CN111471670A

CN111471670A - 一种具有体外裂解活性的沙门氏菌宽谱裂解酶及其应用

Info

Publication number: CN111471670A
Application number: CN202010250320.8A
Authority: CN
Inventors: 庞茂达; 王冉; 孙利厂; 包红朵; 张辉
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2020-04-01
Filing date: 2020-04-01
Publication date: 2020-07-31
Anticipated expiration: 2040-04-01
Also published as: CN111471670B

Abstract

一种具有体外裂解活性的沙门氏菌宽谱裂解酶及其应用。本发明属于生物技术领域，具体涉及一种针对沙门氏菌的宽谱裂解酶及其抗菌应用；该裂解酶命名为LysMD19，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示,核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；该裂解酶能够在没有ETDA等细胞通透试剂的条件下直接在体外高效裂解沙门氏菌，并且对肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌等多种不同血清型的沙门氏菌均具有裂解作用，具有较好的温度稳定性及较强的耐酸碱能力，既可以用于防治沙门氏菌的感染，也可以用于对源头养殖场、加工、包装、运输到市场售卖等多个环节中沙门氏菌的杀灭，确保“从农场到餐桌”的安全，具有良好的应用前景和价值。

Description

一种具有体外裂解活性的沙门氏菌宽谱裂解酶及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种针对沙门氏菌具有体外裂解活性的宽谱裂解酶及其抗菌应用。

背景技术

沙门氏菌是一种革兰氏阴性杆菌，不仅是畜禽养殖中危害严重的致病菌，也是引起食物中毒的重要人畜共患病原菌。在全球范围内的各类细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒常居榜首，基于2006-2010年的统计数据显示，沙门氏菌是引发我国细菌性食源性疾病暴发事件的主要致病菌(70％-80％)，其中起主要致病作用的血清型为肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌，而引起沙门氏菌中毒的食品中，肉、蛋、奶等畜产品约占90％。因此，要解决沙门氏菌感染这一公共卫生问题，需要从源头养殖场、加工、包装、运输到市场售卖等多个环节对沙门氏菌进行检测和防控，确保“从农场到餐桌” 的安全。

噬菌体裂解酶(Lysin，又被称为endolysins和virolysin)是双链DNA噬菌体感染细菌的后期由噬菌体基因编码合成的一种细胞壁水解酶。裂解酶作为抗菌剂的优势主要体现在：噬菌体裂解酶作用的特异性，只作用于相应的靶细菌；裂解酶抗菌作用高效，纳克级的裂解酶即可迅速使细菌细胞破裂；裂解酶之间以及与抗生素之间具有协同抗菌作用，可联合使用；细菌对裂解酶不易产生抗性；噬菌体裂解酶作为一种酶类，不会对机体产生致病性，且裂解酶的抗体不会削弱其裂解杀菌作用；裂解酶可以基因工程化，实现规模化发酵生产。为了开发具有高效杀菌能力的裂解酶，研究人员做了大量的研究，目前针对金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、猪链球菌及李斯特菌等革兰氏阳性菌的裂解酶研究，已充分展现了裂解酶用于细菌感染治疗的巨大潜力。2013年，全球第一个噬菌体裂解酶产品gladskin上市，该产品主要用于辅助治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA) 引起的炎症性皮肤病。目前，针对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的裂解酶CF-301、 P128、SAL200及Staphyfekt SA.100等4种裂解酶已进入临床试验阶段，其中裂解酶 CF-301已完成人体的第一和第二期临床试验，如果获得成功，这可能会使裂解酶首次被认定为抗生素的替代品。

但是，相对于革兰氏阳性菌，因革兰氏阴性细菌的细胞外膜能够阻挡裂解酶与肽聚糖靶点的有效结合，裂解酶从外加入时不能裂解革兰氏阴性细菌，目前仍然缺乏针对革兰氏阴性菌的高效裂解酶。为了解决沙门氏菌感染问题，研究人员已表达出了Lys68、LysSTP4、SPN1S、gp146、Gp110、Lys394、PsP3gp10、LysT144等针对沙门氏菌的裂解酶，这些裂解酶在细胞膜通透试剂EDTA等的帮助下，可以有效裂解沙门氏菌；但遗憾的是，如果没有细胞通透剂的帮助，这些裂解酶均没有体外裂解活性，当作为抗菌药物直接杀灭细菌时无法发挥杀菌作用；而EDTA等细胞通透剂有一定毒性，对粘膜、上呼吸道等具有刺激作用，故此类裂解酶不适合作为抗菌药物、饲料添加剂等进行使用。因此，现在迫切需要开发出一种能够在体外直接高效裂解沙门氏菌的裂解酶，从而为沙门氏菌的防控提供一种安全、有效的新型抗菌药物。

