CN115974970A - 一种具有广谱抗菌性能的短链抗菌肽及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种具有广谱抗菌性能的短链抗菌肽及其应用，抗菌肽的氨基酸序列为LKAPI，该抗菌肽具有序列短、广谱抗菌活性、低毒性、无溶血毒性的特点。本发明的抗菌肽可用于制备抗菌水凝胶，其对耐药菌(大肠杆菌、金黄葡萄球菌、表皮葡萄球菌、枯草芽孢杆菌)及真菌(白色念球菌)的抗菌效果较好。本发明的抗菌肽分子量小，化学合成难度小，具有热稳定性好、合成方便等优点，大幅降低了生产成本，且具有良好的生物安全性，不易引起耐药性，其有望成为新型抗生素的候选药物，在临床抗菌药物中具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物医用功能材料及技术领域，具体而言，是一种具有广谱抗菌性能的新型短链抗菌肽及其应用。
背景技术
近几年来，由于抗生素药物的滥用，越来越多的超级细菌对抗生素产生了耐药性并逐渐发展为“超级细菌”。细菌耐药性、药物残留和环境污染等问题日渐严重，对此人们迫切寻求也可以替代传统抗生素的药物。抗菌肽(Antimicrobial peptides，AMPs)是生物体防御外界病原体侵袭时产生的由基因编码、核糖体合成的一类小分子活性多肽，是生物体内先天性防御系统的重要组成成分。抗菌肽(AMPs)作为常规抗生素的潜在替代品从而引起了极大的关注，抗菌肽具有良好的生物相容性，且抗菌肽能凭借独特的膜破坏和多靶向抗菌机制，主动杀死抗生素耐药微生物，使细菌等不产生耐药性。
虽然天然抗菌肽具有普遍的优点，但也存在着某些明显的不足。例如，相当一部分天然的抗菌肽抑菌活性较低、稳定性较差、毒性较高或导致真核细胞发生溶血等；另外，部分抗菌肽对耐药菌的抑制效果差，不能满足实际应用的要求。通过对天然抗菌肽进行改造或全新合成得到的人工抗菌肽可以在很大程度上改善以上缺点，以适应不同应用需求。
目前开发的抗菌肽中，具有较好抗菌性的抗菌肽氨基酸序列都较为繁琐，生产成本高，细胞毒性相对也会较高。简单的抗菌肽抗菌性能都有所偏差，不能做到广谱抗菌等特性，尚无具有氨基酸序列短和抗菌性能优良同时具备的抗菌肽，给临床大规模应用带来了不便。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有广谱抗菌性能的短链抗菌肽及其应用。
本发明目的技术方案是：
一种具有广谱抗菌性能的短链抗菌肽，其氨基酸序列为LKAPI。
所述的短链抗菌肽在制备抑制革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和真菌药品中的应用。
所述的应用，所述的菌包括革兰氏阴性菌、革兰氏阴性菌、白色念球菌。
所述的应用，所述真菌为白色念珠菌。
所述的应用，所述抗菌肽对白色念珠菌的最小抑菌浓度为50μg/mL。
所述的应用，所述抗菌肽对枯草芽孢杆菌的最小抑菌浓度为125μg/mL。
所述的应用，所述抗菌肽对大肠杆菌的最小抑菌浓度为150μg/mL。
所述的应用，所述抗菌肽对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为200μg/mL。
所述的应用，所述抗菌肽对表皮葡萄球菌的最小抑菌浓度为400μg/mL。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
(1)本发明的抗菌肽具有广谱抗菌性，能抑制革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和真菌。所述抗菌肽对白色念珠菌的最小抑菌浓度为50μg/mL。所述抗菌肽对枯草芽孢杆菌的最小抑菌浓度为125μg/mL；所述抗菌肽对大肠杆菌的最小抑菌浓度为150μg/mL；所述抗菌肽对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为200μg/mL；所述抗菌肽对表皮葡萄球菌的最小抑菌浓度为400μg/mL；
(3)通过本发明制备的抗菌肽具有明显的促进伤口愈合的功效，伤口在第9天就基本愈合。
(4)通过本发明制备的抗菌肽具有显著的治疗真菌感染的功效，在生物医学领域显示出巨大的潜力。
(5)通过本发明制备的抗菌肽生物相容性较好，细胞毒性低，且不使细菌产生耐药性，更利于临床应用。
附图说明
图1是实施例1所得的广谱抗菌性能的新型短链抗菌肽扫描电镜图；
