KR20150042447A - 다제내성균에 대한 항균, 항진균, 항염증 활성을 보이는 프로태티아마이신 항생펩타이드 유도체 및 그 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 흰점박이꽃무지(Protaetia brevitarsis)유충으로부터 분리된 프로태티아마이신의 α-helix영역의 9개 잔기서열을 바탕으로 설계된 항생 펩타이드를 기반으로 항균, 항염 활성은 유지하면서 세포 독성을 감소시키는 서열번호 1 내지 7로 기재된 항생 펩타이드 7종과 그 용도 및 작용기작에 관한 것이다. 본 발명의 신규한 항균 펩타이드 2종은 내성균과 여드름균에 대해 탁월한 항균 활성을 나타내고, 동시에 항염증 활성도 나타내며 세포 독성이 없으므로 인체에 안전한 항균제, 항진균제 등으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

다제내성균에 대한 항균, 항진균, 항염증 활성을 보이는 프로태티아마이신 항생펩타이드 유도체 및 그 용도{Antibiotic peptide analogues with high activities against multidrug resistant bacteria and fungi and anti-inflammatory activities designed from Protaetiamycine, and their uses}

본 발명은 인체에 항생제로서 유용하게 사용될 수 있는 프로태티아마이신 항생펩타이드 유도체의 다제내성균에 대한 항생제 및 항진균제 뿐만 아니라 항염증 치료제로서의 용도에 관한 것이다.

페니실린 이후 수많은 종류의 항생제가 개발되어 생체에 외부침입의 세균을 퇴치를 위하여 사용되어 왔다. 그러나 최근에 들어서 이들 항생제에 내성을 가지는 균주들이 등장하여 큰 문제로 여겨진다. 생명에 위협을 가할 수 있는 엔테로코쿠스 패칼리스 (Enterococcus faecalis), 마이코박테리움 투버쿨로시스 (Mycobacterium tuberculosis) 및 슈도모나스 애루기노사 (Pseudomonas aeruginosa) 등의 세균 종들은 지금까지 알려진 모든 항생제에 대한 저항력을 키워왔다 (Stuart B. Levy, Scientific American, 46-53, 1998).

페니실린, 세파로스포린등과 같은 종래의 화학항생제는 미생물의 세포벽 또는 단백질의 합성저해에 의하여 항생작용을 나타낸다. 이들 내성균주를 퇴치할 수 있는 새로운 작용 메카니즘을 가지는 항생제의 개발이 시급한 실정이며 종래의 화학 항생제와 상이한 항생기전을 나타내는 항생펩타이드들은 새로운 개념의 차세대 항생제로서 주목을 받고 있다 (Zasloff M. Curr Opin Immunol 1992 4, 3-7; Boman, H. G., Cell, 65:205, 1991; Boman, H. G. J Intern Med. 2003, 254(3), 197-215; Hancock, R. E., & Scott, M. G., Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 2000, 97, 8856-8861, Zasloff, M., Nature 2002, 415, 389-395).

최근 다제내성균 중에 P. aeruginosa, A. baumannii는 내인성으로 획득내성 또한 가장 빈번하게 일어나는 균종에 속해서 항균제 내성 문제가 심각한 균종으로 알려져 있다. P. aeruginosa, A. baumannii에서 다제내성은 aminoglycoside, fluoroquinolone, carbapenem등 3가지 계열의 약제에 모두 내성인 균주를 의미하며, 이런 다제내성 균종은 카바페넴이 거의 유일하게 유효한 항균제였는데, 10여 년간 카바페넴에도 내성인 균주가 증가하면서 항균제 치료에 큰 제한이 생겼다는 공통점을 보인다. 녹농균 또는 슈도모나스 에루지노사 (Pseudomonas aeruginosa)는 그람 음성균이며, 흔한 감염성 병원균으로서, 항생제에 대한 감수성이 낮아 자연적으로 쉽게 항균제 내성을 획득할 수 있으며, 인공호흡기를 사용하는 호흡기계 감염, 화상 감염, 낭포성 섬유증 환자의 폐렴, 요로 감염을 유발하는 원인균이며, 인공환기기, 흡인카테터, 고여 있는 오염된 물 등의 감염소에 존재하다가 환자에게 직, 간접적으로 전파되어 정착하게 되는데 진행성의 질환을 가진 환자의 경우에는 치료가 어려워 높은 사망률을 보이는 것으로 알려져 있다.

여드름은 분비가 많아진 피지와 각질덩어리가 모낭의 입구를 막아 피지가 피부의 표면으로 배출되지 못하고 모낭 내에 정체되어 모낭 내에 프로피오니박테리움 아크네스 (Propionibacterium acnes)라는 박테리아가 번식하여 피지의 지방분을 분해하여 유리지방산을 생성하여 모낭벽을 직접 자극하고 박테리아에 의해 분비된 여러 효소의 작용으로 모낭 내 염증을 유발하여 발생된다.

여드름균 치료에 효과적인 방법은 구강 투여 방법과 경피 투여 방법이 있는데, 우선 구강 투여하는 테트라싸이클린 계통의 항생제는 여드름 세균에 대한 살균 작용이 있고 유리 지방산의 생성을 막아 염증을 줄여주는 약제이며, 이소트레티노인은 비타민A의 유도체로 피지의 분비를 억제하고 피지선을 수축하게 하는데, 이 작용은 뇌에 신호를 전달하여 호르몬의 분비를 억제하는 것으로 알려져 있다. 경피 투여 방법으로는 세정력이 우수하면서 자극이 적은 비누나 약산성의 세정제를 사용하여 유분을 제거시키며, 벤조일퍼옥사이드성분이 함유된 연고는 항균작용을 하며 유리 지방산을 감소시켜 염증성 여드름에 탁월한 효과를 보인다. 여드름균에 직접적인 효과를 보이며 유리 지방산이 생성되는 것을 막아서 염증을 감소시키는 국소항생제를 사용하거나 트레티노인이라는 성분이 함유된 피부재생연고를 사용하면 모공을 막고 있는 각질을 제거함으로써 모낭의 파열을 최소화하고 피지 배출이 잘 되도록 하기 때문에 염증으로 발전하는 것을 막아 다양한 여드름에 효과를 가지는 것으로 알려져 있다. 그러나, 상기 방법들은 여드름 치료에 효과적이긴 하지만, 항호르몬제의 사용은 호르몬 남용에 의한 부작용과 더불어 살리실산 제제의 경우 피부발진, 부종, 피부 기피증등을 일으킬 수 있으며, 레티노익산 제제의 경우, 접촉성 피부염, 홍반 및 피부 건조등의 부작용이 보고되고 있다. 또한 에리스로마이신과 크린다마이신 등의 항생제의 경우 cytochrome p450에 의해 대사되는 다른 약재의 혈중 농도를 증가시키는 경향이 있으며, 내성균주의 출현으로 치료효과가 떨어지는 사례가 보고되어 새로운 여드름 치료제의 출연이 시급한 현실이며, 여드름 치료제나 치약 등에 거의 들어가는 성분인 트리클로산은 수돗물의 염소와 반응하여 발암물질인 염화 다이옥신을 생성하고 트리클로산 자체의 아주 소량만으로도 갑상선 기능과 갑상선 호르몬을 방해하는 물질로 알려져 있으며 이 물질을 계속 사용함으로서 내성으로 인해 변종 박테리아를 만들어 내는데 영향을 끼친다고 알려져 있다. 따라서 이와 같은 항균 물질의 규제에 대비하여 기존의 항균 물질을 대체 할 수 있는 새로운 개념의 안전한 항균제의 개발이 시급하다.

항진균제는 진균의 성장에 필수적인 요소의 합성을 억제하여 치료 효과를 나타내게 된다. 가장 많이 사용되는 약제는 azole계 (imidazole. triazole)와 allylamine계 로 알려져 있다. azole계열 중에는 clotrimazole, itraconazole, ketoconazole, fluconazole성분의 약제가 많이 사용되며, allylamine계열 중에는 terbinafine성분의 약제가 많이 사용된다. 연고나 크림 등의 외용제로 사용되는 성분은 clotrimazole (카네스텐, 하이드로졸), isoconazole (트리보코트), terbinafine (라미실)등이 있으며, 경구 투여제로는 fluconazole, terinafine, itraconazole 등을 많이 사용한다.

