CN101970459B - 抗微生物化合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及通式(I)AA-AA-AA-X-Y-Z的化合物，其中，以任何顺序，所述AA(氨基酸)部分中的2个为阳离子性氨基酸，并且所述AA中的1个为具有亲脂性R基团的氨基酸，所述R基团具有14个至27个非氢原子；X为N原子，其可以被支链或直链C1-C10烷基或芳基取代，所述基团可以含有高至2个选自N、O和S的杂原子；Y表示选自-Ra-Rb-、-Ra-Rb-Rb-和-Rb-Rb-Ra-的基团，其中Ra为C、O、S或N，并且Rb为C；每一Ra和Rb可以被C1-C4烷基取代或不被取代；并且Z为包含1至3个环状基团的基团，每一环状基团包含5个或6个非氢原子，2个或更多个环状基团可以是稠合的，并且一个或多个环状基团可以被取代；Z部分包含最多15个非氢原子；并且其中Y和Z之间的键为Y的Ra或Rb与Z的环状基团之一的非氢原子之间的共价键。本发明还涉及包含这些化合物的制剂和它们在治疗方面的用途，尤其是作为抗微生物剂或抗肿瘤剂的用途。

Description

抗微生物化合物
本发明涉及生物活性分子，尤其涉及显示抗微生物活性的肽。
肽和它们的衍生物长期以来一直被认为是治疗方面受关注的分子。大量生物使用肽作为它们的宿主防御机制的一部分。已经从细菌和哺乳动物这样不同的物种中分离了抗微生物肽。通常，这些肽具有净正电荷和在与细菌细胞膜的外部磷脂双层相互作用时具有形成两亲α-螺旋或β-折叠结构的倾向。在大多数情况下，抗菌作用详细的分子机制是未知的，尽管认为某些被分类为L类(溶解)肽的肽与细菌细胞膜相互作用，很可能形成离子通道或孔。
大部分已知的抗细菌肽包含10种或更多种、通常为20种或更多种的氨基酸，需要该数目的氨基酸以便为肽提供足够的、通常为α-螺旋形的长度，以跨细菌细胞膜并形成孔。这样的机制是通常接受的方式，其中大量这样的肽发挥它们的细胞毒性。
现有技术的抗细菌肽的合成是困难的，并通常需要将肽通过细菌或其它生物来合成，能够将所述细菌或其它生物培养并采集以获得受关注的肽，通常在分离翻译的直接产物之后需要附加的处理步骤。如果活性肽能够被识别为较短，这会使得能够通过由氨基酸结构单元或由可得的二肽或三肽的合成来经济地生产。此外，短肽将提供用于生物递送的优势。对于能够不需注射而给药的抗生素的需求日益增长，所述给药例如穿过鼻腔毛细血管的吸入和吸收。
对新颖抗生素的探求特别地紧急，因为对已知和广泛使用的药物显示抗性的菌株数目日益增加。医药以及农业、环境保护和食品安全领域的技术人员始终需要新的抗细菌剂并且必须用若干不同抗细菌剂治疗给定的人群或位点，从而有效地与不期望的细菌作斗争。
如在WO01/66147中所述，最近显示出事实上有可能产生小的抗菌分子，尤其是肽，其被认为通过膜的失稳(destabilisation)起作用。
本发明人目前识别了一小组的修饰的肽，其显示令人印象深刻的一些特征，尤其是抗微生物活性、低毒性和稳定性即耐酶降解的有用组合。
因此一方面，本发明提供通式(I)的化合物，优选为肽：
AA-AA-AA-X-Y-Z(I)
其中，以任何顺序，所述AA(氨基酸)部分中的2个为阳离子性氨基酸，优选为赖氨酸或精氨酸，但可以为组氨酸或任何在pH为7.0时带正电荷的非遗传编码或修饰的氨基酸，并且所述AA中的1个为具有大的亲脂性R基团的氨基酸，R基团具有14个至27个非氢原子并优选含有2个或更多个，例如2个或3个，可以为稠合的或连接的环状基团，这些环状基团通常包含5个或6个非氢原子，优选为6个非氢原子；
X为N原子，其可以被诸如甲基、乙基或苯基的支链或直链C1-C10烷基或芳基取代但优选不被取代，并且该基团可以含有高至2个选自N、O和S的杂原子；
Y表示选自-Ra-Rb-、-Ra-Rb-Rb-和-Rb-Rb-Ra-的基团，其中
Ra为C、O、S或N，优选为C，并且
Rb为C；每一Ra和Rb可以被C1-C4烷基取代或不被取代，优选地，Y为-Ra-Rb-(其中Ra优选为C)并且优选地，该基团不被取代，当Y为-Ra-Rb-Rc-或-Rb-Rb-Ra-时，则优选一个或多个Ra和Rb被取代；并且
Z为包含1个至3个环状基团的基团，每一环状基团包含5个或6个非氢原子(优选为C原子)，2个或更多个环状基团可以是稠合的；一个或更多个环可以被取代并且这些取代可以包括极性基团，但通常不包括极性基团，适当的取代基包括优选溴或氟的卤素和C1-C4烷基；Z部分包含最多15个非氢原子，优选为5个至12个，最优选其为苯基；
Y和Z之间的键为Y的Ra或Rb与Z的环状基团之一的非氢原子之间的共价键。
能够提供阳离子性氨基酸的适当非遗传编码氨基酸和修饰的氨基酸包括赖氨酸、精氨酸和组氨酸的类似物，例如高赖氨酸、鸟氨酸、二氨基丁酸、二氨基庚二酸、二氨基丙酸和高精氨酸以及三甲基赖氨酸和三甲基鸟氨酸、4-氨基哌啶-4-羧酸、4-氨基-1-脒基(carbamimidoyl)哌啶-4-羧酸和4-胍基苯基丙氨酸。
大的亲脂性R基团可以包含杂原子，例如O、N或S，但通常不超过一个杂原子，优选其为氮。优选地，该R基团含有不超过2个极性基团，更优选不含极性基团或含一个极性基团，最优选不含极性基团。
在优选实施方案中，本发明优选为肽的化合物为通式(II)：
AA1-AA2-AA1-X-Y-Z(II)
其中：
AA1为阳离子性氨基酸，优选为赖氨酸或精氨酸，但可以为组氨酸或在pH为7.0时带正电荷的任何非遗传编码的或修饰的氨基酸；
AA2为具有大的亲脂性R基团的氨基酸，所述R基团含有14个至27个非氢原子并优选含有2个或更多个例如2个或3个环状基团，所述环状基团可以是稠合的或连接的，这些环状基团通常包含5个或6个非氢原子，优选为6个非氢原子；并且
