KR101422271B1 - 항균과 항염증 활성을 가지는 펩타이드 이성질체 및 그 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 항균과 항염증 작용을 가지는 펩타이드 이성질체 및 그 용도에 관한 것이다.

Description

항균과 항염증 활성을 가지는 펩타이드 이성질체 및 그 용도{Peptide Isomers Possessing Antimicrobial and Anti-inflammatory Activities and Use of the Same}

본 발명은 항균과 항염증 작용을 가지는 펩타이드 이성질체 및 그 용도에 관한 것이다.

모든 생명체로부터 유래한 막-용해성(lytic), 항생 펩타이드(이하, "AMP"라 함)들은 강력한 치료제 개발을 위한 후보물질로 주목받고 있다(Zaiou M., J. Mol. Med. 85:317, 2007; Koczulla AR, et al., Drugs 63:389, 2003;Zasloff M. Nature 415:389,2002; Hancock REW, et al., Proc. Nat. Acad. Soc. USA 97:8856, 2000; Yeaman MR, et al., Pharmacol. Rev. 55:27, 2003).

새로운 약물 소재 개발의 목적으로 AMP들의 구조-활성 관계에 대한 광범위한 연구들로부터 많은 유도체들이 생성되었다(Zaiou M. J. Mol. Med. 85:317, 2007; Koczulla AR, et al., Drugs 63:389, 2003; Zasloff M. Nature 415:389, 2002; Won HS, et al., J. Biol. Chem. 279:14784, 2004).

이들을 이용하여 임상적 치료제를 개발하기 위한 산업적인 시도들도 널리 이루어지고 있다(Zaiou M.J. Mol.Med. 85:317, 2007; Koczulla AR, et al., Drugs 63:389, 2003; Zasloff M. Nature 415:389, 2002; Jenssen H, et al., Clin. Microbiol. Rev. 19:491,2006).

그러나 이들의 상당하게 큰 분자 크기와 높은 제조원가 및 일부 물질에 나타난 그리 좋지 않은 약제학적 및 약동학적 특성 등은 그들의 산업적 및 임상적인 적용에 있어서의 장애가 되고 있다(Zaiou M. J. Mol. Med. 85:317, 2007; Won HS, et al., J. Biol. Chem. 279:14784, 2004).

따라서 약학적 최적화 및 제조원가를 낮추는 측면에서 더욱 바람직한 선도물질이 되기 위하여, 될 수 있는 한 단순한 아미노산 조성을 가지는 더 짧은 활성 펩타이드들을 발명하는 것이 필요할 것이다. 이러한 측면에서, 항생 활성을 가지는 모델 양친매성 나선 펩타이드를 고안하기 위한 최소 드 노보(De novo) 시도들은 주목할 가치가 있다.

양이온성 양친매성 α-나선 펩타이드들은 특히 풍부하고 광범위하며 자연계에 존재하는 AMP들 중에서 가장 잘 규명된 군이다(Zaiou M. J. Mol. Med. 85:317, 2007; Koczulla AR, et al., Drugs 63:389, 2003; Jenssen H,et al., Hancock REW. Clin. Microbiol. Rev. 19:491, 2006).

관련 선행특허로 대한민국특허공개번호 제1020100065639호는 항균펩타이드 피시딘의 구조를 기반으로 10번째 발린(Val) 잔기를 라이신으로 치환하여 소수성을 감소시키고 양쪽 친매성을 증가시킨 새로운 유도체들에 관한 것이 기재되어 있다.

본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 신규한 항균 펩타이드를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 신규한 항염 펩타이드를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 신규한 나선구조 경향성 또는 형광 청색 편이와 펩타이드들의 용혈 활성의 상관관계를 분석하는 방법을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 11로 구성된 군으로부터 선택된 항균 펩타이드를 제공한다.

또 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 11로 구성된 군으로부터 선택된 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항균용 약학 조성물을 제공한다.

또 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 11로 구성된 군으로부터 선택된 항염 펩타이드를 제공한다.

또한 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 11로 구성된 군으로부터 선택된 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항염증용 약학 조성물을 제공한다.

또 본 발명은 트리플루오르에탄올 함유 용액에서 펩타이드의 원편광이색성(CD) 스펙트럼 또는 형광방출 스펙트럼을 얻어서 상기 펩타이드의 나선 구조 경향도 또는 형광 청색편이와 펩타이드들의 용혈 활성의 상관관계를 분석하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 분석방법에서 사용된 펩타이드는 서열번호 1 내지 서열번호 11로 구성된 군으로부터 선택된 펩타이드인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명은 상기 서열번호로 기재되는 펩타이드는 임상투여시에 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다.

즉, 본원 발명의 펩타이드는 실제로 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용 될 수 있다.

또한, 상기 펩타이드는 생리식염수 또는 유기용매와 같이 약제로 허용된 여러 전달체(carrier)와 혼합하여 사용될 수 있고, 안정성이나 흡수성을 증가시키기 위하여 글루코스, 수크로스 또는 덱스트란과 같은 카보하이드레이트, 아스코르브 산(ascorbic acid) 또는 글루타치온과 같은 항산화제(antioxidants), 킬레이팅 물질(chelating agents), 저분자 단백질 또는 다른 안정화제(stabilizers)들이 약제로 사용될 수 있다.

상기 펩타이드의 유효용량은 1 내지 2 ㎎/㎏이고, 바람직하기에는 0.5 내지 1 ㎎/㎏ 이며, 하루 1 내지 3회 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물에서 서열번호로 기재되는 펩타이드의 총 유효량은 거환(bolus) 형태 혹은 상대적으로 짧은 기간 동안 확산(infusion) 등에 의해 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)이 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 상기 펩타이드의 농도는 약의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 나이 및 건강상태 등 다양한 요인들을 고려하여 환자의 유효 투여량이 결정되는 것이므로 이러한 점을 고려할 때, 이 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 펩타이드의 약학적 조성물로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다.

이하 본 발명을 설명한다.

