CN112321698B - 一种抗菌肽及其药物组合物以及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种抗菌肽及其药物组合物以及应用，所述抗菌肽包括：抗菌肽1、抗菌肽2、抗菌肽3中的任意一种，抗菌肽1的氨基酸序列如SEQ ID No：1所示，抗菌肽2的氨基酸序列如SEQ ID No：2所示，抗菌肽3的氨基酸序列如SEQ ID No：3所示。三种抗菌肽均是以天然抗菌肽PGLa‑AM1为基础进行改造而成，具有抗菌效果更强、性能更优的特点。这三种抗菌肽对幽门螺杆菌的抑制效果均强于PGLa‑AM1，其中抗菌肽3的广谱抗菌效果最强，并且具有很好的pH响应性，从而更好的与幽门螺杆菌接触，抑制幽门螺杆菌生长。根据本发明提供的三种抗菌肽均具有强抑菌活性、生物相容性、及低成本的优点，有望被广泛应用。

Description

一种抗菌肽及其药物组合物以及应用

技术领域

本发明涉及医药领域，更具体地涉及一种抗菌肽及其药物组合物以及应用。

背景技术

自1983年人类发现幽门螺杆菌，到1985年澳大利亚的马歇尔医生喝下了一份含有幽门螺杆菌的培养液之后，幽门螺杆菌的神秘面纱才被揭开。后续的研究发现，幽门螺杆菌感染会100％引起慢性胃炎，而且还有1～2％的概率发展成胃癌、胃淋巴瘤等可怕的疾病。2017年10月27日，世界卫生组织国际癌症研究机构公布的致癌物清单初步整理参考，幽门螺杆菌在一类致癌物清单中。预防幽门螺杆菌的感染引起了人们广泛的关注，而幽门螺杆菌的耐药性是目前亟待解决的问题。

传统的治疗方法容易使细菌产生耐药性，使得无法根除幽门螺杆菌，因此耐药性成为了治疗幽门螺杆菌相关疾病的阻碍。抗菌肽一般是通过静电相互作用与细胞膜结合，然后短时间内进一步通过疏水相互作用和静电力来扰乱磷脂膜，使细菌的细胞膜破裂，最终导致细菌的死亡。因此，抗菌肽具有一定的微生物抗耐药性，并且可作为抑菌药物候选者。抗菌肽广泛存在于生物体内，具有生物相容性好、易修饰、广谱抗菌活性、不易使细菌产生抗性的特点。但是目前针对幽门螺杆菌的抗菌肽研究并不多，因而设计能在强酸性条件和中性条件下自由转换形态的抗菌肽，对于实现根除幽门螺杆菌，并且不破坏人体内的正常菌群就显得尤为重要。

目前报道的典型抗菌肽一般由10-100个氨基酸残基组成，含有很多碱性氨基酸并且一般都是两亲性的。有研究已报道从蛙科类分泌物中提取出来的宿主防御肽PGLa对幽门螺杆菌具有很好的杀伤力。也有从鱼体内分离出来的天然抗菌肽TP4，还有人体中分离出来的天然抗菌肽LL-37都对幽门螺杆菌具有很好的杀伤力。这些发现表明抗菌肽对幽门螺杆菌的治疗效果尤佳，还可作为抑菌添加剂添加到生活中常用的生活用品里，从而帮助我们更好的远离幽门螺杆菌。但是，现有抗幽门螺杆菌肽存在抗菌效果不强，不具有pH响应性，并且很多不具有广谱抗菌活性的缺陷。

发明内容

本发明的目的是提供一种抗菌肽及其药物组合物以及应用，从而解决现有技术中抗幽门螺杆菌肽抗菌效果不强，不具有pH响应性，并且很多抗幽门螺杆菌肽不具有广谱抗菌活性的问题。

为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

根据本发明的第一方面，提供一种抗菌肽，所述抗菌肽包括：抗菌肽1、抗菌肽2、抗菌肽3中的任意一种，所述抗菌肽1的氨基酸序列如SEQ ID No：1所示，所述抗菌肽2的氨基酸序列如SEQ ID No：2所示，所述抗菌肽3的氨基酸序列如SEQ ID No：3所示。

本发明提供了三种能有效抑制幽门螺杆菌生长的抗菌肽，该三种抗菌肽都是在天然抗菌肽PGLa-AM1(来源于非洲爪蟾，是一种含有22个氨基酸的短肽)的基础上进行设计改造得到的，该天然抗菌肽PGLa-AM1的氨基酸序列如SEQ ID No：4所示，具体为GMASKAGSVLGKVAKVALKAAL，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均具有抑制作用。本发明通过对其进行改造，得到了三种抗菌效果更强，性能更优的抗菌肽。