X、Y和Z定义如上。
本发明的其它化合物包括通式(III)和(IV)的化合物：
AA2-AA1-AA1-X-Y-Z(III)
AA1-AA1-AA2-X-Y-Z(IV)
其中AA1、AA2、X、Y和Z定义如上。然而，优选通式(II)的分子。
以上化合物中的某些化合物是优选的。特别地，具有在本文中为了方便而被称为AA2的带有大的亲脂性R基团的氨基酸的化合物是三丁基色氨酸(Tbt)或诸如Bip(4-(2-萘基))、Bip(4-(1-萘基))、Bip(4-正丁基)、Bip(4-苯基)或Bip(4-叔丁基)的联苯丙氨酸衍生物；最优选Bip(4-(2-萘基))和Tbt。另一组优选的化合物为其中Y为如上定义的-Ra-Rb-的那些，优选其中Ra和Rb不被取代，最优选其中Ra和Rb都为碳原子。
另一组优选的化合物为其中-X-Y-Z一起为基团-NHCH2CH2Ph的那些。
化合物包括所有对映异构体形式，D和L氨基酸以及对映异构体由氨基酸R基团和Y或Z部分中的手性中心产生。
最优选的化合物如下：
另一方面，本发明提供用于治疗、特别是用作抗微生物(例如抗细菌)剂以及用作抗肿瘤剂的通式(I)、(II)、(III)或(IV)的化合物。本发明的分子作为抗真菌剂也是有效的，并且他们作为抗真菌剂的用途以及在治疗(包括预防)真菌感染的方法中的用途构成本发明的另一方面。甲癣(Onchyomycosis)特别适合用本发明的分子来治疗。本发明的优选分子具有作为抗真菌剂和抗细菌剂的活性。
这样的抗微生物分子还具有非治疗用途，例如在农业或家庭或工业环境中用作容易受到微生物污染的材料的灭菌剂。因此，另一方面，本发明提供本发明分子作为抗微生物剂，特别是抗细菌剂的用途。
分子显示抗微生物活性，特别地，它们通过直接膜影响机制(directmembrane-affectingmechanism)发挥细胞毒性并能够被称为膜作用的(membraneacting)抗微生物剂。这些分子将细胞膜溶解、去稳定或者甚至穿孔。与作用于诸如细胞表面受体的靶细胞的蛋白质组分或与诸如细胞表面受体的靶细胞的蛋白质组分相互作用的药剂相比，这提供了特殊的治疗优势。当突变可以产生导致抗生素抗性的靶蛋白的新形式时，几乎不可能发生脂质膜的根本改变而防止细胞毒性。溶解作用引起非常快速的细胞死亡并从而在细菌有机会繁殖之前具有杀死细菌的优势。此外，分子可以具有杀死或损伤靶微生物的其它有用性质，例如抑制蛋白质合成的能力，从而它们可以具有多靶标活性。
因此，另一方面，本发明提供用于使微生物细胞膜去稳定和/或渗透的本发明的分子。‘去稳定’意味着正常的三维脂质双分子层构型的扰动，其包括但不限于膜变薄、膜对水、离子或代谢物等的渗透性的增加(通常不涉及通道)，这也削弱了细菌的呼吸系统。
如同可以全部被认为是AA单元的N-取代甘氨酸，将β和γ氨基酸以及α氨基酸包括在术语‘氨基酸’内。本发明的分子包括β肽和缩肽。
通式(I)至(IV)的化合物可以为肽模拟物(peptidomimetic)，并且本文描述并定义的肽的肽模拟物是本发明的另一方面。肽模拟物通常的特征在于保留了其肽等价物的极性、三维大小和功能性(生物活性)，但其中肽键经常被更稳定的键合所替换。‘稳定’意味着对通过水解酶的酶降解更耐受。通常，替换酰胺键的键(酰胺键的替代物)保留了酰胺键的许多性质，例如构象、空间体积、静电特性、氢键结合的可能性等。“DrugDesignandDevelopment(药物设计和开发)”，Krogsgaard，Larsen，LiljeforsandMadsen(Eds)1996，HorwoodAcad.Pub的第14章提供了用于设计和合成肽模拟物的技术的一般性讨论。在分子与膜反应而不是与酶的特定活性位点反应的该情况下，严格模拟亲和力和效力或底物功能的某些所述问题不是相关的，并且肽模拟物能够基于给定的肽结构或需要的官能团的基序容易地制备。适当的酰胺键替代物包括以下基团：N-烷基化(Schmidt，R.etal.，Int.J.PeptideProteinRes.，1995，46，47)、逆反转(retro-inverse)酰胺(Chorev，MandGoodman，M.，Ace.Chem.Res，1993，26，266)、硫代酰胺(ShermanD.B.andSpatola，A.F.J.Am.Chem.Soc.，1990，112，433)、硫代酯、膦酸酯、酮亚甲基(Hoffman，R.V.andKim，H.O.J.Org.Chem.，1995，60，5107)、羟基亚甲基、氟代乙烯基(Allmendinger，T.etal.，TetrahydronLett.，1990，31，7297)、乙烯基、亚甲基氨基(Sasaki，YandAbe，J.Chem.Pharm.Bull.199745，13)、亚甲基硫基(methylenethio)(Spatola，A.F.，MethodsNeurosci，1993，13，19)、链烷烃(Lavielle，S.et.al.，Int.J.PeptideProteinRes.，1993，42，270)和亚磺酰氨基(Luisi，G.etal.TetrahedronLett.1993，34，2391)。
本发明的肽模拟物化合物可以含有3个在大小和功能上与氨基酸(AA单元)大致等同的可确认的亚单元。从而术语‘氨基酸’可以方便地在本文中使用以指代肽模拟物化合物的等同的亚单元。此外，肽模拟物可以含有等同于氨基酸的R基团的基团，并且本文讨论的适当的R基团和N和C端修饰基团经过必要的变化可以应用于肽模拟物化合物。