먼저 본 발명에서 사용된 약어를 정리하면 아래와 같다: AMP, antimicrobial peptide (항생 펩타이드); CD, circular dichroism (원편광 이색성); CMC, critical micelle concentration (임계 미셀 농도);DPC, dodecylphosphocholine; GM, geometric mean of the MICs (최소저해농도의 기하평균값); LPS, lipopolysaccharides; MHC, minimal hemolytic concentration (최소용혈농도); MIC, minimal inhibitory concentration (최소저해농도); [θ], mean residue molar ellipticity (평균잔기 몰 타원율); NATA, N-acetyl-L-tryptophanamide; PB, phosphate buffer (인산 완충액); SDS, sodium dodecylsulfate; TFE, trifluoroethanol; TI', pseudo-therapeutic index (유사치료지수).

본 발명은 생산 단가를 줄이고 약학적 물성을 향상시키며 약제학적 수식을 용이하게 하는 장점을 가지기 위하여 단순한 조성 및 11 잔기로만으로 구성된 짧은 길이의 항생 또는 항염 펩타이드를 제조하였다.

항생활성 측정 결과(표 1) 본 발명의 모든 펩타이드가 강한 항생활성을 보였으며, 트립토판이 서열의 정 가운데 위치하고 있는 W6를 기준으로, W1,2,4,5,7,9,10 및 11 펩타이드는 W6보다 높은 항생활성을 보였다. 특히 설계된 모든 펩타이드가 다제내성균에 대해서도 활성을 가짐을 확인하였다.

용혈독성 측정 결과(도 2), W3 내지 4,5,7,8,9,10 내지 11은 W6보다 낮은 용혈활성을 나타내었다.

최종적으로 안전성의 지표로 항생활성과 용혈독성의 비율로서 유사치료지수를 분석한 결과에서는(표 2),

W2를 제외한 모든 펩타이드가 W6보다 높은 안전성을 나타내었다. 따라서 치료용 소재개발 측면에서 W6보다 더욱 개선된 성능의 항생 펩타이드라고 할 수 있으며, W2의 경우에는 W6보다 안전성은 떨어지지만 가장 강력한 항생활성을 나타낸다는 측면에서 비임상적인 또는 산업적인 살균소재로 사용하거나 서열변동을 통하여 우수한 약제로 개발할 수 있는 선도물질로 활용될 수 있다.

11종의 모든 펩타이드가 항생 활성과 더불어 항염증 활성을 동시에 가지는 것이 확인되었다 (도 6). 따라서 이들은 항생 및 항염증 소재로서 활용될 수 있다.

본 발명은 단순한 아미노산 조성을 가지는 항생 항염 펩타이드를 개발하는 노력에서 본 발명자들은 5개의 류신, 5개의 라이신, 1개의 트립토판 잔기로서 총 3종의 아미노산으로만 구성되어 L₅K₅W 분자식을 가지는 일련의 11잔기 펩타이드 이성질체들을 제조하였다. 아미노산 서열은 펩타이드가 α나선 구조를 취할 때 나선 축의 한쪽 면에 라이신이 그리고 다른 한 면에는 류신을 모아서 완벽하게 양친극성(amphipathic) 나선이 되게 고안하였다. 각 펩타이드는 1차 구조 서열 상에서 트립토판의 위치를 달리하였으나, 공간적으로는 양친극성(amphipathic) α나선 구조의 소수성 면과 친수성 면의 특정 경계면에 항상 트립토판이 위치하도록 고안하였다. 고안된 11종의 L₅K₅W 펩타이드의 나선 형태 및 트립토판 환경을 원편광 이색법(circular dichroism)과 형광 스펙트럼으로 확인하고 특성화하였다. 모든 이성질체는 각각 개별적으로 약간의 차이는 있지만 전체적으로 유사한 수준에서 강력하고 광범위한 항균 활성을 나타내었다. 반면, 인간 적혈구에 대한 그들의 용혈활성은 서로 크게 차이가 나서 유사치료지수(pseudo-therapeutic index)는 L₅K₅W²에 대해서 6.9로 가장 작고 L₅K₅W⁷에 대해서는 47.0으로 가장 크게 다양하였다. 흥미롭게도, 수용성 trifluoroethanol 용액에서의 나선성 경향도 및 형광 청색편이 (blue-shift) 정도가 각 펩타이드의 용혈 독성과 큰 선형 상관관계를 나타내었고, 반면 세제 (detergent) 미셀 용액에서는 이러한 구조 성질과 활성도가 의미 있는 관계를 가지지 못하였다. 최종적으로 모든 펩타이드의 무독성 농도에서의 항염 활성 측정 결과, 염증 유발 인자인 LPS가 처리된 세포의 NO 발생을 효과적으로 억제하였다.

이들 결과는 본 발명자들의 de novo 고안 전략이 신규한 항균 항염 펩타이드를 개발하는데 효과적임을 확인해주며, 더불어 개발된 일련의 L₅K₅W 펩타이드들을 치료제 개발을 위한 유용한 약물소재로서 제안한다.

이하 본 발명을 상세하게 설명한다.

펩타이드 고안 및 형태 확인

테스트된 L₅K₅Wⁿ 모델 펩타이드의 아미노산 서열들을 도 1에 요약하였다.

단순한 아미노산 조성을 가지도록 세 종류의 아미노산만을 사용하여 서열을 고안하였다. 트립토판은 1번 위치에서 11번 위치로 일차 구조 서열에서 위치를 달리하였으며, 배치된 트립토판이 나선 휠 도안에서 류신으로 구성된 소수성 면의 시작점과 라이신으로 구성된 친수성 면의 끝점 사이의 임계점에 존재하도록 전체 서열을 고안하였다. 예에서와 같이, 가장 우수한 안전성을 나타내는 W7 (L₅K₅W⁷) 펩타이드의 나선 휠 투영도를 도 1에 나타내었다. 모든 펩타이드는 라이신의 존재로 인하여 동일한 양전하를 가지며 중성 pH에서 C-말단의 음전하를 제거하기 위하여 C-말단을 아민화하여 화학적으로 합성하였다.

