KR102011669B1

KR102011669B1 - 항균펩타이드를 이용한 여드름 개선용 화장료 조성물

Info

Publication number: KR102011669B1
Application number: KR1020170162802A
Authority: KR
Inventors: 이종범; 전태영; 함태훈; 권오산; 강성민; 김명기
Original assignee: 주식회사 에버코스
Priority date: 2017-11-30
Filing date: 2017-11-30
Publication date: 2019-08-19
Also published as: KR20190063777A

Abstract

여드름 피부에 효과가 있는 카퍼 올리고펩타이드를 함유하는 여드름 개선용 화장료 조성물이 개시된다. 상기 여드름 개선용 화장료 조성물은 유효성분으로 카퍼 올리고펩타이드를 함유 함으로써 여드름균의 증식 억제, 면포 형성억제 및 완화 효과를 나타내어 여드름 피부의 치료 및 완화에 도움을 주는 것에 그 특징이 있다.

Description

항균펩타이드를 이용한 여드름 개선용 화장료 조성물{A COSMETIC COMPOSITION USING ANTIMICROBIAL PEPTIDE FOR ANTI-ACNE}

본 발명은 여드름 개선용 화장료 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 카퍼 올리고펩타이드를 함유하는 여드름 개선 또는 완화용 화장료 조성물에 관한 것이다.

일반적으로 피지는 두피, 얼굴을 포함한 피부에서 피부의 보습유지나 미생물의 침입을 막는 역할을 담당하고 있지만, 사춘기 이후에는 여드름을 유발시키는 주 원인이다. 특히, 20대 이후의 여성의 경우에는 피지의 과잉 분비로 인해 피부 번들거림, 화장의 들뜸 및 모공이 넓어지는 등 미용면에서 많은 문제를 유발시킨다. 피지의 과잉분비에 다른 요인들이 복합적으로 작용하여 여드름을 유발하게 된다. 일반적으로 여드름의 발생은 남성 호르몬의 작용에 기인한 피지의 과다분비, 피지선 내의 각질세포 과각화, 그리고 여드름균(Propionibacterium Acnes) 관여 등 복합적인 작용에 의해서 발생된다고 알려져 있다. 피지선 내의 피지관 내벽의 비정상적인 과각화에 의해 피지관 내벽이 두꺼워져 피지가 분비되는 관이 막히고, 피지의 분비가 증가됨에 따라서 생성된 피지가 피지선 내에 계속 싸이게 되면서 여드름이 발생하게 되는 것이다. 피지선 내에 피지가 분비되지 못하고 잔류하게 되면 피지선 내에 존재하는 여드름 균의 증식이 많아짐에 따라 여드름 균에 의해 이를 구성하고 있는 트리글리세라이드(triglyceride)가 자유 지방산(free fatty acid)으로 전환되어서 자극원으로 작용하거나, 면포 유발성(comedogenic) 물질로 작용하여 여드름 생성을 촉진하게 된다. 또한 더욱 진행되어 염증반응까지 수반하게 된다. 여드름의 발생 원인이 되는 피지선내의 피지관 내벽의 비정상적인 과각화를 억제함으로써 여드름 억제 및 완화를 기대할 수 있다.

각질층은 표피각화세포(keratinocyte)가 각화되고, 죽은 세포로서 편평화된 각질층 세포가 10층 이상 정도 긴밀하게 쌓여져 있고, 두께는 20㎛ 정도이다. 각질층 세포 사이는 표피상층의 각화 세포내의 층판 과립으로부터 분비된 스핑고 지질, 콜레스테롤, 지방산이 층상구조를 취하고 있는 세포간 지질로 채워져 있다. 세포와 세포는 데스모좀(desmosome)이라고 하는 세포접착 인자인 당단백질을 통해 강하게 연결되어있다.

이러한 여드름을 치료하기 위하여 경구제 또는 외용제 형태의 약제를 사용하였는데, 예를 들면, 피지생성을 억제하는 항안드로겐제, 항염제로 작용하는 비스테로이드 소염제, 레소치놀, 유황, 살리실산, 벤조일퍼옥사이드, 이소트레티노인과 같은 항균제 및 각질박리제, 테트라사이클린, 에리스로마이신, 메크로사이클린 등의 항생물질에 의한 프로피오니박테리움 아크네균의 활성억제 방법 등이 있다. 한편, 최근에는 레티노익산(Retinoic acid) 등의 비타민A 유도체를 이용한 치료 방법과 아젤리아산을 이용한 피부방법도 많이 사용되고 있다.