如在以上引用的教科书中所讨论的，以及酰胺键的替换，肽模拟物可以涉及具有二或三肽模拟物结构的较大结构部分的替换，并且在该情况下，诸如唑衍生的模拟物的涉及肽键的模拟部分可以用作二肽的替换。然而，优选其中酰胺键被如上所讨论地替换的肽模拟物和由此的肽模拟物骨架。
适当的肽模拟物包括还原的肽，其中通过将酰胺键用诸如硼烷的还原剂或诸如氢化铝锂的氢化剂处理以将其还原为亚甲基胺。这样的还原的额外优势在于增加分子总的阳离子性。
其它肽模拟物包括通过例如酰胺-官能化的聚甘氨酸的分步合成而形成的类肽。某些肽模拟物骨架会很容易地由它们的肽前体获得，例如由全甲基化的肽获得，适当的方法由Ostresh，J.M.etal在Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1994)91，11138-11142中描述。强碱性条件会有利于N-甲基化而不是O-甲基化并导致肽键中部分或所有氮原子和N-端氮的甲基化。
优选的肽模拟物骨架包括聚酯、聚胺及其衍生物以及取代的烷烃和烯烃。优选地，肽模拟物含有可以如上所讨论地修饰的N和C末端。
本发明提供通过给予本文所述各种分子以治疗微生物感染的方法。还提供类似的将微生物细胞膜去稳定的方法。给予的量应有效地杀死所有或一部分的靶微生物或有效地防止或降低它们的繁殖速率，或者减轻它们对身体的有害作用。临床医生或患者应观察与感染有关的一种或多种参数或症状的改善。给药也可以是预防性的。
可以通过任何方便的方法来合成本发明的肽。通常，在整个合成期间会保护存在的反应性基团(例如氨基、硫醇和/或羧基)。因此，合成的最终步骤会是使本发明受保护的衍生物的去保护。
在构建肽时，原则上能够从C-端或N-端开始，尽管优选从C-端开始的操作。
肽合成的方法是本领域公知的，但对于本发明，在固相载体上进行合成可以是特别方便的，这样的载体是本领域公知的。
已知用于氨基酸的保护基存在多种选择，并且适当的胺保护基可以包括苄氧羰基(也被指定为Z)、叔丁氧基羰基(也被指定为Boc)、4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺酰基(Mtr)和9-芴基甲氧基-羰基(也被指定为Fmoc)。应当理解，当肽从C-末端构建时，胺保护基会存在于每一新添加残基的α-氨基上并需要在下一偶联步骤之前被选择性地除去。
例如可以被使用的羧基保护基包括容易裂解的酯基，例如苄基(Bzl)、对硝基苄基(ONb)、五氯苯基(OPClP)、五氟苯基(OPfp)或叔丁基(OtBu)；以及在固体载体上的偶联基团，例如与聚苯乙烯连接的甲基。
硫醇保护基包括对甲氧基苄基(Mob)、三苯甲基(Trt)和乙酰氨基甲基(Acm)。
对于除去胺-和羧基-保护基存在大量操作。然而，这些过程必须与所用的合成策略相一致。侧链保护基必须对用于在下一偶联步骤之前除去临时α-氨基保护基的条件稳定。
可以通过用酸处理，例如用三氟乙酸处理，将诸如Boc的胺保护基和诸如叔丁基的羧基保护基同时除去。可以使用诸如碘的氧化剂来选择性地除去诸如Trt的硫醇保护基。
用于合成本发明的肽模拟物化合物和其它生物活性分子的参考文献和技术在本文中进行了描述并因此是本领域公知的。
包含与适当的稀释剂、载体或赋形剂混合的本发明的一种或多种化合物的制剂构成本发明的另一方面。这样的制剂可以特别用于药物(包括兽医)或农业用途或者在例如食品工业中用作用于易受微生物污染的材料的灭菌剂。适当的稀释剂、赋形剂和载体是本领域技术人员已知的。
本文定义的肽显示广泛的抗微生物活性并因此也适合作为抗病毒剂和抗真菌剂，其会具有药物和农业应用，以及作为伤口愈合的启动子或杀精子剂。所有这些用途构成本发明的另外方面。
包括向人或动物患者给予本文定义的一种或多种肽或肽模拟物的治疗或防止细菌、病毒或真菌感染或者治疗肿瘤的方法构成本发明的另外方面。
例如，本发明的组合物可以以适用于口、鼻、肠胃外、静脉内、肿瘤内或直肠给药的形式存在。
本文中所使用的术语“药物”包括本发明在兽医上的应用。
本文定义的活性化合物可以以给药的常规药理学形态存在，例如片剂、包衣片剂、鼻喷雾剂、溶液剂、乳剂、脂质体、粉剂、胶囊剂或缓释形态。
肽特别适用于局部给药，例如在糖尿病性溃疡或诸如甲癣的真菌感染的治疗中。用于局部给药的制剂优选为凝胶、乳膏、洗剂、糊剂或比水更粘稠的其它制剂的形式。用于局部应用的其它制剂包括以本发明化合物浸渍的敷料(dressings)、纱布(gauzes)等；当浸渍这样的材料时，包含本发明化合物的制剂不需要比水更粘稠。常规药物赋形剂以及常规的制备方法可以用于制备这些形式。例如可以通过将活性成分或多种活性成分与已知赋形剂混合来制备片剂，所述赋形剂例如诸如碳酸钙、磷酸钙或乳糖的稀释剂；诸如玉米淀粉或藻酸的崩解剂；诸如淀粉或明胶的粘合剂；诸如硬脂酸镁或滑石的润滑剂；和/或用于获得缓释的药剂，例如聚羧乙烯、羧甲基纤维素、醋酸邻苯二甲酸纤维素或聚乙酸乙烯酯。
如果需要，片剂可以由若干层组成。包衣片剂可以通过用通常用于片剂包衣的药剂将以与获得片剂的类似方式获得的核心进行包衣来制备，所述通常用于片剂包衣的药剂例如，聚乙烯吡咯烷酮或虫胶、阿拉伯树胶、滑石、二氧化钛或糖。为了获得缓释或避免不相容性，核心也可以由若干层组成。片剂包衣还可以由若干层组成从而获得缓释，在这种情况下，可以使用用于片剂的上述赋形剂。
还可以使用有机特异性载体系统。
可以以例如常规的方式来制备注射液，例如通过添加诸如对羟基苯甲酸酯的防腐剂或诸如EDTA的稳定剂。随后将溶液填充至注射小瓶或安瓿。
