CN112707961A

CN112707961A - 一种贝类抗菌肽p-amp153及其应用

Info

Publication number: CN112707961A
Application number: CN202110156857.2A
Authority: CN
Inventors: 毛帆; 张扬; 喻子牛
Original assignee: South China Sea Institute of Oceanology of CAS
Current assignee: South China Sea Institute of Oceanology of CAS
Priority date: 2021-02-04
Filing date: 2021-02-04
Publication date: 2021-04-27
Anticipated expiration: 2041-02-04
Also published as: CN112707961B

Abstract

本发现公开了一种贝类抗菌肽P‑AMP153及其应用。贝类血浆抗菌肽P‑AMP153，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明首次从香港牡蛎的血浆中分离出一个天然抗菌肽，用其进行抑菌试验证实其具有较好的清除细菌的作用，可用于抵抗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌或真菌的感染。本发明的抗菌肽不仅对溶藻弧菌、副溶血弧菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、多重耐药的白色念珠球菌均具有较强的杀死作用，而且具有较低的细胞毒性，抗菌活性强，具有高效广谱抑菌作用。本发明中的P‑AMP153可作为抗生素替代品使用，在医疗卫生、农业生产、食品工业等方面具有重要价值。

Description

一种贝类抗菌肽P-AMP153及其应用

技术领域：

本发明属于应用海洋生物技术领域，具体涉及一种新型贝类天然抗菌肽P-AMP153及其广谱抗药性和低生物毒性。

背景技术：

抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)是一类广泛存在于自然界生物体内的小分子多肽物质，对多种细菌、真菌、病毒和寄生虫均具有较好的抑制或者杀伤作用。抗菌肽具有广谱抗菌活性、不易产生耐药性、无残留等特点，是一种潜在的优质抗生素替代品。

贝类是我国重要的经济养殖动物，香港牡蛎(Crassostreahongkongensis)属于软体动物门、双壳纲、珍珠贝目、牡蛎科动物，在沿海经济社会发展中举足轻重。此外，香港牡蛎作为无脊椎动物，依赖于先天性免疫系统抵抗病原入侵，其中包含了部分已知和大量未知的抗菌肽，是一个丰富的天然抗菌肽资源库。

发明内容：

本发明的第一个目的是提供一种新型贝类天然抗菌肽P-AMP153。

本发明的新型贝类天然抗菌肽P-AMP153，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ IDNO.1 所示，具体为：Met-Asp-Ala-Ile-Lys-Lys-Lys-Met-Leu-Ala-Met-Lys-Met-Glu-Lys。

本发明的第二个目的是提供上述贝类抗菌肽P-AMP153在制备抗细菌或真菌药物中的应用。

所述的细菌是革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌。

所述的革兰氏阴性菌是大肠杆菌、溶藻弧菌或副溶血弧菌。

所述的革兰氏阳性菌是金黄色葡萄球菌。

所述的真菌是白色念珠球菌。

本发明的第三个目的是提供一种抗细菌或真菌药物，含有上述的贝类抗菌肽P-AMP153 作为活性成分。

本发明从香港牡蛎中分离了一个15个氨基酸的多肽，通过杀菌能力和动物细胞毒性分析，发现其对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和真菌均具有显著的清除能力，是一种新型的贝类天然抗菌肽P-AMP153。此外，动物细胞实验证实贝类天然抗菌肽P-AMP153的最小杀菌浓度不会引起细胞凋亡和炎症反应。本发明中的P-AMP153具有强烈的杀菌作用，且无细胞和生物毒性，与市面上用于食品、药品、饲料工业以及化妆品的合成添加剂相比，是一个开发潜力较高的天然抗菌肽。

附图说明：

图1.抗菌肽P-AMP153的结构和螺旋轮。氨基酸组成用单字母符号表示，分别为Lys(K)、 Met(M)、Leu(L)、Ile(I)、Ala(A)、Asp(D)。基团着色键：黄色和灰色代表非极性疏水性氨基酸；蓝色代表碱性和带电氨基酸；红色代表酸性氨基酸。箭头表示疏水方向。

图2.不同浓度的抗菌肽P-AMP153对微生物的清除能力。E.coli：Escherichiacoli，大肠杆菌，革兰氏阴性细菌；V.alginolyticus：Vibrio alginolyticus，溶藻弧菌，革兰氏阴性细菌； V.parahaemolyticus：VibrioParahaemolyticus，副溶血弧菌，革兰氏阴性细菌；S.aureus： Staphylococcus aureus，金黄色葡萄球菌，革兰氏阳性细菌；C.albicans：Canidiaalbicans，白色念珠球菌，真菌。

图3.根据LB琼脂平板培养基的菌落数变化，分析天然抗菌肽P-AMP153的最小抑制浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)。

图4.抗菌肽P-AMP153刺激条件下，动物细胞内LDH的释放和IL-1α的产生，表明天然抗菌肽P-AMP153对动物细胞的低毒性，且不会引起炎症反应。

图5.P-AMP153对小鼠气管灌注后的存活率，所测试的三个浓度均不影响小鼠的存活。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：