현재 사용되는 여드름 치료제는 일반적으로 의약품으로 사용되는 것으로 부작용이 있다. 또한 상기에서 설명한 방법들 역시 여드름 치료에 어느 정도 성과를 거두고 있으나, 이의 효과, 부작용 및 사용성 면에서 몇 가지 문제점들을 가지고 있다. 즉, 호르몬제의 사용은 표피의 생장억제나 기타 호르몬 남용 부작용이 보고되어 있으며, 레티노익산과 벤조일퍼옥사이드등의 각질박리제는 각질박리에 따른 피부의 자극성과 접촉성 피부염의 우려가, 테트라사이클린을 위시한 항생물질은 내성균의 출현 및 광과민작용의 가능성이 알려져 있다. 특히, 이소트레티노인은 태아에 최기성 작용이 있음이 알려져 있다. 또한, 몰약 등 종래의 동양 약재 식물 추출물을 이용한 여드름에 유효한 화장료 조성물은 그 효능에 있어서 유효한 효과는 인정되나, 여드름성의 민감성 피부에 대해서는 경우에 따라 알레르기 과민반응을 보이는 경우도 있어 그 사용 범위가 다소 한정될 수 있는 문제점을 가지고 있다.

최근에는, 인체에 안전하면서도 여드름 피부에 대한 개선효과가 우수한 제품의 개발 필요성이 꾸준히 대두되고 있는 상황이다.

본 발명은 전술한 문제를 해결하고자 안출된 것으로서, 본 발명의 일 실시예는 여드름 유발균의 생육을 저해 하는 항균펩타이드를 개발 하여 민감한 피부에도 자극을 최소화하고, 여드름 피부 개선 및 예방에 효과가 있는 여드름 피부 개선 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 기술적 과제로 한정되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

전술한 기술적 과제를 달성하기 위한 기술적 수단으로서, 본 발명의 일 측면에 따른 여드름 개선용 화장료 조성물은 구리이온 및 글리신, 루신, 페닐알라닌, 아스파트산, 이소류신, 라이신, 알라닌, 글루탐산, 세린을 포함하는 올리고펩타이드로서, 9개 내지 16개의 아미노산으로 이루어지는 올리고펩타이드가 복합체를 형성한 카퍼펩타이드를 함유한다.

여기서, 상기 복합체는 상기 구리이온과 상기 올리고펩타이드와 배위결합을 하여 복합체를 형성하는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 올리고펩타이드는 Gly-Leu-Phe-Asp-Ile-Ile-Lys-Lys-Ile-Ala-Glu-Ser-Phe(서열번호 1)의 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 복합체는 상기 올리고펩타이드와 염화제2구리(CuCl2)를 반응하여 합성하는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 복합체의 함량은 화장료 조성물 총 중량에 대해 0.0001 내지 10중량%인 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 팩, 파우더, 비누, 폼클렌져, 오일, 납상 왁스, 분말파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이, 미스트로 구성된 군으로부터 선택되는 제형을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따른 여드름 개선용 화장료 조성물은 여드름 유발균의 생육을 저해 하는 항균펩타이드를 포함하여 민감한 피부에도 자극을 최소화하고, 여드름 피부 개선 및 예방에 효과가 있다.

본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 특허청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

도 1은 카퍼올리고펩타이드-76의 합성 결과 GC MASS 결과이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 시험결과가 나타난 평판 배지이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 펩타이드의 항염효과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 펩타이드에 대한 세포독성(MTT assay) 평가 결과이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따른 펩타이드에 대한 Hyaluronidase 합성 억제 평가 결과이다.

이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 의해 본 발명이 한정되지 않으며 본 발명은 후술할 청구범위의 의해 정의될 뿐이다.

덧붙여, 본 발명에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 발명의 명세서 전체에서 어떤 구성요소를 '포함'한다는 것은 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있다는 것을 의미한다.