发明内容

针对上述问题，本发明提供一种能够在体外不依赖于EDTA等细胞通透试剂而直接高效裂解沙门氏菌的宽谱裂解酶，该裂解酶能够全面、快速、无残留的杀灭沙门氏菌，该裂解酶可以单独作为药物或作为药物组合物或饲料添加剂与其他物质复配使用，既可以用于预防和治疗沙门氏菌的感染，也可以作为环境消毒剂用于从源头养殖场、加工、包装、运输到市场售卖等多个环节对沙门氏菌的杀灭，确保“从农场到餐桌”的安全。为解决以上技术问题，本发明采用如下技术方案：

首先，本发明提供了一种能够在体外直接高效裂解沙门氏菌的宽谱裂解酶，申请人将该裂解酶自命名为LysMD19，其是由如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质，编码该裂解酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

其次，本申请提供了氨基酸序列如SEQ ID NO.1所述的沙门氏菌裂解酶LysMD19在制备预防或治疗沙门氏菌感染的药物组合物中的应用。

第三，本申请提供了氨基酸序列如SEQ ID NO.1所述的沙门氏菌裂解酶LysMD19在制备预防或治疗沙门氏菌感染的饲料添加剂中的应用。

第四，本申请提供了氨基酸序列如SEQ ID NO.1所述的沙门氏菌裂解酶LysMD19在(非医药用途)杀灭食品或环境中沙门氏菌中的应用；该裂解酶可以单独或与其他物质复配作为生物杀菌剂用于从源头养殖场、加工、包装、运输到市场售卖等多个环节对沙门氏菌的杀灭和清除。如以无菌水稀释该裂解酶LysMD19(稀释后终浓度为1μM)，用以涂抹/喷施在食品或环境中(20mL/m²)以杀灭环境中沙门氏菌。

第五，本申请提供了包含氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示沙门氏菌宽谱裂解酶的药物组合物；该药物组合物进一步包含一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂等，如粉末计、颗粒剂、片剂、胶囊剂等；该药物组合物可口服给药、通过吸入喷雾给药、局部给药等医学上可使用的给药方式。

第六，本申请提供了包含氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示沙门氏菌宽谱裂解酶的饲料添加剂；进一步而言，该饲料添加剂还包括食品或饲料可接受的载体，该载体包括赋形剂、稀释剂、辅剂、媒介物或它们的组合经制剂工艺制备为片剂、丸剂、乳剂、胶囊剂、预混剂等饲料添加剂剂型。

第七，本申请提供了包含氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示沙门氏菌宽谱裂解酶的杀菌剂，该杀菌剂的对食品或环境中(非生物体内)的沙门氏菌进行消杀。该杀菌剂可以一次使用，也可以多次使用，当多次使用时，可以以间隔任意时间的方式施药。该杀菌剂在配置时，可以按照本领域技术人员所公知的方法，如《现代农药剂型加工技术》(刘广文)等工具书。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

(1)本发明提供的沙门氏菌裂解酶LysMD19，具有高效的体外抗菌活性(MIC介于2-4μg/mL)能够在没有ETDA等细胞通透试剂的帮助下直接在体外高效裂解沙门氏菌，突破了现有沙门氏菌裂解酶无法从体外裂解沙门氏菌的技术问题，杀菌效率高；现有裂解酶需要在细胞通透剂的帮助下起杀菌作用，而EDTA等细胞通透剂有一定毒性，不适合作为抗菌药物、饲料添加剂等进行使用；

(2)本发明提供的沙门氏菌裂解酶LysMD19属于宽谱裂解酶，能够裂解肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌、乙型伤寒沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌及猪霍乱沙门氏菌等多种不同血清型的沙门氏菌，裂解谱范围广；

(3)本发明提供的沙门氏菌裂解酶LysMD19可根据序列表中序列SEQ ID NO.2提供的核苷酸序列进行合成，并使用常规真核表达系统(如毕赤酵母表达系统)进行表达，便于发酵和规模化生产；

(4)本发明提供的沙门氏菌裂解酶LysMD19，无毒副作用，安全性高；可以单独作为药物或作为药物组合物或饲料添加剂与其他物质复配使用，用于预防和治疗沙门氏菌的感染，也可以单独或与其他物质复配作为生物杀菌剂用于从源头养殖场、加工、包装、运输到市场售卖等多个环节对沙门氏菌的杀灭和清除，应用范围广、应用价值高。