可以将作为优选给药方法的鼻喷雾剂在水性溶液中类似地制成并包装入具有气溶胶型推进剂或提供有用于徒手加压的装置的喷雾容器中。包含一种或若干种活性成分的胶囊可以通过例如将活性成分与诸如乳糖或山梨糖醇的惰性载体混合并将混合物填充至明胶胶囊来制备。
适当的栓剂可以通过例如将活性成分或活性成分的组合与用于该目的的常规载体混合来制备，所述常规载体例如天然脂肪或聚乙二醇或它们的衍生物。
优选地，包含活性分子的剂量单元包含0.1mg至10mg，例如1mg至5mg的抗微生物剂。药物组合物可以另外包含其它活性成分，包括诸如其它抗微生物肽的其它细胞毒性药剂。其它活性成分可以包括不同类型的抗生素，诸如IFN-γ、TNF、CSF和生长因子的细胞因子、免疫调节剂、诸如顺铂的化学治疗剂或抗体。
当在局部组合物中使用时，生物活性分子存在的量通常为至少0.1％重量比。在大多数情况下，不需要使用超过1.0％重量比的肽。
在全身(肌肉内、静脉内、腹膜内)使用这样的组合物时，活性分子以一定量存在以实现生物活性分子的至少约5μg/ml的血清水平。通常，血清水平不需要超过500μg/ml。优选血清水平为约100μg/ml。这样的血清水平可以通过将生物活性分子并入到以1mg/kg至约10mg/kg的剂量全身给药的组合物中来实现。通常，给予分子的剂量不需要超过100mg/kg。
本发明其它方面包括用本发明的一种或多种分子处理环境或农业场所或产物，以及食品生产的食品和场所或者诸如医院环境的表面或工具从而降低存在的活菌数目或限制细菌生长或繁殖的方法。
现在参考以下非限制性实施例和附图对本发明进行进一步的描述，其中
图1为在鼠皮肤感染模型中使用化合物2对金黄色葡萄球菌FDA486局部处理一天的效果图。菌落形成单位(CFU)的数目示于Y-轴并且应用于小鼠的局部处理的类型示于X-轴。
图2为在鼠皮肤感染模型中使用化合物2对化脓性链球菌局部处理一天的效果图。菌落形成单位(CFU)的数目示于Y-轴并且应用于小鼠的局部处理类型示于X-轴。
图3为由制剂诱导的猝灭后ATP的恢复的比较以及它们与已知浓度标准品的比较的图(实施例5)。
图4为应用不同制剂后ATP释放的比较的图(实施例5)。
实施例
实施例1
本发明分子的体外活性
2.0材料和方法
2.1抗微生物剂
预称重的化合物1和化合物2的小瓶由LytixBiopharmaAS提供。
2.2细菌隔离种群(isolates)
本研究中使用的细菌隔离种群来自储存于GRMicroLtd.的全世界的各种来源并与最少的次培养基以未稀释的马血清高蛋白基体中的浓悬浮液保持在-70℃深度冷冻。使用的物种和它们的特征列于表1。这些包括54株革兰氏阳性细菌、33株革兰氏阴性细菌和10株真菌。
2.3最低抑菌浓度(MIC)的测定
使用以下由临床和实验室标准研究所(CLSI，以前为NCCLS)公布的用于抗微生物剂敏感性试验的微量稀释法(microbrothdilutionmethod)来测定MIC：
M7-A6Vol.23No.2January2003用于需氧生长细菌的稀释抗微生物剂敏感性试验的方法；认可的标准-第六版。
M100-S15Vol.25No1.January2005用于抗微生物剂敏感性试验的性能标准；第十五信息增刊。
M11-A6Vol.24No.2用于厌氧菌的抗微生物剂敏感性试验的方法；认可的标准-第六版。
M27-A2Vol.22No.15用于酵母菌的肉汤稀释抗真菌敏感性试验的参考方法；认可的标准-第二版。
M38-AVol.22No.16用于丝状真菌的肉汤稀释抗真菌敏感性试验的参考方法；认可的标准。
使用在GRMicroLtd制备的包含抗细菌剂或抗真菌剂的湿板来进行MIC的估值。
将具有大约105菌落形成单位(CFU)/mL的初始接种物的阳离子调节的Mueller-Hinton肉汤(OxoidLtd.，Basingstoke，UK和TrekDiagnosticSystemsLtd.，EastGrinstead，UK)(补充有用于链球菌(Streptococcusspp.)的5％裂解马血、杰氏棒状杆菌(Corynebacteriumjeikeium)和李斯特菌(Listeriamonocytogenes))用于需氧菌。
将嗜血杆菌检测培养基(包含0.5％酵母提取物的Mueller-Hinton肉汤和包含15mg/L正铁血红素(haematin)和15mg/LNAD的嗜血杆菌检测培养基添加剂，均得自OxoidLtd.，Basingstoke，UK)用于流感嗜血杆菌并以大约105CFU/mL接种。
将具有大约105CFU/mL接种物的补充的Brucella肉汤(SBB)用于厌氧菌株。SBB为补充有5μg/L氯高铁血红素(haemin)和1μg/L维生素K的由1％胨、0.5％‘牛肉膏(Lab-lemco)’、1％葡萄糖和0.5％氯化钠组成的肉汤(均得自SigmaAldrichLtd.)。
在MOPS缓冲的RPMI1640培养基(MOPS缓冲液得自AldrichLtd.，RPMI1640得自InvitrogenLtd，Paisley，Scotland)中进行酵母菌和丝状真菌的MIC。酵母菌接种物在7.5×102CFU/mL至4×103CFU/mL的范围内并且丝状真菌大约为8×103CFU/mL至1×105CFU/mL。
依照常规操作，预先制备包含Mueller-Hinton肉汤的所有板，将其在制备日于-70℃冷冻并在使用日解冻。真菌、嗜血杆菌和厌氧MIC测定都在同一天制备的板上进行。
为了评价冷冻是否影响肽的活性，使用包含新制备的Mueller-Hinton肉汤的板重复进行某些MIC测定。
2.4对照菌株
将以下对照(参照)菌株包括在被检测菌组(panel)以内：
大肠杆菌(Escherichiacoli)ATCC25922