다음 알파 나선 구조 형태는 양친극성 특성을 제공하는 본 발명의 고안에 근본적인 필수요건이다. 따라서 본 발명 모델 펩타이드가 그들의 고안에서 목표했던 것과 같이 생체막 환경에서 나선 구조를 취할 수 있는지를 확인하기 위하여, 그들의 원자외선 CD 스펙트럼을 각각 50% TFE, 10 mM SDS 마이셀, 및 2 mM DPC 마이셀을 포함하는 완충 용액에서 측정하였다. 대표적인 예로서, W7 펩타이드의 CD 스펙트럼을 도 1 에 나타내었다. 208 및 222 nm 근처에서 강한 음성 밴드에 의하여 증명되듯이, 모든 모델 펩타이드는 테스트한 세 용액에서 나선 구조 형태를 채택하는 고유한 경향을 가졌다. 나선구조 함량([α])은 각 펩타이드 및 용매에 따라서 64 및 86% 사이에서 변화한다 것을 예측하였다. 구조 형태의 상세한 고찰은 하기에서 상술한다. 수용성 TFE 용액 및 세제 마이셀 용액은 생체막 유사 환경으로서 일반적으로 채택된다(X. Zhang, C.G. Adda, A. Low, J. Zhang, W. Zhang, H. Sun, X. Tu, R.F. Anders, R.S. Norton, Biochemistry 51 (2012) 1380-1387;D.V. Tulumello, C.M. Deber, Biochemistry 48 (2009) 12096-12103;C.R. Sanders, Magn. Reson. Chem. 44 (2006) 24-40; M.M. Javadpour, M.D. Barkley, Biochemistry 36 (1997) 9540-9549). 비록 그들이 생체막과 완전히 동일하진 않다 하더라도, 본 발명의 결과들은 본 발명의 모델 펩타이드들이 실질적인 생체막 환경에서도 나선 구조 형태를 취할 수 있고, 그것에 의하여 고안 단계에서 의도한 것과 같은 양친극성을 달성할 수 있다는 것을 시사한다.

활성의 평가

표 1은 네 종의 Gram-양성, 다섯 종의 Gram-음성 및 1종의 다중 약제 내성 균주를 포함하는 여러 세균 종에 대한 본 발명의 모델 펩타이드들의 MIC값들을 요약하였다. GM (MICs값들의 기하평균) 값들에 의하여 표준화된 것과 같이, 가장 강력한 활성은 W10 (L₅K₅W¹⁰) 펩타이드에서 관찰되었고, 그것의 GM 값들은 Gram-양성 및 Gram-음성 균주들에 대해서 각각 1.2 및 1.7 μg/ml이었다. 반대로, W8 (L₅K₅W⁸) 펩타이드는 가장 높은 GM 값을 나타내었고, Gram-양성 및 Gram-음성 균주들에 대해서 각각 3.4 및 4.6 μg/ml이었다. 그러나 전체적으로, 본 발명의 펩타이드들은 테스트한 9개 세균 균주들에 대해서 2.7 ± 0.6 μg/ml (1.9 ± 0.4 μM)의 평균 GM 값으로 유사한 정도로 광범위하고 강력한 항균 활성을 소유하였다고 결론을 내릴 수 있다. 또한, 모든 펩타이드들이, 베타-락탐 항생제 및 단백질 합성 저해제에 민감하지 아니하고 반코마이신에 대해서 저항성을 가지는 MRSA-TK784 균주에 대해서 상당한 활성(MICs ≤ 16μg/ml)을 가진다.

이들 결과는 항균 펩타이드를 고안하기 위한 본 발명 전략의 효율성을 증명하고 강력한 항생제로서 L₅K₅Wⁿ 펩타이드 이성질체를 제시한다.

치료 후보물질로 그 펩타이드들의 잠재적인 유용성을 평가하기 위하여 그들의 용혈 독성을 조사하였다(도 2). 고안한 11종 펩타이드들의 강한 항생활성이 서로 유사하였던 것과 달리, 인간 적혈구에 대한 용혈 독성은 펩타이드들 간에 큰 차이가 있었다. 테스트한 최고농도인 128 μg/ml 에서의 용혈 정도 % 값에 기반하여, W2 펩타이드는 가장 용혈활성이 높은 반면에 W4 및 W11 펩타이드에 의한 용혈은 매우 미약하였다. 결국은 항균 및 용혈 활성 사이의 균형을 유사치료지수 (TI') [S.H. Lee, S.J Kim, Y.S Lee, M.D. Song, I.H. Kim, H.S. Won, Regul. Pept. 166 (2011) 36-41;W.L. Zhu, Y.H. Nan, K.S. Hahm, S.Y. Shin, J. Biochem. Mol. Biol. 40 (2007) 1090-1094] 값으로 환산하여 표 2에서 비교하였다. TI' (TI' = MHC/GM)는, 화학요법제에 대한 전형적인 치료 지수(TI = LD₅₀/ED₅₀)와 산출 방식이 달라, 그 절대값을 안전성의 정량적 지표로 사용하기는 어렵지만, 펩타이드들 간의 안전성에 대한 상대적인 비교를 위해 TI' 값들을 사용하는 것은 합리적이다. 이 점에서, W7 (L₅K₅W⁷) 펩타이드가 가장 높은 TI' 값(Gram-양성 및 Gram-음성 박테리아에 대해서 각각 53.8 및 42.2)을 나타내었고, 그것은 그 펩타이드가 치료제 개발을 위한 최적 분자임을 나타낸다. 그러나, 항생제 내성 균주에 대한 그들의 강력한 항균 활성을 고려할 경우, 6.7-7.0의 가장 낮은 TI' 값을 가졌던 W2 펩타이드까지를 포함하여 모든 다른 펩타이드들도 잠재적으로 유용한 항생제로 간주될 수 있다. 특히, 본 발명의 모든 L₅K₅Wⁿ 펩타이드들은 그들의 MIC 범위들(≤8 μg/ml)에서 무시할 정도의 용혈 활성을 나타내므로, 그들 모두는 유효량과 중독량의 정밀한 조절을 통해 사용하거나, 아미노산 서열의 최적화를 통하여 더욱 효과적인 치료제로 개발할 수 있는 주형 분자로 가치가 있다. 대안적으로, 강력한 항균 활성을 가지면서 강한 용혈 활성을 가지는 펩타이드들은 현 단계에서도 비임상적 또는 산업적인 살균제로 사용될 수 있다.

