CN115850368B - 一种短链抗菌肽及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种短链抗菌肽及其应用，属于生物医用技术领域。本发明的一种新型抗菌肽，抗菌肽的氨基酸序列为Arg‑Trp‑Pro‑Ile‑Leu，该抗菌肽具有序列链短、广谱抗菌活性、低毒性、无溶血毒性的特点。本发明的抗菌肽可用于制备抗菌敷料、制备预防或治疗细菌感染的药物，其对耐药菌(大肠杆菌、金黄葡萄球菌等)及真菌(白色念球菌)的抗菌效果较好。本发明的抗菌肽的氨基酸序列大大缩短，大幅降低了生产成本，且具有良好的生物安全性，不易引起耐药性，其有望成为新型抗生素的候选药物，在临床抗菌药物中具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种新型短链抗菌肽及应用，确切的说是一种氨基酸序列又短抗菌性又好的多肽及利用该抗菌肽合成的抗菌敷料。
背景技术
近几年来，为解决抗生素滥用的问题，筛选具有优异抗菌性能和生物相容性的抗菌材料迫在眉睫。抗菌肽(AMPs)作为常规抗生素的潜在替代品从而引起了极大的关注，抗菌肽具有良好的生物相容性，且抗菌肽能凭借独特的膜破坏和多靶向抗菌机制，主动杀死抗生素耐药微生物，使细菌等不产生耐药性。
目前开发的抗菌肽中，具有较好抗菌性的抗菌肽氨基酸序列都较为繁琐，生产成本高，细胞毒性相对也会较高。简单的抗菌肽抗菌性能都有所偏差，不能做到广谱抗菌等特性，尚无具有氨基酸序列短及抗菌性能优良同时具备的抗菌肽，给抗菌敷料制备等情况带了不便。
发明内容
本发明的目的在于提供一种短链新型抗菌肽，该抗菌肽，具有氨基酸序列短，抗菌性能优良等优点。可用于制备抗菌敷料、制备预防或治疗细菌感染的药物，其对耐药菌(大肠杆菌、金黄葡萄球菌等)及真菌(白色念球菌)的抗菌效果较好。
为实现发明目的，本申请采用下述技术方案：
一种短链抗菌肽，所述的短链抗菌肽氨基酸序列为Arg-Trp-Pro-Ile-Leu。
所述的短链抗菌肽在制备针对开放性伤口的抗菌药剂及抗菌敷料中的应用。
所述的应用：所述的菌包括革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和白色念球菌。
所述抗菌肽对大肠杆菌的最小抑菌浓度为200μg/mL；
所述抗菌肽对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为180μg/mL；
所述抗菌肽对白色念珠菌的最小抑菌浓度为80μg/mL。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
(1)通过本发明制备的抗菌肽，氨基酸序列短，制备工艺简单，成本较低，重复性较好；
(2)通过本发明制备的抗菌肽具有广谱抗菌性，能抑制革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和真菌；
(3)通过本发明制备的抗菌肽生物相容性较好，且不使细菌产生耐药性；
(4)通过本发明制备的抗菌肽制备的抗菌敷料，抗菌性较好且无毒无害。
附图说明
图1是实施例1所得的抗菌肽和抗菌敷料针对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及白色念球菌的抑菌圈实验效果图；
图2是实施例1所得的抗菌肽对于大肠杆菌的最小抑菌浓度；
图3是实施例1所得的抗菌肽对于金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度；
图4是实施例1所得的抗菌肽对白色念球菌的最小抑菌浓度；
图5是实施例1所得的抗菌肽的稳定性测试；
图6是实施例1所得的抗菌肽和抗菌敷料细胞存活率图；
图7是实施例1所得的抗菌肽细胞活死图；(a)抗菌肽在细胞中孵育24h活细胞图、(b)抗菌肽在细胞中孵育24h死细胞图、(c)抗菌肽在细胞中孵育72h活细胞图、(d)抗菌肽在细胞中孵育72h死细胞图；
图8是实施例1所得的抗菌敷料细胞活死图；(a)抗菌敷料在细胞中孵育24h活细胞图、(b)抗菌敷料在细胞中孵育24h死细胞图，(c)抗菌敷料在细胞中孵育72h活细胞图、(d)抗菌敷料在细胞中孵育72h死细胞图；
