CN114106103B

CN114106103B - 一种贝类来源的抗菌肽p-amp108及在制备治疗痤疮药物中的应用

Info

Publication number: CN114106103B
Application number: CN202210081440.9A
Authority: CN
Inventors: 张扬; 喻子牛
Original assignee: South China Sea Institute of Oceanology of CAS
Current assignee: South China Sea Institute of Oceanology of CAS
Priority date: 2022-01-24
Filing date: 2022-01-24
Publication date: 2022-04-15
Anticipated expiration: 2042-01-24
Also published as: CN114106103A; WO2022262385A1

Abstract

本发明公开了一种贝类来源的抗菌肽P‑AMP108及在制备治疗痤疮药物中的应用，属于应用海洋生物技术领域。本发明从牡蛎的血浆中分离出一个天然抗菌肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其对革兰氏阳性菌如痤疮丙酸杆菌具有高效的清除和杀灭能力，同时高生物安全性和无细胞物毒性。临床试验显示，抗菌肽P‑AMP108可以有效的治疗痤疮丙酸杆菌引发的痤疮，显示了在治疗痤疮或祛痘领域中的巨大应用价值。

Description

一种贝类来源的抗菌肽P-AMP108及在制备治疗痤疮药物中的应用

技术领域

本发明涉及应用海洋生物技术领域，具体涉及一种贝类来源的抗菌肽P-AMP108及在制备治疗痤疮药物中的应用。

背景技术

抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs）是一类广泛存在于自然界生物体内的天然防御分子，对细菌、真菌、病毒和寄生虫等多种病原均具有较好的杀灭或抑制效果。抗菌肽通常以破坏细菌膜电位、改变膜通透性并引发细菌内容物的外流等多种“物理”杀伤机制清除细菌，所以不会产生耐药性。同时，抗菌肽还具有高度生物安全性、高稳定性、广谱杀菌、无残留等多重优点，已经在医药、美容、食品、饲料等多个领域广泛应用，大放异彩。

痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)，也称痤疮杆菌、疮疱丙酸杆菌，是造成痤疮的主要细菌。痤疮丙酸杆菌感染皮肤以后，大量增生繁殖，并生成溶脂酶分解皮脂产生脂肪酸，在皮脂腺形成红色、凸起的小结节，同时诱发吞噬细胞释放水解酶和多种炎因子，诱导产生炎症反应，并最终破坏皮脂腺，形成痤疮。因此，开发针对痤疮丙酸杆菌的抗菌肽是治疗痤疮或祛痘的有效途径。

牡蛎（Crassostrea spp）属于海洋软体动物，因生活在环境复杂、充满了各种微生物的潮间带区域，长期的进化是的牡蛎基因组编码了丰富且新颖的抗菌肽，是一个天然的抗菌肽资源库。通过对多种牡蛎基因组和多肽组测序，结合大规模筛选技术，可以获得结构新颖的抗菌肽，并在治疗痤疮或祛痘领域有广阔的应用前景。

发明内容

本发明从牡蛎基因组和多肽组中分离鉴定了一个12氨基酸的多肽，对痤疮丙酸杆菌具有高效的清除和杀灭能力，同时无细胞和生物毒性，是一种新颖安全的贝类天然抗菌肽，命名为P-AMP108。

本发明的第一个目的是提供一种贝类抗菌肽P-AMP108，其氨基酸序列为： Met-Asn-Tyr-Val-Ser-Lys-Arg-Trp-Arg-Val-Trp-Phe（SEQ ID NO.1）。

本发明的第二个目的是提供一种上述的贝类抗菌肽P-AMP108的编码基因。

本发明的第三个目的是提供一种重组表达载体，含有上述的编码基因；所述重组表达载体的原始表达载体为pPIC9、pPIC9K、pHIL-S1、pPICZaA或pYAM75P。