항생활성의 평가에서 최소저해농도의 평균이 2 μM로 나타났고, 이 농도에서는 모든 펩타이드의 용혈독성이 전혀 없었기 때문에 동일 농도에서의 항염 활성을 평가하였다. 도 6은 본 발명의 펩타이드에 대해, 염증 유발 물질인 LPS가 처리된 세포에서 염증 매개인자 NO의 발생을 억제하는 활성을 도시한다. 발명된 11개 모든 펩타이드가 유의성 있는 NO 억제 효과를 보였으며, 특히 W2와 W3 펩타이드는 상기 농도에서도 거의 100% NO 발생 억제능을 보여 특히 강력한 항염증 활성을 지님이 확인되었다. 따라서, 11개 펩타이드 모두 항생 활성과 더불어 항염증 활성을 가지는 치료제 개발의 소재로 활용될 수 있다.

구조 분석

본 발명의 모델 펩타이드의 구조-활성 관계를 조사하기 위하여, 여러 용매 조성에서 그들의 형태 선호도를 CD 분광법에 의하여 상세하게 고찰하였다. 일반적으로, 양전하 양친극성 나선 AMP들은 막과 상호작용에서 그들의 나선 형태를 채택하지만 수용액에서는 무질서 상태이다. 본 발명의 L₅K₅Wⁿ 펩타이드들도 수용성 용매인 인산완충액에서 원자외선 CD 스펙트럼을 측정한 결과 200 nm 이하의 강한 음성 밴드 특징을 보여 무질서한 풀린 구조임이 확인되었다 (도 3A). 펩타이드 농도를 입증하는데 유용한 그 펩타이드의 [θ]₂₀₃ 값들은 -16.3 ±0.5 (표준 편차, 11 값들; ±0.16의 표준 에러)x 10³ deg·cm²·mol^-1이고 이것은 문헌의 다른 펩타이드들에 대한 공지된 값인 -15.1±1.6와 잘 일치하였다[M.M. Javadpour, M.D. Barkley, Biochemistry 36 (1997) 9540-9549; M.E. Holtzer, A. Holtzer, Biopolymers 32 (1992) 1675-1677]. 따라서 본 발명의 펩타이드들의 농도 정량이 정확함을 입증한다. 소수성 성분(TFE) 또는 세제(SDS 및 DPC) 마이셀의 첨가에 대해, CD 스펙트럼은 α나선 구조의 특징적인 형태로 변하고 그것은 208 및 222 nm에서 신호 강도의 증가로 입증된다. 대표적인 예로, 가장 강한 항균활성을 나타내는 W10 (L₅K₅W¹⁰) 펩타이드의 CD 스펙트럼을 도 3B 및 3C에 나타내었다. 다른 펩타이드들에 대해서는 스펙트럼의 모양을 유추할 수 있도록 [θ]₂₂₂ 및 [θ]₂₀₈의 절대값들을 각 용매에 따라 도시하였다 (도 3D). TFE 첨가에 의한 스펙트럼 변화는 37.5 또는 50% TFE에서 포화되고 202 또는 203 nm 부근에서 등이색점(isodichroic point)을 나타내어, 무질서 풀린 구조와 α나선 구조의 두 가지 구조 상태 사이의 평형을 지지한다. 반면에, 대부분 펩타이드들이 SDS에 의해 유도된 스펙트럼 변화에서는 등이색점을 나타내지 못하였다. 따라서, 약 8.7 mM의 임계미셀농도 이하의 SDS 수용액에서는, 이중코일 다량체 (coiled-coil oligomer)와 같은 다른 형태 구조도 존재할 수 있음이 예측된다 [G.E. Arnold, L.A. Day, A.K. Dunker, Biochemistry 31 (1992) 7948-7956;J.D. Franke, F. Dong, W.L. Rickoll, M.J. Kelley, D.P. Kiehart,Blood 105 (2005) 161-169]. 그러나, 임계미셀농도보다 더 높은 농도의 SDS 존재에서는 모든 펩타이드들의 스펙트럼 변화가 포화되었다. 이와 유사하게 모든 펩타이들이 2 mM DPC 마이셀에서 안정화된 나선 형태를 나타내었고, DPC의 임계 미셀농도는 약 1.5 mM이다 [C.R. Sanders, Magn. Reson. Chem. 44 (2006) 24-40]. 따라서, 이것은 세제 마이셀 환경에서는 안정화된 단일 형태 구조가 형성되었다는 것을 시사한다. 그러나 동일 용매에서 스펙트럼의 미세한 모양은 펩타이들간에 완전히 일치하지 않았고(도 3D), 동일한 펩타이드의 스펙트럼도 용매환경(TFE 용액, SDS 마이셀, 및 DPC 마이셀)에 따라 다르게 나타났다(도 1 및 3). 이 결과들은 펩타이드들의 기능적 활성 구조인 α나선 구조들은 그 펩타이들이 상호작용하는 막의 조성 및 구조에 따라서 상세한 형태에서 변화할 수 있다는 것을 시사한다.