图2是实施例1所得的抗菌肽对白色念球菌最小抑菌浓度图；
图3是实施例1所得的抗菌肽对枯草芽孢杆菌最小抑菌浓度图；
图4是实施例1所得的抗菌肽对大肠杆菌最小抑菌浓度图；
图5是实施例1所得的抗菌肽对金黄色葡萄球菌最小抑菌浓度图；
图6是实施例1所得的抗菌肽对表皮葡萄球菌最小抑菌浓度图；
图7是实施例1所得的广谱抗菌性能的新型短链抗菌肽溶血数据图；
图8、9是实施例1所得的广谱抗菌性能抗菌肽的细胞毒性数据，图8正常细胞存活率数据；图9细胞活死数据，由图可知，在该微球孵育中的细胞存活率良好，无细胞毒性；
图10是实施例1所得的广谱抗菌性能的新型短链抗菌肽对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌耐药性图。其中第一行是抗菌肽对大肠杆菌耐药性实验；第二行是青霉素-链霉素双抗对大肠杆菌耐药性实验；第三行是抗菌肽对金黄色葡萄球菌耐药性实验；第四行是青霉素-链霉素双抗对金黄色葡萄球菌耐药性实验；
图11、12是实施例1所得的广谱抗菌性能的新型短链抗菌肽的小鼠伤口愈合实验图，图12是小鼠伤口愈合实验皮肤组织切片H&E染色数据，由图可知，该抗菌肽具有很好的促进伤口愈合的效果；
图13是实施例1所得的广谱抗菌性能的新型短链抗菌肽的小鼠真菌感染模型实验治疗前后小鼠肝脏、肾脏组织切片真菌六安银染色数据(a,b)对照组肝脏和肾脏，(c,d)实验组肝脏和肾脏，由图可知，本实例制备的抗菌肽抗真菌效果显著。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
扫描电镜照片由JSM-7800F型扫描电镜测得。
细胞毒性数据由SpectraMax M3酶标仪测得。
细胞活死数据由OLYMPU SCKX53倒置荧光显微镜测得。
实施例1
抗菌肽制备
目标抗菌肽氨基酸序列为：Leu-Lys-Ala-Pro-Ile；
采用Fmoc方法的固相合成多肽，首先，使用DMF溶胀二氯三苯甲基氯树脂90min，加入第一个氨基酸和DIEA反应2h，再加入甲醇和DIEA封闭未反应的linker。使用20％哌啶/DMF脱除Fmoc保护基。然后，加入第二个氨基酸、PyBoP、HoBT、DIEA反应2h，再使用20％哌啶/DMF脱除Fmoc保护基。循环合成所需的多肽库。使用切割剂(TFA:水:三异丙基硅烷＝38:1:1)进行切割，在冰乙醚中析出多肽，离心，将所得沉淀溶于水，冷冻，最后在冻干机中冻干备用。
微球扫描电镜
本实施例制备的抗菌肽，在扫描电镜下观察。图1是实施例1所得的广谱抗菌性能的新型短链抗菌肽扫描电镜图，结果显示，本实施例制备的抗菌肽具有胶状结构。
抗菌效果
本实施例制备的抗菌肽干燥后溶解于PBS中进行最小抑菌浓度实验。图2是实施例1所得的抗菌肽对白色念球菌最小抑菌浓度图；图3是实施例1所得的抗菌肽对枯草芽孢杆菌最小抑菌浓度图；图4是实施例1所得的抗菌肽对大肠杆菌最小抑菌浓度图；
图5是实施例1所得的抗菌肽对金黄色葡萄球菌最小抑菌浓度图；图6是实施例1所得的抗菌肽对表皮葡萄球菌最小抑菌浓度图；结果显示，本实施例制备的抗菌肽具有良好的抗菌性，抗菌肽对白色念珠菌的最小抑菌浓度为50μg/mL；所述抗菌肽对枯草芽孢杆菌的最小抑菌浓度为125μg/mL；所述抗菌肽对大肠杆菌的最小抑菌浓度为150μg/mL；所述抗菌肽对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为200μg/mL；所述抗菌肽对表皮葡萄球菌的最小抑菌浓度为400μg/mL。
细胞毒性
本实例制备的微球使用MTT法检测其细胞毒性，将微球在细胞中孵育分别孵育24、48、72h，用酶标仪测细胞存活率，然后经AM/PI染色，在倒置荧光显微镜下观察细胞活死情况。图7是实施例1所得的广谱抗菌性能的新型短链抗菌肽溶血数据图；图8、9是实施例1所得的广谱抗菌性能抗菌肽的细胞毒性数据，图8正常细胞存活率数据；图9细胞活死数据，由图可知，在该微球孵育中的细胞存活率良好，无细胞毒性；结果显示，本实例制备的抗菌肽无细胞毒性，细胞存活率较高，表明其生物相容性优异。
抗菌肽耐药性实验
