15으로 이루어진 군, 더욱 바람직하게는 서열번호 5, 8, 9, 13, 및 14로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
본 명세서에서 아미노산 서열은 N-말단에서 C-말단의 순서로 나열되어 있으며, Romo1 단백질 서열 중 특정 영역에서 선택되는 아미노산을 기준으로 "연속되는 아미노산 서열"이란 상기 기준 아미노산의 C-말단 방향으로 연속되는 아미노산 서열을 의미한다. 또한, 본 명세서에서 Romo1 단백질의 특정 영역에서 선택되는 임의의 아미노산을 기준으로 연속되는 7 내지 28 개 아미노산 서열이라 함은 상기 Romo1 단백질의 특정 영역에서 선택된 기준 아미노산을 포함하고 상기 기준 아미노산의 C-말단 방향으로 연속되는 아미노산 서열을 포함하여 총 7 내지 28 개의 아미노산 서열을 의미한다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 상기 Romo1 유래 항균 펩타이드의 적용 범위를 확인하기 위하여, 서열번호 13으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 KU-5878 펩타이드를 대표로 선정하여 황색포도상구균, 고초균, 장내구균, 스트렙토미세스 신데넨시스, 엔테로코커스 패칼리스, 스트렙토코커스 뉴모니아, 대장균, 클렙시엘라 뉴모니아, 아시네토박터 바우마니, 녹농균, 엔테로박터 에어로게네스, 메티실린 내성 황색포도상구균, 다제내성 녹농균, 다제내성 아시네토박터 바우마니, 다제내성 클렙시엘라 뉴모니아, 반코마이신 내성 엔테로코커스 패시움, 및 반코마이신 내성 황색포도상구균에 대한 상기 펩타이드의 항균 활성을 확인하였다. 그 결과 본 발명의 Romo1 유래 항균 펩타이드는 그람 양성균, 그람 음성균, 및 다제내성 박테리아 모두에게서 광범위한 항균 활성을 나타냄을 알 수 있었다(실시예 2 참조).
또한, 보다 우수한 항균활성을 갖는 펩타이드 탐색을 위하여 KU-5878을 구성하는 각 아미노산을 그 성질에 따라 X 1X 1MMX 1X 1GGX 1FGX 1FMAIGMGIR (서열번호 16), KTX 2X 2QSGGTFGTFX 2AX 2GX 2GX 2R (서열번호 30), KTMMQSGGTX 3GTX 3MAIGMGIR (서열번호 40), 및 KTMMQSX 4X 4TFX 4TFMX 4IX 4MX 4IR (서열번호 45)으로 구분하여 각 X 1 내지 X 4의 아미노산을 치환한 펩타이드를 합성하여 그 항균활성을 확인하였다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 KU-5878 펩타이드에서 친수성 잔기를 포함하는 아미노산을 양 전하를 포함하는 아미노산으로 치환하는 경우에 항균활성의 변화를 확인하였다. KU-5878 펩타이드에서 친수성 잔기를 포함하는 아미노산의 위치는 서열번호 16에서 X 1으로 표시되어 있으며, X 1 위치의 아미노산을 각각 독립적으로 치환하였다. Romo1 단백질의 α-helix 2 영역에서 친수성 아미노산을 양 전하를 포함하고 있는 아미노산(R, H 또는 K) 또는 다른 친수성 아미노산(T, S, Q, 또는 N)으로 치환하는 경우에서 그 항균활성의 변화를 확인하였다. 그 결과 항균활성이 유지되거나 그보다 우수한 항균활성을 나타냄을 알 수 있었다(실시예 4-1 참조).
또한, 본 발명의 다른 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 KU-5878 펩타이드에서 메티오닌(M) 또는 이소루신(I)을 소수성 잔기를 포함하고 그 구조가 유사한 아미노산(M, L, I, V, 또는 Nle)으로 치환하는 경우와 소수성 잔기를 포함하지만 그 구조가 다른 아미노산(F, Y, 또는 W)으로 치환하는 경우에서 그 항균활성의 변화를 확인하였다. KU-5878 펩타이드에서 메티오닌(M) 및 이소루신(I)은 서열번호 30에서 X 2으로 표시되어 있으며, X 2 위치의 아미노산은 각각 독립적으로 치환되었다. 그 결과, 메티오닌을 노루루신(Nle)으로 치환하는 경우 그 항균활성이 유지되었으며, 또한 이소루신을 트립토판(W)으로 치환하는 경우 항균활성이 감소되었다. 한편, 이소루신을 글리신으로 치환하는 경우 항균활성이 향상된 펩타이드를 얻을 수 있음을 확인하였다(실시예 4-3 참조).
또한, 본 발명의 다른 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 KU-5878 펩타이드에서 소수성 잔기를 포함하는 페닐알라닌(F)을 친수성 아미노산 또는 그 구조가 유사한 소수성 아미노산(F, Y, 또는 W) 또는 그 구조가 다른 소수성 아미노산(M, L, I, V, 또는 Nle)으로 치환하는 경우에 그 항균활성의 변화를 확인하였다. KU-5878 펩타이드에서 페닐알라닌은 서열번호 40에서 X 3으로 표시되어 있으며, X 3 위치의 아미노산은 각각 독립적으로 치환되었다. 그 결과, 페닐알라닌을 트립토판(W)으로 치환하는 경우 항균활성이 향상된 펩타이드를 얻을 수 있음을 확인하였다(실시예 4-4 참조).
또한, 본 발명의 다른 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 KU-5878에서 알라닌(A) 또는 글리신(G)을 각각 글리신 또는 알라닌으로 치환하는 경우에 항균활성의 변화를 확인하였다. KU-5878 펩타이드에서 알라닌과 글리신은 서열번호 45에서 X 4로 표시되어 있으며, X 4 위치의 아미노산을 각각 독립적으로 치환하였다. 그 결과, 알라닌을 글리신으로 치환하는 경우 및 글리신을 알라닌으로 치환하는 경우 항균활성을 나타내지만 KU-5878 펩타이드와 비교하여 감소된 항균활성을 나타냄을 확인하였다(실시예 4-5 참조).
상기로부터, 본 발명의 Romo1 유래 펩타이드는 Romo1의 52-79 영역 내에서 임의의 아미노산을 기준으로 연속되는 7-28개 아미노산 서열을 포함하면서, 그 항균 활성을 나타내는 범위 내에서 하나 이상의 아미노산 치환(substitution)을 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예서, 본 발명자들은 KU-5878 변이체의 적용범위를 확인하기 위하여, KU-5878-K4를 대표로 선정하고 다양한 세균에 대한 항균활성을 확인하였다. 그 결과, KU-5878-K4도 KU-5878과 마찬가지로 그람 양성균, 그람 음성균, 및 다제내성 박테리아 모두에게서 광범위한 항균활성을 나타냄을 알 수 있었다(실시예 4-2 참조).
또한, 본 발명자들은 구체적인 실시예를 통해서 KU-5878 및 KU-5878-K4를 구성하는 아미노산 일부 또는 전부를 D-형 아미노산으로 치환한 펩타이드의 경우에도 KU-5878과 유사한 항균활성을 나타내며, 특히 소 혈청의 존재 하에서 KU-5878 및 KU-5878-K4의 경우 항균활성이 크게 감소하나 D-형 아미노산으로 치환된 변이체의 경우 항균활성 감소 폭이 적음을 알 수 있었다(실시예 4-6 참조).
상기로부터, 본 발명의 Romo1 유래 펩타이드를 구성하는 아미노산은 각각 독립적으로 L-형태 또는 D-형태일 수 있으며, 각 아미노산은 아미노산 유사체, 방사선 라벨링 아미노산, 또는 형광 태그 아미노산일 수 있다.
한편, 본 발명의 Romo1 유래 펩타이드는 아미노산 서열의 일부 부위를 선정하고 그 활성을 증가시키기 위해 아미노(N-) 말단 또는 카르복시(C-) 말단의 변형을 유도할 수 있다. 이러한 변형을 통해 본 발명의 펩타이드는 생체 내 투여 시의 증가된 반감기를 가질 수 있다.
본 발명자들은 구체적인 실시예를 통해 C-말단이 아미데이션(amidation)된 KU-5878 변이체의 경우에 항균활성이 증가함을 확인하였다(실시예 5 참조).