根据本发明的第二方面，提供一种上述抗菌肽在制备抗菌剂中的应用。

所述抗菌肽2和抗菌肽3对幽门螺杆菌的最低抑菌浓度为1μg/mL，所述抗菌肽1对幽门螺杆菌的最低抑菌浓度为4μg/mL。

所述抗菌肽3对大肠杆菌的最低抑菌浓度为4μg/mL，所述抗菌肽1和抗菌肽2对大肠杆菌的最低抑菌浓度为8μg/mL。

所述抗菌肽3对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为8μg/mL，所述抗菌肽1和抗菌肽2对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为16μg/mL。

根据本发明的第三方面，提供一种所述抗菌肽在制备抗幽门螺杆菌的药物中的应用。

根据本发明的第四方面，提供一种药物组合物，所述药物组合物是一种以抗菌肽1，抗菌肽2，抗菌肽3中的任意一种或其任意组合作为抑制幽门螺杆菌的主要成分的药物组合物。

根据本发明的第五方面，提供一种抑菌添加剂，所述抑菌添加剂包括：抗菌肽1、抗菌肽2、抗菌肽3中的任意一种或其任意组合，所述抑菌添加剂可被作为一种添加剂添加到生活用品中使用。

本领域公知，自组装是指小分子通过非共价键(氢键、静电相互作用、分子堆积力等)在特定条件下自发的有规律组装成超分子。根据本发明的研究发现，三种抗菌肽在中性条件下均会进行一定程度的自组装，其中抗菌肽3的自组装程度是最完全的，溶液中的抗菌肽分子全部以纤维的方式存在。而其他的抗菌肽自组装程度较小，都是形成很短的纤维或者是寡聚体的形式存在。但是到了酸性条件下(pH＝2)，四种抗菌肽都以单体或者微小寡聚体的形式存在。通过对比我们发现抗菌肽3具有很好的pH响应性。这一特性有利于抗菌肽在体内的运输，并且在胃部环境下能很好的分散开来，从而更好的与幽门螺杆菌接触，抑制幽门螺杆菌的生长。

根据本发明提供的抗菌肽，抗菌肽1、抗菌肽2、抗菌肽3均具有pH响应性，并且具有广谱抗菌的效果，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌具有很好的抑菌性能，特别是对幽门螺杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌均具有很好的抑菌和杀菌作用。其中，抗菌肽3的广谱抗菌效果最强，并且具有很好的pH响应性。相较于天然抗菌肽PGLa-AM1，改造后的抗菌肽的应用前景更广阔，可以作为一种胃部治疗药物配合其他药物使用或者作为抑制幽门螺杆菌的添加剂。

综上所述，本发明提供了三种具有强抑菌活性、高pH响应性、以及高生物相容性的抗菌肽，这三种抗菌肽可被用于制备抗菌剂，特别是制备一种抗幽门螺杆菌的药物，还可被作为一种抑菌添加剂添加到生活用品中使用，以帮助我们更好的远离幽门螺杆菌。因此，根据本发明提供的三种抗菌肽具有非常广阔的应用前景。

附图说明

图1分别示出了四种抗菌肽与磷脂膜相互作用的AFM图，操作条件为液相中进行实时动态原位成像观察，箭头所示的地方为开始注入抗菌肽到磷脂双分子层中；

图2分别示出了四种抗菌肽对幽门螺杆菌的最低抑菌浓度的结果；

图3分别示出了大肠杆菌在含有不同浓度的四种抗菌肽的LB培养基中的生长曲线；

图4分别示出了金黄色葡萄球菌在含有不同浓度的四种抗菌肽的LB培养基中的生长曲线；

图5分别示出了在不同pH下的抗菌肽自组装的原子力显微镜图像；

图6分别示出了不同pH条件下的THT荧光图，其中，a为pH＝2，b为pH＝7.4。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。

根据本发明所提供的三种抗菌肽都是在天然抗菌肽PGLa-AM1的基础上进行改造设计得到的，该天然抗菌肽PGLa-AM1(以下简称为GL22)的氨基酸序列如SEQ ID No：4所示：GMASKAGSVLGKVAKVALKAAL，本发明通过对其进行改造，得到了抗菌效果更强，性能更优的抗菌肽。