金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)ATCC29213
粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)ATCC29212
肺炎球菌(Streptococcuspneumoniae)ATCC49619
绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)ATCC27853
克柔念珠菌(Candidakrusei)ATCC6258
以下对照菌株是检测菌组之外的，并且在需要时被包括在内，以检验比较物(comparator)在范围内。
流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)ATCC49247
近平滑假丝酵母(Candidaparapsilosis)ATCC22019
脆弱拟杆菌(Bacteroidesfragilis)ATCC25285
迟缓埃格特菌(Eggerthellalenta)ATCC43055
3.0结果
将结果作为单线列表示于表1。将重复的对照菌株结果示于表2。可以看到，对照菌株结果的可重现性高，其包括来自包含冷冻储存或新鲜使用的Mueller-Hinton肉汤的板的数据。冷冻的板对其它细菌菌株的MIC无影响。
获得的MIC数据非常鼓舞人心并表明肽具有相当广谱的活性。
表1：两种新颖抗微生物肽和比较物对抗一组革兰氏阳性菌、革兰氏阴细菌和真菌的体外活性的单线列表。
EMRSA16金黄色葡萄球菌(MRSA)-SSCmec型2 4 4
EMRSA1金黄色葡萄球菌(MRSA)-SSCmec型3 8 8
EMRSA15金黄色葡萄球菌(MRSA)-SSCmec型4 4 4
HT2001254金黄色葡萄球菌(MRSA)-PVL阳性 4 4
无乳链球菌-抗生-敏感性临床分离菌株 16 8
无乳链球菌-大环内酯耐药性临床分离菌株 32 16
C群链球菌-抗生-敏感性临床分离菌株 32 16
C群链球菌-大环内酯耐药性临床分离菌株 64 32
G群链球菌-抗生-敏感性临床分离菌株 32 8，
G群链球菌-大环内酯耐药性临床分离菌株 32 16
缓症链球菌-抗生-敏感性临床分离菌株 64 16
缓症链球菌-大环内酯耐药性临床分离菌株 ≥128 32
星座链球菌-抗生-敏感性临床分离菌株 64 32
星座链球菌-大环内酯耐药性临床分离菌株 64 32
口腔链球菌-抗生-敏感性临床分离菌株 64 32
口腔链球菌-大环内酯耐药性临床分离菌株 32 32
牛链球菌-抗生-敏感性临床分离菌株 64 32
牛链球菌-大环内酯耐药性临床分离菌株 8 8
血链球菌-抗生-敏感性临床分离菌株 64 32
血链球菌-大环内酯耐药性临床分离菌株 32 32
产气荚膜梭菌-抗生-敏感性临床分离菌株 ≥128 32
艰梭状芽孢杆菌(Clostridium difficile)-抗生-敏感性临床分离菌株 32 16
表2：两种新颖抗微生物肽和比较物对抗ATCC对照菌株的体外活性(包括检测菌组之外的ATCC对照菌株)
MHB为Mueller-Hinton肉汤；HTM为嗜血杆菌检测培养基；SBB为补充的Brucella肉汤。
实施例2
肽合成
化学品
被保护的氨基酸Boc-Trp-OH、Boc-Arg-OH、Boc-4-苯基-Phe和Ac-Arg-OH购自BachemAG，而Boc-4-碘苯丙氨酸、Boc-3，3-二苯基丙氨酸和Boc-(9-蒽基)丙氨酸购自Aldrich。除了N-乙基苄胺购自Acros之外，组成肽C-端的苄胺、2-苯基乙胺、3-苯基丙胺、(R)-2-苯基丙胺、(S)-2-苯基丙胺、N，N-甲基苄胺、N，N-乙基苄胺和N，N-二苄胺购自Fluka。二异丙基乙胺(DIPEA)、1-羟基苯并三唑(1-HOBt)、氯代三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐(PyCloP)和O-(苯并三氮唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)购自Fluka。4-正丁基苯基硼酸、4-叔丁基苯基硼酸、4-联苯硼酸、2-萘基硼酸、三邻甲苯基膦、苄基溴和乙酸钯购自Aldrich。溶剂购自Merck、Riedel-de或Aldrich。
氨基酸的制备
Boc-2，5，7-三-叔丁基色氨酸-OH的制备：将H2N-Trp-OH(1.8g，8，8mmol)和t-BuOH(4,7g，63,4mmol)在三氟乙酸(19mL)中的混合物于70℃搅拌3小时。将所得浅棕色(mid-brown)半透明溶液于室温下在旋转式蒸发器中30min以使体积减小，随后通过滴加60mL7％(按重量计)的NaHCO3来研制。随后将获得的灰色/白色粒状固体通过真空过滤回收并在室温下真空干燥24小时。从40％乙醇在水中的近沸混合物中通过结晶将产物分离。通常体积为大约20mL每克粗产物。
从粗产物一次结晶产生的分离产物相对于样品中所有其它物质的纯度(HPLC)为80％至83％并且相对于已知的TBT类似物的纯度大约为94％至95％。该阶段的收率为60％至65％。