优选，所述重组表达载体的原始表达载体为pPIC9K。

本发明的第四个目的是提供一种基因工程细胞，其为整合有上述的编码基因或转化有上述的重组表达载体的细胞。

优选，所述的细胞为酵母；更优选为毕赤酵母。

本发明的第五个目的是提供上述的贝类抗菌肽P-AMP108、编码基因、重组表达载体和/或基因工程细胞在制备抗菌制剂或制备治疗痤疮药物中的应用。

优选，所述的抗菌是抗革兰氏阳性菌；更优选是痤疮丙酸杆菌。

本发明的第六个目的是提供一种抗菌制剂，以上述的抗菌肽P-AMP108为活性成分。

优选，所述的抗菌制剂包含：抗菌肽P-AMP108 250ppm，甘露糖5%（w/v，g/ml），海藻糖 1%（w/v，g/ml）。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明首次从牡蛎基因组和多肽组中分离鉴定了一个12氨基酸的多肽，对痤疮丙酸杆菌具有高效的清除和杀灭能力，同时无细胞和生物毒性，是一种新颖安全且强抑菌的贝类天然抗菌肽。同时，临床试验显示，抗菌肽P-AMP108可以高效的治疗痤疮并且具备高度的安全性，显示了在治疗痤疮或祛痘领域中的巨大应用前景。

附图说明

图1为抗菌肽P-AMP108的化学式和二级结构。

图2为抗菌肽P-AMP108对痤疮丙酸杆菌的清除能力。

图3为抗菌肽P-AMP108对细胞LDH释放的影响。

图4为抗菌肽P-AMP108对细胞IL-1α诱导的影响。

图5为抗菌肽P-AMP108 对小鼠存活率的影响。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1 抗菌肽P-AMP108序列的鉴定及其结构的分析

（1）从牡蛎围心腔中抽取血淋巴液，转移至离心管中；（2）4℃，1000×g离心5 min，吸取上清；（3）按体积稀释比（1:1000）加入蛋白酶抑制剂Cocktail，冰上放置5min，加入终浓度10 mM DTT，涡旋震荡1 min后12,000 g离心10 min，取上清；（4）使用10K的超滤膜，进行过滤，对上清体液进行冷冻干燥，使用Q-Exactive组合型四极杆Orbitrap质谱仪进行序列鉴定；（5）对肽段进行离子化，获得二级质谱，根据牡蛎基因组进行进行检索结合匹配度得分，可获取肽段序列；（6）对多肽测序的结果进行抗菌能力预测，获得抗菌肽P-AMP108，其氨基酸序列为：Met-Asn-Tyr-Val-Ser-Lys-Arg-Trp-Arg-Val-Trp-Phe（SEQ ID NO.1），其化学式如图1A所示。其肽结构和α-螺旋，具有较强的疏水性（图1）。

实施例2 重组表达载体pPIC9K的构建

(1)根据抗菌肽序列设计引物，序列为：

F1：5′-CTCTCTCGAG ATGAACTATGTGAGCAAACGCTGG-3′;

R1： 5′-TGTGTCTAGA AAACCACACGCGCCAGCGTTTGCTC-3′;

(2)利用引物进行无模板PCR扩增，获得PCR产物；

纯化PCR产物，利用Xho I和Xba I酶切位点，使用快速DNA连接试剂盒(Rapid DNALigation Kit，碧云天)连接至质粒pPIC9K，获得含有抗菌肽P-AMP108重组表达载体pPIC9K。

实施例3 重组表达载体pPIC9K转化毕赤酵母

（1）取80μL毕赤酵母感受态细胞分别与10μL (5～10 mg/L) Sac I线性化的含有抗菌肽P-AMP108的重组表达载体pPIC9K，使用Bio2Rad Gene Pluser电转仪进行电转化（电压：1500 V；电容：25 μF；电阻：400 Ω；电激次数：1次/管；时间参数：8. 9 ms），涂布于YPDS (Zeocin 100 mg/L) 抗性选择平板上筛选转化子；（2）挑取酵母转化子，接种于100mL BMGY培养基，在30℃、250～300 r/min摇瓶培养至OD₆₀₀ = 2；（3）3000 r/min，室温离心菌体5 min，去上清，重悬于100～200 mL BMMY中；（4）将菌体置于500 mL锥形瓶中继续培养，每隔24 h加入甲醇至终浓度5 g/L, 保持诱导；（5）24小时后，将发酵上清液纯度进行HPLC分析，进样20uL，使用C18色谱柱Diamonsil^TM， 250×4.6mm，其中流动相A为0.1 %TFA和氢氧化铵溶液（pH3.15），流动相B为1.2%TFA+氢氧化铵（pH2.20）:甲醇：乙腈=80：10：10（v：v：v），洗脱梯度：B: 0~100% 20min，流速设置为1ml/min，检测波长：245nm；其中标准品为化学合成的抗菌肽P-AMP108，通过观察和计算与标准品的保留时间，峰面积百分比，确定纯度大约为8.6%。

