CN111944060B - 一种兼具抗菌、抗炎、解毒活性的多功能杂合肽及其应用 - Google Patents

一种兼具抗菌、抗炎、解毒活性的多功能杂合肽及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及蛋白质工程技术领域，具体涉及一种兼具抗菌、抗炎、解毒活性的多功能杂合肽及其应用。本发明提供的多功能杂合肽命名为CLA，其为免疫抗炎杂合肽LTA和抗菌抗病毒杂合肽CL经蛋白质工程计算机设计、杂合、体内外复筛得到，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。多功能杂合肽具有较高的抗菌、消解内毒素、免疫调节、抗炎及抗感染功能，且具有细胞毒性低、安全性高等优势，可作为理想的抗生素替代品和人畜生物性抗菌药物、抗感染药物、饲料添加剂、防腐剂、消杀剂、免疫调节剂或抗炎剂，具有很好的应用潜力和价值。

Description

一种兼具抗菌、抗炎、解毒活性的多功能杂合肽及其应用
技术领域
本发明涉及蛋白质工程技术领域，具体涉及一种兼具抗菌、抗炎、解读活性的新型多功能杂合肽及其应用。
背景技术
细菌感染是致病菌或条件致病菌侵入动物机体中生长繁殖，产生毒素(如内毒素)和其他代谢产物所引起的感染性疾病，可诱发炎症以及氧化损伤等，重则损坏免疫系统，甚至导致死亡。动物在幼龄、体弱、疾病、应激、病原感染等情况下，经常导致免疫力降低，进而发生继发感染(细菌感染等)，引起炎性反应。对于感染和炎症治疗，传统的防治策略是使用抗生素和化学药物制剂。抗生素和化学药物制剂的持续使用不仅容易产生耐药性和多种副作用，而且容易造成药物残留和食品安全风险。
近年来，科学家们努力探索新型抗病原微生物及抗炎药物，主要包括功能性益生菌制剂、植物提取物以及生物活性肽等。
生物活性肽是指对机体生命活动有益或者具有一定生理作用的肽类化合物，其分子量一般小于6000Da。由于它们的氨基酸组成，排列顺序以及空间结构的不同,从而表现出不同的生理功能，如免疫调节、抗炎、镇静、抗菌、抗病毒、抗氧化、降血压等作用。随着进一步的研究发现很多生物活性肽还具有不易产生耐药性和药物残留等优势。所以，生物活性肽在提高畜禽免疫力，防治病原体引起的感染、炎症、免疫损伤等方面具有广阔的应用前景和开发潜力
然而，天然的生物活性肽也存在着一些缺陷，主要表现为：(1)有些天然生物活性肽的生物活性相对较低、功能较单一，如猪的乳铁蛋白肽存在抗菌活性较弱的问题；而天蚕素A虽然具有良好的抗菌功效，但其抗炎能力却相对较弱，因此这使天然生物活性肽难以全面取代抗生素；(2)一些天然生物活性肽的细胞毒性较高，在抑杀病原微生物的同时也会造成机体的严重损伤(如蜂毒素(melittin)和LL-37)；(3)多数天然活性肽体内稳定性较差，半衰期较短，易被降解(胃肠损失)，这格外增加了其实际应用难度。
随着对生物活性肽的结构、功能与作用机理研究的不断深入，科研人员开始尝试利用蛋白质工程方法设计安全性更高、调节活性更强、功能更全面的多功能生物活性肽。已有研究报道通过将不同类型的多肽进行杂合是获得兼具新型多功能杂合肽。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种兼具抗菌、抗炎、解毒活性的新型多功能杂合肽及其应用。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：本发明在对免疫抗炎多肽LTA(公开于中国专利CN110066342A)及抗菌抗病毒多肽CL(公开于中国专利CN110305222A)的序列、结构以及序列结构与功能的关系进行大量研究的基础上，运用蛋白质分子设计技术进行多肽LTA(氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)和多肽CL(氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示)的杂合优化，获得一种新型多功能杂合肽，命名为CLA，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。杂合肽CLA同时具有两个母源肽的功能，即具有抗菌、消解内毒素、抗感染、抗炎等多重功能。
具体地，本发明提供以下技术方案：
本发明提供一种杂合肽，其包含：肽I以及与肽I融合的肽II，其中，肽I的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，肽II的氨基酸序列如SEQ ID NO.2的第19～32位所示。
本发明所述的杂合肽的结构优选为：肽II的N端与肽I的C端直接或经连接肽融合。