트립토판 환경

본 발명의 펩타이드 고안에서, 단일 트립토판은 항상 양친극성 나선 구조의 임계면에 위치하였다. 따라서 본 발명의 펩타이드들에서 트립토판의 역할을 평가하기 위하여, 트립토판의 미세환경을 형광 분광법으로 조사하였다(도 4). 본 발명의 펩타이드의 형광 방출은 단일 트립토판으로부터 기인한다. 따라서 본 발명자들은 펩타이드 결합을 하고 있는 트립토판 잔기와 가장 유사한 인돌 유도체인 N-acetyl-L-tryptophanamide (NATA)를 형광 측정을 위한 대조물질로 사용하였다. 도 4A는 형광 스펙트럼의 예로서, 본 발명의 펩타이드 중 가장 큰 용혈활성을 나타내는 W2 (L₅K₅W²) 펩타이드에 대하여 안정적인 나선구조를 취하는 세 가지 다른 환경에서 형광 방출 스펙트럼을 대조물질인 NATA와 비교하여 나타낸다. 다른 펩타이드들에 대해서는, 방출 λmax 값들을 도 5B에 나타낸다. TFE 첨가 용액에서 본 발명의 펩타이드들의 λmax 값들은 NATA의 것에 비하여 3.5±2.2 nm 더 작았다. TFE 첨가 용액은 등방성(isotrophic) 환경이기 때문에, NATA 및 펩타이드 사이의 λmax 차이(△λmax = λ_{max , 펩타이드} - λ_{max , NATA})는 트립토판의 국소 형태에 기인하고 그것은 필수적으로 펩타이드의 2차 구조의 지배를 받는다. 따라서, 펩타이드들의 트립토판 잔기가 α나선 구조에 관여함을 알 수 있다. SDS 마이셀 환경 및 DPC 마이셀 환경에서는 λ max가 각각 -19.6±2.7 및 -18.6±2.4 nm으로, 매우 큰 청색편이가 나타났다. 세제 마이셀 용액은 비등방성(anisotrophic) 환경을 생성하므로, λ_{max , NATA}에 비해 λ_{max , 펩타이드}가 보이는 그처럼 강한 청색편이는 펩타이드 구조형성의 영향 뿐 아니라 트립토판의 위치에 크게 영향 받는다. 따라서 그 결과들은 본 발명의 펩타이드들의 트립토판 잔기가 마이셀의 소수성 내부로 효과적으로 삽입된 반면에 NATA는 마이셀의 친수성 표면 또는 마이셀 바깥의 용액에 존재한다는 것을 시사한다. 결론적으로, 본 발명의 펩타이드에서 트립토판은 그들의 생체막 투과를 견인하기 위하여 막에 그 펩타이드들을 붙게 하는 역할을 하는 것으로 파악된다.

구조-활성 상관관계

양전하 양친극성 나선 AMP들의 구조-활성 상관관계는 몇 가지 물리화학적 특성 및 구조 파라미터와 활성 연관성의 관점에서 일반적으로 설명된다. 이들은 펩타이드 길이 또는 아미노산 수, 전체 양전하 수, 극성 각도, 평균 잔기 소수성 (H) 또는 역상 HPLC 상의 잔류 시간(tR), 양친극성 정도(amphipathicity) 또는 소수성 모멘트 (μH), 나선도(helicity) 또는 나선 구조 함량([α])이다[Y. Huang, J. Huang, Y. Chen, Protein Cell 1 (2010) 143-152; I. Zelezetsky, A. Tossi, Biochim. Biophys. Acta. 1758 (2006) 1436-1449]. 많은 이들 파라미터들은 서로 연결되어 있어서, 그 활성은 종종 상호작용을 하는 파라미터의 복잡하고 협동적인 결과물로 나타난다. 그러나 본 발명의 L₅K₅Wⁿ 펩타이드들은 그들이 보존된 특성을 가지는 이성질체로 관련이 있어서 단순화된 구조-활성 상호관계의 고찰이 가능하다. 예를 들어, 펩타이드 크기는 11잔기 1410 Da 분자량으로 동일하고 전체 양전하는 중성 pH에서 +7로 동일하다. 마찬가지로, 이론적인 H는 Eisenberg 스케일상에서 -0.22로 동일하고 실질적인 tR은 C18컬럼 상에서 20.8±1.1 분(데이터 도시 안함)로 크게 차이가 없었다. 완벽한 나선 구조를 취할 경우의 극성 각도도 나선 휠 도면 상에서 120°또는 140°중 하나의 동일한 각도를 갖고(도 1), μH 값도 Eisenberg 스케일상에서 0.51±0.015로 유사하다.

따라서, 본 발명의 펩타이드들의 가변적인 파라미터는 오직 나선구조도(helicity)이고 그것은 CD 스펙트럼으로 평가될 수 있다. 그 다음, 본 발명의 펩타이드들에 대한 부가적인 구조 파라미터들은 트립토판 주위의 국소 형태를 반영하는 형광 방출 스펙트럼으로부터 유추될 수 있다. 본 펩타이드 고안에서, 트립토판은 활성을 부여하는 구조적인 역할을 기대하여 특정한 위치에 삽입되었다.

본 발명자들은 CD 및 형광 스펙트럼으로부터 유래한 구조 파라미터 및 펩타이드의 활성 사이의 관계를 조사하였다. 그러나 테스트한 세균 균주에 따라 변하는 MIC 값들로 대변되는 항생 활성의 경우 펩타이드 사이에서 그 차이가 크지 않아 통계적 유의성을 가질 수 없으므로 구조 파라미터 변동과의 연관성 분석이 불가능하였다. 반면, 용혈독성의 경우 테스트한 최고 농도인 128 μg/ml에서 확연히 다르게 나타나는 용혈 정도 %를 기반으로 구조 파라미터와의 관계성을 동정할 수 있었다.