따라서, 본 발명의 Romo1 유래 펩타이드의 아미노 말단은 아세틸기, 플루오레닐 메톡시 카르보닐기, 포르밀기, 팔미토일기, 미리스틸기, 스테아릴기 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 등의 보호기가 결합될 수 있으며, 펩타이드의 카르복시 말단은 히드록시기(-OH), 아미노기(-NH 2), 아자이드(-NHNH 2) 등으로 변형될 수 있다. 또한 본 발명의 펩타이드의 말단 또는 아미노산의 R-잔기(R-group)에 지방산(fatty acids), 당사슬(oligosaccharides chains), 모든 나노입자(골드입자, 리포솜, 헤파린, 하이드로젤 등), 아미노산, 담체 단백질(carrier proteins) 등을 결합할 수 있다. 상술한 아미노산의 변형은 본 발명의 펩타이드의 역가(potency)와 안정성을 개선하는 작용을 한다. 본 명세서에서 용어 "안정성"은 생체 내(in vivo) 안정성뿐만 아니라, 저장 안정성(상온, 냉장, 냉동 보관 시 저장 안정성 포함)도 의미한다.
한편, 본 발명의 Romo1 유래 항균 펩타이드는 이를 구성하는 하나 이상의 아미노산 서열이 결실된 펩타이드일 수 있다. 상기에 따라, 본 발명의 Romo1 유래 펩타이드를 구성하는 하나 이상의 아미노산을 치환(substitution), 변이(modification), 또는 결손(deletion)시킨 펩타이드에서도 항균활성을 확인할 수 있었는바, 본 발명은 Romo1 유래 펩타이드 변이체를 항균 펩타이드로 제공할 수 있다.
본 발명에서 "변이체"는 항균활성을 나타내는 범위에서 상기 Romo1 유래 펩타이드를 구성하는 하나 이상의 아미노산이 치환(substitution), 변이(modification), 및/또는 결손(deletion)된 펩타이드를 의미하고, 항균활성을 나타낸다면 본 발명의 Romo1 유래 펩타이드보다 우수한 항균활성을 나타내는 변이체인 것으로 제한되지 않는다.
본 발명의 항균 펩타이드는 서열번호 13의 아미노산 서열; 또는 서열번호 13의 아미노산 서열에 대해 하기 (a) 내지 (h) 중 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는 서열로 이루어지는 것일 수 있다.
상기 (a)는 1번째 아미노산 K를 R로 치환, (b)는 2번째 아미노산 T를 K 또는 R로 치환, (c)는 5번째 아미노산 Q를 K 또는 R로 치환, (d)는 6번째 아미노산 S를 K, R, 또는 H로 치환, (e)는 9번째 아미노산 T를 K 또는 R로 치환, (f)는 10번째 아미노산 F를 W로 치환, (g)는 16번째 아미노산 I를 L로 치환, (h)는 20번째 아미노산 I를 G 또는 L로 치환일 수 있다. 실시예 8 및 9에 따르면, 본 발명자는 KU-5878의 아미노산 서열을 상기 (a) 내지 (h) 중 어느 하나로 치환하면 펩타이드의 항균 효과가 향상됨을 확인하였다.
또 다른 구현예로서, 상기 항균 펩타이드는 적어도 하나의 메티오닌이 노루루신 또는 이소루신으로 치환된 것일 수 있다. 노루루신(Norleucine)은 메티오닌과 비교하면 황(S)이 탄소로 치환된 것을 제외하면 구조가 동일하며, 이소루신은 노루루신과 비교하면 탄소수가 같은 알킬 치환기를 갖는 공통점을 갖는다. 본 발명자는 KU-5878의 아미노산 서열상에 있는 4개의 메티오닌 중 1 내지 4개를 노루루신으로 치환하면 항균 활성이 개선됨을 확인하였다. (표 13 참조)
또 다른 구현예로서, 상기 항균 펩타이드는 3, 4, 5, 7, 8, 9, 11, 17, 18, 및 19 번째 아미노산 중 어느 하나가 결손되거나; 또는 3 또는 4번째 아미노산, 및 7 또는 8번째 아미노산이 결손된 것일 수 있다. 본원 실시예 6, 7에 따르면, KU-5878의 3, 4, 5, 7, 8, 9, 11, 17, 18, 및 19 번째 아미노산 중 어느 하나가 결손되면 항균 활성이 증가하였으며, KU-5878의 일부 아미노산이 치환된 펩타이드에 대해서도 같은 효과를 기대할 수 있다.
또 다른 구현예로서, 상기 항균 펩타이드는 C말단에 연결된 아미노산 서열을 더 포함하고, 상기 C말단에 연결된 아미노산 서열은 R 또는 K가 1 내지 3개 반복하는 서열로 이루어진 것일 수 있다. 실시예 10에 따르면, 본 발명자는 KU-5878의 C말단에 RRR 또는 KK로 이루어지는 아미노산 서열을 더 부가하면 항균 활성이 증가함을 확인하였다.
본 발명의 Romo1 유래 펩타이드 및 그 변이체는 그람 양성균, 그람 음성균, 및 다제내성 박테리아에 대한 항균 활성을 가지고 있는바, 본 발명은 상기 항균 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 세균 감염성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명의 Romo1 유래 펩타이드 및 그 변이체가 증식 및/또는 그 생장을 방해하는 상기 그람 양성균의 비제한적인 예로는 포도상구균 속( Staphylococcus sp.), 간균 속( Bacillus sp.), 엔테로코커스 속( Enterococcus sp.), 스트렙토마이세스 속( Streptomyces sp.), 및 스트렙토코커스 속( Streptococcus sp.) 등이 있으며, 바람직하게는 황색포도상구균( Staphylococcus aureus), 고초균( Bacillus subtilis), 엔테로코커스 패시움( Enterococcus faecium), 스트렙토마이세스 신데넨시스( Streptomyces sindenensis), 엔테로코커스 패칼리스( Enterococcus faecalis), 및/또는 스트렙토코커스 뉴모니아( Streptococcus pneumoniae)일 수 있다.
또한, 본 발명의 Romo1 유래 펩타이드 및 그 변이체가 증식 및/또는 그 생장을 방해하는 상기 그람 음성균의 비제한적인 예로는 대장균 속( Escherichia sp.), 클렙시엘라 속( Klebsiella sp.), 아시네토박터 속( Acinetobacter sp.), 수도모나스 속( Pseudomonas sp.), 및 엔테로박터 속( Enterobacter sp.) 등이 있으나, 바람직하게는 대장균( Escherichia coli), 클렙시엘라 뉴모니아( Klebsiella pneumoniae), 아시네토박터 바우마니( Acinetobacter baumannii), 녹농균( Pseudomonas aeruginosa), 및/또는 엔테로박터 에어로게네스( Enterobacter aerogenes)일 수 있다.
또한, 본 발명의 Romo1 유래 펩타이드 및 그 변이체는 다제내성균에 대한 항균활성을 가지고 있는바, Romo1 유래 펩타이드 및 그 변이체가 증식 및/또는 그 생장을 방해하는 상기 다제내성균은 페니실린계(penicillins), 카바페넴계(carbapenems), 세팔로스포린계(cephalosporins), 퀴놀론계(quinolones), 마크로라이드계(macrolides), 테트라사이클린계(tetracyclins), 또는 글리코펩티드계(glycopeptides)에 속하는 1종 이상의 항생물질에 대한 내성을 갖는 상기 그람 양성균 또는 그람 음성균일 수 있으며, 바람직하게는 메티실린 내성 포도상구균 속(methicillin-resistant Staphylococcus sp.), 다제내성 수도모나스 속(multidrug-resistant Pseudomonas sp.), 반코마이신 내성 엔테로코커스 속(vancomycin-resistant Enterococcus sp.), 다제내성 클렙시엘라 속(multidrug-resistant Klebsiella sp.), 다제내성 아시네토박터 속(multidrug-resistant Acinetobacter sp.), 및/또는 반코마이신 내성 포도상구균 속(vancomycin-resistant Staphylococcus sp.) 일 수 있다.
본 발명은 Romo1 유래 펩타이드 및/또는 그 변이체를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물, 즉 항생제를 제공할 수 있으며, 본 발명의 약학적 조성물이 예방 또는 치료의 대상으로 하는 "세균성 감염 질환"은 상기 그람 양성균, 그람 음성균, 및/또는 다제내성균의 감염에 의한 질환일 수 있으며, 바람직하게는 상기 세균 감염에 의하여 유발되는 피부감염, 식중독, 중이염, 방광염, 복막염, 요로감염, 유방염, 폐렴, 심내막염, 결막염, 관절염, 자궁내막염, 선역, 균혈증, 패혈증, 및/또는 여드름 등일 수 있고, 더욱 바람직하게는 패혈증 또는 폐렴일 수 있다.
또한, 본 발명은 Romo1 유래 펩타이드 및/또는 그 변이체를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 세균성 감염 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, "개체"란 포유류라면 제한되지 아니하나, 바람직하게는 인간 또는 가축일 수 있다.