항염증제는 염증을 없애는 성질을 가지고 있는 물질이나 치료를 의미하며, 조직을 긴축하고 치밀하게 하여 장액과 점액의 분비를 줄이고 표면에 있는 작은 혈관에 빈혈을 일으켜서 충혈이 되는 것을 방지함으로써 염증적 병변을 제거하여 모든 증세를 없앤다. 항염증제는 스테로이드계 약물과 비스테로이드계 약물로 분류되며, 스테로이드계 약물로는 코르티코그테로이드라고 불리며, 클루코코르티코이드를 포함한 많은 스테로이드들이 글루코코르티코이드 수용체에 결합하여 붓기와 염증을 줄여주는 작용을 한다. 또한 비스테로이드성 약물은 염증을 일으키는 원인인 prostaglandin을 합성하는 cyclooxygenase 효소를 저해하여 통증을 완화시키는 작용을 하며, 대표적인 약물로는 아스피린, 이부프로펜, 그리고 나프록센등이 있다.

넓은 의미로서 면역반응으로 불리어지는 항원항체 반응은 인간을 포함한 무척추동물에 있어서 생체방어의 주된 역할을 해 왔다. 그러나 곤충은 항원 항체반응과 같은 후천적 면역기구와는 다른 선천적 면역기구를 강화하는 것으로 자신을 보호하고 있다. 이와 같이 선천적 면역은 곤충뿐만 아니라 사람을 포함한 척추동물에 있어서도 초기감염에 대해 중요한 방어계로서 역할을 하고 있다. 곤충의 선천적 면역기구의 아주 중요한 수단은 다양한 미생물에 대해 살균, 불활성화작용을 가진 물질을 획득한다는 것이다. 그 중에서도 항균성 펩타이드를 중심으로 한 항미생물작용을 가진 펩타이드나 단백질은 우리 인간을 포함한 가축 등의 질병 방제에 대해서 이용 가능성 높다. 이러한 곤충유래 항병원성 단백질은 인간 및 가축의 질병에 대한 가치뿐만 아니라 각종 병원균의 감염에 의해 야기되는 농작물의 피해 방지 및 치료를 위해서도 매우 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

오래전부터 반묘, 백강잠, 궁벵이, 거미, 전갈 등의 곤충이 질병치료에 이용되어져 왔는데 그중에 반묘는 가려운 곳을 치료하는 곤충이라고 동의보감에도 기록되어 있다. 곤충은 현재도 여러 분야에서 연구와 응용이 이뤄지고 있는데, 호르몬이나 페로몬은 신경학과 내분비학의 연구에서 응용되고 있으며 기생이나 공생의 구조는 항균제나 해충방제에 응용되고 있다. 최근 들어 곤충으로부터 항생 펩타이드와 항암물질 등을 이용한 새로운 신약 후보 물질에 관심이 늘어나고 있으며, 고지혈증, 당뇨, 비만, 염증치료, 항암에 탁월한 효능을 보이는 활성물질의 탐색이 활발히 진행되어 탁월한 효능을 보이는 활성물질이 많이 밝혀지고 있고, 특히 항생 펩타이드는 기존 항생제에 내성을 가진 균주에 대해서도 활성을 유지하는 것으로 보여진다. 그러므로 곤충으로부터 유래한 항생 펩타이드는 내성 균주의 출연으로 위협받고 있는 기존의 항생제를 대체할 새로운 개념의 항생제 탐색에 중요한 생물자원으로 각광받고 있다.

항생 펩타이드는 구조에 따라 세 개의 그룹으로 나눌 수 있다. 첫 번째는 시스테인이 풍부한 (cysteine-rich) β-쉬트(sheet) 펩타이드이고, 두 번째는 α-나선형 (helical)의 양친매성 펩타이드 분자이며, 세 번째는 프롤린이나 트립토판등의 특정 아미노산이 풍부한 (proline-rich, Trp-rich) 펩타이드이다 (Mayasaki et al., Int . J. Antimicrob . Agents, 9, 269-280, 1998; Andreu , D.; Rivas , L. Biopolymers 1998, 47, 415-433). 이들 항균 펩타이드들은 숙주 방어 및 선천적 면역계에 있어서 중요한 역할을 담당하는 것으로 알려져 있다.

또한, 상기 항균 펩타이드들은 아미노산 서열에 따라 다양한 구조를 갖는데, 이들 구조 중 가장 흔한 것은 곤충에서 발견된 항균 펩타이드인 멜리틴 (melittin)이나 세크로핀 (cecropin)과 같이 시스테인 (cysteine) 잔기가 없고 양친화성 α-나선형을 형성하는 구조이다.

현재까지 밝혀진 곤충유래 항균 단백질로서는 쉬파리과(Sarcophaga peregrina)에서 발견된 sacotoxin Ⅲ(Baba et al, 1987), 노랑초파리(Drosophila melanogaster)에서 발견된 diptericin(Wicker et al 1990), 참검정풍뎅이(Holotrichia diomphalia)에서 발견된 holotricin 3(Lee et al., Biol. Pharm. Bull., 18:1049-1052, 1995), 갈색거저리(Tenebrio molitor)에서 발견된 tenecin 3(Lee et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 218:6-11, 1996), 장수풍뎅이(Allomirina dichotoma)에서 발견된 Defensin, Coleoptericin A and B(Miyanoshita et al., 1996 ; Sakisaca et al., 2001) 담배나방아과의 Heliothis virescens에서 발견된 heliomicin(Lamberty et al., J. Biol. Chem. 274:9320-9326, 1999), 남방장수풍뎅이(Oryctes rhinoceros)에서 발견된 Rhinocerosin, Scarabaecin(Yang et al., 1998 ; Tomie et al., 2003), 매미아과의 Cicada flammata에서 발견된 cicadin(Wang and Ng, Peptides, 23:7-11, 2002), 큰우단하늘소(Acalolepta luxuriosa)로부터 발견된 Cecropin(saito et al., 2005), 담배거세미나방(Spodoptera litura)으로부터 발견된 Moricin analogue(Orizumi et al., 2005)등이며, 흰점박이꽃무지에 대한 연구는 면역을 유도한 유충으로부터 Protaetin 1,2,3가 보고 된바 있다 (Yoon et al., 2003).

본 발명은 항균 펩타이드, 프로태티아마이신의 잔기서열로부터 설계된 7종의 신규한 항균펩타이드를 합성하고 6종의 박테리아 뿐만 아니라 16종의 항생제 내성균주에 대한 항균 활성과 칸디다균과 말라세지아균에 대한 항진균 활성을 확인하고, 항염증 활성을 유지하면서 인체 독성을 낮춘 것을 확인하는 것을 목적으로 한다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 1 내지 7로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 펩타이드 군으로부터 선택된 하나의 항생 펩타이드를 제공한다.

또 본 발명은 상기 본 발명의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항균용 약학 조성물을 제공한다.

또 본 발명은 그람 양성균, 그람 음성균, 다제내성균 및 진균으로 구성된 군으로부터 선택된 미생물의 세포막에 작용하는 서열번호 1 내지 7로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 펩타이드 군으로부터 선택된 하나의 항생 펩타이드를 제공한다.

또 본 발명은 서열번호 1 내지 7로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 펩타이드 군으로부터 선택된 하나의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항염증용 약학 조성물을 제공한다.

또 본 발명은 서열번호 1 내지 7로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 펩타이드 군으로부터 선택된 하나의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 미생물은 그람 양성균, 그람 음성균, 항생제 내성균주, 여드름균주 또는 진균인 칸디다 균주 및 비듬균주인 것이 바람직하고, 상기 그람 양성균은 B. subtilis , S. aureus , 또는 S. epidermidis이고, 그람 양성균은 E. coli , P. aeruginosa, 또는 S. typhimurium이며, 상기 항생제 내성균주는 MRSA (3089, 3090, 3108, 3114, 3126), MDRST (8003, 8007, 8009), MDREC (1229, 1238), MDRPA (2002, 2003, 2095), MDRAB (12035, 12036, 12037)이며, 여드름균주는 P. acnes (3314, 3320, 5527, 5933)이며, 칸디다 균주는 Candida albicans (7270)이며, 비듬균주는 Malassezia furfur (7743), M. globosa (7846), M. sympodialis (7985), M. pachydermatis (17008), M. sloofiae (17431), M. dermatis (17610), M. yamatoensis (17656), M. obtusa (7847)인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 항염증 활성은 유도물질 나이트레이트 옥사이드의 생성을 억제함으로 수행되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 항염증용 조성물은 인간의 적혈구 세포 또는 포유류 정상 세포에 대하여 독성을 가지지 않는 것이 바람직하다.