以上所述的连接肽可为本领域常用的连接肽序列，例如：包含一个或几个甘氨酸和丝氨酸的肽。
具体地，本发明所述的杂合肽的氨基酸序列为如下任一种：
(1)如SEQ ID NO.1所示；
(2)与如SEQ ID NO.1所示的序列具有至少90％的同源性、由如SEQ ID NO.3所示序列的全部或部分与如SEQ ID NO.2所示序列的全部或部分融合得到的具有相同功能肽的氨基酸序列；
以上所述同源性优选为至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。
(3)将如SEQ ID NO.1所示序列经一个或多个氨基酸的替换、缺失或插入、由如SEQID NO.3所示序列的全部或部分与如SEQ ID NO.2所示序列的全部或部分融合得到的具有相同功能肽的氨基酸序列。
以上所述的在如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的基础上进行改造获得的具有相同功能的杂合肽的衍生多肽包括但不限于如下多肽：
(1)在如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的C端或N端添加蛋白标签序列得到的多肽，例如：在如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的C端或N端添加含有蛋白标签序列(如His标签、GST标签或C-Myc标签)得到的多肽。
本领域技术人员应该理解，为实现易于纯化、多肽标记等目的，在多肽的两端添加标签序列是本领域的常规技术手段，并不会对多肽本身固有的功能和活性造成影响，因此，上述在如SEQ ID NO.1所示的杂合肽CLA的两端添加标签序列得到的CLA衍生物也在本发明的保护范围内。
(2)在如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列进行一个或多个氨基酸序列的保守性氨基酸替换得到的多肽，例如：将第4位的Leu替换为Ile不会对蛋白的功能造成实质改变。因此，本发明的多功能杂合肽还包括SEQ ID NO.1所示氨基酸序列经取代、替换和/或增加一个或几个氨基酸，形成的具有同等功能的由SEQ ID NO.1衍生的多肽。
本发明还提供编码所述具有抗菌、消解内毒素、抗感染、抗炎功能的杂合肽的基因。
在已知杂合肽CLA的氨基酸序列的情况下，本领域技术人员可以根据对于多肽表达的需要，基于密码子的简并性原则和不同物种对于密码子的使用偏好性，设计具有不同核苷酸序列的杂合肽CLA的编码基因。
进一步地，本发明还提供含有所述杂合肽编码基因的生物材料，所述生物材料包括重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、噬菌体载体、病毒载体或宿主细胞。
进一步地，本发明提供所述杂合肽的制备方法，包括：将编码所述杂合肽的基因导入宿主细胞中，表达所述杂合肽。
作为优选，所述制备方法包括：将所述杂合肽CLA的编码基因与表达载体连接，构建重组表达载体，通过转基因方法，将重组表达载体导入宿主细胞，得到导入编码基因的宿主细胞。
所述转基因方法包括热应激转化、电转化法、转染等。
本领域技术人员根据本发明杂合肽CLA的序列，可以通过化学合成的方法获得所述杂合肽。
本发明通过体内和体外试验证明，杂合肽CLA对多株革兰氏阴性菌具有良好的抗菌作用并具有良好的内毒素中和作用，且CLA能够有效的抑制内毒素LPS及出血型大肠杆菌EHEC O157：H7引起的炎症反应，缓解细菌感染对小鼠生长抑制作用，降低细菌在肠道内的定植量，减少细胞因子表达量。综上，杂合肽CLA具有良好的抗菌、抗感染、消解内毒素及抗炎作用。
基于上述功能，本发明提供所述杂合肽或采用所述制备方法制备得到的杂合肽在制备抗菌制剂中的应用。
作为优选，所述抗菌制剂为抑制或杀灭革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌的抗菌制剂。
上述抗菌制剂可用于包括但不仅限于大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌在内的微生物抑杀。
本发明还提供所述杂合肽或采用所述制备方法制备得到的杂合肽在制备抗炎制剂及抗感染制剂中的应用。
作为优选，所述抗炎制剂为炎症抑制剂。
上述抗炎制剂可用于包括EHEC、LPS诱导的炎症反应在内的多种炎症或细菌感染的败血症、脓毒血症的预防和治疗。
本发明还提供所述杂合肽或采用所述制备方法制备得到的杂合肽在制备消解内毒素制剂中的应用。
作为优选，所述备消解内毒素制剂为LPS中和剂。