본 발명에서 예방이란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 상기 그람 양성균, 그람 음성성균, 및/또는 다제내성 세균의 감염을 지연시키거나, 그 감염에 의한 질병의 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미하고, 치료란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 상기 세균 감염에 따른 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 약학적 조성물(pharmaceutical composition)은 Romo1 유래 펩타이는 및/또는 그 변이체 외에 공지의 항생물질을 1종 이상 더 포함할 수 있으며, 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제, 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 "담체(carrier)"란 비이클(vehicle)이라고도 불리우며, 세포 또는 조직 내로의 단백질 또는 펩타이드의 부가를 용이하게 하는 화합물을 의미하는 것으로서, 예를 들어, 디메틸술폭사이드(DMSO)는 생물체의 세포 또는 조직 내로의 많은 유기물의 투입을 용이하게 하는 통상 사용되는 담체이다.
본 발명에서 "희석제(diluent)"란 대상 단백질 또는 펩타이드의 생물학적 활성 형태를 안정화시킬 뿐만 아니라, 단백질 또는 펩타이드를 용해시키게 되는 물에서 희석되는 화합물로 정의된다. 버퍼 용액에 용해되어 있는 염은 당해 분야에서 희석제로 사용된다. 통상 사용되는 버퍼 용액은 포스페이트 버퍼 식염수이며, 이는 인간 용액의 염 상태를 모방하고 있기 때문이다. 버퍼 염은 낮은 농도에서 용액의 pH를 제어할 수 있기 때문에, 버퍼 희석제가 화합물의 생물학적 활성을 변형하는 일은 드물다. 여기에 사용된 아젤라산을 함유하는 화합물들은 인간 환자에게 그 자체로서, 또는 결합 요법에서와 같이 다른 성분들과 함께 또는 적당한 담체나 부형제와 함께 혼합된 약제학적 조성물로서, 투여될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 Romo1 유래 펩타이드 및/또는 그 변이체를 유효성분으로 포함하는 세균성 감염 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 외용제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 본 발명의 항균용 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있으며, 예를 들어, 약학적으로 허용가능한 담체와 혼합된 형태로 약 0.001mg 내지 1000mg이 투여될 수 있다. 본 발명의 항균용 조성물은 필요에 따라 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있으며, 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 Romo1 유래 펩타이드 및/또는 그 변이체는 세균 감염 질환의예방 또는 개선을 목적으로 하는 의약외품 조성물을 제공할 수 있으며, 본 발명의 의약외품 조성물은 다른 의약외품 또는 의약외품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 상기 의약외품 조성물은 소독청결제, 샤워폼, 가그린, 물티슈, 세제비누, 핸드워시, 가습기 충진제, 마스크, 연고제, 또는 필터 충진제 등에 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 Romo1 유래 펩타이드 및/또는 그 변이체는 화장료 조성물의 형태로 제공될 수 있다. 본 발명에 따른 화장료 조성물의 제형은 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스쳐 크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 또는 바디클렌저의 형태일 수 있다. 본 발명의 화장료 조성물에는 상기 필수 성분과 더불어 필요에 따라 통상 화장품에 배합되는 다른 성분과 함께 배합될 수 있다.
아울러, 본 발명은 Romo1 유래 펩타이드 및/또는 그 변이체를 유효성분으로 포함하는 식품 조성물 또는 사료 조성물을 제공한다. 본 발명의 Romo1 유래 펩타이드 및/또는 그 변이체를 식품 또는 사료의 첨가물로 사용할 경우, 상기 Romo1 유래 펩타이드 및/또는 그 변이체를 그대로 첨가하거나 다른 식품, 사료, 또는 그 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적(세균의 증식 및 생장 억제를 통한 감염성 질환의 예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 사료, 식품 또는 음료의 제조시 본 발명의 Romo1 유래 펩타이드 및/또는 그 변이체는 원료에 대하여 15 중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하의 양으로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다. 상기 식품 및 사료의 종류에는 특별한 제한은 없다.
본 발명에서는 아미노산 서열을 IUPAC-IUB 명명법에 따라 아래와 같이 약어로 기재하였다.
아르기닌(Arg, R), 라이신(Lys, K), 히스티딘(His, H), 세린(Ser, S), 트레오닌(Thr, T), 글루타민(Gln, Q), 아스파라진(Asp, N), 메티오닌(Met, M), 루신(Leu, L), 이소루신(Ile, I), 발린(Val, V), 페닐알라닌(Phe, F), 트립토판(Trp, W), 티로신(Tyr, Y), 알라닌(Ala, A), 글리신(Gly, G), 프롤린(Pro, P), 시스테인(Cys, C), 아스파르트산(Asp, D) 글루탐산(Glu, E), 노루루신(Nle)
본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 이하 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
[실시예]
실시예 1. Romo1 유래 펩타이드의 항균활성 확인 및 최적의 펩타이드 탐색
Romo1 단백질은 2개의 알파 헬릭스(α-helix)를 포함하고 있다. 본 발명자들은 친수성 및 소수성의 양면성을 갖는 두 번째 알파 헬릭스(α-helix 2) 영역을 합성하고, 박테리아 살균 최소 농도 측정법(minimum bactericidal concentration: MBC)을 이용하여 그 항균 활성을 확인하고, 이를 KU-5279(Romo1 단백질의 52-79 아미노산 영역)으로 명명하였다. 이어서, 인체 적용에 유리하고 항균활성이 우수한 펩타이드를 탐색하기 위하여 Romo1 단백질의 52-79 아미노산 영역에서 임의의 아미노산을 기준으로 연속되는 아미노산 서열을 포함하는 수 종의 펩타이드를 합성하여 박테리아 살균 최소 농도 측정법을 통해 각 펩타이드의 항균 활성을 비교 확인하였다(각 펩타이드의 정보는 하기 표 1 참조). 상기 각 펩타이드의 박테리아 살균 최소 농도 측정법을 이용한 항균 활성 확인은 구체적으로 하기와 같이 수행되었다.
먼저, 녹농균(ATCC 27853)과 황색포도상구균(ATCC 29213)을 3%(w/v) TSB(Tryptic Soy Broth) 액체 배지에 37℃, 200 rpm 조건으로 4 시간 배양한 후, 다시 동일한 조건에서 5×10 6 CFU/㎖ 농도가 되도록 3 시간 동안 2차 배양하였다. 상기 2차 배양한 각 균주의 최종 농도가 2×10 5 CFU/㎖ 농도가 되도록 SP(Sodium phosphate buffer: 10 mM Sodium phosphate, 1% TSB) 용액으로 희석하여 균주 용액을 준비하였다.
이어서, 96-웰 마이크로 플레이트의 각 웰에 농도를 달리하여(0 ㎍/㎖ 내지 300 ㎍/㎖ 펩타이드) 각 펩타이드를 분주하고, 상기 준비된 균주 용액을 100 ㎕ (1×10 5 CFU/㎖)를 넣고 섞어 37℃ 항온기에서 1 시간 동안 반응시켰다.
그리고, TS(Tryptic Soy) 30 g/L 및 한천 15 g/L을 증류수에 녹이고 멸균한 다음 100 ㎜ 원형 플레이트에 25 ㎖을 붓고 하루 이상 실온에서 굳혀서 제조한 TS 한천 플레이트에 상기 펩타이드와 균주의 반응 용액을 10 ㎕씩 일정한 크기로 도말하고, 37℃ 항온기에서 18 시간 동안 배양한 뒤, 플레이트에서 콜로니 생성을 확인하였다. 박테리아 살균 최소농도는 콜로니가 단 하나도 생성되지 않은 펩타이드의 최소 농도로 정의하였고, 실험 결과는 하기 표 1과 같다.
서열번호 펩타이드 아미노산 서열 황색포도상구균 MBC 값 (μg/ml) 녹농균 MBC 값 (μg/ml)
1 로모1 MPVAVGPYGQSQPSCFDRVKMGFVMGCAVGMAAGALFGTFSCLRIGMRGRELMGGIGKTMMQSGGTFGTFMAIGMGIRC 불용성 불용성
2 KU-5278 LMGGIGKTMMQSGGTFGTFMAIGMGIR 300 300
3 KU-5279 LMGGIGKTMMQSGGTFGTFMAIGMGIRC 300 300
4 KU-5478 GGIGKTMMQSGGTFGTFMAIGMGIR 300 300
5 KU-5479 GGIGKTMMQSGGTFGTFMAIGMGIRC 200 300
6 KU-5678 IGKTMMQSGGTFGTFMAIGMGIR 300 300
7 KU-5679 IGKTMMQSGGTFGTFMAIGMGIRC 300 300
8 KU-5778 GKTMMQSGGTFGTFMAIGMGIR 280 300
9 KU-5779 GKTMMQSGGTFGTFMAIGMGIRC 250 280
10 KU-5875 KTMMQSGGTFGTFMAIGM >300 >300
11 KU-5876 KTMMQSGGTFGTFMAIGMG >300 >300
12 KU-5877 KTMMQSGGTFGTFMAIGMGI >300 >300
13 KU-5878 KTMMQSGGTFGTFMAIGMGIR 100 100
14 KU-5879 KTMMQSGGTFGTFMAIGMGIRC 150 150
15 KU-6079 MMQSGGTFGTFMAIGMGIRC >300 >300
48 pCM19 CLRIGMRGRELMGGIGKTM 250 300
49 pCM12 CLRIGMRGRELM >300 >300
상기 표 1에 나타낸 바와 같이, pCM19와 KU-5279 펩타이드는 비슷한 살균력을 보이나, pCM12의 경우 낮은 살균력 때문에 박테리아 살균 최소 농도 측정법을 이용하여 항균 활성의 측정이 불가능 했다. 한편, 21개의 아미노산 잔기로 구성되어 있는 KU-5878 펩타이드의 항균활성이 가장 우수하였으며, KU-5878은 KU-5279보다 3배 우수한 항균 활성을 가짐을 확인할 수 있었다.