이하 본 발명을 설명한다.

본 발명에서는 흰점박이꽃무지의 유충으로부터 분리된 항균 펩타이드, 프로태티아마이신의 잔기서열로부터 설계된 고항균, 항염 펩타이드 유도체를 합성하여 항균 활성과 항염 활성을 나타냄을 밝히는 것이다.

이하 본 발명을 단계에 따라 보다 구체적으로 설명하고자 한다.

본 발명에서는 프로태티아마이신 항균펩타이드 helix영역의 아미노산 서열에 기반하여 높은 항생활성을 가져 특허 등록된(특허등록번호: 10-1062975) 9Pbw3의 잔기서열에 기반하여, 독성은 낮추고 활성을 유지하기 위하여 서열번호 1의 9Pbw3-1은 트립토판이 세포막에 대한 독성이 높다고 알려져 있기 때문에 7번째 트립토판 잔기를 소수성을 유지하면서 비슷한 활성을 낼 수 있는 페닐알라닌 잔기로 치환하였으며, 서열번호 2와 3의 9Pbw3-2와 9Pbw3-3은 세포독성을 낮추기 위하여 각각 4번째와 6번째 루신 잔기를 알라닌 잔기로 치환하므로써 소수성을 조절하였으며, 서열번호 4의 9Pbw3-4은 방향족 고리를 가진 소수성 아미노산인 7번째 트립토판 잔기를 독성은 낮추고 소수성은 유지하기 위하여 소수성 아미노산인 루신으로 치환하였으며, 서열번호 5의 9Pbw3-5는 소수성 아미노산인 2번째 루신 잔기를 양전하성 아미노산인 알지닌으로 치환하여 소수성을 조절하고 유효전하의 양전하성을 높였으며, 서열번호 6과 7의 9Pbw3-6과 9Pbw3-7은 3번째 트립토판 잔기를 소수성을 유지하면서 비슷한 활성을 낼 수 있는 페닐알라닌 잔기와 소수성 아미노산인 루신 잔기로 각각 치환하였다. 인간의 세포에 대한 독성은 낮추고 병원성 세균 뿐만 아니라 여드름균에 대한 항균활성과 칸디다균과 말라세지아균을 포함하는 진균에 대하여 항진균 활성 및 항염증 활성을 가지는 펩타이드 유도체를 설계하고 활성을 측정하여 인체의 항균치료제로 응용될 수 있음을 확인하므로써 본 발명을 완성하였다.

이들 7종의 항생펩타이드를 합성하여 그람 양성균 및 그람 음성균의 6종의 박테리아에 대한 항생활성을 검정하였다. 그 결과 본 발명에 의한 항균 펩타이드의 유도체를 처리 시 공시한 6종의 균들과 16종의 다제내성균의 생장이 억제되었다. 서열번호 1 내지 7의 항생 펩타이드를 비교 펩타이드인 9Pbw3와 비교하였을 때 비교 펩타이드인 9Pbw3와 비슷한 소수성 정도를 보이는 서열번호 1, 4, 6, 7과 다른 유도체보다 유효전하의 양전하성이 높은 서열번호 5의 항생 펩타이드인 경우 비교 펩타이드인 9Pbw3와 비슷하거나 약간 우수한 활성을 나타내는 것을 확인하였다. 또한 4종의 여드름균에 대하여 서열번호 4와 서열번호 5의 경우 비교 펩타이드인 9Pbw3와 비교하였을 때 우수한 항균활성을 나타내는 것을 보인다. 항진균 활성을 확인하기 위하여 칸디다균과 8종의 말라세지아 균에서 항진균 활성을 비교 펩타이드인 9Pbw3와 비교하였을 때 서열번호 4인 9Pbw3-4의 펩타이드는 비교 펩타이드와 유사한 우수한 항진균 활성을 확인할 수 있었다. 또한 9Pbw3와 비슷한 소수성도를 보이는 서열번호 1, 6, 7의 항생 펩타이드와 유효전하의 양전하성이 높은 서열번호 5의 항생 펩타이드도 비교 펩타이드인 9Pbw3와 비슷한 수준의 우수한 항진규 활성을 나타내었다. 특히 본 발명의 서열번호 1 내지 7의 항생 펩타이드가 세포 독성을 나타내는지를 확인하기 위하여 적혈구 파괴능을 조사한 결과, 양성 대조군으로 사용한 벌독 유래 항생펩타이드인 melittin에 비해 비교 펩타이드인 9Pbw3의 항생 펩타이드는 현저히 낮은 용혈 활성을 나타내었으며, 서열번호 1 내지 7의 7종의 펩타이드는 비교 펩타이드인 9Pbw3는 보다 더 낮은 용혈활성을 보이며 거의 인간의 적혈구를 파괴하지 않는 것을 알 수 있었으며, 쥐의 대식세포에 대하여 양성 대조군으로 사용한 melittin에 비해 비교 펩타이드인 9Pbw3의 항생 펩타이드는 현저히 낮은 세포 독성을 나타내었으며, 본 발명의 서열번호 1 내지 7의 7종의 펩타이드는 비교 펩타이드인 9Pbw3는 보다 더 낮은 세포 독성을 나타내었다. 본 발명에서 독성은 낮추고 활성을 유지하기 위하여 소수성을 조절하여 설계된 서열번호 1 내지 7로 기재되는 7종의 항생 펩타이드 중에서 7번째 트립토판을 루신으로 치환하여 소수성을 유지한 서열번호 4의 9Pbw3-4는 본 발명에서 테스트 한 그람 양성균, 그람 음성균, 다제내성균, 진균 및 여드름균에 대하여 가장 우수한 항균 활성을 나타내었으며, 항염증 활성이 탁월하고 비교 펩타이드인 9Pbw3보다 낮은 세포 독성을 보여 항균 활성은 유지하면서 세포 독성을 낮추기 위한 펩타이드중에 가장 우수한 펩타이드로 설게 되었으며, 2번째 루신 잔기를 양전하성의 알지닌으로 치환한 서열번호 5의 9Pbw3-5의 항생 펩타이드는 비교 펩타이드의 9Pbw3보다 소수성을 낮추어 탁월하게 가장 낮은 세포 독성을 보임에도 불구하고 양전하성의 알지닌을 N-terminal쪽으로 치환하므로써 유효 전하량이 다른 유도체보다 양전하성의 항생 펩타이드로 설계하여 모든 균주에 대하여 서열번호 4에 이어서 우수한 항균 활성과 항염증 활성을 보이는 것으로 확인하였다.

이런 이유로 상기 제시된 서열번호 4와 서열번호 5의 항생 펩타이드는 비교 펩타이드인 9Pbw3에 비하여 활성은 유지하면서 세포 독성을 낮추고자 한 본 발명의 목표에 가장 부합하는 펩타이드이며, 인체의 안전한 항생제 및 항염증제로도 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

이하 실시예에 의해 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 구체적으로 설명하는 것으로, 이들 실시예에 의해 본 발명의 범위가 제한되지 않는 다는 것은 당업계에서 통상적인 지식을 가진 자들에게 있어서 자명할 것이다. 또한 비록 구체적인 실시예로 제시되지는 않았지만, 항균, 항진균 작용이 있는 본 발명에 의한 항균 펩타이드 유도체를 유효성분으로 함유하는 항균제용 약학적 조성물이 가능함이 당업자에게 당연할 것이다.

펩타이드	아미노산서열	소수성
서열번호 1: 9Pbw3-1	RLWLAIFRR-NH2	1.85
서열번호 2: 9Pbw3-2	RLWAAIWRR-NH2	0.62
서열번호 3: 9Pbw3-3	RLWLAAWRR-NH2	0.73
서열번호 4: 9Pbw3-4	RLWLAILRR-NH2	1.82
서열번호 5: 9Pbw3-5	RRWLAIWRR-NH2	-0.36
서열번호 6: 9Pbw3-6	RLFLAIWRR-NH2	1.85
서열번호 7: 9Pbw3-7	RLLLAIWRR-NH2	1.82
비교펩타이드서열번호 8: 9Pbw3	RLWLAIWRR-NH2	1.82

표 1은 서열번호 1 내지 7의 비교펩타이드와 서열번호 8의 아미노산 서열 표.