본 발명의 조성물이 적용되는 “여드름”은 당업계에서 여드름 통칭되는 모든 피부 질환 또는 여드름과 유사한 기전을 통해 발명되는 모든 피부 질환을 포함하며, 예컨대, 집합성 여드름, 브롬화물에 의한 여드름, 일반적 여드름, 응괴 여드름(congoblate acne), 화장품 사용에 의한 여드름, 디터지칸 여드름(acne dtergicans), 청춘기 여드름, 섬광모양의 여드름(acne fulminans), 절성 여드름(acne furunculoid), 할로겐에 의한 여드름, 경결성 여드름, 켈로이드성 여드름, 물리적 자극에 의한 여드름(mechanical acne), 약물성 여드름, 괴사성 여드름, 속립성 여드름, 신생아 여드름(acne neonatorum), 지성 여드름(acne oil), 구진성 여드름, 적창(pomade acne), 월경전 여드름, 주사 여드름(acne rosacea), 모창성 여드름, 열대성 여드름(tropical acne), 중독성 여드름(acne venenata), 및 심상성 여드름 등을 포함한다.

본 발명의 일 측면에 따른 여드름 개선용 화장료 조성물은 구리이온 글리신, 루신, 페닐알라닌, 아스파트산, 이소류신, 라이신, 알라닌, 글루탐산, 세린을 포함하는 올리고펩타이드로서, 9 내지 16 개의 아미노산으로 이루어지는 올리고펩타이드가 복합체를 형성한 카퍼펩타이드를 함유한다.

상기 복합체는 상기 구리이온과 상기 올리고펩타이드가 배위결합을 하여 복합체를 형성하는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 올리고펩타이드는 Gly-Leu-Phe-Asp-Ile-Ile-Lys-Lys-Ile-Ala-Glu-Ser-Phe(서열번호 1)의 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명의 상기 올리고펩타이드는 각질세포를 연결하고 있는 데스모좀이라는 단백질의 연결을 약하게 하여 노화된 각질이 자연스럽게 떨어져 나가도록 도와줄 수 있다. 데스모좀은 데스모글레인(Desmoglein)과 데스모콜린(Desmocollin)이라는 두 개의 단백질의 세포접착 인식(Cell Adhesion Recognition: 줄여서 CAR)부위가 서로 이형질 결합으로 이루어져 있다. 상기 올리고펩타이드는 데스모글레인의 세포접착 인식 부위와 경쟁적으로 데스모콜린의 세포접착 인식 부위와 결합을 하여 결과적으로 데스모좀의 결합력을 약화시켜 피부 자극없이 안전하게 피부 갱신 속도를 높여줄 수 있다.

상기 여드름 개선용 화장료 조성물에서, 상기 카퍼펩타이드는 우수한 콜라겐 합성 촉진 기능을 보이므로, 피부 보습과 탄력을 증진시키고 피부를 진정시킬 수 있다. 또한 여드름 유발균인 프로피오네박테리움 아크네(Propionebacteriumacne)에 대한 항균 활성을 통해 여드름 방지 및 개선시키는 작용을 할 수 있다.

상기 복합체는 상기 올리고펩타이드와 구리이온을 반응하여 합성하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 구리이온에는 이 분야에서 널리 알려진 구리이온이면 특별한 제한은 없으나, 바람직하게는 염화제2구리(CuCl₂)를 반응하여 합성하는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 복합체의 함량은 화장료 조성물 총 중량에 대해 0.0001 내지 10중량%인 것을 특징으로 할 수 있다. 바람직하게는 0.0005 내지 10중량%일 수 있다. 상기 복합체의 함량이 0.0001 중량% 미만일 때에는 미백 효과가 나타나기 어렵고, 상기 복합체의 함량이 10.0중량% 이상일 때에는 피부에 자극을 유발할 가능성이 높으며, 제형의 안정화에도 큰 영향을 미칠 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 팩, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 납상 왁스, 분말파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이, 미스트로 구성된 군으로부터 선택되는 제형을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. 보다 상세하게는 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징크림, 폼클렌징, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸에테르와 같은 추진제를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 유효 성분으로 포함되는 상기 복합체 이외에 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.