실시예 2. KU-5878의 항균 활성 확인
2-1. 다양한 세균에 대한 항균 활성 확인
상기 실시예 1에서 항균활성을 확인한 Romo1 단백질의 52-79 아미노산 영역 또는 그 일부 영역을 포함하는 펩타이드가 살균력을 발휘하는 세균의 종류를 확인하기 위하여, 상기 표 1에 나타낸 합성 펩타이드 중 KU-5878을 대표로 선정하여 하기 표 2에 나타낸 세균에 대한 항균 활성을 박테리아 살균 최소 농도 측정법을 이용하여 측정하였다. 박테리아 살균 최소 농도 측정법은 상기 실시예 1의 방법과 동일하다.
구체적으로, 각 세균을 3%(w/v) TSB액체 배지에 37℃, 200 rpm 조건으로 4 시간 배양한 후, 다시 동일한 조건에서 5×10 6 CFU/㎖ 농도가 되도록 3 시간 동안 2차 배양하였다. 상기 2차 배양한 각 균주의 최종 농도가 2×10 5 CFU/㎖ 농도가 되도록 SP 용액으로 희석하여 균주 용액을 준비하였다.
이어서, 96-웰 마이크로 플레이트의 각 웰에 농도를 달리하여(0 ㎍/㎖ 내지 300 ㎍/㎖ 펩타이드) KU-5878 펩타이드를 분주하고, 상기 준비된 각 균주를 100 ㎕ (1 × 10 5 CFU/㎖)를 넣고 섞어 37℃ 항온기에서 1 시간 동안 반응시켰다.
그리고, TS 한천 플레이트에 상기 펩타이드와 균주의 반응 용액을 10 ㎕씩 일정한 크기로 도말하고, 37℃ 항온기에서 18 시간 동안 배양한 뒤, 플레이트에서 콜로니 생성을 확인하였다. 박테리아 살균 최소 농도는 콜로니가 단 하나도 생성되지 않은 펩타이드의 최소 농도로 정의하였고, 실험 결과는 하기 표 2와 같다.
한편, 하기 표 2에서 다제내성 녹농균, 다제내성 아시네토박터, 및 다제내성 클렙시엘라는 고려대학교 안암병원의 환자로부터 분리한 균으로서, 다제내성 녹농균의 경우 피페라실린(piperacilin), 피페라실린타조박탐(piperacilin-tazobactam), 세프타지딤(ceftazidime), 이미페넴(imipenem), 메로페넴(meropenem), 젠타마이신(gentamicin), 아미카신(amikacin), 및 시프로플록사신(ciprofloxacin) 항생제에 내성을 나타내고, 다제내성 아시네토박터는 피페라실린, 피페라실린타조박탐, 세프타지딤, 이미페넴, 메로페넴, 젠타마이신, 아미카신, 시프로플록사신, 및 세페핌(cefepime) 항생제에 내성을 나타내며, 다제내성 클렙시엘라는 피페라실린타조박탐, 세프타지딤, 세페핌, 이미페넴, 젠타마이신, 및 시프로플록사신 항생제에 내성을 나타냄을 확인하고 실험에 이용하였다.
그룹 패혈증과 폐렴 원인균 및 다제내성균 관리 번호 KU-5878 MBC 값 (μg/㎖)
그람 양성 황색포도상구균 Staphylococcus aureus ATCC 29213 100
고초균 Bacillus subtilis ATCC 6633 90
엔테로코커스 패시움(장내 구균) Enterococcus faecium ATCC 19434 85
스트렙토미세스 신데넨시스 Streptomyces sindenensis ATCC 12392 95
엔테로코커스 패칼리스 Enterococcus faecalis ATCC 19433 85
스트렙토코커스 뉴모니아 Streptococcus pneumoniae NCCP 14585 100
그람 음성 대장균 Escherichia coli ATCC 25922 85
클렙시엘라 뉴모니아 Klebsiella pneumoniae ATCC 13883 100
아시네토박터 바우마니 Acinetobacter　baumannii ATCC 19606 100
녹농균 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 100
엔테로박터 에어로게네스 Enterobacter　aerogenes ATCC 13048 90
다제내성균 메티실린 내성 황색포도상구균methicillin-resistant S. aureus ATCC 33591 100
다제내성 녹농균multidrug-resistant P. aeruginosa - 110
다제내성 아시네토박터 바우마니multidrug-resistant A. baumannii - 110
다제내성 클렙시엘라 뉴모니아multidrug-resistant K. pneumoniae - 100
반코마이신 내성 엔테로코커스 패시움vancomycin-resistant E. faecium NCCP 11522 100
반코마이신 내성 황색포도상구균vancomycin-resistant S. aureus NCCP 15872 120
상기 표 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, KU-5878은 그람 양성균, 그람 음성균, 및 다제내성 박테리아 모두에게서 광범위한 항균 활성을 나타냄을 알 수 있었다.
2-2. 공지의 항균 펩타이드와 KU-5878의 항균 활성 비교 확인
In vitro에서 항균활성을 확인한 KU-5878 펩타이드가 in vivo, 특히 동물의 혈관 내에서의 세균에 대한 살균력을 효과적으로 발휘하는지 확인하기 위하여, 그람 양성균으로는 황색포도상구균, 그람 음성균으로는 녹농균, 다제내성균으로는 메타실린 내성 황색포도상구균 및 다제내성 녹농균을 대표로 선정하여 하기의 실험을 수행하였다.
구체적으로, 황색포도상구균, 메티실린 내성 황색포도상구균, 녹농균, 또는 다제내성 녹농균을 3%(w/v) TSB액체 배지에 37℃, 200 rpm 조건으로 4 시간 배양한 후, 다시 동일한 조건에서 5×10 9 CFU/㎖ 농도가 되도록 3 시간 동안 2차 배양하였다. 상기 2차 배양한 각 균주의 최종 농도가 1×10 5 CFU/㎕ 농도가 되도록 PBS 용액으로 희석하여 균주 용액을 준비하였다.
이어서, 10 주령된 수컷 생쥐(C57BL/6)의 꼬리 정맥에 각 균주 100 μl를 정맥주사(IV, Intravenous Injection)를 실시하였다. 한 시간 뒤에 KU-5878을 10 mg/kg 농도로 정맥주사하였다. 대조군으로는 PBS를, 양성 대조군으로는 LL-37, 마개닌 2, 또는 답토마이신을 각각 10 mg/kg 농도로 정맥주사 하였다.
각 약물의 정맥 주사 후 40 분 뒤에 쥐의 꼬리 끝의 약 1 cm 되는 지점을 수술용 가위를 이용하여 자르고, 절단면 끝 혈액의 10 μl를 채취하여 PBS에 희석시켰다. 희석시킨 혈액 샘플은 미리 준비한 TSB 한천 플레이트에 도말하고 37℃ 항온기에서 18 시간 동안 배양한 뒤 생성된 콜로니를 계수하여 비교하였다.
그 결과, 도 1 및 도 2에 나타낸 바와 같이, 생쥐 혈관에 잔존하는 박테리아 수는 약물의 정맥주사에 의해 감소하였고, KU-5878의 투여시 가장 크게 감소함을 알 수 있었다. 상기로부터 KU-5878이 항균활성을 가진 것으로 공지된 LL-37, 마개닌 2, 및 답토마이신보다 현저하게 우수한 항균 활성을 나타냄을 알 수 있었다.
2-3. 공지의 항생제와 KU-5878의 항균 활성 비교 확인
상기 실시예 2-2에 이어서, in vivo에서 KU-5878 펩타이드의 항균활성을 확인하기 위하여, 그람 양성균으로는 황색포도상구균, 그람 음성균으로는 녹농균, 클렙시엘라 뉴모니아, 및 아시네토박터 바우마니, 다제내성균으로는 다제내성 녹농균, 메티실린 내성 황색포도상구균, 다제내성 클렙시엘라 뉴모니아, 다제내성 아시네토박터 바우마니를 선정하여 하기의 실험을 수행하였다.