먼저, 발명된 11개 펩타이드 이성질체의 용혈 % 값들(도 5A) 및 50% TFE 용액에서 그들의 나선구조 함량 %(도 6B)는 유사한 분산 패턴을 나타내었다. 50% TFE는 본 발명의 펩타이드들 모두의 나선구조를 완성하는 최소 농도이다. 두 데이터 세트(용혈 대 나선 함량)의 최소 자승 회귀 분석(Least square regression analysis)은 0.7321의 R²값을 가지는 선형 상관관계를 나타내었다(도 5C). 이러한 선형성(linearity)은 50% 미만의 TFE 농도에서는 명백하지 않거나 현저하게 감소되었고(데이터 도시안함), 그것은 일부 펩타이드들의 나선 구조가 아직 최종적으로 안정화되지 않았기 때문으로 볼 수 있다. 나선 함량은 CD 데이터로부터 2차 구조를 예측하는 프로그램 또는 알고리즘의 종류에 따라 다소 다르게 분석될 수 있기 때문에, 원 데이터인 [θ]₂₂₂ 및 [θ]₂₀₈를 단순히 곱한 값([θ]₂₂₂x[θ]₂₀₈)으로서 나선성 정도를 표현하여 예측된 나선 함량 대신 사용한 경우, 그 회귀선의 R²값은 0.9022로 크게 증가하여 매우 높은 선형성을 나타내었다. 파장 222 및 208 nm는 나선 구조의 정도를 대변하는 지점들이다. 따라서, 이들 두 회귀 결과들은 본 발명의 L₅K₅Wⁿ 펩타이드들이 TFE에 의해 유도된 나선 구조도와 그들의 용혈 활성 사이에 밀접한 상관관계가 있다는 것을 시사한다. 도 5C는 75% TFE 용액에서 형광 방출 λmax 및 용혈 활성 사이의 선형 상관관계(R² = 0.7776)를 나타낸다. 이러한 분석에서, W1 및 W11 펩타이드는 트립토판을 각각 N- 및 C-말단에 가지기 때문에 다른 펩타이드들과 다르고 그들의 형광은 트립토판 주위의 구조 형태를 정확히 반영할 수 없다. 따라서, 본 발명자들이 W1 및 W11 펩타이드를 제외한 아홉 펩타이드만을 가지고 데이터를 분석하였을 때, 회귀 R²는 0.9518에 다다르고, 매우 현저한 선형 상관관계를 나타낸다. 이 결과들은 TFE에 의해 유도된 나선 구조에서 특히 트립토판 주위의 국소 형태가 L₅K₅Wⁿ 모델 펩타이드의 용혈 능력과 강하게 상관관계를 가진다는 것을 시사한다. 이것은 또 본 발명의 펩타이드에서 트립토판이 그들의 활성을 지배하는 중요한 역할을 한다는 것을 시사한다.

요약하면, 본 발명의 결과는 TFE 용액에서 나선구조 경향도 및 트립토판 형광으로 표현되는 구조 파라미터 분석이 펩타이드의 상대적인 용혈 독성 정도를 예측하는 유용한 기술로 사용될 수 있음을 제시한다.

그러나 세제 (SDS 및 DPC) 마이셀에서는 용혈 독성과 구조 파라미터 사이에 유의적인 상관관계가 관찰되지 않았다(데이터 도시안함). 일반적으로 양전하 양친극성 나선 AMP들의 활성 및 선택성은 다양한 막에서 그들의 구조 파라미터의 서로 다른 기여로부터 기원한다고 믿어진다. 세균의 막은 음이온 표면을 가지므로 양전하 양친극성 나선 펩타이드의 구조 파라미터들은 소수성 상호작용과 더불어 효과적인 정전기 상호작용을 위해 더욱 복잡하고 협동적으로 작동한다. 반면에 진핵세포 막은 표면의 알짜 전하가 거의 0에 가까운 반면 다양한 지질 및 스테롤을 함유하고 있기 때문에, 펩타이드와의 상호작용 조절은 소수성 상호작용에 의해 더욱 직접적으로 지배받는다. 이 점에서, DPC 마이셀에서 펩타이드 구조 파라미터들이 용혈 활성과 상관관계가 없다는 것은 흥미롭다. 즉, 비록 DPC 마이셀이, 음이온 표면을 가지는 SDS와는 다르게, 양전하와 음전하를 모두 가지지만, 그들은 진핵세포 막에서 형성된 펩타이드 활성 구조를 정확하게 유도하지 못한다고 볼 수 있다. 반면, 본 발명의 모델 펩타이드들이 TFE에 의해 유도된 나선 구조는 단순히 소수성 상호작용에 의해 안정화되므로 실제 진핵세포막에서의 활성구조와 유사하게 형성된다는 것을 나타낸다. 그러나, TFE에 의해 유도된 구조는 박테리아 막에서의 활성 구조와는 다를 수도 있다. 본 발명의 결과들은 본 발명의 모델 펩타이드들이 비록 전체적으로는 유사한 형태의 나선 구조를 채택하고 있지만 정확한 미세구조는 환경에 따라 다르다는 것을 보여주었다. 따라서 이러한 형태적 유연성은 그들의 활성 및 선택성을 변화시키는 중요한 성질일 것이다.

NO 생성 억제능으로 대변되는 항염 활성정도는 상기 분석된 구조 파라미터들과 뚜렷한 선형적 연관성을 보이지 않았다(데이터 도시 안함). 따라서 주로 생체막에서의 구조와 관련 있는 항생활성 및 용혈 독성과는 다른 분자적 작용기전에 의해 본 발명 펩타이드들의 항염 활성이 유발 될 것으로 예측할 수 있다.

표 1은 L₅K₅Wⁿ 모델 펩타이드의 항균 활성을 나타낸 표이다.

표 2는 L₅K₅Wⁿ 모델 펩타이드의 MHC (Minimal hemolytic concentration) 및 유사치료지수(TI')값을 나타낸 표로, ^a 테스트한 4 Gram-양성 균주에 대하여; ^b 테스트한 5 Gram-음성 균주에 대하여; ^c 테스트한 9균주 모두에 대한 값.

본 발명에서 11개의 L₅K₅Wⁿ 펩타이드 이성질체를 양친극성 나선 구조 펩타이드를 고안하는 특정한 룰에 따라서 제조하였고, 그들 모두는 강력한 항균활성과 항염증 활성을 나타내었다. 그 다음, 50% 이상의 TFE 함유 용액에서의 분광학적 분석법은 그들의 상대적인 용혈 독성 정도를 쉽게 예측할 수 있는 간단하고 유용한 기술로서 제안될 수 있다. 비록 다양한 항생 항염 펩타이드들이 개발되고 있지만, 독성의 감소는 치료제로 그들의 실질적인 개발을 위한 가장 중요하고 선결적인 과정 중 하나이다. 특히 용혈 테스트는 항생 항염 펩타이드들의 독성을 평가하는 첫 번째 단계로 종종 채택된다. 따라서 본 발명자들은 본 발명의 결과가 항생 항염 펩타이드의 de novo 고안 및 체계적인 연구개발의 전형이 될 수 있는 조직화된 연구법을 제공할 것으로 기대한다.