이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.

제조예 1. 항균펩타이드의 합성

펩타이드의 합성은 고체 합성법(Solid-phase peptide synthesis)을 이용 하여 올리고펩타이드-76을 1차 합성 하였고, 2차 올리고펩타이드-76과 염화제2구리(CuCl₂)를 약 1:1 mol 비로 반응 시켜 GC Mass를 이용하여 합성을 확인 하였다.

도 1에 나타난 결과와 같이, Mass 1544.03 m/z peak이 올리고펩타이드와 CuCl2가 반응한 분자의 분자량으로 확인 됨. 따라서 카퍼올리고펩타이드-76의 합성을 확인 하였다.

실험예 1. 항균펩타이드의 P.acnes 균 MIC 측정

1) 균주 배양

항균력 검색에 사용한 공시균주인 Propionibactrium acnes KCTC 3314(P.acnes)는 한국생명공학연구원 생물자원센터에서 분양받아 사용하였다. P. acnes는 37℃, GasPack EZ Anaerobic Container System(BD, USA)을 이용한 혐기성 환경에서 Reinforce Clostridial broth에서 배양하였다.

2) 항균활성 측정

항균활성 측정에 대하여 최소성장저해농도(minimum inhibitory concentration, MIC) 측정을 실시하였으며, 시험법은 broth microdilution method (Reuben, 1989)를 이용하였다. 고체배지에서 자란 각 균주의 단일집락을 10 mL의 액체배지에 접종하여 각각 균의 최적생육 온도에서 12시간씩 액체배지에서 2회 계대배양 하였다. 96 well microplate에 배지를 각각 100 μL씩 분주하고 시료를 100 μL씩 2배 희석하여 농도를 조절 한 후 각각의 시험균은 대수 증식기 중기(2~6시간 배양 후)에 도달하였을 때 배양액을 균의 농도를 2⁴~10⁵ CFU/mL이 되도록 희석시켜 well당 100 μL씩 첨가하였다. 그 후 37℃에서 24시간 배양한 뒤, 650 nm에서 microplate reader (Molecular Devices, USA)로 흡광도를 측정하였다.

실험예 2. 펩타이드의 항균 효능 평가

1) 균주 배양

P. acnes 는 Blood-Agar medium(tryptic soy broth 3%, yeast extract 0.5%, 0.025% resazurin 2 mL, agar 1.5%, cysteine HCl-H₂O 0.05%, hemin solution 0.5 mg/mL, vitamin K₁ 2 mg/mL, sheep blood 5.0%)(BRL)를 사용하여 혐기성 세균배양기(Bactron 300: Shell Lab, IL, USA)를 사용하여 혐기성조건(anaerobic gas mixture : 85% N₂, 10% H₂, 5% CO₂) 에서 배양하였다.

2) 시험방법

펩타이드의 항균력은 paper disc 법에 의하여 실시하였다. 즉, 평판배지에 배양된 각 균주를 1 백금이량 취해서 액체 배지 10 ㎖에서 18～24시간 배 양하여 활성화시킨 후 다시 액체 배지 10 ㎖에 균 배양액을 0.1 ㎖ 종하여 3～6시간 본 배양한 후 평판배지 1개당 균수를 약 10⁷ cells되게 종하여 멸균 면으로 균일하게 도말하였다. 멸균된 filter paper disc(Tokyo, 8 mm, Japan)를 고체 평 배지에 올려놓은 다음 0.05 ㎖/disc가 되도록 시료를 농도별로 흡수시켜 37℃에서 18～24시간 배양하여 disc 주의 clear zone mm)의 직경을 측정하였다.

Stains	Concentration (mg/mL)	Clear zone on plate (mm)
Stains	Concentration (mg/mL)	(a)	(b)	(c)	평균
P.acnes	0	-	-	-	-
	1	13	12	8.5	11.2
	2	16	14	11	13.7
	3	14	14	10	12.7
	5	18	15	13	15.3

상기 표 1과 같이 펩타이드의 균주에 대한 농도별 억제 효과를 실험 하기 위하여 실험 하였다. 그 결과, 처리 용량(1, 2, 3, 5 mg/mL)에서 각각 농도의존적으로 균주를 억제 한는 결과를 나타내었다. 도 2는 시험결과가 나타난 평판 배지를 나타낸 것이다.