표 1은 기존 발명된 9Pbw3 잔기서열을 기반으로 개발된 본 발명의 서열번호 1 내지 7로 기재되는 된 고기능성 펩타이드 유도체 7종의 잔기서열과 비교펩타이드 서열번호 8의 잔기서열이다.

본 발명에서는 프로태티아마이신 항균펩타이드 helix영역의 아미노산 서열에 기반하여 높은 항생활성을 가져 특허 등록된(특허등록번호: 10-1062975) 9Pbw3의 잔기서열에 기반하여, 소수성을 조절하는 잔기 치환으로서 인간의 세포에 대한 독성은 낮추고 병원성 세균에 대해 높은 항균활성 뿐만 아니라, 여드름균에 대한 항균활성 및 칸디다균과 말라세지아균에 대한 항진균 활성과 항염증활성을 가지는 박테리아 선택적 유도체를 설계하고 활성을 측정하여 인체의 항균 치료제 및 항진균 치료제와 항염증제를 개발하였다.

우선, 본 발명의 항균 펩타이드인 서열번호 1 내지 7의 항생 펩타이드가 상기 용도로 사용될 수 있는지 확인하기 위하여 본 발명자들은 본 발명에서 합성한 항균 펩타이드및 대조군 펩타이드에 대하여 그람-음성균 (3종류의 균주) 및 그람-양성균 (3종류의 균주)과 16종의 다제내성균에 대하여 항균 활성을 측정하였다. 항균 활성은 균체가 분열되지 않는 펩타이드의 최소성장 억제농도 (minimal inhibitory concentration: MIC), 이하 “MIC”라 약칭함)를 측정하여 관찰하였다. 그람 양성균으로써 Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus , S. epidermidis를, 그람 음성균으로써 Escherichia coli, Psedomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium를, 다제내성균으로써 S. typhimurium 8003(R), S. typhimurium 8007(R),S. typhimurium 8009(R), E. coli 1229(R), E. coli 1238(R), S. aureus 3089(R), S. aureus 3090(R),S. aureus 3108(R), S. aureus 3114(R), S. aureus 3126(R), P. aeruginosa 2002(R), P. aeruginosa 2003(R),P. aeruginosa 2095(R), A. baumanii 12035(R), A. baumanii 12036(R), A. baumanii 12037(R)를 그 대상으로 하였으며, 진균으로써 Malassezia furfur (KCTC7743), M. globosa (KCTC7846), M. sympodialis (KCTC7985), M. pachydermatis (KTCT17008), M. sloofiae (KTCT17431), M. dermatis (KTCT17610), M. yamatoensis (KTCT17656)과 Candida albicans(KCTC7270)를 그 대상으로 하였다.

서열번호 1 내지 7의 항생 펩타이드를 비교 펩타이드인 9Pbw3와 비교하였을 때 위의 공시한 6종의 균에 대하여 비교 펩타이드인 9Pbw3와 비슷한 소수성 정도를 보이는 서열번호 1, 4, 6, 7과 다른 유도체보다 유효전하의 양전하성이 높은 서열번호 5의 항생 펩타이드인 경우 비교 펩타이드인 9Pbw3와 비슷하거나 약간 우수한 활성을 보였다 (표 2 참조). 또한 위의 공시한 16종의 다제내성균에 대하여 서열번호 1, 4, 5, 6, 7에서 비교 펩타이드인 9Pbw3와 비슷하게 우수한 항균 활성을 타내내었다 (표 3 참조).

본 발명의 서열번호 1 내지 7의 항균 펩타이드 9Pbw3-1, 9Pbw3-2, 9Pbw3-3, 9Pbw3-4, 9Pbw3-5, 9Pbw3-6, 또는 9Pbw3-7이 상기 용도로 사용될 수 있는지 확인하기 위하여 합성한 항균 펩타이드및 대조군 펩타이드와 비교 화합물에 대하여 프로피오니박테리움 아크네스균(4종류의 균주)에 대하여 항균 활성을 측정하였다. 항균 활성은 균체가 분열되지 않는 펩타이드의 최소성장 억제농도 ((minimal inhibitory concentration: MIC), 이하 “MIC”라 약칭함)를 측정하여 관찰하였다. 프로피오니박테리움 아크네스균은 그람양성균으로 KCTC3341. KCTC3320, KCTC5527, KCTC5933를 그 대상으로 하였다.

본 발명의 서열번호 1 내지 7의 항균 펩타이드 중에서 서열번호 4 내지 5의 2종의 항생펩타이드는 4종의 여드름균에 대하여 비교펩타이드인 9Pbw3 보다 탁월하게 우수한 항균 활성을 나타냈다. 게다가 여드름 치료제로 상용화 되어 있는 비교 화합물인 triclosan과 benzoyl peroxide보다 비슷하거나 높은 항생 활성을 보였다 (표 4 참조).

서열번호 1 내지 7의 펩타이드 중에서 서열번호 4의 9Pbw3-4의 항생 펩타이드는 칸디다균과 모든 말라세지아균에서 대조펩타이드인 melittin과 9Pbw3보다 비슷한 활성을 보여 비듬균 억제제 후보물질로서의 능력을 확인하였다.(표 5 참조).

본 발명의 항균 펩타이드 서열번호 1 내지 7의 숙주세포에 대한 독성을 조사한 결과 대조군인 melittin은 항균 활성을 나타내는 MIC농도와 같은 낮은 농도에서도 독성이 높았다. 비교 펩타이드인 9Pbw3를 비롯하여 서열번호 1 내지 7의 항생 펩타이드는 모두 MIC보다 훨씬 높은 농도인 12.5uM에서 전혀 용혈활성을 보이지 않았다. 비교 펩타이드인 9Pbw3는 50uM 농도 처리 시 10% 정도의 용혈 활성을 보이는데 비하여 비교 펩타이드인 9Pbw3보다 훨씬 낮은 소수성을 보이는 서열번호 2, 3, 5의 항생 펩타이드는 50uM에서도 전혀 용혈 활성을 보이지 않았으며, 비교 펩타이드인 9Pbw3와 비슷한 정도의 소수성을 보이는 서열번호 1, 4, 6, 7의 항생 펩타이드는 50uM의 펩타이드 처리 시 5% 미만의 낮은 용혈 활성을 나타내었다. 따라서 서열번호 5인 9Pbw3-5는 높은 항균 활성과 낮은 용혈 활성을 보이는 것으로 우수한 세포 선택성을 가짐을 알 수 있었다 (도 1 참조). 또한 도 2는 마우스 대식세포 (RAW264.7)에 대하여 서열번호 1 내지 7로 표시되는 항생 펩타이드의 생존율을 조사한 결과 항균 활성 뿐만 아니라 항염 활성을 나타내는 농도 보다도 훨씬 더 높은 농도인 25uM까지 100%의 생존율을 보여서 독성이 낮음을 확인하였다. 비교 펩타이드인 9Pbw3의 경우 12.5uM까지는 100% 생존률을 보이고 25uM에서 67%의 생존률을 보였다.

본 발명에서는 9Pbw3와 서열번호 1 내지 7로 표시되는 항생 펩타이드의 항염증 활성을 검정하였다. 그 결과, 도3은 서열번호 1 내지 7로 표시되는 항생 펩타이드의 항염증 활성을 알아보기 위하여 마우스 대식세포에서 pathogen LPS 자극에 의해 생성되는 NO (nitric oxide)의 생산 억제 정도를 측정하여 보았더니, 비교 펩타이드인 9Pbw3와 비슷한 소수성정도를 보이는 서열번호 1, 4, 6, 7로 표기 되는 항생 펩타이드와 유효전하가 양전하를 하나 더 가지는 서열번호 5는 LPS처리하지 않은 대조구의 nitrite의 수치를 비교하였을 때 NO (nitric oxide)의 생산을 비교 펩타이드인 9Pbw3와 비슷한 수준으로 억제하였다.