图9是实施例1所得的抗菌肽和抗菌敷料溶血率图；
图10是实施例1所得的抗菌肽和抗菌敷料共孵育红细胞形态图；
图11是实施例1所得抗菌肽和抗菌敷料对哺乳动物创伤抗感染模型试验。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
抗菌肽制备
采用Fmoc方法的固相合成多肽，(1)首先，使用10mLDMF溶胀0.5g二氯三苯甲基氯树脂90min，加入0.36g精氨酸和100uL DIEA反应2h，再加入5mL甲醇和100uL DIEA封闭未反应的linker。使用5mL 20％哌啶溶液进行Fmoc保护基的脱除。(2)然后，再依次加入0.45g色氨酸、0.58g PyBoP、0.15g HoBT和100uL DIEA反应2h，再使用5mL 20％哌啶溶液进行Fmoc保护基的脱除；(3)重复上述步骤(2)依次将色氨酸替换为0.42g脯氨酸、0.475g异亮氨酸、0.38g亮氨酸。(4)最后，使用切割剂(TFA:水:三异丙基硅烷＝95:2.5:2.5)进行切割，在10mL乙醚中析出多肽，最后在冻干机中冻干备用。
抗菌敷料制备
将1g硬脂醇、2g凡士林和3mL液体石蜡置于70℃的水浴锅上加热溶解，作为抗菌敷料的油相基质，另取抗菌肽0.5g，甘油1.5g，月桂醇硫酸钠0.2g，尼泊金乙酯0.02g，蒸馏水12mL置于30℃的水浴锅上加热溶解，作为抗菌敷料的水相基质，将溶解好的水相在500r/min搅拌条件下缓缓加入油相中，不断搅拌至冷凝即可。
调节抗菌肽溶液浓度，可以得到不同浓度的抗菌敷料。
抗菌肽及抗菌敷料抑菌性
本实施例制备的抗菌肽干燥后溶解于蒸馏水中进行抑菌圈实验。结果显示，本实施例制备的抗菌肽具有良好的抗菌性。
本实施例制备的抗菌敷料进行抑菌圈实验。结果显示，本实施例制备的抗菌敷料具有良好的抗菌性。
抗菌肽最小抑菌浓度
使用前，所有细菌首先在LB平板上于37℃培养24h。挑选单个细菌菌落并接种到LB肉汤中，然后在37℃下以300rpm摇动孵育过夜。接下来，将50μL细菌悬浮液添加到5mL新鲜LB肉汤中，并在37℃下孵育直至达到对数中期。作为抗微生物剂的重要指标，此处评估了抗菌肽的最小抑菌浓度(MIC)。简而言之，将2mL浓度在0至400μg/mL范围内的多肽灭菌溶液添加到离心管中，然后添加100μL预制细菌悬浮液(1×107CFU/mL)。在37℃下以100rpm的温和摇动孵育2小时后，将100μL的混合物均匀铺板在LB培养上，并在37℃孵育24小时后对菌落进行计数。仅将微生物悬液用作阴性对照，将含有抗生素(青霉素-链霉素)的微生物悬液用作阳性对照。
抗菌肽热稳定性
本实例制备的抗菌肽，配制1mg/mL。将其煮沸0、15、30、30、45、60、75、90、105和120分钟，再使用进行高效液相色谱仪进行检测，最后通过观察峰面积大小，来测试抗菌肽抗菌肽的热稳定性。最后，以空白对照为基础进行归一化作图，来表现测试抗菌肽的热稳定性。结果显示，具有较好的热稳定性。
抗菌肽pH稳定性
本实例制备的抗菌肽，配制1mg/mL，用各种pH缓冲液(pH＝2～12)处理。使用进行高效液相色谱仪进行检测，最后通过观察峰面积大小，来测试抗菌肽pH的稳定性。最后，以空白对照为基础进行归一化作图，来表现测试抗菌肽pH的稳定性。结果显示，抗菌肽具有更广泛的pH适应性，更加方便其用于饲料加工和药物的生产。
抗菌肽氧化稳定性
本实例制备的抗菌肽，配制1mg/mL，用各种不同浓度的H2O2处理。使用进行高效液相色谱仪进行检测，最后通过观察峰面积大小，来测试抗菌肽抗氧化性的稳定性。最后，以空白对照为基础进行归一化作图，来表现测试抗菌肽抗氧化性的稳定性。结果显示，抗菌肽具有一定的抗氧化性。
抗菌肽及抗菌敷料细胞毒性
本实例制备的抗菌肽和抗菌敷料使用MTT法检测其细胞毒性，将抗菌肽溶液和抗菌敷料孵育液在细胞中孵育分别孵育24、48、72h，用酶标仪测细胞存活率，然后经AM/PI染色，在倒置荧光显微镜下观察细胞活死情况。结果显示，本实例制备的抗菌肽和抗菌敷料无细胞毒性，细胞存活率较高，表明其生物相容性较好。
抗菌肽及抗菌敷料溶血性