실험예 3. 펩타이드의 항염 효과 평가(Nitrite assay에 의한 NO 생성억제 효과 측정)

Nitric oxide(NO) 측정은 RAW 264.7 cell에서 nitric oxide synthase을 발시키고 생성된 상층 액에서의 NO의 양을 Griess 시약을 사용하여 NO2-의 형태로 측정하다21). 96 well plate에 5 4cell/well이 되도록 종하여 12시간 이상 배 양시킨 후에 로콜리 추출물을 농도별로 처리하 고 1시간 후에 lipopolysacchride(LPS) 1㎍/㎖을 처리하여 24시간 배양하다. 배양액의 상층액을 회수하여 griess 시약과 반응시킨 후 ELISA reader (BioTek, Italy)를 이용하여 540 nm에서 흡도를 측정하다. NO의 생성량은 nitric oxide standard solution을 이용하여 계산하였다.

samples		NO increase	NO increase	NO increase	평균	편차
samples		(%)	(%)	(%)
	CON	84.70353	90.32792	98.35953	91.13033	6.863272
올리고펩타이드-76	LPS	100	100	100	100	0
	5	110.8104	110.9482	114.4701	112.0762	2.07433
	10	88.62135	72.53447	92.85287	84.66956	10.72016
	15	98.97166	91.46583	95.12263	95.18671	3.753327
	20	87.70049	93.20914	79.38665	86.76543	6.958526

samples		NO increase	NO increase	NO increase	평균	편차
samples		(%)	(%)	(%)
카퍼올리고펩타이드-76	5	90.09292	94.14797	102.6349	95.62525	6.400143
	10	94.14443	88.66297	105.1649	95.99076	8.404463
	15	94.14338	88.44258	93.63678	92.07424	3.155296
	20	70.94069	66.55938	76.99732	71.49913	5.241331

NO 유도물질인 LPS 처리하여 생성된 NO 양을 Griess 시약을 이 용하여 측정하였다. 상기 표 2 및 도 3에 나타난 결과와 같이, LPS 처리 후 NO 생성량은 대조군과 비교하여 올리고펩타이드-76에서 최대 112%의 억제 효과를 나타내었으며, 카퍼올리고펩타이드-76에서는 최대 96%의 억제 효과를 나타내는 것으로 확인되었다.

이와 같은 결과는 올리고펩타이드-76과 카퍼올리고펩타이드-76이 모두 일정한 NO생성 억제 능력이 있음을 나타낸다.

실험예 4. 펩타이드에 대한 세포독성(MTT assay) 평가

세포를 2 x 10⁵/mL 농도로 96 well plate에 seeding 하고, 24시간 후 serum-free DMEM으로 교체해준 후 펩타이드 추출물을 처리하였다. 24시간 동안 배양한 후 media를 걷어내고 20 μL의 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT, 5㎎/mL)을 넣어주고 CO₂ 배양기에서 2시간 배양하였다. 100 μL의 DMSO로 결정을 용해시킨 후에 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 생존율은 control과 비교하여 %로 표시하였다. 세포에 처리한 샘플에 포함된 DMSO는 최종농도 0.1%로 조정하였다.

도 4에 나타난 바와 같이, 실험결과 펩타이드에 대한 세포독성 시험결과 positive control인 RA에 비하여 25ppm의 경우 37%, 50ppm의 경우 44.3%, 100ppm의 경우 23.6%의 세포 생존율을 나타내었다.