상기의 결과로부터, 본 발명의 서열번호 1 내지 7로 기재되는 항생 펩타이드 중에 서열번호 4의 9Pbw3-4는 설계한 7개 항생 펩타이드 중에 가장 탁월한 항균 및 항진균 활성을 나타내며 우수한 항염증 활성을 보이고 비교 펩타이드인 9Pbw3와 비교하였을 때 용혈 활성과 세포 독성이 다소 낮아서 세포 선택성을 증가시킨 항생 펩타이드임을 확인 하였으다 이로서 7번? 잔기위치에 소수성잔기의 존재가 활성에 중요하며 Trp보다는 Leu잔기로 치환되는 것이 독성의 감소에 도움이 됨을 알수 있었다. 서열번호 5는 비교 펩타이드인 9Pbw3보다는 다소 낮은 항균 활성을 보이지만 항염증 활성과 인간 적혈구 세포에 대하여 거의 용혈 활성을 보이지 않고 포유류 세포에 대한 가장 낮은 독성을 보이는 우수한 세포막 선택성을 가지는 고기능성 항균펩타이드임을 확인할 수 있었다. 이로서 두 번째 잔기위치에 Leu을 Arg으로 치환하여 소수성을 낮춤과 동시에 양이온성을 높임으로서 활성은 다소 낮아지나 독성은 현저히 감소시킬 수 있음을 알수 있었다.

상기 서열번호 1 내지 7로 기재되는 펩타이드는 임상투여시에 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다.

즉, 본원 발명의 펩타이드는 실제로 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

또한, 상기 펩타이드는 생리식염수 또는 유기용매와 같이 약제로 허용된 여러 전달체(carrier)와 혼합하여 사용될 수 있고, 안정성이나 흡수성을 증가시키기 위하여 글루코스, 수크로스 또는 덱스트란과 같은 카보하이드레이트, 아스코르브 산(ascorbic acid) 또는 글루타치온과 같은 항산화제(antioxidants), 킬레이팅 물질(chelating agents), 저분자 단백질 또는 다른 안정화제(stabilizers)들이 약제로 사용될 수 있다.

상기 펩타이드의 유효용량은 0.1 내지 20 ㎎/㎏이고, 바람직하기에는 0.5 내지 10 ㎎/㎏ 이며, 하루 1 내지 3회 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물에서 서열번호 1 내지 7로 기재되는 펩타이드 및 그의 유도체의 총 유효량은 거환(bolus) 형태 혹은 상대적으로 짧은 기간 동안 확산(infusion) 등에 의해 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)이 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 상기 펩타이드의 농도는 약의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 나이 및 건강상태 등 다양한 요인들을 고려하여 환자의 유효 투여량이 결정되는 것이므로 이러한 점을 고려할 때, 이 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 펩타이드의 약학적 조성물로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다.

또 본 발명의 화장료 조성물은 유효성분으로 상기 신규한 펩타이드 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들이 포함되며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어,용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수(스킨), 영양 화장수(밀크로션), 영양 크림, 맛사지 크림, 에센스,아이크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴(세안폼), 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀,전분, 트라가칸타, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제,에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라가칸타 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

화장품 보존제 및 의약품 보존제는 식품이나 의약품의 변질, 부패, 변색 및 화학변화를 방지하기 위해 사용되는 첨가물로서 살균제, 산화방지제가 이에 포함되며 세균, 곰팡이, 효모 등 미생물의 증식을 억제하여 화장품 및 의약품에서 부패미생물의 발육저지 또는 살균작용을 하는 등의 기능성 항생제도 포함된다. 이러한 화장품 및 의약품 보존제의 이상적인 조건으로는 독성이 없어야 하며, 미량으로도 효과가 있어야 한다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 흰점박이꽃무지 유충으로부터 분리된 펩타이드의 α-helix 영역의 잔기서열로 부터 개발된 9Pbw3 잔기서열을 기반으로 독성은 낮추고 활성을 유지하기 위하여 소수성을 조절하여 설계된 서열번호 1 내지 7로 기재되는 7종의 항생 펩타이드 서열을 제공한다. 서열번호 5의 항생 펩타이드 9Pbw3-5는 그람 양성균 및 그람 음성균에 대하여 비교 펩타이드인 9Pbw3와 비슷하거나 우수한 항균 활성을 나타내었다. 16종의 다제내성균에 대하여 서열번호 4와 서열번호 6의 항생 펩타이드는 비교 펩타이드 보다 우수한 활성을 나타내었으며, 서열번호 1과 서열번호 5, 서열번호 7의 항생 펩타이드는 비교 펩타이드인 9Pbw3와 비슷한 활성을 나타내었다. 또한 4종의 여드름균주에서 서열번호 4와 5의 두 개의 항생 펩타이드 모두 대조군인 9Pbw3보다 탁월하게 우수한 항균활성을 보이며 여드름 치료제로 상용화 되어있는 비교화합물인 triclosan과 benzoyl peroxide와 비교하였을 때 거의 모든 균주에서 비슷하거나 조금 우수한 활성을 나타내었다. 또한 서열번호 1, 4, 5, 6, 7의 항생 펩타이드는 칸디다균과 모든 말라세지아 균에서 비교 펩타이드인 melittin과 9Pbw3와 비슷하거나 조금 낮은 활성을 보였다. 또한 비듬균 치료제로 시중에서 널리 사용되고 있는 비교 화합물과 비교했을 때에도 비슷하거나 조금 낮은 억제 효과를 보임을 확인하였다. 종합적으로 본 발명에서는 서열번호 4의 9Pbw3-4는 그람 양성균, 그람 음성균, 다제내성균, 진균 및 여드름균에 대하여 항균 활성이 가장 우수하며, 비교 펩타이드인 9Pbw3보다 낮은 세포 독성을 보임과 동시에 펩타이드를 전혀 처리하지 않은 control의 NO수치와 비교했을 때, 펩타이드 농도가 증가함에 따라 효과적인 항염증 활성을 확인하여 항균활성이 탁월하고 세포독성을 낮추는 항생 펩타이드로서 우수하게 설계되었음을 확인하였다. 또한 2번째 루신 잔기를 양전하성의 알지닌으로 치환한 서열번호 5의 9Pbw3-5의 항생 펩타이드는 비교 펩타이드의 9Pbw3보다 소수성을 낮추어 탁월하게 가장 낮은 세포 독성을 보이고 유효 전하량이 다른 유도체보다 양전하성이므로 본 발명에서 테스트한 모든 균주에 대하여 서열번호 4에 이어서 우수한 항균 활성과 항염증 활성을 보이는 것으로 확인하였다. 이런 이유로 서열번호 4와 서열번호 5의 9Pbw3-4와 9Pbw3-5의 항생 펩타이드는 비교 펩타이드에 비하여 활성은 유지하면서 세포 독성을 낮추고자 한 본 발명의 목표에 가장 부합하는 펩타이드로 선정할 수 있겠다. 이것으로서 서열번호 4 내지 5의 항생 펩타이드는 인체의 안전한 항생제로 유용하게 사용할 수 있으며, 서열번호 4 내지 5의 항생 펩타이드는 항생제 뿐만 아니라 항염증제로도 유용하게 사용될 수 있을 것이다. 본 발명에 의해 제공되는 항생 펩타이드는 활성 농도 범위에서 세포독성을 전혀 나타내지 않으므로 인체에 안전한 항생제 또는 항염증제로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 특허 등록(특허등록번호: 10-1062975)된 9Pbw3로부터 항균활성은 유지하면서 세포독성은 감소되도록 설계된 서열번호 1 내지 7로 기재된 9-mer 펩타이드를 인간의 적혈구 세포에 처리한 후, 펩타이드 농도에 따른 펩타이드의 용혈활성을 % hemolysis로 나타낸 것이고, 여기서는 대조군(용혈활성을 나타내는 펩타이드)으로 비교 펩타이드 9Pbw3과 melittin을 사용하였다.
도 2는 서열번호 1 내지 7로 기재된 항생 펩타이드를 마우스의 대식세포 (RAW264.7)에 대해 처리하여 펩타이드 농도에 따른 펩타이드 독성을 측정하여 % survival rate로 나타낸 것이고, 여기서는 대조군으로 비교 펩타이드 9Pbw3과 melittin을 사용하였다.
도 3은 서열번호 1 내지 7로 기재된 항생 펩타이드를 처리한 마우스 대식세포 RAW264.7 cell에 염증을 일으키는 pathogen으로 알려진 LPS (lipopolysaccharide)로 자극을 주어 생성되는 염증 유발 물질 nitric oxide (NO)양을 펩타이드 농도에 따라 측정하였다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 펩타이드들의 합성 및 분리정제

