CN117736292A - 一种纳米脂肽的制备及其在抗耐药细菌中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种纳米脂肽的制备及其在抗耐药细菌中的应用。本发明公开的一种纳米脂肽,为肉豆蔻酸与序列2或序列3所示的多肽N端的氨基酸残基缩合所形成的化合物。本发明通过改变天然抗菌肽的氨基酸组成和部分序列,并进行脂肪酸修饰,得到的短链脂肽可在去离子水中自组装形成纳米微粒,获得纳米脂肽,所得纳米脂肽具有高抗菌活性和耐盐能力,并保持较低细胞毒性。本发明对于微生物,特别是耐药病原菌的防治具有重大价值。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域中,一种纳米脂肽的制备及其在抗耐药细菌中的应用。
背景技术
抗生素在临床和畜牧业等方面的不合理使用导致细菌产生了严重的耐药性,甚至出现了对几乎所有抗生素耐药的“超级细菌”,这对人类健康造成了严峻挑战。相比以前,细菌获得耐药性的速度明显加快,新抗生素从投入临床使用后很短的时间就会产生相应的耐药菌株,比如最新获批上市的利柰唑胺和替加环素,仅使用一年后就检测出对其具有耐药性的病原菌。据报道,全球每年约有70万人因感染耐药细菌而死亡,若形势得不到改善,预计2050年全球每年约有1000万人死于耐药细菌引发的感染。因此,研发高效且不易诱发细菌产生耐药性的新型抗菌药物是对抗耐药细菌的有效手段,对保障人类健康具有重要意义。
自上世纪80年代以来,科学家相继从微生物、植物、无脊椎动物、两栖动物、哺乳动物和人体中分离得到多种具有抗菌活性的多肽,统称为抗菌肽,目前报告的种类已超过3000种。天然抗菌肽是一种典型的两亲性分子,同时含有亲水氨基酸和疏水氨基酸,长度一般小于50个氨基酸,生理pH值条件下净正电荷为+2至+9。细菌细胞膜结构中富含负电性的脂质双分子层,正电性的抗菌肽可通过静电作用吸附在细菌表面,破坏细胞膜的生物功能,同时疏水基团可穿透细胞膜,导致细胞膜破裂诱发细胞内容物渗漏,造成细菌死亡。此种抗菌机制使抗菌肽具有不易诱发细菌产生耐药性的优点。抗菌肽是新型抗菌药物研发的重要方向,将来或许能成为对付耐药细菌的有力武器。
天然抗菌肽的活性易受环境的盐浓度和离子种类的影响。过高的盐浓度会导致抗菌肽活性水平急剧下降。一价离子对抗菌肽活性影响较小,二价离子(如钙、镁离子)则可显著降低抗菌肽的活性。分析认为较高的盐浓度(>50mM)可能会影响抗菌肽的净正电荷量,进而降低其抗菌效果,而人体生理环境盐浓度约为150mM,一定程度限制了抗菌肽的临床应用。此外,抗菌肽的活性亦受其自身净正电荷的影响。在一定范围内,抗菌活性随着自身带电量的增加而升高,超过这个阈值不仅不会继续提升抗菌活性,反而会导致细胞毒性增加。因此,提升抗菌肽的活性和盐耐受能力、降低毒副作用可推动抗菌肽的实际应用。本发明利用脂肪酸对抗菌肽进行修饰,提升其疏水性和两亲性,增强细胞膜破膜能力。同时两亲性抗菌肽分子在水溶液中可通过疏水作用等相互作用自组装成大分子或超分子,可使抗菌肽的侧链更加紧密,展现出独特的理化性质,放大单分子单独作用的效果,可提升盐耐受能力。引入脂肪酸后,多肽的稳定性增强,氨基酸链长度可大幅缩短,极大地降低合成成本。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何抑制抗菌肽。
为解决上述技术问题,本发明首先提供了一种化合物,其为肉豆蔻酸与序列2所示的多肽N端的氨基酸残基缩合所形成的化合物。
本发明还提供了另一种化合物,其为肉豆蔻酸与序列3所示的多肽N端的氨基酸残基缩合所形成的化合物。
序列2所示的多肽,也属于本发明的保护范围。
序列3所示的多肽,也属于本发明的保护范围。
本发明还提供了与所述多肽相关的生物材料,其为下述B1)至B8)中的任一种:
B1)编码所述多肽的核酸分子;
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒;
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体;
B4)含有B2)所述表达盒的重组载体;
B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物;
B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物;
B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物;
B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物。
上述生物材料中,B2)所述的含有编码所述多肽的核酸分子的表达盒,是指能够在宿主细胞中表达所述多肽的DNA,该DNA不但可包括启动所述多肽基因转录的启动子,还可包括终止所述多肽基因转录的终止子。进一步,所述表达盒还可包括增强子序列。
可用现有的表达载体构建含有所述多肽基因表达盒的重组载体。
上述生物材料中,所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。
上述应用中,所述抗菌肽抑制的病原菌是细菌。
所述多肽或所述多肽或所述生物材料在制备预防和/或治疗细菌引起的疾病的药物或疫苗中的应用,也属于本发明的保护范围。