실험예 5. 펩타이드에 대한 Hyaluronidase 합성 억제 평가

HYAL 저해율을 측정하기 위해 Hyaluronidase enzyme assay를 시행하였고, Morgan-Elson method에 따랐다. Bovine hyaluronidase 50 ㎕ (8 ㎎/㎖, 0.1 M acetate buffer, pH 3.6)과 50 ㎕의 시료를 섞은 후에 37 ℃에서 20분간 방치하였다. CaCl₂ 200 ㎕ (12.5 mM)를 넣어준 후 다시 37 ℃에서 20분간 방치하였다. Sodium hyaluronate 250 ㎕ (12 ㎎ / 5 ㎖의 농도로 acetate buffer에 녹였다.)를 넣어주고 다시 37 ℃에서 40분간 방치한 후 NaOH 100 ㎕ (0.4 M)와 potassium tetraborate 100 ㎕ (0.4 M)를 넣어주었다. 끓는 물에 3분간 놓아둔 후 실온에서 식힌 후에 DMAB 용액 (1.5 ㎖)를 넣어주고 다시 37 ℃에서 20분간 방치한 후 585 nm에서 흡광도를 측정하였다. HYAL 저해제로 알려진 glycyrrhizin과 비교하였다. 저해율은 [(ODc - ODs)/ ODc] x 100 (%)로 계산하였다.

con	glycyrrhizin	25ppm	50ppm	100ppm
0.229	0.117	0.199	0.203	0.213
0.227	0.113	0.198	0.212	0.216
0.23	0.119	0.202	0.21	0.212
0.224	0.114	0.19	0.2	0.188
0.208	0.114	0.189	0.204	0.202
0.226	0.113	0.19	0.204	0.194

표 3 및 도 5에 나타난 바와 같이, HYAL의 저해율은 positive control과 비교하여 25, 50, 100 ppm에서 각각 14.4%, 8.4%, 10.6%로 나타났으며, 기존에 알려진 고시형 보습소재나 일부 천연물 소재에 비하여 억제효과가 탁월하지는 않았으나 hyaluronidase에 대하여 일부 억제 효과가 있는 것으로 확인하였다.

제조예 2. 항균펩타이드를 이용한 스킨 토너 제조

개발된 카퍼 올리고펩타이드-76(100ppm)을 유효 성분으로 함유하는 스킨토너를 표 4와 같은 조성으로 제조 하였다.

성분명	함량(%)
카보머	0.02
디포타슘글리시리제이트	0.10
알란토인	0.10
판테놀	1.00
하이드롤라이즈드하이알루로닉애씨드	0.05
나이아신아마이드	2.00
베타인살리실레이트	0.60
알지닌	0.20
하이드록시아세토페논	0.40
프로판디올	6.00
옥틸도데세스-16	1.00
에톡시디글라이콜	4.00
알로에베라잎즙	10.00
카퍼 올리고펩타이드-76	1.00
아시아티코사이드	미량
아시아틱애씨드	미량
마데카식애씨드	미량
목련나무껍질추출물	미량
병풀추출물	미량
티트리잎오일	미량
정제수	잔량

제조예 3. 항균펩타이드를 이용한 스팟 트리트먼트 제조

개발된 카퍼 올리고펩타이드-76(100ppm)을 유효 성분으로 함유하는 스팟 트리트먼트를 표 5과 같은 조성으로 제조 하였다.

원료명(Chemical Name)	함량(%)
글리세린	10.00
나이아신아마이드	2.00
부틸렌글라이콜	2.00
아크릴레이트/C10-30알킬아크릴레이트크로스폴리머	0.30
하이드로제네이티드폴리이소부텐	6.00
알루미늄스타치옥테닐석시네이트	4.00
글리세릴스테아레이트에스이	3.00
카프릴릴메치콘	2.00
폴리C10-30알킬아크릴레이트	1.80
비즈왁스	1.50
펜틸렌글라이콜	2.00
판테놀	1.00
트레할로스	1.00
베타인살리실레이트	0.50
하이드록시아세토페논	0.50
1,2-헥산디올	0.50
카퍼 올리고펩타이드-76	1.00
포타슘세틸포스페이트	0.20
하이드롤라이즈드하이알루로닉애씨드	미량
트로메타민	적량
디소듐이디티에이	미량
알지닌	미량
아시아티코사이드	미량
아시아틱애씨드	미량
마데카식애씨드	미량
디포타슘글리시리제이트	미량
착향제	미량
정제수	잔량

실험예 6. 제품 안정성 시험

제조예 2 및 3의 스킨토너, 스팟트리트먼트의 제품의 안정성을 시험하기 위해 플라스틱 용기에 담아 50℃, 38℃, 25℃, 4℃, Cycle로 일정하게 유지되고 완전히 차광된 항온조에서 각 조건별로 보관한 후 변색, 변취, 물성, 화학적 변화를 관찰하였으며, 직사광선 조건하에서의 변화를 관찰 하여 그 결과를 표 6에 나타내었다.