서열번호 1 내지 7로 기재되는 항균 펩타이드들은 Fmoc (9-fluorenyl -methoxycarbonyl)-chemistry를 이용한 고상 펩타이드 합성법(solid phase peptide synthesis) (Merrifield, R. B. Science 232: 341-347)에 의하여 제조하였다. 각 Fmoc-아미노산 및 Fmoc-Nlys(Boc)-OH의 coupling에 의한 펩타이드 chain의 연장은 Coupling시약인 N-hydroxybenzotriazole(HOBt) 및 dicyclohexycarbodiimide (DCC)를 사용하였다. 각 펩타이드의 아미노 말단의 Fmoc-아미노산인 Fmoc-Val-OH을 coupling 시킨 후, 20% piperidine/N-methyl pyrolidone (NMP)용액으로 Fmoc기를 제거하고 NMP 및 dichoromethane (DCM)으로 여러 번 씻어준 다음 질소 가스로 말렸다. 여기에 TFA (trifluoroacetic acid)-phenol-thioanisole-ethanedithiol-H₂O (82.5: 5: 5: 2.5: 5, vol./vol.) 용액을 가하고 실온에서 2시간 반응시켜 보호기의 제거 및 수지(resin)으로 부터 펩타이드를 분리시킨 다음, diethylether로 펩타이드를 침전화 시켰다. 이렇게 하여 얻은 crude 펩타이드는 정제형 역상 칼럼 (Vydac C_18, 300Å, 15μm, 2.2 cm × 25 cm)이 부착된 0.05% TFA가 포함된 CH₃CN (acetonitrile) gradient로 하는 크로마토그래피(HPLC)로 정제하였다. 정제를 완료한 순수한 펩타이드는 MALDI 질량 분석법(Hill, et al. Rapid Commun. Mass Spectrometry, 5, 395, 1991)을 이용하여 얻은 분자량이 아미노산 서열로부터 계산하여 얻은 분자량과 일치하므로 정확한 아미노산 서열을 가지는 펩타이드가 합성되었음을 확인하였다.

실시예2 : 항균활성의 측정

서열번호 1 내지 7로 표기되는 펩타이드의 항균활성을 측정하기 위하여 다음과 같이 실시하였다. 그람-양성균(Gram-negative bacteria)로서는 한국생명공학연구원의 Korean Collection for Type Cultures(KCTC)로부터 분양받은 그람 양성균으로써 Bacillus subtilis (KCTC3068), Staphylococcus aureus (KCTC1621), S. epidermidis (KCTC1917)를, 그람 음성균으로써 Escherichia coli (KCTC1682), Psedomonas aeruginosa (KCTC1637), S. typhimurium (KCTC1926)를 그 대상으로 하였으며, 항생제 내성균으로서는 항생제 내성균주은행 (Culture collection of antimicrobial resistant microbe)으로부터 MRSA (CCARM3089), MRSA (CCARM3090), MRSA (CCARM3108), MRSA (CCARM3114), MRSA (CCARM3126), MDRST (CCARM8003), MDRST (CCARM8007), MDRST (CCARM8009), MDREC (CCARM1229), MDREC (CCARM1238), MDRPA (CCARM2002), MDRPA (CCARM2003), MDRPA (CCARM2095), MDRAB (CCARM12035), MDRAB (CCARM12036), MDRAB (CCARM12037)를 대상으로 하였다. 세균수가 ml 당 2×10⁶ colony-forming units (CFUs)가 되도록 1% peptone으로 희석하고 50 ㎕씩 96-웰 마이크로적정 플레이트(microtiter plate)에 분주한 후, 1% peptone으로 희석한 펩타이드 용액 (2:1 단계적으로 희석된 용액)을 각 웰에 50 ㎕씩 첨가한다. 플레이트를 37℃에서 18시간 동안 배양 한 후 ELISA판독기 (Bio-Tek Instruments)로 620nm에서 각 웰의 흡광도를 측정하여 펩타이드의 최소성장억제농도 (MIC: minimal inhibitory concentration)를 결정한다. 대조군의 펩타이드로서 항균 펩타이드 melittin과 9Pbw3를 사용하였다.

그 결과 신규하게 설계된 서열번호 1 내지 7의 7종의 항생 펩타이드 중에서 서열번호 4와 5의 항생 펩타이드는 그람 양성균 및 그람 음성균에 대하여 비교 펩타이드인 9Pbw3와 비슷하거나 우수한 항균 활성을 나타내었으며, 16종의 다제내성균에 대하여 서열번호 4와 6의 항생 펩타이드는 비교 펩타이드 보다 우수한 활성을 나타내었으며, 서열번호 1, 5, 7의 항생 펩타이드는 비교 펩타이드인 9Pbw3와 비슷한 활성을 나타내었다. 그 결과 우수한 활성을 보이는 서열번호 4와 5의 두 개의 펩타이드 모두 대조군인 9Pbw3보다 비슷하거나 다소 높은 항균활성을 가져 성공적으로 펩타이드 설계가 이루어졌음을 알 수 있었다.

	최소생장억제농도 MIC (μM)
	서열번호 1:9Pbw3-1	서열번호 2:9Pbw3-2	서열번호 3:9Pbw3-3	서열번호 2:9Pbw3-4	서열번호 5:9Pbw3-5	서열번호 6:9Pbw3-6	서열번호 7:9Pbw3-7	비교펩타이드: 9Pbw3	비교펩타이드: melittin
E. coli	4.0	2.0	4.0	2.0	1.0	2.0	2.0	2.0	4.0
P. aeruginosa	8.0	16	32	8.0	8.0	8.0	8.0	8.0	4.0
S. typhimurium	8.0	16	32	8.0	4.0	8.0	16	8.0	4.0
B. subtilis	2.0	4.0	16	2.0	2.0	4.0	2.0	2.0	4.0
E. epidermidis	4.0	8.0	16	4.0	2.0	4.0	8.0	4.0	2.0
S. aureus	4.0	8.0	16	4.0	2.0	4.0	4.0	4.0	4.0

표 2는 그람 양성균 및 그람 음성균에 대한 항생 펩타이드의 항균 활성

	최소생장억제농도 MIC (μM)
	서열번호 1:9Pbw3-1	서열번호 2:9Pbw3-2	서열번호 3:9Pbw3-3	서열번호 2:9Pbw3-4	서열번호 5:9Pbw3-5	서열번호 6:9Pbw3-6	서열번호 7:9Pbw3-7	비교펩타이드: 9Pbw3	비교펩타이드: melittin
S. typhimurium 8003(R)	16	64	64	16	16	16	16	16	8.0
S. typhimurium 8007(R)	16	64	64	16	32	16	16	16	8.0
S. typhimurium 8009(R)	16	32	64	16	16	16	16	16	8.0
E. coli 1229(R)	16	32	64	16	8.0	16	16	16	8.0
E. coli 1238(R)	16	32	64	16	16	16	16	16	8.0
S. aureus 3089(R)	16	16	32	8.0	8.0	8.0	8.0	8.0	8.0
S. aureus 3090(R)	8.0	8.0	16	4.0	4.0	4.0	4.0	4.0	4.0
S. aureus 3108(R)	4.0	8.0	8.0	4.0	4.0	4.0	4.0	4.0	4.0
S. aureus 3114(R)	4.0	8.0	16	4.0	4.0	2.0	4.0	4.0	4.0
S. aureus 3126(R)	4.0	16	16	8.0	8.0	4.0	4.0	4.0	4.0
P. aeruginosa 2002(R)	8.0	16	16	8.0	16	8.0	8.0	8.0	16
P. aeruginosa 2003(R)	16	16	16	8.0	16	8.0	8.0	8.0	16
P. aeruginosa 2095(R)	8.0	16	16	8.0	16	8.0	8.0	8.0	8.0
A. baumanii 12035(R)	16	16	16	16	16	16	16	16	8.0
A. baumanii 12036(R)	16	16	16	16	16	16	16	16	8.0
A. baumanii 12037(R)	16	16	16	8.0	16	16	16	16	8.0