본 발명은 단순한 아미노산 조성을 가지는 작고 강력한 항균 항염 펩타이드를 고안하고 그들의 구조-활성 관계를 특성화하는 유용한 방법을 확립하였다. 결국 본 발명자들은 새로운 항균 항염제의 개발을 위한 유망한 분자로 L₅K₅Wⁿ 모델 펩타이드들을 제안하였다.

도 1은 펩타이드 서열의 고안 및 구조 확인. 각 L₅K₅Wⁿ 모델 펩타이드의 아미노산 서열(왼쪽 패널)은 왼편에 일련번호로 표지하고 오른편에 조성으로 펩타이드 이름을 표지. 나선 휠 도안의 일례(중간 패널)은 W7 펩타이드에 대해서 묘사. W7 펩타이드의 원자외선 CD 스펙트럼(우측 패널)을 각각 50% TFE, 10 mM SDS 마이셀 및 2 mM DPC 마이셀을 포함하는 10 mM 인산 버퍼(pH 6.5)에서 측정함.
도 2는 L₅K₅Wⁿ 모델 펩타이드의 용혈 활성을 나타낸 그림. 인간 적혈구를 여러 농도에서 각 펩타이드로 처리하고 용혈 정도 (%)를 펩타이드 농도에 대해서 작도. 아미노산 서열을 해당 모델 번호로 대변.
도 3은 L₅K₅Wⁿ 모델 펩타이드의 CD 분석을 나타낸 그림. (A) 10 mM 인산 버퍼(pH 6.5)에서 각 펩타이드의 원자외선 CD 스펙트럼을 겹쳐놓았다. (B 및 C) 여러 농도의 TFE 및 세제(SDS 및 DPC)을 함유하는 인산 버퍼에서 W10 펩타이드의 CD 스펙트럼을 각각 나타냄. (D) 222 nm ([θ]₂₂₂; 상단 패널) 및 208 nm ([θ]₂₀₈; 하단 패널)에서 평균 잔기 몰 타원률(ellipticity)의 절대값을 세 가지 다른 용액에서 각 펩타이드에 대해서 작도.
도 4는 L₅K₅Wⁿ 모델 펩타이드의 트립토판 형광. (A) 75% TFE (청색), 10 mM SDS (적색) 및 2 mM DPC (녹색) 용액에서 NATA (가는 선) 및 W2 펩타이드(굵은 선)의 형광 방출 스펙트럼을 나타냄. (B) 각 용액에서 방출 λmax를 개별 펩타이드 및 NATA에 대해서 작도(대조군인 NATA를 'c'로 나타냄).
도 5는 L₅K₅Wⁿ 모델 펩타이드의 구조 파라미터들과 용혈 활성 사이의 상관관계를 나타낸 그림. (A) 128 μg/ml 농도에서 개별 펩타이드의 용혈 유발 정도 (%)는 도 2로부터 추출. (B) 50% (CD 분석시) 또는 75% (형광 분석시) TFE 용액에서 개별 펩타이드의 구조적 및 분광학적 파라미터들. 예측된 나선구조 함량([α]; 상단 패널) 및 [θ]₂₂₂x[θ]₂₀₈ 값들(중간 패널)은 도 3의 CD 데이터로부터 유래함. 펩타이드와 NATA사이의 λmax 차이값(|△λmax|; 하단 패널)은 도 4에서 형광 방출 데이터로부터 유래함. 엷은 회색 막대는 (C)에서 엷은 기호 데이터에 해당함. (C) 50% (CD 분석시) 또는 75% (형광 분석시) TFE 용액에서 용혈 활성과 구조 파라미터들 사이의 상관관계. 용혈 %는 각각 [θ]₂₂₂x[θ]₂₀₈ (하단 좌표를 가지는 검은 동그라미 기호; 왼쪽 패널) 및 [α] (상단 좌표를 가지는 빈 동그라미 기호; 중간 패널)에 대하여 선형 최소 자승 분석에 의하여 결정된 해당 회귀선을 가지고 작도. 선형 R² 계수들은 각각 0.9022 (실선) 및 0.7321 (점선).
용혈 %와 |△λmax|에 대해서 작도(다이아몬드 기호; 오른쪽 패널). 선형 회귀 선들은 각각 11개 모든 데이터 포인트(점선; R²=0.7776) 및 선택된 9개 데이터 포인트들(굵은 다이아몬드 기호를 가지는 실선; R²=0.9518)을 사용하여 결정됨.
도 6은 본 발명의 펩타이드들의 NO 생성 억제능을 측정한 그림. 무독성 농도인 2 μM의 펩타이드를 세포에 전처리 후, LPS 처리에 의한 NO 발생을 측정. M은 배지만 첨가한 경우. C는 펩타이드 전처리 없이 LPS만 처리한 경우. 1-11은 전처리한 각 펩타이드 번호.

이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재된 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.

실시예 1; 펩타이드 제조

화학적으로 합성된 모델 펩타이드는 펩타이드 제조사인 AnyGen (Kwangju, Korea; http://www.anygen.com)으로부터 건조분발의 형태로 구입하였다. 제품 펩타이드의 순도 및 정확한 질량을 각각 HPLC 및 질량분석법으로 결정하였다. 그것의 지정된 용매에 용해된 각 펩타이드의 농도는 본 발명의 펩타이드가 단일 트립토판 잔기를 가지고 있기 때문에 알려져 있는 트립토판 몰 흡광계수(280 nm에서 5,500 M^-1cm^-1)를 사용하여 분광학적으로 결정하였다.