本发明所述制剂包括药物、保健品以及食品或饲料添加剂。本发明还提供一种产品，该产品含有上述多功能杂合肽，所述产品为选自药物、保健品以及食品或饲料添加剂中的任意一种。所述产品中，可以以所述杂合肽为有效成分或将所述杂合肽复配其它活性成分组成药物、保健品以及食品或饲料添加剂的有效成分。
作为优选，所述药物还包含药学领域可接收的载体或辅料。
本发明的有益效果在于：本发明首次通过将LTA和CL杂合，得到多功能杂合肽CLA，CLA同时具有两个母源肽的功能，即具有抗菌、消解内毒素、抗感染、抗炎功能，并且，与母源肽LTA和CL的相应活性相比，其消解内毒素活性、抗感染活性、抗炎活性、抗菌活性更强。同时CLA具有细胞毒性低、安全性高，制备方便、成本低廉的优势，可作为理想的抗菌剂、内毒素消解剂、抗感染制剂、抗炎剂，广泛用于人和动物的医药、食品、保健、饲料、营养等领域，具有巨大的应用价值。
附图说明
图1为本发明实施例1中候选杂合肽的抗炎活性。NS,P>0.05，*,P≤0.05；**,P≤0.01；***,P≤0.001。
图2为本发明实施例3中杂合肽CLA对LPS的中和活性效果示意图。
图3为本发明实施例4中杂合肽CLA对LPS诱导的炎症状态小鼠巨噬细胞RAW264.7的细胞因子表达量的影响；其中A图为小鼠巨噬细胞炎症态下CLA对TNF-α的表达量的影响；其中B图为小鼠巨噬细胞炎症态下CLA对IL-6的表达量的影响；Control代表正常组，LPS为模型组，LTA+LPS代表试验组1(加入LTA处理后用LPS诱导炎症模型),CL+LPS代表试验组2(加入CL处理后用LPS诱导炎症模型),CLA+LPS代表试验组3(加入CLA处理后用LPS诱导炎症模型)。*,P≤0.05；****,P≤0.0001。
图4为本发明实施例5中杂合肽CLA对EHEC诱导的肠炎小鼠的体重及肠道的保护作用；其中，A图为CLA对免疫抑制小鼠体重的影响；B图为CLA对小鼠结肠组织损伤评分的影响。NS,P>0.05；*,P≤0.05；****,P≤0.0001。
图5为本发明实施例5中杂合肽CLA对小鼠炎症反应的抑制作用；其中，A图为CLA对小鼠细胞因子TNF-α释放量的影响；B图为CLA对小鼠细胞因子IFN-γ释放量的影响；C图为CLA对小鼠细胞因子IL-6释放量的影响；Control代表空白组，EHEC代表模型组，CLA+EHEC，LTA+EHEC，CL+EHEC代表试验组。NS,P>0.05；*，P≤0.05；***,P≤0.001；****,P≤0.0001。
图6为本发明实施例5中杂合肽CLA对大肠杆菌在肠道中定植情况的影响。*,P≤0.05；***,P≤0.001；****,P≤0.0001。
图7为本发明实施例6中杂合肽CLA对肠上皮细胞细菌粘附入侵的抑制作用。*,P≤0.05；**,P≤0.01；****,P≤0.0001。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1多功能杂合肽CLA的制备
通过对多肽LTA(SEQ ID NO.2)和CL(SEQ ID NO.3)的序列、结构以及序列结构与功能的关系进行研究，利用蛋白质分子设计技术进行多肽LTA和CL杂合，得到多条候选杂合肽。本实施例以杂合肽CLA(序列如SEQ ID NO.1所示)，LACL(序列如SEQ ID NO.4所示)，以及CLLA(序列如SEQ ID NO.5所示)为例，说明多功能杂合肽CLA的筛选过程，上述三条杂合多肽均由LTA与CL杂合获得。图1显示了各种候选杂合肽的抗炎活性，证实当细胞处于LPS诱导的炎症状态时，CLA能够显著抑制TNF-α的表达量，且抑制效果均优于母源肽CL、LTA，并特别显著优于其他候选杂合肽LACL、CLLA。
表1多功能杂合肽的最小抑菌浓度(MIC)
Figure BDA0002607501490000071
实施例2多功能杂合肽CLA的抗菌作用
采用微量稀释法检测实施例1制得的多功能杂合肽CLA对E.coil CVCC 245，E.Coil K88，EHEC O157：H7及Salmonella CVCC 2212的MIC。如表2所示多功能杂合肽CLA对4种革兰氏阴性菌均具有良好的抗菌活性，且其抗菌活性显著高于其母源肽。
表2多功能杂合肽的最小抑菌浓度(MIC)
Figure BDA0002607501490000081
实施例3杂合肽CLA对LPS的中和作用
利用无热源内毒素检查用水将杂合肽CLA及其母源肽LTA、CL溶解稀释为不同浓度的溶液(0-64μg/mL)，分别取100μL的上述各浓度的多肽溶液与LPS(1EU/mL)混合。37℃孵育30min后，采用显色机制鲎试剂盒检测多肽CLA、LTA、CL对LPS的中和率，以多粘菌素B(PMB)作为对照。结果如图2所示，多肽CLA具有较高的LPS中和活性，其LPS中和活性与多粘菌素B相当，在浓度为4μg/mL时，杂合肽CLA对LPS的中和率接近100％，且其中和活性显著高于其母源肽LTA及CL。