실험방법은 상기 실시예 2-2와 같다. 다만, 생쥐에 투여하는 각 균주의 최종 농도는 하기 표 3과 같고, 양성 대조군은 생쥐에 상기 각 세균을 주사하고 24시간 경과 후에 카바페넴계 항생물질인 이미페넴을 30 mg/kg을 복강 주사(IP, Intraperitoneal injection)하고, 이후 12 시간 간격으로 총 4회 동량의 이미페넴을 복강 투여하였다. 각 대조군과 실험군의 생존률을 24 시간 간격으로 측정하였다.
세균 최종 농도 (CFU)
황색포도상구균 1 × 10 8
녹농균 2 × 10 7
클렙시엘라 뉴모니아 8 × 10 8
아시네토박터 바우마니 4 × 10 8
메티실린 내성 황색포도상구균 3 × 10 8
다제내성 녹농균 8 × 10 7
다제내성 아시네토박터 바우마니 5 × 10 8
다제내성 클렙시엘라 뉴모니아 8 × 10 8
그 결과, 도 3에서 확인되는 바와 같이, 그람 양성 또는 그람 음성 박테리아만을 주사한 생쥐의 생존율은 0-20%, KU-5878을 주사한 생쥐의 경우 60%, 이미페넴을 주사한 생쥐는 약 60-80%의 생존율을 나타내었다. 또한, 도 4에서 확인할 수 있는 바와 같이, 다제내성 박테리아만 주사한 생쥐는 0-7%, KU-5878을 주사한 생쥐의 경우 60-67%, 이미페넴을 주사한 생쥐는 7-27%의 생존율을 나타내었다.
실시예 3. KU-5878의 독성 확인
상기 실시예 1 및 2에서 그람 양성, 그람 음성, 및 다제내성 세균에 대한 살균력을 확인한 Romo1 단백질의 52-79 아미노산 영역 또는 그 일부 영역을 포함하는 펩타이드가 개체에 적용 가능한지 확인하기 위하여 그 독성을 측정하고자 하였다. 이하 실험에서는 상기 표 1에 나타낸 합성 펩타이드 중 KU-5878을 대표로 선정하여 그 독성을 확인하였다.
3-1. 혈관 내피세포 유래 휴벡 세포(HUVEC cells)에 대한 독성 확인
인간의 혈관 내피세포 유래 세포주인 휴벡 세포를 96-웰 마이크로 플레이트에 배양하고, MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliurn bromide)시약은 2 mg/ml 농도로 PBS 녹인 후 0.2 μm membrane filter로 멸균 여과하여 준비하였다. 대조군으로 PBS를 사용하였다.
휴벡 세포 배지를 새로 교체하고, KU-5878, 멜리틴, 또는 마개닌 2를 농도를 달리하여(0 ㎍/㎖ 내지 300 ㎍/㎖) 분주하였다. 이어서 각 웰에 MTT시약을 100 μl처리하고 37℃에서 2 시간 항온 반응시켰다. 이어서, 세포가 분리되지 않도록 조심히 배지 및 펩타이드를 제거하고 DMSO(Dimethyl sulfoxide) 100 μl를 첨가하고, 분광광도계로 570 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 상대적 세포 생존도를 대조군인 비처리세포의 생존도의 백분률로서 계산하였다.
그 결과, 도 5로부터 확인되는 바와 같이, KU-5878은 휴벡 세포에서 매우 낮은 독성을 나타냄을 알 수 있었다.
3-2. 적혈구에 대한 독성 확인
혈액 적혈구를 PBS로 희석한 후 900 g 로 10 분 동안 3 회 반복하여 원심분리하고 세척하였다. 상기 희석된 적혈구 용액(10 % v/v PBS)을 96-웰 마이크로 플레이트에 100 μl씩 분주하고, KU-5878, KU-5878-K4, KU-5878-K4-D, 멜리틴, 마개닌 2, 또는 답토마이신을 첨가하고, 200 μl이 되도록 PBS로 채워서 37℃의 인큐베이션(incubation)에서 1 시간 동안 배양하여 반응시켰다. 이어서, 상기 반응 용액의 상층액을 분리하고 분광광도계를 이용하여 550 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로 PBS와 0.1% 트라이톤 X-100(Triton X-100) 용액을 사용하였다.
상기 흡광도 측정 결과를 기반으로 하기의 수학식 1에 따라 적혈구 세포 파괴 정도를 계산하여 그 결과를 도 6에 나타내었다.
[수학식 1]
% intact RBC = 100 (%)- [(펩타이드 처리 적혈구 용액 흡광도-PBS 처리 적혈구 용액 흡광도)/(트라이톤 X-100처리 적혈구 용액-PBS 처리 적혈구 용액 흡광도) ×100 (%)]
그 결과, 도 6으로부터 확인되는 바와 같이, KU-5878은 높은 농도에서도 용혈현상이 거의 나타내지 않음을 확인하였다. KU-5878과 마찬가지로 KU-5878-K4 및 KU-5878-K4-D도 마개닌 2, 답토마이신, 및 멜리틴과 비교하여 적혈구의 용혈 현상이 거의 나타나지 아니하였는바, 적혈구에 대한 독성이 매우 낮음을 알 수 있었다.
3-3. in vivo 에서 독성 확인
In vitro에서 무독성을 확인한 KU-5878 펩타이드가 in vivo, 특히 동물(개체)의 혈관에 주사하였을 때 개체에 독성을 나타내지 않는지 확인하기 위하여, 10 주령된 수컷 생쥐(C57BL/6)의 꼬리 정맥에 KU-5878을 100 mg/kg 농도로 투여하였다. 이때, 주사 용량의 최대 부피는 150 μl였다. 주사 이후 1 시간 동안 생쥐의 행동을 관찰하였으며, 이후 24 시간 간격으로 12 일 동안 생쥐의 몸무게 변화를 측정하였다.
그 결과, KU-5878을 투여한 생쥐는 모두 생존하였으며 도 7에 나타낸 바와 같이, KU-5878은 생쥐의 체중에는 전혀 영향을 주지 않음을 확인할 수 있었다.
실시예 4. KU-5878을 구성하는 일부 아미노산이 치환된 펩타이드의 항균 활성 확인
4-1. 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 KU-5878 변이체의 항균 활성 확인
이어서, 보다 항균활성이 우수한 펩타이드를 탐색하기 위하여 KU-5878의 친수성 잔기를 포함하는 아미노산을 양 전하를 포함하고 있는 라이신(K) 또는 아르기닌(R)으로 치환한 후 그 변이체의 항균 활성을 박테리아 살균 최소 농도 측정법을 이용하여 비교 확인하였다. 실험은 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하였다. KU-5878 변이체의 구체적인 정보 및 각 세균에 대한 MBC 값은 하기 표 4에 나타내었다.
서열번호 펩타이드 아미노산 서열 황색포도상구균 MBC 값(㎍/ml) 녹농균 MBC 값(㎍/ml) 메티실린 내성 황색포도상구균 MBC값(㎍/ml) 다제내성 녹농균 MBC값(㎍/ml)
13 KU-5878 KTMMQSGGTFGTFMAIGMGIR 100 100 100 110
17 KU-5878-T59K K KMMQSGGTFGTFMAIGMGIR 40 50 45 45
18 KU-5878-Q62K KTMM KSGGTFGTFMAIGMGIR 80 90 85 90
19 KU-5878-S63K KTMMQ KGGTFGTFMAIGMGIR 50 60 60 60
20 KU-5878-T66K KTMMQSGG KFGTFMAIGMGIR 60 80 70 80
21 KU-5878-T69K KTMMQSGGTFG KFMAIGMGIR 130 140 150 150
22 KU-5878-K2(T59K, Q62K) K KMM KSGGTFGTFMAIGMGIR 8 8 8 8
23 KU-5878-K3(T59K, Q62K, S63K) K KMM KKGGTFGTFMAIGMGIR 4 4 5 4
24 KU-5878-K3(T59K, Q62K, S63K, T66K) K KMM KKGG KFGTFMAIGMGIR 3 4 5 5
25 KU-5878-K58R RTMMQSGGTFGTFMAIGMGIR 120 120 130 120
26 KU-5878-K58A ATMMQSGGTFGTFMAIGMGIR >300 >300 >300 >300
27 KU-5878-T59R K RMMQSGGTFGTFMAIGMGIR 25 30 30 35
28 KU-5878-R78A KTMMQSGGTFGTFMAIGMGI A >300 >300 >300 >300
29 KU-5878-R78K KTMMQSGGTFGTFMAIGMGI K >300 >300 >300 >300
상기 표 4에서 확인할 수 있는 바와 같이, Romo1 단백질의 59, 62, 63, 또는 66 번째 아미노산을 라이신으로 치환한 펩타이드와 59 번째 아미노산을 아르기닌으로 치환한 펩타이드가 KU-5878보다 항균 활성이 우수함을 알 수 있었다. 또한, Romo1 단백질의 58 번째 아미노산을 아르기닌으로 치환한 KU-5878 변이체도 KU-5878과 유사한 항균 활성을 나타냄을 알 수 있었다. 상기 결과로부터, Romo1 단백질의 α-helix 2 영역에서 친수성 아미노산을 양 전하를 포함하고 있는 아미노산, 특히 라이신(K) 또는 아르기닌(R)으로 치환하는 경우도 유사한 항균활성을 나타내거나 보다 우수한 항균활성을 나타낼 수 있음을 알 수 있다.