其中，抗菌肽1(以下简称为GD27)的氨基酸序列如SEQ ID No：1所示，GMASKAGSVLGKVAKVALKAALVFFAD；

抗菌肽2(以下简称为GE27)的氨基酸序列如SEQ ID No：2所示：GMASKAGSVLGKVAKVALKAALVFFAE；

抗菌肽3(以下简称为GE33)的氨基酸序列如SEQ ID No：3所示，GMASKAGSVLGKVAKVALKAALGHHQKLVFFAE。

本文使用氨基酸的通用单字母和三字母编码，如下所示：

G(Gly)甘氨酸M(Met)甲硫氨酸A(Ala)丙氨酸S(Ser)丝氨酸K(Lys)赖氨酸V(Val)缬氨酸L(Leu)亮氨酸D(Asp)天冬氨酸E(Glu)谷氨酸H(His)组氨酸F(Phe)苯丙氨酸。

实例1：四种抗菌肽与负电磷脂膜的相互作用

实验材料：

本实施例使用的四种抗菌肽均通过标准固相法合成得到。通过HPLC和ESI-MS确认抗菌肽纯度。二油酰磷脂酰甘油(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-(phospho-rac-(1-glycerol),DOPG),二油酰磷脂酰胆碱(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine,DOPC)，胆固醇(cholesterol)均采购自Avanti公司。

实验方法：

DOPC与DOPG按摩尔比为7：3模拟微生物的负电磷脂，分别混合后溶解在氯仿中，使用氮气吹干，HEPES缓冲溶液溶解磷脂，经过超声涡旋制备脂质体，在洁净的云母上孵育，制备磷脂双分子膜，然后加入0.1mg/mL的抗菌肽，通过原子力电子显微镜(AFM)观察。

结果如图1所示，这四种抗菌肽均能靶向负电磷脂膜并造成磷脂膜的破裂穿孔。该结果表明本发明设计的抗菌肽能特异性地对微生物的磷脂膜造成破坏，其中GE27和GE33的作用效果比较明显，负电磷脂膜的破裂速度最快，破裂强度最强。

实例2：四种抗菌肽对幽门螺杆菌的最低抑菌浓度

实验材料：幽门螺杆菌(百欧博伟生物科技有限公司)，脑心浸出肉汤培养基(杭州百思生物科技有限公司)，胎牛血清(GIBCO)。

实验方法：

1.取9g脑心浸出肉汤培养基用250mL纯水溶解后灭菌，灭菌后加入10％的胎牛血清。

2.配制四种抗菌肽的浓度至128μg/mL、64μg/mL、32μg/mL、16μg/mL、8μg/mL、4μg/mL、2μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL、0.25μg/mL、0.125μg/mL。

3.取5mL步骤1中培养基于12mL的摇菌管内，并加入50μL预先溶解好的幽门螺杆菌菌液，加盖(管口不要拧紧)。

4.将摇菌管置于厌氧袋内密封培养(180转摇菌过夜)。第二天菌液变混。菌液进行1000倍稀释后铺板至96孔板，每孔50μL。96孔板内再加入50μL相应浓度的抗菌肽。

5.将96孔板放于厌氧袋内置于37℃恒温培养箱内培养3天，在第48h后用酶标仪测定600nm出的吸光值。

四种抗菌肽对幽门螺杆菌的抑菌浓度如图2所示，在同样的操作体系中，发现GE27和GE33对幽门螺杆菌MIC值(最低抑菌浓度)均为1μg/mL，GD27为4μg/mL，而天然抗菌肽GL22对幽门螺杆菌的MIC值高达32μg/mL，该结果表明本发明的设计非常成功。

实例3：抗菌肽对大肠杆菌生长的影响

实验材料：LB肉汤培养基(购自青岛海博生物科技有限公司)。

实验方法：将处于对数中期的大肠杆菌稀释至5*10⁵/ml，10μL每孔接种至含有不同浓度抗菌肽的LB溶液中的96孔板中，220rpm，于37℃下在酶标仪中动态监测OD600的值(其中以天然抗菌肽GL22作为阳性对照组)。

结果如图3所示，抗菌肽对大肠杆菌生长有明显的抑制作用，且呈现浓度依赖性，GE33的最低抑菌浓度(MIC)为4μg/mL，GE27和GD27均为8μg/mL，具有很好的抑菌及杀菌效果。这说明本发明设计的三种抗菌肽均对革兰氏阴性菌具有很好的抑菌性能。