附图说明

图1毕赤酵母重组表达载体pPIC9K-LysMD19的酶切验证。

图2裂解酶LysMD19诱导表达后的SDS-PAGE。

图3裂解酶LysMD19的抑菌圈。

图4沙门氏菌的扫描电镜观察结果，图A和B分别代表未经和经过LysMD19处理的沙门氏菌样品。

图5裂解酶LysMD19的热稳定性分析。

图6裂解酶LysMD19的PH定性分析。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

下述实施例中涉及的菌株:肠炎沙门氏菌(ATCC6539、ATCC13076)、鼠伤寒沙门氏菌 (ATCC13311、ATCC29631)、、鸡白痢沙门氏菌(CVCC533、CVCC 514)、猪霍乱沙门氏菌(CMCC50018、CMCC50191)、甲型副伤寒沙门氏菌(CICC21501)、乙型副伤寒沙门氏菌(CMCC50094)分别购于美国典型培养物保藏中心(ATCC)、中国医学细菌保藏管理中心(CMCC)及中国兽医微生物菌种保藏管理中心(CVCC)，沙门氏菌临床分离株SX1419、SX1403、SX1407、SX1428、SM-61-KDE、SM2017029、SM1428、SM-ZQ-18X、SM1403、SM-ZQ-14N 及毕赤酵母菌GS115由江苏省细菌耐药与噬菌体工程研究中心保存。

下述实施例中所用的培养基及化学试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1 LysMD19基因的克隆、重组表达载体及表达菌株的构建

本研究室分离了大量的沙门氏菌噬菌体，通过对这些噬菌体杀菌活性及宿主谱等特性的分析，发现一株沙门氏菌噬菌体(自命名为vB_SenS_MD1)具有广谱的杀菌活性，推测该噬菌体编码的裂解酶(申请人自命名为裂解酶LysMD19，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)能够发挥广谱杀菌活性，因此对该裂解酶进行了后续研究：

LysMD19基因的克隆：PCR条件均为：先95℃5分钟；后进入循环，95℃30秒， 55℃30秒，72℃30秒，共30个循环；最后72℃10分钟。反应结束后，使用1％琼脂糖凝胶电泳检测片段，如果出现目的条带(目的条带约为530bp)，则用胶回收试剂盒回收PCR产物，送至测序公司进行测序后保证所扩增的目的基因(SEQ ID NO.2)完全正确。在实际应用中，也可以根据SEQ ID NO.2提供的序列对该基因进行人工合成。

重组表达载体pPIC9K-LysMD19的构建：用限制性核酸内切酶EcoR Ⅰ和Not Ⅰ对上步所获得的PCR产物和质粒pPIC9K-His进行双酶切，双酶切后用T4 DNA连接酶进行连接，连接条件为4℃静置过夜。将连接产物转化入大肠杆菌感受态细胞DH5α中，步骤为：待感受态细胞融化后，加入重组质粒并用手拨打EP管底部，轻轻混匀，在冰中静置30分钟。42℃水浴热击45s，迅速放回冰上并静置两分钟。向离心管中加入900μL 不含抗生素的LB液体培养基，混匀后37℃200rpm振荡培养60min。随后以5000rpm 离心1min收取菌体，留约150μL左右上清重悬菌体。取重悬液涂布于带有氨苄抗性 (终浓度50μg/mL)的LB平板筛选阳性克隆。对阳性克隆菌株通过PCR进行鉴定，随后挑取阳性克隆菌株转接至5ml LB液体培养基中，用质粒提取试剂盒抽提质粒，使用 EcoR Ⅰ和Not Ⅰ进行酶切鉴定，并将质粒送去测序公司进行测序。结果如图1所示，重组表达载体pPIC9K-LysMD19和空质粒pPIC9K-His酶切后条带大小正确，测序结果与序列表中SEQ ID NO.2完全相同，说明重组表达载体构建正确。