1.抗菌肽序列提取和鉴定

离心富集中国香港牡蛎血浆蛋白，具体步骤如下：(1)从十只中国香港牡蛎的围心腔中抽取血淋巴液，转移至离心管中；(2)4℃，1000×g离心5min，吸取上清转移至新管；(3)按体积稀释比加入终浓度为1×的Coktail(含EDTA)，置于冰上5min后，加入终浓度10mMDTT，涡旋震荡1min后25,000g离心15min，取上清液即为多肽提取液；(4)血浆多肽的测序由华大基因公司完成；(5)对多肽测序的结果进行抗菌能力预测，其中抗菌肽P-AMP153最具抗菌潜力，其氨基酸序列为：Met-Asp-Ala-Ile-Lys-Lys-Lys-Met-Leu-Ala-Met-Lys-Met-Glu-Lys。其肽结构和螺旋轮如图1所示，具有较强的疏水性。

2.天然抗菌肽P-AMP153的细菌清除能力分析

抗菌肽对细菌的抑制能力采用涂平板法，具体操作如下：(1)在相应培养条件下对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和真菌摇菌，培养至OD600为0.2；(2)通过低速离心收集细菌，然后用Tris缓冲液(50mM，pH 8.0)洗涤3次，然后重悬于1mL PBS中以进行后续分析；(3)在室温下，用准备好的细菌与不同浓度(0、0.5、1、2、5、10、20和50μM)的抗菌肽P-AMP153共同孵育2h；(4)将50μL抗菌肽和细菌的混合液接种于LB琼脂平板上过夜培养，对平板上的菌落数进行计数。

结果如图2和3所示，抗菌肽P-AMP153对革兰氏阴性菌的最小抑制浓度(Minimuminhibitory concentration，MIC)位于1-10μM，最小杀菌浓度(minimumbactericidalconcentrations)位于10-20μM。对革兰氏阳性菌，如对金黄色葡萄球菌的MIC位于1-5μM，MBC位于10-20 μM。对真菌的清除能力，如对白色念珠球菌的MIC位于1-10μM，MBC位于10-20μM。

3.天然抗菌肽P-AMP153的动物细胞毒性分析

天然抗菌肽P-AMP153与动物细胞HEK293共孵育，具体操作如下：(1)HEK293T细胞培养于含10％胎牛血清以及10％双抗的DMEM培养基，培养的条件为37℃，5％CO2，饱和湿度，维持单层贴壁生长；(2)细胞在无血清条件下培养过夜，用抗菌肽P-AMP153(20uM)处理；(3)24h后，通过测定乳酸脱氢酶(LDH)的释放量来评估P-AMP153对细胞的毒性。

结果如图4A所示，抗菌肽P-AMP153对动物细胞低毒性。

4.天然抗菌肽P-AMP153对动物细胞促炎症反应的分析

天然抗菌肽P-AMP153与动物细胞J774共孵育，具体操作如下：(1)肺泡巨噬细胞J774 在含10％胎牛血清以及10％双抗的DMEM培养基中，培养的条件为37℃，5％CO₂，饱和湿度，维持单层贴壁生长；(2)细胞在无血清培养基中孵育过夜，用抗菌肽P-AMP153(20uM)处理24小时；(3)用ELISA试剂盒检测细胞因子IL-1α的水平。

结果如图4B所示，抗菌肽P-AMP153不会引起炎症反应。

5.天然抗菌肽P-AMP153对小鼠的毒性分析

小鼠气管灌注多肽P-AMP153(多肽的溶剂为PBS)，每只注射50μL。对照组小鼠注射50μLPBS，6小时后再次灌注；以二次灌注后的时间为起始时间，持续观察24h小时，记录每组小鼠，死亡数量和死亡时间。实验组设置如表1所示，，分别为3组实验组，加上对照共 4组，每组10只小鼠。

表1小鼠气管灌注方案

序号	预设浓度	注射体积	对应的注射液浓度	一只小鼠的体重	注射浓度(mg/kg)
						1	10uM	50ul	0.018mg/mL	20g	0.045mg/kg
2	100uM	50ul	0.18mg/mL	20g	0.45mg/kg
						3	1000uM	50ul	1.8mg/mL	20g	4.5mg/kg

结果如图5所示，抗菌肽对实验小鼠没有致死性的毒性。

序列表

<110> 中国科学院南海海洋研究所

<120> 一种贝类抗菌肽P-AMP153及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 15

<212> PRT

<213> 香港牡蛎(Crassostrea hongkongensis)

<400> 1

Met Asp Ala Ile Lys Lys Lys Met Leu Ala Met Lys Met Glu Lys

1 5 10 15

Claims

1.一种贝类抗菌肽P-AMP153，其特征在于，其氨基酸序列为：Met-Asp-Ala-Ile-Lys-Lys-Lys-Met-Leu-Ala-Met-Lys-Met-Glu-Lys。

2.根据权利1所述的贝类抗菌肽P-AMP153在制备抗细菌或真菌药物中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的细菌是革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的革兰氏阴性菌是大肠杆菌、溶藻弧菌或副溶血弧菌。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的革兰氏阳性菌是金黄色葡萄球菌。

6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的真菌是白色念珠球菌。

7.一种抗细菌或真菌药物，其特征在于，含有权利要求1所述的贝类抗菌肽P-AMP153作为活性成分。