实施例4杂合肽CLA在小鼠巨噬细胞中的免疫调节活性
将杂合肽CLA及其母源肽LTA、CL用DMEM培养基稀释，配制浓度为10μg/mL的多肽溶液，检测杂合肽CLA及其母源肽LTP、CL对LPS诱导的炎症状态下的小鼠巨噬细胞RAW264.7的TNF-α等细胞因子分泌的影响。分别设置正常组(Control)、模型组(LPS)、试验组1(LTA+LPS)、试验组2(CL+LPS)、试验组3(CLA+LPS)，其中，正常组不做任何处理；试验组1、2、3分别在细胞过夜培养后加入终浓度为10μg/mL LTA、CL或CLA，1小时后，模型组与试验组1、2、3加入终浓度为100ng/mL的LPS溶液。采用ELISA方法检测细胞因子TNF-α及IL-6的表达量，结果如图3所示，当细胞处于LPS诱导的炎症状态时，CLA能够显著抑制TNF-α(图3的A图)及IL-6(图3的B图)的表达量，且抑制效果优于其母源肽LTA和CL。由此说明，杂合肽CLA可以抑制LPS诱导的炎症反应，且其抗炎效果均优于其母源肽LTA和CL。
实施例5多功能杂合肽CLA对EHEC感染的小鼠炎症的抗炎作用
本实施例采用C57BL/6系雄性小鼠(3～4周龄清洁级雌性，购买自北京维通利华实验动物技术有限公司)进行动物实验，整个试验过程都参照欧洲实验动物伦理委员会的指导原则(86/609/EEC)，并且获得中国农业大学实验动物伦理委员会的许可。动物饲养环境为清洁级，环境温度22±2℃，湿度50％～55％，8:00～20:00光照。小鼠每笼6～8只饲养，可自用摄食饮水。
1、杂合肽CLA对炎症状态小鼠的体重及肠道的影响
将预饲一周后的60只小鼠随机分为5组(n＝12)，分别为对照组、EHEC组、EHEC+CL组、EHEC+LTA组、EHEC+CLA组。
在试验开始的第一天，对小鼠禁食4h，然后分别给各组小鼠灌服100μL的无菌生理盐水、或100μL EHEC O157:H7菌液；第2至4天，分别给各组小鼠腹腔注射100μL的无菌生理盐水、CL、LTA或CLA(10mg/kg)，每天注射一次，连续3天。最后一次注射生理盐水或多肽16小时后，将小鼠颈椎脱臼致死。在此期间，每天观察并记录小鼠的行为及精神状态、称重。试验期间将室温设为24℃，允许小鼠自由采食、饮水，此外在小鼠饲养和称重时将染菌小鼠和未染菌小鼠隔离操作。实验结果如图4所示，结果表明，模型组小鼠的体重较空白组显著降低，且其结肠组织损伤评分显著降低，说明EHEC诱导的炎症反应会导致小鼠体重下降，肠道损伤；而试验组小鼠的体重和肠道损伤均显著恢复，且CLA处理的小鼠的体重显著高于其母源肽LTA及CL组，损伤程度显著低于其母源肽治疗组。说明杂合肽CLA可保护EHEC诱导的炎症反应对小鼠体重及肠道造成的损伤。
2、杂合肽CLA对炎症状态小鼠的细胞因子表达量的影响
将预饲一周后的60只小鼠随机分为5组(n＝12)，分别为对照组、EHEC组、EHEC+CL组、EHEC+LTA组、EHEC+CLA组。
给药方式同上述1中所述，采用ELISA法检测小鼠血清中细胞因子(TNF-α、IFN-γ及IL-6)的含量。实验结果如图5所示，结果表明，与空白组相比，模型组小鼠的细胞因子(TNF-α、IFN-γ及IL-6)含量显著升高；而试验组给药杂合肽CLA可显著抑制LPS诱导的细胞因子(TNF-α、IFN-γ及IL-6)的表达量，进而抑制炎症反应，且其抑制效果显著优于其母源肽。
3、杂合肽CLA对细菌粘附入侵的影响
将预饲一周后的60只小鼠随机分为5组(n＝12)，分别为对照组、EHEC组、EHEC+CL组、EHEC+LTA组、EHEC+CLA组。
给药方式同上述1中所述，将无菌分离的小鼠结肠组织称重并记录，按照相应比例加入无菌PBS及磁珠，研磨结肠组织。将结肠组织匀浆液按照一定比例稀释，然后将其涂布于大肠杆菌选择培养基的平板中，将平板置于恒温培养箱过夜培养后，对菌落数进行统计计数。试验结果如图6所示，结果表明，与空白组相比，模型组小鼠的结肠组织中大肠杆菌定植量显著升高；而试验组给药杂合肽CLA可显著降低结肠组织中大肠杆菌定植量，进而抑制大肠杆菌诱导的炎症反应，且其抑制效果显著优于其母源肽。
实施例6多功能杂合肽CLA对肠上皮细胞细菌粘附入侵的抑制作用