毕赤酵母重组表达菌株的构建：将重组表达质粒使用Sal Ⅰ在37℃条件下酶切使质粒线性化，然后使用硅基质膜吸附柱回收线性化的质粒；在80μL GS115酵母感受态细胞中加入线性化的重组质粒5μg，用移液枪吹打混匀，在冰上放置15分钟，迅速加入冰预冷的0.2cm电转化杯中，轻轻将液体震到杯底，立即冰浴20min；设定电转化参数：电压2000V、电容25μF、电阻200Ω，并进行电转，电转后立即加入1mL 冰预冷的1M山梨醇，迅速混合均匀,置于30度静置培养1h；离心收集菌体，弃掉850 微升上清液，取150μL上述菌液涂布在YNB平板上，在30℃恒温培养箱中倒置培养 2-3天，直至菌落直径约1mm，用接种环挑取单克隆菌落在MM平板及MD平板上划线，在30℃恒温培养箱中倒置培养2天，计数平板，寻找在MD平板上正常生长而在MM平板上菌落很小或者是没有出现菌落的菌株，该菌株为Mut^s型，其余为Mut⁺型，随后对Mut^s型单克隆菌株进行PCR鉴定并测序，获得毕赤酵母重组表达菌株。

毕赤酵母菌表达体系为本领域成熟发酵菌株和表达质粒，也可通过市售途径获得，如上海北诺生物科技有限公司等提供的酵母表达体系。此外，本实施例中获得毕赤酵母重组表达菌株的方法同样为本领域常规方法，实际应用中，也可以使用本领域其他公开方法获得毕赤酵母重组表达菌株。

实施例2裂解酶LysMD19的诱导表达及纯化

裂解酶LysMD19的诱导表达:用接种环挑取重组表达菌株单菌落，置于装有25mLBMGY液体培养基的250mL锥形瓶中，于30℃、220rpm条件下振荡培养至OD600约为 2；室温下5000g离心5min，用BMMY液体培养基重悬菌体，使OD600＝1.0左右，将菌液置于1L的摇瓶中，于30℃、220rpm条件下振荡培养；每隔12h向培养基中添加分析纯级的甲醇至终浓度为1.0％；按照24h、48h、72h等时间点进行取样，收集上清，并使用0.22μm的滤器进行过滤，用以分析酵母表达液上清中目的蛋白的表达量。结果表明，重组表达菌株在诱导48h后表达量达到最高值，如图2所示，在18kDa大小处出现目的条带(泳道1-3，泳道M为Marker)，而空表达载体(泳道4)对照组未在该处出现目的条带，说明裂解酶LysMD19在毕赤酵母菌中得到了成功的表达，经过测定酵母表达产物的蛋白表达量最高可达到280μg/mL左右，随后通过镍柱对裂解酶进行纯化。

本实施例纯化裂解酶的方法为本领域常规方法，在具体应用中，也可以使用其他方法对裂解酶LysMD19进行纯化而实现相同的发明目的。

实施例3裂解酶LysMD19的裂解谱分析

试验选择20株不同血清型的沙门氏菌作为试验对象，其中10株为标准对照株，其它10 株为临床分离株，具体操作如下：分别取100μL培养至对数期的沙门氏菌菌液，滴加在TSB固体培养基中央，用涂布棒将它们涂制成均匀的菌苔。然后取10μL裂解酶 LysMD19(浓度为1μM)滴加在菌苔表面，待液滴干燥后倒置于37℃培养12h，观察结果，LysMD19所形成的抑菌圈如图3所示，图3中LysMD17、LysMD18、LysMD19均为申请人表达的自命名的噬菌体裂解酶。裂解酶LysMD19处理后的鼠伤寒沙门氏菌 ATCC13311扫描电镜观察结果如图4B所示，菌体表面出现了孔洞等损伤，而未处理的沙门氏菌菌体表面完整(图4A)，说明LysMD19可以穿透破坏沙门氏菌细胞外膜。LysMD19 的裂解谱结果如表1所示：

表1裂解酶LysMD19的裂解谱

注：“+”表示可形成透亮的抑菌斑；“±”表示可形成不透亮的空斑，12h后抑菌斑中有部分细菌菌落形成。

由表1可见，裂解酶LysMD19对20株沙门氏菌均有裂解作用，对其中的18株沙门氏菌裂解效果较好，可形成透亮的抑菌斑，裂解率为90％，说明该裂解酶是一种宽谱裂解酶，能够对多种不同血清型的沙门氏菌起到裂解作用。