因此，本发明的抗菌肽P-AMP108可以化学合成，也可以通过重组表达载体表达后再经纯化获得。

实施例4 抗菌肽P-AMP108药效及毒性分析

⒈抗菌肽P-AMP108对细菌的清除能力

（1）培养痤疮丙酸杆菌（ATCC：6919）至OD₆₀₀为0.2；（2）通过低速离心收集细菌，然后用Tris缓冲液（50 mM，pH 8.0）洗涤3次，然后重悬于1 mL PBS缓冲液（0.01mM）中以进行后续分析；（3）在室温下，用准备好的细菌液，每个50 uL（含有2×10⁵个细菌），实验组分别与不同浓度抗菌肽P-AMP108 10 uL（溶剂为PBS）混合共同孵育30min，使抗菌肽P-AMP108终浓度为10、20、30、40、50μM，对照组（即肽浓度为0μM）加入等量体积的PBS，并设置3个重复；（4）将50μL抗菌肽和细菌的混合液接种于LB琼脂平板上室温过夜培养，对平板上的菌落数进行计数，使用graphpad prism软件的Best-fit计算可得抗菌肽P-AMP108对痤疮丙酸杆菌（ATCC：6919）的IC50 (Half maximal inhibitory concentration)为 2.982μM（图2）。

⒉抗菌肽P-AMP108的细胞毒性分析

（1）将10⁴个HEK293细胞置于12孔板培养，加入于含10%胎牛血清以及1%双抗（青霉素和链霉素）的DMEM培养基，培养条件为37 ℃，5％CO₂，饱和湿度；（2）培养24小时后，全部更换在无血清DMEM培养基进行培养，实验组分别用终浓度为1、5、10、20、50 μM的抗菌肽P-AMP108处理（细胞培养基和抗菌肽体积比为100:1），对照组（即肽浓度为0μM）加入等量体积的PBS，并设置三个重复；（3）24 h后，通过测定乳酸脱氢酶（LDH）的释放量来评估P-AMP108对细胞的毒性。结果显示抗菌肽P-AMP108对LDH释放没有刺激作用，提示了其低细胞毒性（图3）。

⒊抗菌肽P-AMP108对细胞促炎症反应的分析

（1）将10⁴个肺泡巨噬细胞J774置于12孔板培养，加入于含10%胎牛血清以及1%双抗（青霉素和链霉素）的DMEM培养基中，培养条件为37 ℃，5％CO₂，饱和湿度；（2）培养24小时后，全部更换无血清DMEM培养基进行培养，实验组分别用终浓度为1、3、5、10、15μM的抗菌肽P-AMP108处理24小时（细胞培养基和抗菌肽体积比为100:1），对照组（即肽浓度为0μM）加入等量体积的PBS处理24小时，并设置三个重复；（3）用ELISA试剂盒检测细胞因子IL-1α的水平，结果显示抗菌肽P-AMP108不会刺激细胞释放炎症因子（图4）。

⒋抗菌肽P-AMP108对小鼠的毒性分析

取体重、生长情况一致的昆明小鼠40只，平均体重20g左右，进行抗菌肽毒性分析，实验组分别以0.045mg/kg、0.45mg/kg、4.5mg/kg体重的剂量气管灌注小鼠多肽P-AMP108（溶剂为0.01mM PBS），每组10只小鼠，每只注射50 μL试剂。对照组（control）小鼠注射50 μL PBS。6小时后再次灌注；以二次灌注后的时间为起始时间，持续观察24h小时，记录每组小鼠，死亡数量和死亡时间。结果显示抗菌肽对实验小鼠无致死性（图5）。

实施例5 抗菌肽P-AMP108人体功效和安全性评价

配制含有抗菌肽P-AMP108的乳液，按照以下浓度配制含有抗菌肽P-AMP108的乳液：

抗菌肽P-AMP108 250ppm，甘露糖5%（w/v g/ml），海藻糖1%（w/v g/ml）。配置方法：将甘露糖和海藻糖溶解在水中，高温灭菌，待冷却至室温，加入抗菌肽P-AMP108。对照乳液（不含有抗菌肽P-AMP108）的配制：将甘露糖和海藻糖溶解在水中，高温灭菌，待冷却至室温，即可。