Boc-4-碘苯丙氨酸的苄基化。将Boc-4-碘苯丙氨酸(1当量)溶于90％甲醇水溶液中并通过添加碳酸铯来中和直至pH为弱碱性(通过石蕊试纸测定)。将溶剂通过旋转蒸发来除去，并将Boc-4-碘苯丙氨酸铯盐中剩余的水通过用甲苯的重复共沸蒸馏来进一步降低。将所得干燥的盐溶于二甲基甲酰胺(DMF)中，添加苄基溴(1.2当量)并将所得混合物搅拌6h至8h。在反应的最后，减压除去DMF，形成含标题化合物的油状物。将该油状物溶于乙酸乙酯中并将所得溶液用等体积的柠檬酸溶液(三次)、碳酸氢钠溶液和盐水洗涤。通过使用二氯甲烷∶乙酸乙酯(95∶5)作为洗脱液的快速色谱分离标题化合物，其为浅黄色油状物，收率为85％。能够通过从正庚烷中重结晶而获得结晶状苄基Boc-4-碘苯丙氨酸。
用于Suzuki偶联的通用操作：将苄基Boc-4-碘苯丙氨酸(1当量)、芳基硼酸(1.5当量)、碳酸钠(2当量)、乙酸钯(0.05当量)和三邻甲苯基膦(0.1当量)添加至二甲氧基乙烷(6ml/mmol的苄基Boc-4-碘苯丙氨酸)和水(1ml/mmol的苄基Boc-4-碘苯丙氨酸)的脱气混合物中。将所得反应混合物保持在氩气下并加热至80℃持续4h至6h。当将混合物冷却至室温后，将其通过硅胶和碳酸钠的短垫来过滤。将滤饼进一步用乙酸乙酯洗涤。将滤液合并，并减压除去溶剂。通过使用乙酸乙酯和正己烷的混合物作为洗脱液的快速色谱来分离产物。
Boc-Bip(正丁基)-OBn的制备：使用用于Suzuki偶联的通用操作，从4-正丁基苯基硼酸制备标题化合物，收率为53％。使用乙酸乙酯∶正己烷为80∶20的洗脱液来分离Boc-Bip(正丁基)-OBn。
Boc-Bip(叔丁基)-OBn的制备：使用用于Suzuki偶联的通用操作，从4-叔丁基苯基硼酸制备标题化合物，收率为79％。使用乙酸乙酯∶正己烷为80∶20的洗脱液来分离Boc-Bip(叔丁基)-OBn。
Boc-Bip(4-苯基)-OBn的制备：使用用于Suzuki偶联的通用操作，从4-联苯硼酸制备标题化合物，收率为61％。通过将粗产物正庚烷中重结晶而分离Boc-Bip(4-苯基)-OBn。
Boc-Bip(4-(2-萘基))-OBn的制备：使用用于Suzuki偶联的通用操作，从2-萘基硼酸制备标题化合物，收率为68％。通过将粗产物从正庚烷中重结晶而分离Boc-Bip(4-(2-萘基))-OBn。
Boc-Bip(4-(1-萘基))-OBn的制备：使用用于Suzuki偶联的通用操作，从2-萘基硼酸制备标题化合物。通过将粗产物从正庚烷中重结晶而分离Boc-Bip(4-(1-萘基))-OBn。
用于苄基酯脱酯化的通用操作：将苄基酯溶于DMF中并使用10％的Pd/C作为催化剂于环境压力下氢化2天。在反应的最后，通过过滤除去催化剂并减压除去溶剂。通过从二乙醚中重结晶而分离游离酸。
Boc-Bip(4-正丁基)-OH的制备：将收率为61％的标题化合物使用用于脱酯化的通用过程从Boc-Bip(正丁基)-OBn中制备。
Boc-Bip(4-叔丁基)-OH的制备：使用用于脱酯化的通用操作，从Boc-Bip(叔丁基)-OBn制备标题化合物，收率为65％。
Boc-Bip(4-苯基)-OH的制备：使用用于脱酯化的通用操作，从Boc-Bip(4-苯基)-OBn制备标题化合物，收率为61％。
Boc-Bip(4-(2-萘基))-OH的制备：使用用于脱酯化的通用操作，从Boc-Bip(4-(2-萘基))-OBn制备标题化合物，收率为68％。
Boc-Bip(4-(2-萘基))-OH的制备：使用用于脱酯化的通用操作，从Boc-Bip(4-(2-萘基))-OBn制备标题化合物，收率为68％。
使用HBTU的溶液相肽合成的通用操作。根据以下通用操作通过使用Boc保护策略的分步氨基酸偶联在溶液中制备肽。将带有游离氨基的C-端肽(1eq)和Boc保护的氨基酸(1.05eq)和1-羟基苯并三唑(1-HOBt)(1.8eq)在添加至二异丙基乙基胺(DIPEA)(4.8eq)之前溶于DMF(2-4ml/mmol氨基组分)中。将混合物于冰上冷却并添加O-(苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)(1.2eq)。将反应混合物于环境温度下振荡1h至2h。将反应混合物用乙酸乙酯稀释并用柠檬酸、碳酸氢钠和盐水洗涤。真空除去溶剂，并使用95％TFA或无水甲醇中的乙酰氯于暗处将所得肽的Boc保护基去保护。
使用PyCloP的溶液相酰胺的形成。Boc-Arg-N(CH2Ph)2的合成。Boc-Arg-OH(1eq)、NH(CH2Ph)2(1.1eq)和PyCloP(1eq)在干燥DCM(通过氧化铝过滤)(2ml)和DMF(1ml)中的溶液。将溶液于冰上冷却，并在搅拌下添加DIPEA(2eq)。将溶液于室温下搅拌1h。将反应混合物蒸发，并在乙酸乙酯中再溶解，并用柠檬酸、碳酸氢钠和盐水洗涤。真空除去溶剂，并使用95％的TFA于暗处将所得肽的Boc保护基去保护。
肽的纯化和分析。将肽于Delta-Pak(Waters)C18柱(，15μm，25×100mm)上使用水和乙腈(均包含0.1％TFA)的混合物作为洗脱液的反相HPLC来纯化。将肽通过使用分析Delta-Pak(Waters)C18柱( ，5μm，3.9×150mm)的RP-HPLC和VGQuattro四极杆质谱仪上(VGInstrumentsInc.，Altringham，UK)的正离子电喷雾质谱来分析。
实施例3：对于胰蛋白酶降解的稳定性
检测通式为AA1-AA2-AA1-NHCH2CH2Ph的化合物的胰蛋白酶抗性和抗微生物活性。
肽半衰期的测量和计算