实施例4裂解酶LysMD19的最小抑菌浓度分析

参照(NCCLS)推荐的微量肉汤稀释法，测定裂解酶LysMD19对肠炎沙门氏菌(ATCC13076)、鼠伤寒沙门氏菌(ATCC13311)、鸡白痢沙门氏菌(CVCC533)、猪霍乱沙门氏菌(CMCC50018)等菌株的最小抑菌浓度。具体操作步骤如下：首先，在96孔板中将裂解酶LysMD19初始浓度调整至64μM，进行倍比稀释；随后取处于对数生长期的细菌，调整细菌浓度至OD600约0.2，经1：100稀释后，每孔100μL接种于96孔板，并以PBS为阴性对照组；将96孔板置于37℃培养箱中孵育12h后取出，用多功能酶标仪测量培养液的OD600值，将能完全抑制菌体生长的最低浓度确定为最小抑菌浓度，重复3次，取平均值为最终最小抑菌浓度结果。结果表明，裂解酶LysMD19对肠炎沙门氏菌(ATCC13076)、鼠伤寒沙门氏菌(ATCC13311)、鸡白痢沙门氏菌(CVCC533)、猪霍乱沙门氏菌(CMCC50018)等4株沙门氏菌的最小抑菌浓度0.125-0.5μM(2.27-9.08 μg/mL)，说明裂解酶LysMD19的抑菌效果良好。

实施例5温度对裂解酶LysMD19活性的影响

将裂解酶LysMD19置于不同温度下(10-100℃)，处理30min后调整至室温；将处于对数生长期的鼠伤寒沙门氏菌ATCC13311培养至对数生长期后，将细菌浓度调节至 OD600约为0.6，随后分别取不同温度处理的裂解酶LysMD19加入细菌菌悬液中(裂解酶终浓度为1μM)，在37℃温箱中孵育2h后，用多功能酶标仪测定各处理组的OD600，裂解酶的活性以各处理组OD600下降值除以OD600最大下降值的百分比来表示。结果显示在10℃处理组，OD600下降值最大，裂解酶活性最佳，如图5所示，裂解酶LysMD19 在20℃、30℃处理组中活性基本不下降，在40-60℃处理组中能保留80％以上的活性，当温度为90℃，裂解酶仍能保留约50％的活性，说明裂解酶LysMD19具有较好的温度稳定性。

实施例6酸碱度对裂解酶LysMD19活性的影响

将裂解酶LysMD19置于不同pH(2.0-12.0)条件下的磷酸钾缓冲液，30℃处理1 h；将处于对数生长期的鼠伤寒沙门氏菌ATCC13311培养至对数生长期后，将细菌浓度调节至OD600约为0.6，随后分别取不同PH条件处理的裂解酶LysMD19加入细菌菌悬液中(裂解酶终浓度为1μM)，在37℃温箱中孵育2h后，用多功能酶标仪测定各处理组的OD600，裂解酶的活性以各处理组OD600下降值除以OD600最大下降值的百分比来表示。结果显示在pH8.0处理组，OD600下降值最大，裂解酶活性最佳，如图6所示，裂解酶LysMD19在pH3.0-10.0的条件下，活性能够保留80％以上，说明裂解酶LysMD19 具有较好的酸碱耐受能力。

实施例7裂解酶LysMD19的细胞毒性分析

选择HEp-2细胞用于测定裂解酶LysMD19的细胞毒性，试验参考CytoTox96试剂盒的说明书，通过测定裂解酶作用于细胞后，细胞乳酸脱氢酶(lacticdehydrogenase, LDH)的释放量来确定裂解酶对细胞是否具有毒性。首先将HEp-2细胞分别按每孔2.5 ×10⁴的细胞量培养于96孔细胞培养板中，待细胞长成单层后以PBS洗涤细胞3次后，加入50μLMEM待用。试验在96孔细胞培养板中进行，共设置以下4组试验孔：裂解酶试验孔(每孔细胞中加入50μL裂解酶(终浓度为1μM)、靶细胞自发LDH释放孔 (向每孔细胞中加入50μLMEM培养基)、靶细胞最大LDH释放孔(向每孔细胞中加入50μLMEM培养基)及培养基背景对照孔(向空白孔中加入100μLMEM培养基)。将所有试验组处理完后，将细胞培养板置于30℃，5％CO2环境中培养3h，在培养结束前45min，将10μL裂解液加入到靶细胞最大LDH释放孔中。培养3h后，每孔取出 50μL培养上清液转移至新的96孔细胞板中，随后向含有上清液的细胞培养板中每孔加入50μL配置好的底物，室温避光作用30min。最后向每孔中加入50μL终止液，测定每孔液体的OD490，计算每个处理组的细胞毒性。结果显示，裂解酶试验孔和靶细胞自发LDH释放孔的OD490无显著性差异，说明裂解酶LysMD19对HEp-2细胞无细胞毒性。可以用于饲料添加剂、制备预防或治疗沙门氏菌感染的药物组合物以及消杀食品环境中的沙门氏菌。