⒈人体功效评价（受试者自评）

（1）选取面部有明显痤疮，颜面部皮肤易长粉刺的志愿者共30名，年龄在20-30之间，男女各半，进行半脸测试；（2）使用方法：每天早晨清洗面部后，使用含有抗菌肽P-AMP108的乳液进行涂抹1次（约0.5ml），连续使用28天，并在第14天和第28天进行回访和统计；对照组使用不含有抗菌肽P-AMP108的乳液，使用方法相同；（3）按照祛痘类功效性护肤品临床评价标准T/CNMIA 0012-2020的ISGA量表进行分级（0-5分共六个等级），依据以下公式计算皮损减少百分率：皮损减少百分率（%）=（首诊ISGA评分-随诊ISGA评分）/ 首诊ISGA评分× 100%；（4）按照上述临床标准，临床志愿者进行皮肤改善自评，相关标准为（1分：洁净、完全清除；2分：改善非常好，清除>75%；3分：改善良好，清除50~75%；4分：中度改善，清除<50%；5分：无改善，未清除；6分：恶化或加重），改善率（%）=（1-4分的人数之和）/总人数×100%。

最终测试结果显示，涂抹含有抗菌肽P-AMP108的乳液在14天和28天的皮损减少百分率分别为74.2% 和92.8%，而对照组（不含有抗菌肽P-AMP108的乳液）在14天和28天的皮损减少百分率分别为2.1%和3.2%；受试者自评结果统计结果如表1所示，14天和28天的改善率分别为93.3% 和100%，其中对照组在14天和28天的改善率分别为3.3 % 和6.6%。

⒉人体安全性评价

（1）选取30名志愿者，年龄在20-30之间，男女各半，进行重复性开放涂抹实验；（2）每次取0.05ml含有抗菌肽P-AMP108的乳液置于斑试器的药室内，空白组为0.05ml不含抗菌肽P-AMP108的溶液（5%甘露糖，1%海藻糖），在受试皮肤上均匀涂抹，每天两次，连续观察28天；（3）按照2015版《化妆品安全技术规范》说述人体皮肤开放型斑贴试验评分标准：（0，阴性反应；1，微弱红斑、皮肤干燥、褶皱；2，红斑、水肿、丘疹、风团、脱屑、裂隙；3，明显红斑、水肿、水疱；4，重度红斑、水肿、大疱，糜烂、色素沉着或色素减退、痤疮样改变）。在实验14天和28天后，涂抹含有抗菌肽P-AMP108的乳液的测试组和空白组阴性反应均为100%，证明了抗菌肽的高度安全性和对皮肤的温和性。

序列表

<110> 中国科学院南海海洋研究所

<120> 一种贝类来源的抗菌肽P-AMP108及在制备治疗痤疮药物中的应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 12

<212> PRT

<213> 牡蛎(Crassostrea spp)

<400> 1

Met Asn Tyr Val Ser Lys Arg Trp Arg Val Trp Phe

1 5 10

Claims

1.一种贝类抗菌肽P-AMP108，其特征在于，其氨基酸序列为：Met-Asn-Tyr-Val-Ser-Lys-Arg-Trp-Arg-Val-Trp-Phe。

2.一种权利要求1所述的贝类抗菌肽P-AMP108的编码基因。

3.一种重组表达载体，其特征在于，含有权利要求2所述的编码基因。

4.一种基因工程细胞，其特征在于，其为整合有权利要求2所述的编码基因或转化有权利要求3所述的重组表达载体的细胞。

5.根据权利要求4所述的基因工程细胞，其特征在于，所述的细胞为毕赤酵母。

6.权利要求1所述的贝类抗菌肽P-AMP108、权利要求2所述的编码基因、权利要求3所述的重组表达载体或权利要求4或5所述的基因工程细胞在制备抗菌制剂或制备治疗痤疮药物中的应用；所述的抗菌是抗痤疮丙酸杆菌。

7.一种抗菌制剂，其特征在于，以权利要求1所述的抗菌肽P-AMP108为活性成分，所述的抗菌是抗痤疮丙酸杆菌。

8.根据权利要求7所述的抗菌制剂，其特征在于，包含：抗菌肽P-AMP108 250ppm，甘露糖5％(w/v，g/ml)，海藻糖1％(w/v，g/ml)。