将每一肽溶于0.1M的NH4HCO3缓冲液(pH6.5)中以获得1mg/ml的最终肽浓度。通过将1mg的胰蛋白酶溶于50ml0.1M的NH4HCO3缓冲液(pH8.2)中来制备胰蛋白酶溶液。为了测定稳定性，将250μl新鲜制成的胰蛋白酶溶液和250μl肽溶液在振动台上于37℃在2ml的0.1MNH4HCO3缓冲液(pH8.6)中孵育。在不同时间间隔取样0.5ml等分，并用包含1％TFA的0.5ml水∶乙腈(60∶40v/v)稀释，并如上所述通过RP-HPLC进行分析。将在37℃于0h和20h后所取的未添加胰蛋白酶的样品作为阴性对照。将在分析的最初5小时期间内采集的样品于254nm的峰面积的积分用于生成τ1/2。将在最初24h期间内未显示降解的肽分类为稳定。
抗细菌分析
通过使用标准方法的ToslabAS，在金黄色葡萄球菌菌株ATCC25923、甲氧西林耐药性金黄色葡萄球菌(MRSA)菌株ATCC33591和甲氧西林耐药性表皮葡萄球菌(MRSE)菌株ATCC27626上进行MIC测定。Amsterdam，D.(1996)Susceptibilitytestingofantimicrobialsinliquidmedia(液体培养基中的抗微生物剂敏感性试验)，inAntibioticsinLaboratoryMedicine.4thed(Lorian，V.，Ed.)pp75-78，WilliamsandWilkinsCo，Baltimore。
表3被测量为半衰期(τ1/2)的AA1-AA2-AA1-NHCH2CH2Ph肽对胰蛋白酶的稳定性以及显示为MIC的抗细菌活性。
a将来自康奈尔大学的医学计算器用于计算半衰期。
b最低抑菌浓度
c金黄色葡萄球菌菌株ATCC25923
d甲氧西林耐药性金黄色葡萄球菌ATCC33591
e甲氧西林耐药性表皮葡萄球菌ATCC27626
f不在本发明范围内
实施例4化合物2的体内活性
使鼠皮肤被金黄色葡萄球菌或化脓性链球菌(Streptococcuspyogene)感染，随后以三小时的间隔进行总共三次治疗。在最后一次治疗后三小时，收集皮肤活组织检查切片并测定存在于皮肤样品中的菌落形成单位(CFU)的数目。将表示为菌落形成单位数/小鼠的结果示于附图1和2中。在实验1(附图1)中，将化合物2作为包含2％(w/w)化合物2的乳膏或凝胶的一部分应用于鼠皮肤。将不含化合物2的相同乳膏或凝胶用作阴性对照(安慰剂)。能够清楚地看到，当将包含化合物2的乳膏或凝胶应用于鼠皮肤时，CFU数目比阴性对照的CFU数目降低，这表明化合物2发挥了对金黄色葡萄球菌的抗微生物作用。载体乳膏或凝胶的性质无显著性影响。
在实验2(附图2)中，将化合物2以在1％或2％凝胶的两种不同浓度来应用。将安慰剂凝胶和已知的抗细菌剂“百多邦(bactroban)”用作对照。能够看到，在降低CFU的数目方面，包含化合物2的凝胶比安慰剂凝胶或百多邦更有效。包含2％的化合物2的凝胶比仅包含1％的化合物2的凝胶更有效。
实施例5在受感染指甲模型中化合物2对红色毛癣菌的离体效力
本研究的目的是测量用于治疗甲癣的化合物2的抗真菌效力(如在实施例1中所定义)并在使用人指甲的MedPharm’s体外TCCTTM感染指甲模型中将其与市售的罗霉乐(Loceryl)进行比较。
材料
检测物1为作为HCl盐的化合物2。参考物1为罗霉乐指甲油
表4：研究中使用的材料列表
材料 供应商
两性霉素B Sigma，UK
ATP标准品 Sigma，UK
BacTiter-GloTM PROMEGA，UK
乙醇 Fisher，UK
沙氏葡糖琼脂 Oxoid，UK
林格氏液 Oxoid，UK
盐酸特比萘芬 Hetero Labs Limited，India
Tween 80 Merck，Germany
检测系统
ChubTur系统
·ChubTur检测系统由MedPharm设计。
·使用红色毛癣菌作为检测真菌来设置ChubTur检测系统，其来源的详细资料描述如下。
·在环境温度下设置ChubTur检测系统。然而，最终细胞的孵育是在25℃±2℃。
红色毛癣菌
接种有红色毛癣菌的沙氏葡糖琼脂(SDA)斜面得自Cardiff大学。将培养物最初从甲癣患者中分离。收到之后，将生物于25℃在新鲜SDA斜面上次培养7天，并将参考样品置于甘油溶液中并低温冷冻。将生物每三个月次培养以保持活性。次培养后，将培养物于25℃储存7天，随后在2℃至8℃储存直至需要时。
方法
初步研究
化合物2的制备
使用10mg的化合物2在1ml去离子水中制备化合物2的饱和溶液。搅拌过夜后，将混合物以13,000rpm离心分离5min，并将所得上清液倾出并于2℃至8℃储存不超过14天。
安慰剂是单独的去离子水。
生物悬浮液的制备
沙氏葡糖琼脂的制备
简言之，将65g粉末状SDA添加至1L去离子水中。将混合物加热直至琼脂显著地的溶解。随后将其于121℃在高压釜中灭菌15min，冷却至56℃，然后将25ml转移至无菌的90mm培养皿。在使用前，在层流柜中将培养皿盖稍微半开(开口直径为1cm)放置30min。
林格氏液的制备
如SOP3080中所述制备林格氏液。随后将林格氏液于121℃在高压釜中灭菌15min。
红色毛癣菌悬浮液的制备
(i)通过使用无菌拭子从斜面培养基轻柔地除去菌丝体和孢子并将它们转移至琼脂表面而将红色毛癣菌植入90mmSDA板中。
(ii)随后将琼脂板于25℃孵育7天。
(iii)随后用林格氏液(20ml)将白色孢子从板的表面洗去。
(iv)随后将孢子悬浮液通过无菌纱布(Smith+Nephew，Propax，7.5cm×7.5cm8层纱布拭子，BP型13)过滤以除去菌丝体和琼脂碎片。
(v)进行孢子悬浮液的活菌计数，并通过相应地稀释或浓缩孢子而将20ml最终体积中的孢子计数调整为大约1×107cfu/ml。
指甲的制备
在将人末端指甲切成3mm×3mm的段之前，将指甲从冷冻柜中移出并置于层流柜中30min以在室温下进行平衡。此后，将指甲分别如下进行简单洗涤：