实施例8裂解酶LysMD19作为生物杀菌剂清除养殖环境中的沙门氏菌污染实验

将1mL浓度为10⁵CFU/mL的鼠伤寒沙门氏菌ATCC13311均匀涂抹在肉鸡养殖场料槽表面，随后使用以无菌水稀释的裂解酶LysMD19(稀释后终浓度为1μM)对料槽(20 mL/m²)实施喷杀，喷杀3h和5h后，使用平板计数法对料槽表面的沙门氏菌数量进行统计，同时以无菌水喷杀组作为对照。结果表明，使用裂解酶作为杀菌剂喷杀3h后，料槽表面沙门氏菌的数量降到100CFU以下，喷杀5h后，料槽表面沙门氏菌的数量下降到10CFU以下，基本将沙门氏菌清除干净，而无菌水对照组在喷杀5h后，CFU数量仍高于50000CFU，说明裂解酶LysMD19作为生物杀菌剂能够有效清除养殖环境中的沙门氏菌。

序列表

<110> 江苏省农业科学院

<120> 一种具有体外裂解活性的沙门氏菌宽谱裂解酶及其应用

<141> 2020-04-01

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 163

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Leu Trp Ile Tyr Thr Val Lys Ile Asn Val Ser Phe His Ser Thr

1 5 10 15

Ser Val Phe Gln Pro Leu Ile Glu Glu Ile Glu Gly Val Lys Tyr Lys

20 25 30

Pro Tyr Lys Asp Ile Ala Gly Ile Trp Thr Val Cys His Gly Ile Thr

35 40 45

Gly Lys Asp Val Ile Leu Gly Lys Glu Tyr Thr Arg Arg Glu Cys Asp

50 55 60

Ala Leu Leu Ala Lys His Met Lys Val Ala Ala Asp Ala Val Asp Lys

65 70 75 80

Ala Val Lys Val Glu Ile Pro Leu Ser Met Arg Ala Ala Leu Tyr Ser

85 90 95

Phe Thr Phe Asn Ala Gly Thr Gly Ala Phe Arg Lys Ser Thr Arg Asn

100 105 110

Gln Pro Pro Leu Asn Met Arg His Val Ser Leu Val Leu Ile Trp Leu

115 120 125

Ile Val Val Ile Gly Leu Leu Cys Val Ile Gly Tyr Arg Thr Leu Gly

130 135 140

Met Gln Ala Val Val Leu Ile Lys Asp Thr Arg Thr Val Gly Leu Lys

145 150 155 160

Asn Ser Tyr

<210> 2

<211> 492

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgctttgga tatacactgt caagataaat gtcagcttcc attctacgtc tgtttttcag 60

cctttgattg aagaaattga gggcgtaaag tataagcctt acaaggatat tgctggaatc 120

tggacggtat gccacggcat taccggaaag gatgtgattc ttggaaagga atataccagg 180

cgagaatgtg acgcgctatt agcaaaacac atgaaagtag cggctgacgc tgttgataag 240

gcggttaagg ttgaaattcc tttatcaatg cgagcggctc tgtactcatt cacttttaat 300

gctggtactg gcgcgtttcg taagtcaacc agaaatcaac caccactgaa tatgaggcat 360

gtgtctcttg tacttatctg gctaatagtg gtgattggac tgctgtgtgt tataggttat 420

cggactttag gtatgcaggc ggtggtgtta ataaaggata ccagaaccgt agggctaaag 480

aacagttact ga 492

Claims

1.一种具有体外裂解活性的沙门氏菌宽谱裂解酶，该裂解酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

2.一种编码如权利要求1所述沙门氏菌宽谱裂解酶的基因，其核苷酸序列如SEQ ID .2所示。

3.如权利要求1所述的沙门氏菌宽谱裂解酶在制备预防或治疗沙门氏菌感染的药物组合物中的应用。

4.如权利要求1所述的沙门氏菌宽谱裂解酶在制备预防或治疗沙门氏菌感染的饲料添加剂中的应用。

5.如权利要求1所述的沙门氏菌宽谱裂解酶在杀灭食品或环境中沙门氏菌中的应用。

6.一种包含氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示沙门氏菌宽谱裂解酶的药物组合物。

7.一种包含氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示沙门氏菌宽谱裂解酶的饲料添加剂。

8.一种包含氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的生物杀菌剂。