온도 기간 제 품 명	45 ℃	38 ℃	25 ℃	4 ℃	cycle (45℃→25℃→4℃)	직사광선
온도 기간 제 품 명	3개월	3개월	3개월	3개월	3개월	7일
스킨 토너	변화 없음	변화 없음	변화 없음	변화 없음	변화 없음	변화 없음
스팟트리트먼트	변화 없음	변화 없음	변화 없음	변화 없음	변화 없음	변화 없음

상기 표 6의 결과에서 보듯이 스킨 토너 스팟트리트먼트 모두 제품 안정성이 우수함을 알 수 있었다.

실험예 7. 스킨 토너, 스팟 트리트먼트의 인체피부 자극시험

제조예 2 및 3의 스킨토너, 스팟트리트먼트의 제품의 피부에서의 자극 유무를 패취 테스트에 의하여 실시 하였으며, 피험자수는 통계적 비교가 가능하기 위해 20명 이상으로 하여 유효데이터를 확보 한다. 자극의 평가는 평가기준에 따라 측정 하고 그 결과는 표 7과 같다.

시험품목	48시간 경과					96시간 경과
시험품목	-	±	+	++	+++	-	±	+	++	+++
스킨 토너	-	-	-	-		-	-	-	-
스팟 트리트먼트	-	-	-	-		-	-	-	-

<판정기준>

- : Negative

±: Doubtful or slight reaction and erythema

+ : Erythema + Induration

++: Erythema + Induration +Vesicle

+++: Erythema + Induration +Bullae

(ICDRG 판정기준 : International Contact Dermatitis Research Group)

상기 표 7의 결과 제조예 2 및 3의 스킨토너, 스팟 트리트먼트는 저자극 제품임을 확인할 수 있었다.

실험예 8. 스킨토너, 스팟 트리트먼트 여드름 피부 적합성 테스트

논코메도제닉 테스트를 진행 하였으며, 여드름 유발 시험인 논코메도제닉 테스트는 인체의 등부위에 모도포, 유발물질 도포, 시험시료도포 부위를 무작위로 선정 하여 구획된 시험부위에 시료를 폐쇄 첩포 한다. 피험자수는 통계적 비교가 가능하기 위해 20명 이상으로 하여 유효데이터를 확보 한다. 첩포전과 후의 시험부위별 모낭과 면포의 개수를 판별 하여 분석검정을 실시 하여 유효성을 판정 했다.

그 결과는 시험시료가 적용 전후의 모낭/면포 비율의 변화가 적고 무도포와 유발물질 도포 부위와의 분산분석을 이용 하여 '유의차가 없음 (P>0.05)'을 밝혀 시료의 '논코메도제닉'을 판단 하였다.

Claims

구리이온; 및
Gly-Leu-Phe-Asp-Ile-Ile-Lys-Lys-Ile-Ala-Glu-Ser-Phe(서열번호 1)의 서열을 포함하는 올리고 펩타이드로서, 13 내지 16개의 아미노산으로 이루어지는 올리고펩타이드
가 복합체를 형성한 카퍼펩타이드를 함유하는 여드름 개선용 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 복합체는 상기 구리이온과 상기 올리고펩타이드가 배위결합을 하여 복합체를 형성하는 것을 특징으로 하는 여드름 개선용 화장료 조성물.
삭제
제1항에 있어서,
상기 복합체는 상기 올리고펩타이드와 염화제2구리(CuCl₂)를 반응하여 합성하는 것을 특징으로 하는 여드름 개선용 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 복합체의 함량은 화장료 조성물 총 중량에 대해 0.0001 내지 1.0중량%인 것을 특징으로 하는 여드름 개선용 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 팩, 파우더, 비누, 폼클렌져, 오일, 납상 왁스, 분말파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이, 미스트로 구성된 군으로부터 선택되는 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 여드름 개선용 화장료 조성물.