本实例制备的抗菌肽，用预先制备好的细菌悬液(1×107CFU/mL)，配置抗菌肽对大肠杆菌的最小抑菌浓度和对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度，同时配置抗生素的最小抑菌浓度作为对照。在细菌培养箱中孵育(37℃，100rpm)，每2小时取200μL作为一代，然后取100μL混合液均匀涂抹在LB培养基上，孵育(37℃，24小时)，计数菌落。图10是实施例1所得的广谱抗菌性能的新型短链抗菌肽对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌耐药性图。其中第一行是抗菌肽对大肠杆菌耐药性实验；第二行是青霉素-链霉素双抗对大肠杆菌耐药性实验；第三行是抗菌肽对金黄色葡萄球菌耐药性实验；第四行是青霉素-链霉素双抗对金黄色葡萄球菌耐药性实验。结果显示，本实例制备的抗菌肽具有优异的抗菌抗性。
小鼠伤口愈合实验模型
将小鼠分为四组：分别用等量的无菌PBS、抗菌肽Leu-Lys-Ala-Pro-Ile、金黄色葡萄球菌悬液(1×107CFU/mL)、抗菌肽Leu-Lys-Ala-Pro-Ile和金黄色葡萄球菌悬液(1×107CFU/mL)进行治疗。每组6只小鼠。在整个实验过程中，各组小鼠自由饮水和进食。在每组中，使用无菌剪刀在每只实验小鼠的背部切除深2.0mm，直径10mm的伤口。伤口底部无明显出血。然后将对数中期金黄色葡萄球菌50μL(1×107CFU/mL)接种到小鼠的每个伤口中。在实验组中，在伤口创面加入50μL抗菌肽(MIC＝200μg/mL)，空白对照组在创面加入50μL无菌PBS。每天测量小鼠的伤口面积和体重。进行伤口愈合情况观察，伤口愈合后取小鼠的伤口皮肤组织进行切片观察。图11、12是实施例1所得的广谱抗菌性能的新型短链抗菌肽的小鼠伤口愈合实验图，图12是小鼠伤口愈合实验皮肤组织切片H&E染色数据，由图可知，该抗菌肽具有很好的促进伤口愈合的效果；结果显示，本实例制备的抗菌肽在第9天伤口基本愈合，促进伤口愈合效果显著。
小鼠白色念珠菌真菌感染模型
给小鼠体内建立白色念珠菌真菌感染模型，选择浓度为1×108CFU/mL的白色念珠菌悬浮液通过尾静脉注射200μL，每组6只。24h后在无菌条件下取小鼠的脾，称重后，用毛玻璃将其研碎，经稀释在沙堡弱氏固体培养基上培养48h，对培养出的菌落进行鉴定以用来确定真菌感染模型成功建立。空白组是小鼠白色念珠菌真菌感染模型建立后注射200μL无菌生理盐水；实验组是小鼠白色念珠菌真菌感染模型建立后注射200μL浓度50μg/mL的抗菌肽治疗。48小时后取小鼠的肝脏和肾脏组织器官进行切片观察。图13是实施例1所得的广谱抗菌性能的新型短链抗菌肽的小鼠真菌感染模型实验治疗前后小鼠肝脏、肾脏组织切片真菌六安银染色数据，由图可知，本实例制备的抗菌肽抗真菌效果显著。结果显示，本实例制备的抗菌肽抗真菌治疗效果显著。
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (9)
1.一种具有广谱抗菌性能的短链抗菌肽，其氨基酸序列为LKAPI。
2.权利要求1所述的短链抗菌肽在制备抑制革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和真菌药品中的应用。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的菌包括革兰氏阴性菌、革兰氏阴性菌、白色念球菌。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述真菌为白色念珠菌。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述抗菌肽对白色念珠菌的最小抑菌浓度为50μg/mL。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述抗菌肽对枯草芽孢杆菌的最小抑菌浓度为125μg/mL。
7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述抗菌肽对大肠杆菌的最小抑菌浓度为150μg/mL。
8.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述抗菌肽对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为200μg/mL。
9.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述抗菌肽对表皮葡萄球菌的最小抑菌浓度为400μg/mL。
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