将不同浓度抗菌肽溶液和抗菌敷料孵育液与新鲜血液分别孵育，离心取上清液用酶标仪测试溶血率，用扫描电镜下观察红细胞形态情况。结果显示，本实例制备的抗菌肽和抗菌敷料无溶血性，红细胞形态较好，表明其生物相容性较好。
抗菌肽及抗菌敷料哺乳动物体内抗感染模型试验
分别将消毒PBS、金黄色葡萄球菌悬液(107CFU/mL)、抗菌肽和金黄色葡萄球菌悬液(107CFU/mL)、抗菌敷料和金黄色葡萄球菌悬液(107CFU/mL)治疗KM小鼠创伤伤口，每天测量小鼠的伤口面积和体重。结果显示，添加抗菌肽和抗菌敷料的组，伤口愈合较快，表明该抗菌肽能够促进伤口愈合，具有促伤口愈合功能。
图1是实施例1所得的抗菌肽和抗菌敷料抑菌圈图，(a)抗菌肽对金黄葡萄球菌、白色念球菌、大肠杆菌抑菌性(b)普通敷料对金黄葡萄球菌、白色念球菌、大肠杆菌抑菌性(c)抗菌肽敷料对金黄葡萄球菌、白色念球菌、大肠杆菌抑菌性，由图可知，该抗菌肽具有较好的抑菌性；
图2、3、4是实施例1所得的抗菌肽最小抑菌浓度图，2是抗菌肽对大肠杆菌最小抑菌浓度图，3是抗菌肽对金黄葡萄球菌最小抑菌浓度图，4是抗菌肽对白色念球菌最小抑菌浓度图，由图可知，该抗菌肽对大肠杆菌的最小抑菌浓度为200μg/mL、对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为180μg/mL、对白色念珠菌的最小抑菌浓度为80μg/mL；
图5是实施例1所得的抗菌肽稳定性图，(a)温度对抗菌肽稳定性影响(b)pH对抗菌肽稳定性影响(c)过氧化氢对抗菌肽稳定性影响，由图可知，该抗菌肽具有较好的稳定性；
图6、7、8是实施例1所得的抗菌肽及抗菌敷料的细胞毒性数据，图2细胞存活率数据；图3为抗菌肽细胞活死数据，(a)抗菌肽在细胞中孵育24h活细胞图、(b)抗菌肽在细胞中孵育24h死细胞图、(c)抗菌肽在细胞中孵育72h活细胞图、(d)抗菌肽在细胞中孵育72h死细胞图，图4为抗菌敷料细胞活死数据，(a)抗菌敷料在细胞中孵育24h活细胞图、(b)抗菌敷料在细胞中孵育24h死细胞图，(c)抗菌敷料在细胞中孵育72h活细胞图、(d)抗菌敷料在细胞中孵育72h死细胞图，由图可知，在该抗菌肽和抗菌敷料孵育中的细胞存活率良好，无细胞毒性；
图9、10是实施例1所得的抗菌肽及抗菌敷料的溶血性数据，图9溶血率数据；图10为红细胞形态图，由图可知，该抗菌肽溶血率较低，红细胞形态良好，无溶血性；
图11是实施例1所得的抗菌肽及抗菌敷料对哺乳动物感染伤口的促伤口愈合数据图，由图可知，该抗菌肽及抗菌敷料具有促伤口愈合作用。
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (6)
1.一种短链抗菌肽，其特征在于，所述的短链抗菌肽氨基酸序列为Arg-Trp-Pro-Ile-Leu。
2.权利要求1所述的短链抗菌肽在制备针对开放性伤口的抗菌药剂及抗菌敷料中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的菌包括革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和白色念球菌。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述抗菌肽对大肠杆菌的最小抑菌浓度为200μg/mL；
所述抗菌肽对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为180μg/mL；
所述抗菌肽对白色念珠菌的最小抑菌浓度为80μg/mL。
5.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的开放性伤口为慢性难愈合伤口、手术缝合伤口、运动损伤、烧烫伤、运动擦伤一类的清洁或污染伤口。
6.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述抗菌肽应用于制备治疗革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌感染的广谱抗菌药物。
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