所述细菌可为鲍曼不动杆菌。
本发明还提供了一种化合物的制备方法,所述方法包括将肉豆蔻酸与序列2或3所示的多肽N端的氨基酸残基进行缩合反应,得到目的化合物。
本发明通过改变天然抗菌肽的氨基酸组成和部分序列,并进行脂肪酸修饰,得到的短链脂肽可在去离子水中自组装形成纳米微粒,获得纳米脂肽,具有高抗菌活性和耐盐能力,并保持较低细胞毒性。本发明对于微生物,特别是耐药病原菌的防治具有重大价值。
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述,给出的实施例仅为了阐明本发明,而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南,并不以任何方式构成对本发明的限制。
附图说明
图1:纳米脂肽的电镜观察及粒径计算。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法,按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验,均设置三次重复实验,结果取平均值。
下述实施例中的鲍曼不动杆菌临床分离住MDR-ZJ06(Genomic Analysis of theultidrug-Resistant Acinetobacter baumanniiStrain MDR-ZJ06 Widely Spread inChina,ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY,Oct.2011,p.4506–4512),公众可从申请人处获得该生物材料,该生物材料只为重复本发明的相关实验所用,不可作为其它用途使用。
实施例1:抗菌肽的设计
人β防御素3(hBD-3)是一种人体来源的抗菌肽,其氨基酸序列如下:
hBD-3:GIINTLQKYYCRVRGGRCAVLSCLPKEEQIGKCSTRGRKCCRRKK
在hBD-3中,截取C端10个氨基酸的多肽片段(见上述序列下划线部分),获得短肽C10,其序列如下:
C10:RGRKCCRRKK
用于修饰短肽C10的短链脂肪酸为肉豆蔻酸(Myristic acid,Myr),其结构式如下:
Myr:
将肉豆蔻酸的羧基(-COOH)与短肽N端G氨基酸的氨基(-NH2)脱水缩合,获得新型脂肽Myr-C10,如下所示:
Myr-C10:Myr-RGRKCCRRKK
进行脂肽的部分氨基酸替换,以去除半胱氨酸,防止形成二硫键,获得新型脂肽Myr-C10L,如下下划线所示:
Myr-C10L:Myr-RGRRSSRRKK。
实施例2:纳米脂肽的合成、自组装与鉴定
脂肽合成:委托上海吉尔生化有限公司使用标准Fmoc固相多肽合成法进行多肽合成,合成的多肽用反向高效液相层析(RP-HPLC)进行纯化,样品注入Phenomenex C18层析柱(25cm,内径5mm),用含0.1%TFA的蒸馏水(A液)和0.1%TFA的乙腈(B液)洗脱,收集下的组分冻干干燥并进行RP-HPLC分析。纳米脂肽自组装:使用去离子水将脂肽干粉溶解至浓度为200μg/ml,轻轻吹打混匀,利用脂肽自身的疏水作用力,即可自组装形成纳米微粒。透射电镜观察:使用微量移液器吸取少量的样品溶液滴加镀膜铜网上,用滤纸轻蘸吸去多余的自组装防御素溶液,静置干燥大约10秒,微量移液器滴加少量4%醋酸双氧铀进行负染,染色大约30-35秒后用滤纸吸去多余液体,经25℃室温干燥后可在透射电子显微镜下观察并保存图片。粒径测定:使用Image J软件打开纳米脂肽透射电镜图片,选取100个左右的纳米微粒数据,进行纳米粒径的测量。将测量后的数据导入excel表格中,选取Length一列中的数据复制到Origin软件中选择合适的参数进行处理作图,进行粒径平均值和标准差的计算。电镜观察结果见图1。结果显示,Myr-C10自组装后粒径大小为29.6±4.6nm,myr-C10L自组装后粒径大小为31.4±6.8nm,天然抗菌肽hBD-3对照组未能形成纳米微粒。
实施例3:纳米抗菌肽的抗菌活性
(1)用液体培养基培养待测菌株至OD600nm约为0.6,然后用PBS缓冲液稀释,得到浓度为106CFU/ml的菌液;(2)在步骤(1)得到的菌液中加入待测化合物(即实施例2制备得到的hBD-3,Myr-C10,Myr-C10L,以及多种临床常用抗生素,在反应体系中的浓度设置为0μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml、32μg/ml、64μg/ml、128μg/ml),37℃孵育3h;(3)将步骤(2)得到的混合液用PBS缓冲液稀释至1000倍体积后取100μl均匀涂布在固体培养基平板上,37℃培养12小时,对活菌进行计数。细菌全部被杀死时所用最低抗菌肽浓度即为最小杀菌浓度。实验菌株为多重耐药的鲍曼不动杆菌临床分离住MDR-ZJ06。
表1:多种化合物多重耐药鲍曼不动杆菌的杀菌活性
结果表明,天然抗菌肽hBD-3的最小杀菌浓度为8μg/ml,Myr-C10的最小杀菌浓度为2μg/ml,Myr-C10L的最小杀菌浓度1μg/ml,本发明提供的纳米脂肽比天然抗菌肽的抗菌活性显著增强。同时本发明提供的纳米脂肽最小杀菌浓度低于大部分临床常用抗生素,表明对耐药细菌具有强大的抗菌活性。