상기 결과로부터, Romo1 단백질의 α-helix 2 영역에서 친수성 아미노산을 양 전하를 포함하고 있는 아미노산, 특히 라이신(K) 또는 아르기닌(R)으로 치환하는 경우도 유사한 항균활성을 나타내거나 보다 우수한 항균활성을 나타낼 수 있음을 알 수 있다.
4-2. KU-5878-K4의 다양한 세균에 대한 항균 활성 확인
상기 실시예 4-1에서 항균활성을 확인한 KU-5878 변이체가 살균력을 발휘하는 세균의 종류를 확인하기 위하여, 상기 표 4에 나타낸 KU-5878 변이체 중에서 KU-5878-K4를 대표로 선정하여 하기 표 5에 나타낸 세균에 대한 항균 활성을 박테리아 살균 최소 농도 측정법 이용하여 측정하였다. 박테리아 살균 최소 농도 측정법은 상기 실시예 1의 방법과 동일하게 수행하였다.
그룹 패혈증과 폐렴 원인균 및 다제내성균 관리 번호 KU-5878-K4 MBC 값(μg/㎖)
그람양성 황색포도상구균 Staphylococcus aureus ATCC 29213 3
고초균 Bacillus subtilis ATCC 6633 5
엔테로코커스 패시움(장내 구균) Enterococcus faecium ATCC 19434 5
스트렙토미세스 신데넨시스 Streptomyces sindenensis ATCC 12392 5
엔테로코커스 패칼리스 Enterococcus faecalis ATCC 19433 5
스트렙토코커스 뉴모니아 Streptococcus pneumoniae NCCP 14585 4
그람음성 대장균 Escherichia coli ATCC 25922 5
클렙시엘라 뉴모니아 Klebsiella pneumoniae ATCC 13883 5
아시네토박터 바우마니 Acinetobacter　baumannii ATCC 19606 4
녹농균 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 4
엔테로박터 에어로게네스 Enterobacter　aerogenes ATCC 13048 5
다제내성균 메티실린 내성 황색포도상구균methicillin-resistant S. aureus ATCC 33591 5
다제내성 녹농균multidrug-resistant P. aeruginosa - 5
다제내성 아시네토박터 바우마니multidrug-resistant A. baumannii - 4
다제내성 클렙시엘라 뉴모니아multidrug-resistant K. pneumoniae - 5
반코마이신 내성 엔테로코커스 패시움vancomycin-resistant E. faecium NCCP 11522 5
반코마이신 내성 황색포도상구균vancomycin-resistant S. aureus NCCP 15872 6
상기 표 5에서 확인할 수 있는 바와 같이, KU-5878-K4는 그람 양성균, 그람 음성균, 및 다제내성 박테리아 모두에게서 광범위한 항균 활성을 나타냄을 알 수 있었다.
4-3. 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 KU-5878 변이체의 항균 활성 확인
상기 실시예 4-1에서 KU-5878의 친수성 잔기를 양 전하를 포함하는 아미노산으로 치환하는 경우에도 그 항균 활성이 유지되거나 보다 우수한 항균활성을 나타냄을 확인하고, 이어서 KU-5878의 소수성 잔기를 포함하고 잔기의 구조가 유사한 메티오닌(M) 또는 이소루신(I)을 친수성 또는 잔기의 구조가 다른 아미노산으로 치환한 후 항균 활성을 살균 최소 농도 측정법을 이용하여 비교 확인하였다. 실험은 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하였다. KU-5878 변이체의 구체적인 정보 및 각 세균에 대한 MBC 값은 하기 표 6에 나타내었다.
서열번호 펩타이드 아미노산 서열 황색포도상구균 MBC 값(㎍/ml) 녹농균 MBC 값(㎍/ml)
31 KU-5878-M60A KT AMQSGGTFGTFMAIGMGIR >300 >300
32 KU-5878-I73A KTMMQSGGTFGTFMA AGMGIR >300 >300
33 KU-5878-I73K KTMMQSGGTFGTFMA KGMGIR >300 >300
34 KU-5878-I73W KTMMQSGGTFGTFMA WGMGIR 300 300
35 KU-5878-I77A KTMMQSGGTFGTFMAIGMG AR >300 >300
36 KU-5878-I73K KTMMQSGGTFGTFMAIGMG KR >300 >300
37 KU-5878-I73T KTMMQSGGTFGTFMAIGMG TR >300 >300
38 KU-5878-I73G KTMMQSGGTFGTFMAIGMG GR 90 80
39 KU-5878-4Nle KT(Nle)(Nle)QSGGTFGTF(Nle)AIG(Nle)GIR 90 110
상기 표 6에서 확인할 수 있는 바와 같이, KU-5878에서 소수성 잔기를 포함하고 잔기의 구조가 유사한 메티오닌 또는 이소루신 중 한 개를 친수성 아미노산으로 치환하였을 경우 항균 활성이 감소하였다. 반면에 메티오닌을 유사한 잔기 구조를 갖는 노루루신(Nle)으로 치환할 경우 항균 활성의 변화가 크지 않았다. 또한, 이소루신을 글리신(G)으로 치환할 경우 항균 활성이 증가함을 알 수 있었다.
4-4. 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 KU-5878 변이체의 항균 활성 확인
이어서, KU-5878의 항균활성에 상응하거나 그보다 상회하는 항균활성을 갖는 KU-5878 변이체를 탐색하기 위하여, KU-5878에서 소수성 잔기를 포함하는 페닐알라닌(F)을 친수성 또는 잔기의 구조가 다른 아미노산으로 치환한 후 항균 활성을 살균 최소 농도 측정법을 이용하여 비교 확인하였다. 실험은 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하였다. KU-5878 변이체의 구체적인 정보 및 각 세균에 대한 MBC 값은 하기 표 7에 나타내었다.
서열번호 펩타이드 아미노산 서열 황색포도상구균 MBC 값(㎍/ml) 녹농균 MBC 값(㎍/ml)
41 KU-5878-F67A KTMMQSGGT AGTFMAIGMGIR >300 >300
42 KU-5878-F67W KTMMQSGGT WGTFMAIGMGIR 80 80
43 KU-5878-F70K KTMMQSGGTAGT KMAIGMGIR >300 >300
44 KU-5878-F70W KTMMQSGGTAGT WMAIGMGIR 300 300
그 결과, 표 7에서 확인할 수 있는 바와 같이, KU-5878에서 소수성 잔기를 포함하는 67번 페닐알라닌을 유사한 잔기 구조를 갖는 트립토판으로 치환할 경우 항균 활성이 증가함을 알 수 있었다.
4-5. 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 KU-5878 변이체의 항균 활성 확인
상기 실시예 4-4에 이어서, KU-5878에서 알라닌(A) 또는 글리신(G)을 각각 글리신 또는 알라닌으로 치환한 후 항균 활성을 살균 최소 농도 측정법을 이용하여 비교 확인하였다. 실험은 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하였다. KU-5878 변이체의 구체적인 정보 및 각 세균에 대한 MBC 값은 하기 표 8에 나타내었다.
서열번호 펩타이드 아미노산 서열 황색포도상구균 MBC 값(㎍/ml) 녹농균 MBC 값(㎍/ml)
46 KU-5878-A72G KTMMQSGGTFGTFM GIGMGIR 350 350
47 KU-5878-G76A KTMMQSGGTFGTFMAIGM AIR >400 >400
그 결과, 상기 표 8에서 확인할 수 있는 바와 같이, KU-5878에서 알라닌을 글리신으로 치환 또는 글리신을 알라닌으로 치환한 펩타이드는 항균활성을 나타내기는 하였으나, KU-5878과 비교하여 감소된 항균 활성을 나타냄을 알 수 있었다.
4-6. KU-5878 및 KU-5878-K4를 구성하는 아미노산 일부 또는 전부를 D-형 아미노산으로 치환한 펩타이드의 항균 활성 확인
상기 실시예 1 내지 5에 이어서, KU-5878 및 KU-5878-K4을 구성하는 아미노산을 D-형 아미노산으로 치환한 펩타이드(KU-5878-D(all) 및 KU-5878-K4-D)를 합성하여 그 항균활성을 비교 확인하였다. KU-5878-K4-D는 KU-5878-K4에서 59번, 62번, 63번, 66번 라이신 아미노산 잔기를 D-형태의 아미노산으로 치환한 펩타이드이고, KU-5878-D(all)은 KU-5878의 모든 아미노산을 D-형태의 아미노산으로 치환한 펩타이드이다.