将1×106个/mL的猪小肠上皮细胞IPEC-J2细胞接种于6孔板中，置于37℃，5％CO2培养箱培养至形成单层上皮屏障。移去细胞培养液，添加终浓度为10μg/mL的CLA、LTA或CL溶液，置于37℃，5％CO2培养箱培养24h，移去细胞培养液，加入MOI＝10的EHEC O157:H7悬液，侵染1h后弃去培养基，利用PBS清洗除掉未粘附的细菌，然后向培养板中加入1％TritonX-100裂解液对细胞进行裂解。将得到的细胞裂解液涂布在LB固体培养基中，将平板置于37℃的恒温培养箱中培养18-24h，进行菌落计数。试验结果如图7所示，结果表明，给药杂合肽CLA可有效降低粘附在IPEC-J2细胞上的EHEC的数量。
本发明也进行了杂合肽CLA的衍生物如末端酰胺化的CLA以及对第4位氨基酸进行相应替换后的CLA的功能实验，结果表明，杂合肽CLA的上述衍生物也同样具有与杂合肽CLA相似的抗菌、免疫、抗炎功能。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国农业大学
<120> 一种兼具抗菌、抗炎、解毒活性的多功能杂合肽及其应用
<130> KHP201114309.1
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile
1 5 10 15
Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val Pro Arg Thr Glu Lys Glu Lys Lys
20 25 30
Glu Val Val Glu
35
<210> 2
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Ile Gly Lys Glu Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu
1 5 10 15
Arg Asn Leu Val Pro Arg Thr Glu Lys Gly Lys Lys Glu Val Val Glu
20 25 30
<210> 3
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile
1 5 10 15
Lys Asp Phe Leu Arg Asn
20
<210> 4
<211> 54
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Ile Gly Lys Glu Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu
1 5 10 15
Arg Asn Leu Val Pro Arg Thr Glu Lys Glu Lys Lys Glu Val Val Glu
20 25 30
Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile
35 40 45
Lys Asp Phe Leu Arg Asn
50
<210> 5
<211> 54
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile
1 5 10 15
Lys Asp Phe Leu Arg Asn Ile Gly Lys Glu Phe Lys Arg Ile Val Gln
20 25 30
Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val Pro Arg Thr Glu Lys Glu
35 40 45
Lys Lys Glu Val Val Glu
50

Claims (8)

1.一种兼具抗菌、抗炎、解毒活性的多功能杂合肽，其特征在于，所述多功能杂合肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种核酸，其特征在于，所述核酸编码权利要求1所述多功能杂合肽。
3.一种生物材料，其特征在于，包含权利要求2所述的核酸，所述生物材料为重组DNA、表达盒、转座子、载体或宿主细胞。
4.权利要求1所述多功能杂合肽的制备方法，其特征在于，包括：将权利要求2所述的核酸导入宿主细胞中，表达所述杂合肽。
5.权利要求1所述的多功能杂合肽或采用权利要求4所述制备方法制得的杂合肽在制备抗炎制剂、抗感染制剂中的应用。
6.权利要求1所述的多功能杂合肽或采用权利要求4所述制备方法得到的杂合肽在制备消解或抗内毒素制剂中的应用。
7.权利要求1所述的多功能杂合肽或采用权利要求4所述制备方法制得的杂合肽在制备抗菌制剂中的应用。
8.一种产品，其特征在于，所述产品包含权利要求1所述多功能杂合肽或包含采用权利要求4所述制备方法得到的杂合肽；所述产品为选自药物、饲料添加剂中的任意一种。
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