实例4：抗菌肽对金黄色葡萄球菌生长的影响

实验材料：LB肉汤培养基(购自青岛海博生物科技有限公司)。

实验方法，将处于对数中期的金黄色葡萄球菌稀释至5*10⁵/ml,10μL每孔接种至含有不同浓度抗菌肽的LB溶液中的96孔板中，220rpm，于37℃下在酶标仪中动态监测OD600的值。

结果如图4所示，三种抗菌肽对金黄色葡萄球菌的生长有明显的抑制作用，且呈现浓度依赖性，GE33的最低抑菌浓度(MIC)为8μg/mL，GE27和GD27均为16μg/mL，具有很好的抑菌及杀菌效果。这说明本发明设计的三种抗菌肽对革兰氏阳性菌具有很好的抑菌性能。通过上述实验说明设计的三种抗菌肽具有广谱抗菌活性。

实例5：抗菌肽的pH响应性

实验材料：PBS、THT(国药集团)

实验方法：

(1)先将三种抗菌肽在pH＝7.4，PBS条件下配置成浓度为1mg/mL的溶液，孵育5h后开始AFM扫描，用1mM的盐酸溶液将pH值调到2时再进行制样扫描。制样方法：取5μL样品滴加在洁净的云母片上，吸附5分钟后，用PBS冲洗干净，自然干燥后用原子力显微镜(NanoScopeVIII，Bruker)进行扫描观察形貌。

(2)在不同pH条件下测量抗菌肽组装体的二级结构。使用THT动态追踪抗菌肽自组装的动力学变化。将抗菌肽溶液和THT加入到96孔板中，加入PBS稀释至抗菌肽溶液的浓度为1mg/mL，使用的THT终浓度为12.5μM。使用酶标仪在激发波长440nm下动态监测24小时。

图5所示结果表明三种抗菌肽在中性条件下会进行一定程度的自组装，其中GE33的自组装程度是最完全的，溶液中的抗菌肽分子全部以纤维的方式存在。而其他的抗菌肽自组装程度较小，都是形成很短的纤维或者是寡聚体的形式存在。但是到了酸性条件下(pH＝2)，四种抗菌肽都以单体或者微小寡聚体的形式存在。通过对比我们发现GE33具有很好的pH响应性。图6中THT荧光实验进一步证明了GE33在中性环境下的自组装程度是最高的，同样条件下具有最强的荧光值。

以上所述的，仅为本发明的较佳实施例，并非用以限定本发明的范围，本发明的上述实施例还可以做出各种变化。凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰，皆落入本发明专利的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的均为常规技术内容。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院上海应用物理研究所

<120> 一种抗菌肽及其药物组合物以及应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Gly Met Ala Ser Lys Ala Gly Ser Val Leu Gly Lys Val Ala Lys Val

1 5 10 15

Ala Leu Lys Ala Ala Leu Val Phe Phe Ala Asp

20 25

<210> 2

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Gly Met Ala Ser Lys Ala Gly Ser Val Leu Gly Lys Val Ala Lys Val

1 5 10 15

Ala Leu Lys Ala Ala Leu Val Phe Phe Ala Glu

20 25

<210> 3

<211> 33

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Gly Met Ala Ser Lys Ala Gly Ser Val Leu Gly Lys Val Ala Lys Val

1 5 10 15

Ala Leu Lys Ala Ala Leu Gly His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala

20 25 30

Glu

<210> 4

<211> 22

<212> PRT

<213> 非洲爪蟾

<400> 4

Gly Met Ala Ser Lys Ala Gly Ser Val Leu Gly Lys Val Ala Lys Val

1 5 10 15

Ala Leu Lys Ala Ala Leu

20

Claims (8)

1.一种抗菌肽，其特征在于，所述抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID No：3所示。

2.一种根据权利要求1所述的抗菌肽在制备抗菌剂中的应用。

3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述抗菌肽对幽门螺杆菌的最低抑菌浓度为1 μg/mL。

4. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述抗菌肽对大肠杆菌的最低抑菌浓度为4 μg/mL。

5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述抗菌肽对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为8 μg/mL。

6.一种根据权利要求1所述的抗菌肽在制备抗幽门螺杆菌的药物中的应用。

7. 一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物是一种以根据权利要求1所述的抗菌肽作为抑制幽门螺杆菌的主要成分的药物组合物，其中，所述抗菌肽的氨基酸序列如SEQID No：3所示。

8. 一种抑菌添加剂，其特征在于，所述抑菌添加剂包括：根据权利要求1所述的抗菌肽，所述抑菌添加剂可被作为一种添加剂添加到生活用品中使用，其中，所述抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID No：3所示。

Images