소 혈청(bovine serum)의 유무를 달리하여 상기 실시예 1의 방법과 동일하게 각 펩타이드의 살균 최초 농도 측정을 수행하여 그 결과를 하기 표 9에 나타내었다.
펩타이드 종류 소 혈청 X 소 혈청 O
황색포도상구균 MBC 값(μg/ml) 녹농균 MBC 값(μg/ml) 황색포도상구균 MBC 값(μg/ml) 녹농균 MBC 값(μg/ml)
KU-5878 100 100 300 300
KU-5878-D(all) 300 300 >500 >500
KU-5878-K4 3 4 40 32
KU-5878-K4-D 3 3 25 20
상기 표 9에서 확인할 수 있는 바와 같이, 소 혈청을 추가한 항균 활성 실험에서 KU-5878과 KU-5878-K4는 항균 활성이 낮아졌지만 KU-5878-K4-D의 경우 KU-5878-K4와 비교하여 항균 활성 감소의 폭이 적음을 알 수 있었다.
실시예 5. KU-5878을 구성하는 일부 아미노산이 변이된 펩타이드의 항균 활성 확인
KU-5878의 우수한 항균활성과 보다 높은 안정성을 갖는 펩타이드를 탐색하기 위하여, KU-5878의 C-말단을 아미데이션(amidation) 후 펩타이드 항균 활성을 박테리아 살균 최소 농도 측정법을 이용하여 비교 확인하였다. 실험은 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하였다. KU-5878 변이체의 구체적인 정보 및 각 세균에 대한 MBC 값은 하기 표 10에 나타내었다.
펩타이드 아미노산 서열 황색포도상구균 MBC 값(μg/ml) 녹농균 MBC 값(μg/ml)
KU-5878-NH 2 KTMMQSGGTFGTFMAIGMGIR 70 60
상기 표 10에서 확인할 수 있는 바와 같이, KU-5878의 말단이 변이된 펩타이드의 경우 항균 활성이 증가됨을 알 수 있었다.
실시예 6. KU-5878에서 한 개의 아미노산이 결손된 펩타이드의 항균 활성 평가
KU-5878(서열번호 13)의 아미노산 서열에 대하여 1개의 아미노산을 결손시킨 변이체를 제작하고 항균 활성을 평가하였다. 항균 활성 평가는 하기 표 11에 개시되어 있다.
그 결과, KU05878의 아미노산 순서를 58번 내지 78번으로 보면, 60, 61, 62, 64, 65, 66, 68, 74, 75, 또는 76번째 아미노산이 결손된 경우 항균활성이 증가하였다. 동일 아미노산이 연속된 것을 고려하면, 61번째 M 결손은 60번째 M 결손과 동일하고, 65번째 G 결손은 64번째 G 결손과 동일하다.
서열번호 13을 기준으로는 3, 4, 5, 7, 8, 9, 11, 17, 18, 또는 19번째 아미노산이 결손된 경우 항균 활성이 증가하였다.
펩타이드 명 아미노산 서열 MBC 활성증가
녹농균 황색포도상구균 CRPA MRSA
5878 KTMMQSGGTFGTFMAIGMGIR 100 100 110 100
5878-d58K -TMMQSGGTFGTFMAIGMGIR 300 300 300 >300
5878-d59T K-MMQSGGTFGTFMAIGMGIR 150 150 150 150
5878-d60M KT-MQSGGTFGTFMAIGMGIR 90 90 90 100 O
5878-d61M KTM-QSGGTFGTFMAIGMGIR 90 90 90 100 O
5878-d62Q KTMM-SGGTFGTFMAIGMGIR 100 90 100 100 O
5878-d63S KTMMQ-GGTFGTFMAIGMGIR 200 200 200 200
5878-d64G KTMMQS-GTFGTFMAIGMGIR 100 100 110 100 O
5878-d65G KTMMQSG-TFGTFMAIGMGIR 100 100 110 100 O
5878-d66T KTMMQSGG-FGTFMAIGMGIR 90 90 100 90 O
5878-d67F KTMMQSGGT-GTFMAIGMGIR 200 200 200 200
5878-d68G KTMMQSGGTF-TFMAIGMGIR 25 20 18 25 O
5878-d69T KTMMQSGGTFG-FMAIGMGIR 120 120 140 140
5878-d70F KTMMQSGGTFGT-MAIGMGIR 200 200 200 200
5878-d71M KTMMQSGGTFGTF-AIGMGIR 250 250 300 300
5878-d72A KTMMQSGGTFGTFM-IGMGIR 150 150 170 160
5878-d73I KTMMQSGGTFGTFMA-GMGIR >300 >300 >300 >300
5878-d74G KTMMQSGGTFGTFMAI-MGIR 20 25 30 25 O
5878-d75M KTMMQSGGTFGTFMAIG-GIR 100 100 100 110 O
5878-d76G KTMMQSGGTFGTFMAIGM-IR 80 70 90 90 O
5878-d77I KTMMQSGGTFGTFMAIGMG-R >300 >300 >300 >300
5878-d78R KTMMQSGGTFGTFMAIGMGI- 300 300 >300 >300
실시예 7. KU-5878에서 2 개 이상의 아미노산이 결손된 펩타이드의 항균 활성 평가
KU-5878(서열번호 13)의 아미노산 서열에 대하여 하나의 아미노산을 결손시키고 항균 활성을 평가하였다. 항균 활성 평가는 하기 표 12에 개시되어 있다.
60번째 M, 64번째 G를 결손시킨 경우를 제외하고 대부분 항균활성이 저하되었다. 동일 아미노산이 연속된 것을 고려하면, 60번째 M 결손은 61번째 M 결손과 동일하고, 64번째 G 결손은 65번째 G 결손과 동일하다.
서열번호 13을 기준으로는 3 또는 4번째 아미노산이 결손되고, 7 또는 8번째 아미노산이 결손된 경우 항균 활성이 증가하였다.
펩타이드 명 아미노산 서열 MBC 활성증가
녹농균 황색포도상구균 CRPA MRSA
5878-d60M, d64G KT-MQS-GTFGTFMAIGMGIR 100 100 100 110 O
5878-d71M, d75M KTMMQSGGTFGTF-AIG-GIR 300 250 300 300
5878-d60M, d72A, d75M KT-MQSGGTFGTFM-IG-GIR 300 280 300 300
5878-d64G, d71M, d76G KTMMQS-GTFGTF-AIGM-IR 200 200 200 200
5878-d60M, d64G, d72A, d75M KT-MQS-GTFGTFM-IG-GIR 120 100 120 120
5878-d60M, d64G, d71M, d72A, d75M KT-MQS-GTFGTF- -IG-GIR 200 200 200 200
실시예 8. KU-5878에서 1개의 아미노산이 치환된 펩타이드의 항균 활성 평가
KU-5878(서열번호 13)의 아미노산 서열에 대하여 하나의 아미노산을 치환시키고 항균 활성을 평가하였다. 항균 활성 평가는 하기 표 13에 개시되어 있다.
서열번호 13을 기준으로는 1번째 아미노산 K를 R로 치환, 2번째 아미노산 T를 K 또는 R로 치환, 5번째 아미노산 Q를 K 또는 R로 치환, 6번째 아미노산 S를 K, R, 또는 H로 치환, 9번째 아미노산 T를 K 또는 R로 치환, 10번째 아미노산 F를 W로 치환, 16번째 아미노산 I를 L로 치환, 20번째 아미노산 I를 G 또는 L로 치환한 경우 항균 활성이 증가하였다.
또한 하기 표 13의 KU-5878-4Nle을 참고하면, KU-5878의 4개의 메티오닌을 모두 노루루신(Norleucine)으로 치환한 결과 항균 활성이 개선되었음을 확인하였다. 이는 메티오닌과 노루루신이 황이 탄소로 변경된 것을 제외하면 구조가 동일하기 때문인 것으로 추측된다.