표 3은 항생제 내성균에 대한 항생 펩타이드의 항균 활성

실시예 3: 항여드름균활성의 측정

서열번호 1 내지 7로 표기되는 펩타이드의 항균활성을 측정하기 위하여 다음과 같이 실시하였다. 4종의 여드름 균주는 한국생명공학연구원의 Korean Collection for Type Cultures(KCTC)로부터 분양받은 균주로서, P. acnes (KCTC3314), P. acnes (KCTC3320), P. acnes (KCTC5527), P. acnes (KCTC5933)를 그 대상으로 하였으며, 항생 펩타이드는 128 μg/ml이 되도록 MH(Muller Hinton)배지에 녹여 만들어 serial dilution하였다. P. acnes균을 5% sheep blood가 포함된 triptic soy agar배지에 striking하여 2~3일 정도 콜로니가 적당히 나타날 때까지 키운 후, 미리 준비해 둔 McFaland nephleometer standards 0.5 (1% Barum chloride (0.05 ml) + 1% Sulfuric acid (9.95 ml))의 탁도와 동일하게 하면 균의 농도는 1X10⁸ cells/ml이었다. 이 균을 MH배지에 1/20으로 희석하면, 이 때의 균의 농도는 5X10⁶ cells/ml이었다. 희석된 균을 serial dilution된 항생 펩타이드 100 μl에 10 μl씩 분주하면 균의 최종 농도는 5X10⁵ cells/ml이며 37℃에서 3일 이상 배양하였다.

그 결과 4종의 여드름균주에서 서열번호 4와 5의 두 개의 항생 펩타이드 모두 대조군인 9Pbw3보다 탁월하게 우수한 항균활성을 보이며 여드름 치료제로 상용화 되어있는 비교화합물인 triclosan과 benzoyl peroxide와 비교하였을 때 거의 모든 균주에서 비슷하거나 조금 우수한 활성을 나타내는 것으로 보아 성공적으로 펩타이드 설계가 이루어졌음을 알 수 있었다.

	최소생장억제농도 MIC (μM)
	서열번호 1:9Pbw3-1	서열번호 2:9Pbw3-2	서열번호 3:9Pbw3-3	서열번호 2:9Pbw3-4	서열번호 5:9Pbw3-5	서열번호 6:9Pbw3-6	서열번호 7:9Pbw3-7	비교펩타이드: 9Pbw3	비교화합물: triclosan	비교화합물: benzoyl peroxide
P. acnes (KCTC3314)	52	104	104	27	24	52	54	50	14	33
P. acnes (KCTC3320)	26	52	52	27	24	52	54	50	28	33
P. acnes (KCTC5527)	52	52	52	27	24	52	54	50	28	33
P. acnes (KCTC5933)	26	104	104	27	49	26	54	50	28	66

표 4는 여드름균에 대한 항생 펩타이드의 항균 활성

실시예 4: 항진균 및 항비듬균 활성의 측정

서열번호 1 내지 7로 표시되는 펩타이드의 항진균활성을 측정하기 위해 다음과 같이 실시하였다. 칸디다균과 말라세지아의 곰팡이 균을 사용하였으며, 한국생명공학연구원의 Korean collection for Type Cultures (KCTC)로부터 분양 받은 Malassezia furfur (KCTC7743), M. globosa (KCTC7846), M. sympodialis (KCTC7985), M. pachydermatis (KCTC17008), M. sloofiae (KCTC17431), M. dermatis (KCTC17610), M. yamatoensis (KCTC17656), M. obtusa (KCTC7847)과 Candida albicans (KCTC7270)를 대상으로 하였다. 칸디다균은 YM배지에서 24시간 동안 배양하였며, 말라세지아균은 1% 올리브유가 첨가된 Sabouraud dextrose배지에서 24시간 동안 배양한 후, 세포 농도를 hemocytometer를 이용하여 측정하여, 2Ｘ10⁴cells/ml이 되도록 1% peptone으로 희석한 후, 96-웰 마이크로적정 플레이트(microtiter plate)에 100㎕씩 분주한 후, 1% peptone으로 희석한 펩타이드 용액 (2:1 단계적으로 희석된 용액)을 각 웰에 100㎕씩 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 48시간 동안 배양한 후 각각의 웰에 MTT(3-(4, 5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide)용액을 첨가하여, MTT say 방법에 따라 ELISA Microplate Reade를 이용하여, 580nm에서 각 웰의 흡광도를 측정하여 곰팡이에 대한 펩타이드의 최소생장억제농도(MIC: minimum inhibitory concentration)를 결정하였다. 대조군의 펩타이드로서 항균 펩타이드 melittin과 9Pbw3를 사용하였다. 또한 비듬 삼푸 치료제의 성분으로 알려진 시클로 피록시올아민과 피리티온 아연 (Zinc pyrithione)과 함께 비교하였다.

그 결과 서열번호 1, 4, 5, 6, 7의 항생 펩타이드는 칸디다균과 모든 말라세지아균에서 비교 펩타이드인 melittin과 9Pbw3와 비슷하거나 조금 낮은 활성을 보였다. 또한 비듬균 치료제로 시중에서 널리 사용되고 있는 시클로 피록시올아민과 피리티온 아연의 비교 화합물과 비교했을 때에도 비슷하거나 조금 낮은 진균 억제 효과를 보여 칸디다균 및 비듬균 억제제 후보물질로 능력을 확인하였다.

최소생장억제농도MIC(μM)
Fungal strains	서열번호 1:9Pbw3-1	서열번호 2:9Pbw3-2	서열번호 3:9Pbw3-3	서열번호 2:9Pbw3-4	서열번호 5:9Pbw3-5	서열번호 6:9Pbw3-6	서열번호 7:9Pbw3-7	비교펩타이드:9Pbw3	비교펩타이드:Melittin	비교화합물:Zinc pyrithione	비교화합물:Ciclopirox olamine
C. albicans	2.0	16	4.0	2.0	4.0	2.0	2.0	2.0	4.0	-	-
M. pachydermatis	8.0	16	16	4.0	8.0	8.0	8.0	4.0	2.0	1.6	19
M. dermatis	8.0	16	16	8.0	8.0	8.0	8.0	8.0	4.0	6.3	75
M. sloofiae	8.0	16	16	4.0	4.0	8.0	8.0	4.0	2.0	1.6	38
M. yamatoensis	16	32	32	16	16	16	16	16	1.0	1.6	19
M. furfur	16	16	16	8.0	8.0	8.0	8.0	8.0	4.0	1.6	38
	8.0	8.0	8.0	4.0	8.0	4.0	4.0	4.0	2.0	1.6	38
M. globosa
	8.0	16	16	8.0	8.0	8.0	8.0	4.0	4.0	3.1	38
M. sympodialis
	8.0	16	16	8.0	8.0	8.0	8.0	4.0	2.0	3.1	38
M. obitus

표 5는 비듬균에 대한 항생 펩타이드의 항균 활성

실시예 5: 용혈활성의 측정

서열번호 1 내지 7로 표기되는 펩타이드에 대하여, 사람의 적혈구 용혈활성을 통하여 세포독성 여부를 판별하기 위하여 다음과 같이 실시하였다. 사람의 적혈구(human erythrocytes)를 PBS(phosphate-buffered saline: 35 mM 포스페이트 완충용액/150 mM NaCl의 혼합용액, pH 7.4)으로 희석한 후 원심력 1000g로 10분간 원심분리 하는 것에 의하여 3회 세척한다. PBS로 희석한 8.0% 적혈구 용액을 96-웰 마이크로적정 플레이트(microtiter plate)에 100㎕씩 로딩한 후, 펩타이드 용액 100㎕씩 섞어 준 후, 37℃에서 1 시간동안 배양한 후, 96-웰 마이크로적정 플레이트를 원심력 1000g로 5분간 원심분리 한다. 상층액 100㎕씩 취하여 다른 96-웰 마이크로적정 플레이트에 옮긴 후, 405 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 또한, 대조군 펩타이드로, melittin과 9Pbw3를 사용 하였다. 이때, 0.1% 트리톤 X-100로 처리하였을 경우의 값을 100% 용혈로 계산하고, 펩타이드의 용혈활성(세포파괴 정도)을 % hemolysis로서 수학식 1에 의하여 산출하였다. 여기서 A는 펩타이드 용액에서의 405 nm의 흡광도이고, B는 0.1% 트리톤 X-100에서의 405 nm의 흡광도이고, C는 PBS 용액에서의 405 nm의 흡광도를 나타낸다. 이 때 대조군의 펩타이드로서 강한 용혈활성을 나타내는 항균 펩타이드로서는 melittin를 사용하였다.