실시예 2: 원편광 이색성 ( CD ) 분광법

0-75% TFE, 0.625-20 (2배 계대 희석) mM SDS 및 2 mM DPC 마이셀을 각각 함유하는 10 mM 인산 완충액(PB)에 녹인 45 μM 펩타이드를 0.2 cm 직경의 석영 용기에 담아 20℃에서 Applied Photophysics Chirascan CD 분광분석기로 측정하였다. 1 nm 대역폭으로 260으로부터 190 nm 범위의 CD 신호를 0.5 nm 간격으로 주사하여 기록하였다. 3회 측정의 값을 합하여 평균하고 용매의 CD 신호를 감하여 최종 데이터로 저장하였다. 최종적으로, 각 파장에서 CD 강도를 평균 잔기 몰 타원율,[θ]_λ (deg·cm²·mol^-1)로 표준화하였다. 나선구조 함량은 CDNN 2.1 프로그램 [G. Bohm, R. Muhr, R. Jaenicke, Protein Eng. 5 (1992) 191-195]을 사용하여 추론하였다.

실시예 3: 형광 분광법

지정된 용매에 녹인 5 μM 농도의 NATA 및 펩타이드를 10 mm 직경의 석영 용기에 담아 20℃에서 JASCO FP-6500 분광형광계에서 형광 방출을 측정하였다. 280 nm의 여기 파장을 5 nm 여기 대역폭으로 사용하였다. 형광 방출을 5 nm 방출 대역폭 및 0.5 s 반응 시간을 가지고 매 0.2 nm 마다 기록하였다. 300부터 450 nm까지 주사하여 취한 세 개별 데이터들을 합하여 평균하였다.

실시예 4:항균 활성 분석

각 펩타이드들의 항균 활성을 네 종의 Gram-양성균(Bacillus subtilis ATCC 6633, Staphylococcus aureus ATCC 6538p, Staphylococcus epidermis ATCC 12228, 및 Micrococcus luteus ATCC 10240) 및 다섯 종의 Gram-음성균(Escherichia coli ATCC 25922, Shigella dysentariae ATCC 9752, Salmonella typhomurium ATCC 14028, Klebsiella pneumoniae ATCC 10031, 및 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853)에 대해서 결정하였다. 또한 methicillin-저항성 Staphylococcus aureus 균주인 MRSA-TK784를 다중 약제 내성균으로 채택하였다. 상기 균주들을 이용하여, 본 발명의 모델 펩타이드에 대한 항생 감수성 평가는 액상(broth)배지에서의 미량희석법(microdilution method)으로 최소저해 농도(MIC) 값들을 측정하여 수행하였다.

즉, 다양한 농도(1-128 μg/ml, 2배 연속 희석)로 각각의 펩타이드가 첨가된 세포 배양액(10⁶~10⁸ cells/㎖, LB 액상 배지)으로부터, 세포 성장을 완전하게 저해하는 가장 낮은 펩타이드 농도를 그 MIC로 결정하였다. 독자적인 3회 실험을 통해 두 번 또는 세 번 모두 재현된 MIC 값들을 기록하였다.

실시예 5: 용혈 독성 분석

다양한 농도의 펩타이드들(1~128 ㎍/㎖, 2-배씩 순차적으로 희석)이 있는 조건에서, 인간 적혈구 세포 현탁액(10% v/v)을 37℃ 에서, 1시간 배양했다. 상기 배양액을 원심분리한 다음, 상층액의 흡광도를 550 ㎚에서 측정하여 용혈 정도를 평가하였다. 펩타이드 대신 0.2% Triton X-100을 처리한 결과를 100% 용혈활성의 대조군으로 하여, 각 펩타이드의 용혈 능력을 %로 나타내었다.

상기 실험은 3개의 샘플로 수행되어졌으며, 3회의 독립적인 측정의 평균값을 기록하였다. 최소 용혈 농도(Minimal hemolytic concentration, MHC)는 오차범위에 해당하는 5% 이상의 용혈 활성을 나타내는 최소 농도 값으로 결정하였다.

실시예 6:항염증 활성 측정

항염증 활성의 지표로서 아질산염(nitrite) 생성에 대한 펩타이드의 효과는 NO assay로 확인하였다. RAW264.7 세포를 24 well plate에 1x10⁵ cell/well로 plating 한 다음, 시료를 2μM로 1시간 전처리 후, LPS(100ng/mL)를 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 배양상층액(100μL)를 Griess시약(100μL)과 혼합 한 후 10분간 반응시키고, ELISA reader로 550nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다.

<110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp. <120> Peptide Isomers Possessing Antimicrobial and Anti-inflammatory Activities and Use of the Same <160> 11 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> W1 <400> 1 Trp Leu Lys Lys Leu Leu Lys Lys Leu Leu Lys 1 5 10 <210> 2 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> W2 <400> 2 Lys Trp Leu Lys Lys Leu Leu Lys Lys Leu Leu 1 5 10 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> W3 <400> 3 Leu Lys Trp Leu Lys Lys Leu Leu Lys Lys Leu 1 5 10 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> W4 <400> 4 Leu Leu Lys Trp Leu Lys Lys Leu Leu Lys Lys 1 5 10 <210> 5 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> W5 <400> 5 Lys Leu Leu Lys Trp Leu Lys Lys Leu Leu Lys 1 5 10 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> W6 <400> 6 Lys Lys Leu Leu Lys Trp Leu Lys Lys Leu Leu 1 5 10 <210> 7 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> W7 <400> 7 Leu Lys Lys Leu Leu Lys Trp Leu Lys Lys Leu 1 5 10 <210> 8 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> W8 <400> 8 Leu Leu Lys Lys Leu Leu Lys Trp Leu Lys Lys 1 5 10 <210> 9 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> W9 <400> 9 Lys Leu Leu Lys Lys Leu Leu Lys Trp Leu Lys 1 5 10 <210> 10 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> W10 <400> 10 Lys Lys Leu Leu Lys Lys Leu Leu Lys Trp Leu 1 5 10 <210> 11 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> W11 <400> 11 Leu Lys Lys Leu Leu Lys Lys Leu Leu Lys Trp 1 5 10

Claims (6)

1. 삭제
2. 서열번호 4, 서열번호 7 및 서열번호 11로 구성된 군으로부터 선택된 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항균용 약학 조성물.
3. 삭제
4. 서열번호 2 및 서열번호 3으로 구성된 군으로부터 선택된 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항염증용 약학 조성물.
   
5. 삭제
6. 삭제

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