펩타이드 명 아미노산 서열 MBC 활성증가
녹농균 황색포도상구균 CRPA MRSA
KU-5878 KTMMQSGGTFGTFMAIGMGIR 100 100 110 110
KU-5878-T59K KKMMQSGGTFGTFMAIGMGIR 50 40 50 50 O
KU-5878-Q62K KTMMKSGGTFGTFMAIGMGIR 90 80 90 90 O
KU-5878-S63K KTMMQKGGTFGTFMAIGMGIR 60 50 50 50 O
KU-5878-T66K KTMMQSGGKFGTFMAIGMGIR 80 60 70 80 O
KU-5878-T69K KTMMQSGGTFGKFMAIGMGIR 140 130 150 150
KU-5878-T59R KRMMQSGGTFGTFMAIGMGIR 30 25 30 30 O
KU-5878-Q62R KTMMRSGGTFGTFMAIGMGIR 80 80 80 90 O
KU-5878-S63R KTMMQRGGTFGTFMAIGMGIR 20 15 20 25 O
KU-5878-T66R KTMMQSGGRFGTFMAIGMGIR 80 90 80 90 O
KU-5878-T59H KHMMQSGGTFGTFMAIGMGIR >300 >300 >300 >300
KU-5878-Q62H KTMMHSGGTFGTFMAIGMGIR >300 >300 >300 >300
KU-5878-S63H KTMMQHGGTFGTFMAIGMGIR 100 100 100 110 O
KU-5878-T66H KTMMQSGGHFGTFMAIGMGIR >300 >300 >300 >300
KU-5878-T59S KSMMQSGGTFGTFMAIGMGIR >300 >300 >300 >300
KU-5878-Q62S KTMMSSGGTFGTFMAIGMGIR >300 >300 >300 >300
KU-5878-S63T KTMMQTGGTFGTFMAIGMGIR >300 >300 >300 >300
KU-5878-T66S KTMMQSGGSFGTFMAIGMGIR >300 >300 >300 >300
KU-5878- K58A ATMMQSGGTFGTFMAIGMGIR >300 >300 >300 >300
KU-5878-T59A KAMMQSGGTFGTFMAIGMGIR 150 120 130 140
KU-5878-Q62A KTMMASGGTFGTFMAIGMGIR >300 >300 >300 >300
KU-5878-S63A KTMMQAGGTFGTFMAIGMGIR 300 300 300 >300
KU-5878-T66A KTMMQSGGAFGTFMAIGMGIR >300 >300 >300 >300
KU-5878-T69A KTMMQSGGTFGAFMAIGMGIR 300 300 300 300
KU-5878-K58R RTMMQSGGTFGTFMAIGMGIR 120 120 120 120
KU-5878- K58A ATMMQSGGTFGTFMAIGMGIR >300 >300 >300 >300
KU-5878-R78A KTMMQSGGTFGTFMAIGMGIA >300 >300 >300 >300
KU-5878-R78K KTMMQSGGTFGTFMAIGMGIK >300 >300 >300 >300
KU-5878-M60A KTAMQSGGTFGTFMAIGMGIR >300 >300 >300 >300
KU-5878-I73A KTMMQSGGTFGTFMAAGMGIR >300 >300 >300 >300
KU-5878-I73K KTMMQSGGTFGTFMAKGMGIR >300 >300 >300 >300
KU-5878-I73W KTMMQSGGTFGTFMAWGMGIR 300 300 300 >300
KU-5878-I77A KTMMQSGGTFGTFMAIGMGAR >300 >300 >300 >300
KU-5878-I77K KTMMQSGGTFGTFMAIGMGKR >300 >300 >300 >300
KU-5878-I77T KTMMQSGGTFGTFMAIGMGTR >300 >300 >300 >300
KU-5878-I77G KTMMQSGGTFGTFMAIGMGGR 80 90 100 90 O
KU-5878-4Nle KT(Nle)(Nle)QSGGTFGTF(Nle)AIG(Nle)GIR 110 90 100 100 O
KU-5878-F67A KTMMQSGGTAGTFMAIGMGIR >300 >300 >300 >300
KU-5878-F67W KTMMQSGGTWGTFMAIGMGIR 80 80 80 90 O
KU-5878-F70K KTMMQSGGTFGTKMAIGMGIR >300 >300 >300 >300
KU-5878-F70W KTMMQSGGTFGTWMAIGMGIR 300 300 300 >300
KU-5878-A72G KTMMQSGGTFGTFMGIGMGIR >300 >300 >300 >300
KU-5878-G76A KTMMQSGGTFGTFMAIGMAIR >300 >300 >300 >300
실시예 9. KU-5878에서 59번 아미노산 치환을 기초로 하는 다치환 펩티드의 항균 활성 확인
U-5878-T59K 아미노산 서열에 대하여 Q62K, S63K, T66K의 치환을 순차적으로 추가하고 항균 활성을 평가하였다. 항균 활성 평가는 하기 표 14에 개시되어 있다.
상기 T59K, Q62K, S63K, T66K의 치환 위치는 서열번호 13을 기준으로 2, 5, 6, 9번째 아미노산에 해당한다.
펩타이드 명 아미노산 서열 MBC 활성증가
녹농균 황색포도상구균 CRPA MRSA
KU-5878 KTMMQSGGTFGTFMAIGMGIR 100 100 110 110
KU-5878-T59K KKMMQSGGTFGTFMAIGMGIR 50 40 50 50 O
KU-5878-K2(T59K,Q62K) KKMMKSGGTFGTFMAIGMGIR 8 8 6 8 O
KU-5878-K3(T59K,Q62K,S63K) KKMMKKGGTFGTFMAIGMGIR 4 4 4 5 O
KU-5878-K4(T59K,Q62K,S63K,T66K) KKMMKKGGKFGTFMAIGMGIR 4 3 3 4 O
실시예 10. C말단에 아미노산 서열 추가된 KU-5878의 항균 활성 확인
KU-5878의 C말단에 아미노산 반복 서열을 추가하고 항균 활성도를 평가하였다. 하기 표 15에 따르면, KU-5878의 C 말단에 R(arginine) 반복 서열 또는 K(lysine) 서열을 부가하면 항균 활성이 증가하였다.
펩타이드 명 아미노산 서열 MBC 활성증가
녹농균 황색포도상구균 CRPA MRSA
5878-3R KTMMQSGGTFGTFMAIGMGIR RRR 8 8 8 10 O
5878-KK KTMMQSGGTFGTFMAIGMGIRK K 15 16 16 16 O
5878-Q KTMMQSGGTFGTFMAIGMGIR Q 150 180 180 180
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (10)

  1. 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 구성된 Romo1 단백질 서열 중 52 내지 62 번째 아미노산 영역에서 선택되는 임의의 하나의 아미노산을 기준으로 연속된 18개 아미노산 서열을 포함하는 항균 펩타이드.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 펩타이드는 서열번호 2 내지 12, 14, 및 15로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 항균 펩타이드.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 펩타이드는 N-말단 또는 C-말단이 변이(modification)된 것으로서, 상기 변이는 페길레이션(PEGylation), 아세틸레이션(acetylation), 카르복실레이션(carboxylation), 리피데이션(lipidation), 또는 아미데이션(amidation)인 것을 특징으로 하는, 항균 펩타이드.
  4. 서열번호 16, 30, 40, 및 45 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진, 항균 펩타이드.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 서열번호 16은 서열번호 17 내지 29으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 아미노산 서열이고,
    상기 서열번호 30은 서열번호 31 내지 39으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 아미노산 서열이고,
    상기 서열번호 40은 서열번호 41 내지 44으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 아미노산 서열이고,
    상기 서열번호 45는 서열번호 46 내지 47로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열인,
    항균 펩타이드.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 펩타이드는 N-말단, C-말단, 또는 임의의 아미노산이 변형(modification)된 것으로서,
    상기 변이는 페길레이션(PEGylation), 아세틸레이션(acetylation), 카르복실레이션(carboxylation), 리피데이션(lipidation), 또는 아미데이션(amidation)인 것을 특징으로 하는, 항균 펩타이드.
  7. 서열번호 13의 아미노산 서열; 또는
    서열번호 13의 아미노산 서열에 대해 하기 (a) 내지 (h) 중 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는 서열로 이루어지는 항균 펩타이드:
    (a) 1번째 아미노산 K를 R로 치환
    (b) 2번째 아미노산 T를 K 또는 R로 치환
    (c) 5번째 아미노산 Q를 K 또는 R로 치환
    (d) 6번째 아미노산 S를 K, R, 또는 H로 치환
    (e) 9번째 아미노산 T를 K 또는 R로 치환
    (f) 10번째 아미노산 F를 W로 치환
    (g) 16번째 아미노산 I를 L로 치환
    (h) 20번째 아미노산 I를 G 또는 L로 치환.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 항균 펩타이드는 적어도 하나의 메티오닌이 노루루신 또는 이소루신으로 치환된,
    항균 펩타이드.
  9. 제7항에 있어서,
    3, 4, 5, 7, 8, 9, 11, 17, 18, 및 19 번째 아미노산 중 어느 하나가 결손; 또는 3 또는 4번째 아미노산, 및 7 또는 8번째 아미노산이 결손된,
    항균 펩타이드.
  10. 제7항에 있어서,
    상기 항균 펩타이드는 C말단에 연결된 아미노산 서열을 더 포함하고,
    상기 C말단에 연결된 아미노산 서열은 R 또는 K가 1 내지 3개 반복하는 서열로 이루어진 것인,
    항균 펩타이드.
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