实施例4:纳米脂肽的耐盐活性
(1)用液体培养基培养待测菌株至OD600nm约为0.6,然后用PBS缓冲液稀释,得到浓度为106CFU/ml的菌液;(2)在步骤(1)得到的菌液中加入剂量大于最小杀菌浓度的待测多肽(即实施例2制备得到的hBD-3、Myr-C10和Myr-C10L,在反应体系中的浓度均为8μg/ml),并加入NaCl,使NaCl浓度分别达到50、100或150mmol/L,37℃孵育3h;(3)将步骤(2)得到的混合液用PBS缓冲液稀释至1000倍体积后取100μl均匀涂布在固体培养基平板上,37℃培养12小时,对活菌进行计数。设置不加入NaCl的对照组甲。设置不加入NaCl且不加入待测多肽的对照组乙。进行三次重复实验,结果取平均值。计算各个浓度的NaCl处理组与对照组相比的抑菌活性。杀菌率=(对照组乙的活菌数-实验组或对照组甲的活菌数)÷对照组乙的活菌数×100%。实验菌株为多重耐药的鲍曼不动杆菌临床分离住MDR-ZJ06。
结果表明(表1),本发明提供的纳米脂肽在有盐条件下(>50mM NaCl)的杀菌率不差于天然抗菌肽hBD-3,特别是在高盐(≥150mM NaCl)条件下Myr-C10L具有更好的杀菌活性,耐盐能力显著增强。
表2:多肽在不同盐浓度条件下对耐药鲍曼不动杆菌的杀菌活性
实施例5:纳米脂肽的细胞毒性
(1)从液氮中取出保存的细胞,加入含有10%胎牛血清的DMEM培养基进行传代培养保证细胞恢复状态。(2)取步骤(1)获得的细胞重新悬浮,计数后进行96孔板的铺板:96孔板的边缘孔用无菌PBS缓冲液填充,其余每孔5×104个细胞,每孔加100μl,放在37℃,5%的CO2条件下培养到细胞长满96孔板。(3)在步骤(1)96孔板中每孔加入200μl用PBS稀释的多肽,终浓度为10μg/ml,20μg/ml,30μg/ml和40μg/ml,37℃,5%CO2环境中孵育1h,阴性对照孔只有细胞无药物处理孔。(4)移除步骤(3)中的药物溶液,每孔加入200μl的DMEM(不含血清)和50μl的MTT,置于细胞培养箱中培养4h。(5)将步骤(4)中的液体弃去,每孔中加入200μl的DMSO,吹打均匀,使MTT完全溶解,于490nm下测量吸光值。实验所用细胞为A549肺癌细胞。
表2:纳米脂肽的细胞毒性检测
结果表明,在浓度低于30μg/ml范围内,myr-C10L对肺癌细胞A549的毒性与hBD-3无显著性差异。即本发明提供的纳米脂肽可在提升杀菌活性的同时,保持较低的细胞毒性。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说,在不脱离本发明的宗旨和范围,以及无需进行不必要的实验情况下,可在等同参数、浓度和条件下,在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例,应该理解为,可以对本发明作进一步的改进。总之,按本发明的原理,本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进,包括脱离了本申请中已公开范围,而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围,可以进行一些基本特征的应用。
Claims (10)
1.化合物,为肉豆蔻酸与序列2所示的多肽N端的氨基酸残基缩合所形成的化合物。
2.化合物,为肉豆蔻酸与序列3所示的多肽N端的氨基酸残基缩合所形成的化合物。
3.序列2所示的多肽。
4.序列3所示的多肽。
5.与权利要求3或4所述多肽相关的生物材料,为下述B1)至B8)中的任一种:
B1)编码权利要求3或4所述多肽的核酸分子;
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒;
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体;
B4)含有B2)所述表达盒的重组载体;
B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物;
B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物;
B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物;
B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物。
6.权利要求1或2所述多肽或权利要求3或4所述多肽或权利要求5所述生物材料在制备抗菌肽中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于:所述抗菌肽抑制的病原菌是细菌。
8.权利要求1或2所述多肽或权利要求3或4所述多肽或权利要求5所述生物材料在制备预防和/或治疗细菌引起的疾病的药物或疫苗中的应用。
9.根据权利要求7或8所述的应用,其特征在于:所述细菌为鲍曼不动杆菌。
10.一种化合物的制备方法,包括将肉豆蔻酸与序列2或3所示的多肽N端的氨基酸残基进行缩合反应,得到目的化合物。
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