(i)将指甲浸入70％乙醇水溶液中并涡旋混合1min。
(ii)将乙醇溶液倾出并用新鲜的70％乙醇溶液替换并继续涡旋混合1min。
(iii)将乙醇溶液倾出并用林格氏液替换，涡旋混合1min并倾出并用新鲜的林格氏液替换。使用林格氏液洗涤的该工序进行三次，在每一阶段替换洗涤溶液。
(iv)一旦洗涤工序完成，将指甲置于无盖的无菌培养皿中并在室温下于层流柜中风干30min。
方法说明：ChubTur池
ChubTur池使用如下：
(i)制备指甲后，在将指甲装配入ChubTur池之前，使用卡尺测量每一指甲的厚度。
(ii)最初在指甲段的下侧用红色毛癣菌(5μL的1×107cfu/ml)接种，在层流柜中干燥，随后背侧向上安装在ChubTur池中。将接收器腔(体积为4.4cm3±0.24cm3)容量的一半填充无菌林格氏液。
(iii)随后将细胞在25℃±3℃孵育14天以使得指甲上的生物完全生长。
(iv)在第14天，将ChubTur池从孵育中除去并将10μL的化合物2和罗霉乐分别应用于用生物悬浮液接种的指甲一侧的对侧的表面。一旦将化合物2和罗霉乐应用于指甲表面，则将细胞返回至25℃±3℃的孵育。
(v)使用以24h的间隔向细胞给药5天的多剂量方案(表5)。给药之前，将指甲表面用无菌林格氏液洗涤，以从先前的剂量中除去过量化合物2和罗霉乐。一旦洗涤完成，根据表5中的给药方案，将新鲜的10μL剂量化合物2和罗霉乐应用于适当的细胞。
表5：待研究样品的概述
(vi)给药5天后，将可能存在的过量的化合物2和罗霉乐从指甲表面除去，并将指甲从ChubTur池的垫上拆除。随后分析指甲中来自活真菌的ATP的存在。
结果和讨论
干扰研究：制剂存在下的猝灭效应
通过将10μL的化合物2、罗霉乐和安慰剂添加至已知浓度的ATP校正标准品(n＝3)中并将其与单独的标准品(未含检测物)比较来检测来自检测物的任何猝灭效应。产生线性回归曲线，示出ATP校正标准品在10mg/mL至1000ng/mL的范围内浓度相对于发光单位的关系。在附图3中表示在各种基体(matrices)的存在下ATP标准品之间的比较。从图中能够看到，与单独的标准品相比，当将化合物2和罗霉乐添加至已知浓度的ATP标准品溶液(750ng/mL)中时，两制剂的吸收单位显示显著的降低，此时化合物2和罗霉乐示出猝灭效应。安慰剂未示出猝灭效应，因为在安慰剂和单独的标准品之间不存在显著的差异。
药物应用后的ATP恢复
附图4示出从应用检测物的受感染指甲样品(n＝3)中释放的ATP的变化以及它们与未处理的受感染的和未处理的未受感染的对照指甲样品(以n＝2检测对照品)的比较。应当指出，ATP恢复的量越低，检测物对检测生物的效力越高。能够从图中看到，未处理的受感染的对照品产生预期的高ATP恢复，而未处理的未受感染的对照产生非常低水平的ATP。还可以看到，与受感染的对照和安慰剂相比，化合物2和罗霉乐产生低的ATP恢复，这表明它们对检测生物的高效力。在安慰剂和未处理的受感染的对照之间无显著差异。
实施例6
制备本发明的其它化合物并获得对一系列细菌的最低抑菌浓度(MIC)值。
H-Arg-Tbt-Arg-NH(CH2)2(2-Br-苯基)
Boc-Arg-Tbt-Arg-OMe的皂化
将LiOH·H2O(373mg，8.9mmol)添加至BocArgTbtArg-OMe·2HCl(2.5g，2.9mmol，如在WO01/66147中所述的制备)在H2O(5ml)THF(20ml)混合物中的无色溶液中，并将反应于室温下搅拌30min，在此期间其迅速显示黄色。添加稀HCl(52ml)和饱和盐水(35ml)，并将所得混合物用DCM萃取。将DCM蒸发并将有机物质再溶解于DCM中，用Na2SO4干燥，过滤并浓缩。BocArgTbtArg-OH获得的质量为2.46g，93％。
PyBOP介导的偶联
将BocArgTbtArgCO2H(365mg，0.35mmol)的TFA盐在DMF(0.9ml)中与2-溴苯乙胺(53μl)混合，并添加DIPEA(120μl)。将反应混合物于室温下搅拌5min随后放置3小时，然后添加PyBOP(194mg，0.37mmol)。在处理之前，将混合物用EtOAc(20ml)稀释，并用2×30ml5％柠檬酸溶液、2×30ml5％NaHCO3溶液和30ml饱和盐水洗涤，随后用Na2SO4干燥，过滤并浓缩。分离粗产物，为油状物(432mg)，其含有来自偶联试剂的副产物。通过将粗产物溶于15ml1，4-二噁烷中的4MHCl中以除去Boc基团，将其于室温搅拌30min，然后通过反相层析浓缩和最终纯化。
纯度：＞95％；电喷雾质谱(m/z，质子化分子离子)：866.48/868.56(计算值)，866.5/868,5(观察值)。
微生物数据
最低抑菌浓度(mg/l)，
H-Arg-Tbt-Arg-NH-Y-Z
Y-Z 大肠杆菌 金黄色葡萄球菌 MRSA 化脓性链球菌
-(CH2)2-(2-BrPh) 6 3 3 3

Claims (6)

1.通式(II)的化合物：
AA1-AA2-AA1-X-Y-Z(II)
所述化合物选自：
2.权利要求1所述的化合物在制备抗细菌剂或抗真菌剂中的用途。
3.权利要求1所述的化合物作为抗细菌剂的非治疗目的的用途，所述非治疗目的用途包括处理环境或农业场所或产物，以及食品生产的食品和场所，或者表面或工具。
4.制剂，包含与适当稀释剂、载体或赋形剂混合的权利要求1所述的化合物。
5.如权利要求4所述的制剂，其为药物制剂。
6.如权利要求5所述的制剂，其适于局部给药。
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