도 1에 나타낸 바와 같이 서열번호 1 내지 7로 표기되는 발명 펩타이드는 비교 펩타이드인 9Pbw3보다 낮은 용혈 활성을 나타내었으며, 비교 펩타이드인 9Pbw3를 비롯하여 서열번호 1 내지 7의 항생 펩타이드는 모두 MIC보다 훨씬 높은 농도인 12.5uM에서 전혀 용혈활성을 보이지 않았다. 비교 펩타이드인 9Pbw3보다 낮은 소수성정도를 보이는 서열번호 2, 3, 5의 항생 펩타이드는 50uM에서도 전혀 용혈 활성을 보이지 않았으며, 비교 펩타이드인 9Pbw3와 비슷한 정도의 소수성을 보이는 서열번호 1, 4, 6, 7의 항생 펩타이드는 비교 펩타이드인 9Pbw3가 50uM 농도 처리 시 10% 정도의 용혈 활성을 보이는데 비하여, 50uM의 펩타이드 처리 시 5% 미만의 낮은 용혈 활성을 나타내는 것을 확인하였다.

실시예 6: 쥐의 대식세포에 대한 독성측정

서열 1 내지 7로 표기되는 펩타이드들에 대해 포유류 세포주에 대한 독성여부를 판별하기 위하여 다음과 같이 실험을 실시하였다. 쥐의 대식세포를 10% 소태아혈청 (FBS: fetal bivine serum)을 포함하는 세포배양 배지인 RPMI1640 배양액으로 37℃의 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 96-웰 마이크로적정 플레이트(microtiter plate)의 각 웰에 2X10⁴ 세포수가 되도록 RPMI1640 배양액 100μL씩 분주한 후, 37℃의 5% CO₂ 배양기에서 하룻밤 (overnight)동안 배양한다. 배지를 제거한 플레이트에 100μM부터 2배의 농도로 희석한 펩타이드를 10% 소태아혈청이 제외된 RPMI1640 배양배지와 함께 배양된 쥐의 대식 세포에 처리한다. 이때 음성 대조군으로는 펩타이드를 처리한지 않고 배양액만을 넣은 것으로 비교하였다. 세포가 분주된 플레이트를 37℃의 5% CO₂ 배양기에서 하룻밤 (overnight)동안 배양한다. MTT [3-(4, 5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide]용액 (MTT를 5mg/ml되게 PBS에 녹인 용액) 20μl씩을 플레이트 각 웰에 분주하고 37℃에서 4시간 동안 배양한다. 생존세포의 미토콘드리아 효소에 의해 생성된 MTT formazan에 100μL의 DMSO(Dimethyl sulfoxide)을 처리한 후, 각 웰의 생존세포율 (% Survival)을 ELISA판독기로 570nm에서 흡광도를 측정하였다. 펩타이드를 처리한 웰의 흡광도 값을 펩타이드를 처리하지 않는 대조군 세포가 들어 있는 흡광도 값으로 나눈 백분율로 펩타이드의 세포독성을 측정하였다.

도 2에 나타난 바와 같이 비교 펩타이드인 9Pbw3와 항생 펩타이드인 서열번호 1 내지 7의 펩타이드 모두 활성을 가지는 농도에서 100%의 생존률을 보였으며, 인간의 표피세포에 대해서도 독성이 아주 적은 것을 확인하였다.

실시예 7: Raw264 .7 cell 에서 Pathogen LPS 자극에 의해 생성되는 NO( nitrite oxide)의 생산 억제 측정

서열번호 1 내지 7으로 표기되는 펩타이드에 대하여 항염증 활성작용에 효과적인지 알아보기 위하여 다음과 같이 실시하였다. 마우스의 대식세포 Raw264.7세포를 10% 소태아혈청 (FBS: fetal bovine serum), 1% antibiotics (100U/mL penicillin, 100ug/mL streptomycin)를 포함하는 RPMI1640배양액으로 5% CO₂ 존재 하에서 37℃에서 배양하였다. 96-웰 마이크로적정 플레이트(microtiter plate)의 각 웰에 1×10⁵ 세포수가 되도록 RPMI1640배양액 200㎕씩 분주한다. 이때 음성 대조군으로는 배양액만을 넣은 것을 사용하였고, 양성 대조군은 LPS 처리한 배양액만 넣은 것을 사용하였다. 96-웰 마이크로적정 플레이트를 5% CO₂ 배양기에서 37℃에서 하룻밤(overnight) 배양 한 후, cell proliferation assay에 의해 펩타이드 최고농도(10uM)에서 세포독성이 전혀 없음을 확인한 서열번호 1, 2에 해당하는 펩타이드를 마우스 대식세포 (RAW264.7 cell)에서 한 시간 반응 시키고, 이후 그람 음성균 세포벽을 구성하는 성분이며, 염증을 일으키는 pathogen으로 알려진 LPS (lipopolysaccharide)로 자극을 주어 24시간 배양한다. 24시간 동안 배양 이후 배양 상등액 100ul와 동량의 Griess Reagent 시약으로 반응시킴으로 배양 상등액에 녹아져 있는 NO (nitrite oxide)양을 ELISA판독기 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA)를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다. NO양은 standard (NaNO₂)의 흡광도 값과 비교하여 정량한다.

도 3에서 확인할 수 있듯이 비교 펩타이드인 9Pbw3와 비슷한 소수성을 보이는 서열번호 1, 4, 6, 7의 항생 펩타이드는 펩타이드를 전혀 처리하지 않은 control의 NO수치와 비교했을 때, 펩타이드 농도가 증가함에 따라 효과적으로 NO생산 억제 능력을 확인할 수 있었고, 다른 유도체보다 유효전하가 양전하성이 높은 서열번호 5의 항생 펩타이드인 경우도 비교 펩타이드인 9Pbw3보다 약하지만 농도에 따라 NO 생산을 억제시키며 항염증 활성을 보이는 것으로 확인하였다. 이를 통해 항생 펩타이드의 소수성과 유효전하량이 nitrite oxide에 의한 염증반응을 억제하는데 중요한 구성요소라고 예측할 수 있다.

<110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp. <120> Antibiotic peptide analogues with high activities against multidrug resistant bacteria and fungi and anti-inflammatory activities designed from Protaetiamycine and their uses <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 1 Arg Leu Trp Leu Ala Ile Phe Arg Arg 1 5 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 2 Arg Leu Trp Ala Ala Ile Trp Arg Arg 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 3 Arg Leu Trp Leu Ala Ala Trp Arg Arg 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 4 Arg Leu Trp Leu Ala Ile Leu Arg Arg 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 5 Arg Arg Trp Leu Ala Ile Trp Arg Arg 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 6 Arg Leu Phe Leu Ala Ile Trp Arg Arg 1 5 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 7 Arg Leu Leu Leu Ala Ile Trp Arg Arg 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 8 Arg Leu Trp Leu Ala Ile Trp Arg Arg 1 5

Claims (8)

1. 서열번호 1 내지 7로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 펩타이드 군으로부터 선택된 하나의 항생 펩타이드.
2. 제1항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항균용 약학 조성물.
3. 제 2항에 있어서, 상기 조성물은 그람양성균으로 B. subtilis, S. aureus , S. epidermidis, 그람 음성균으로써 E. coli, P. aeruginosa, S. typhimurium로 이루어진 군에서 선택되는 어느 균주에 대하여 항균 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 조성물.
4. 제 2항에 있어서, 상기 펩타이드의 유효량은 1uM에서 20uM 인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
5. 제 2항에 있어서, 상기 조성물은 사람의 적혈구 세포, 상피세포로 이루어진 군에서 선택되는 어느 세포주에 대하여 독성을 가지지 않는 것을 특징으로 하는 조성물.
6. 그람 양성균, 그람 음성균, 다제내성균 및 진균으로 구성된 군으로부터 선택된 미생물의 세포막에 작용하는 서열번호 1 내지 7로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 펩타이드 군으로부터 선택된 하나의 항생 펩타이드.
7. 서열번호 1 내지 7로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 펩타이드 군으로부터 선택된 하나의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항염증용 약학 조성물.
8. 서열번호 1 내지 7로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 펩타이드 군으로부터 선택된 하나의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물.

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