CN110305222B - 一种兼具解毒、抗炎、抗细胞凋亡、保护肠道屏障及促进伤口愈合的杂合肽及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种兼具解毒、抗炎、抗细胞凋亡、保护肠道屏障及促进伤口愈合的杂合肽及其应用。本发明的杂合肽命名为C‑L，其为抗菌肽LL‑37和天蚕素Cecropin A经生物信息学技术设计、杂合、体内外试验筛选验证得到，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。C‑L不但可以中和消解内毒素，而且在炎症状态下，可以抑制机体炎症反应。另外，C‑L可以缓解外源病原导致的细胞凋亡，并且可以保护肠道屏障完整性及促进伤口愈合速度，同时C‑L具有细胞毒性低、安全性高等优势，可作为理想的内毒素解毒剂(消毒剂)、抗炎剂、抗细胞凋亡剂、肠道屏障完整性保护剂或伤口愈合促进剂，具有很好的应用潜力和价值。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程及生物制剂领域，具体涉及一种兼具解毒、抗炎、抗细胞凋亡、保护肠道屏障及促进伤口愈合的杂合肽及其制备方法与应用。
背景技术
动物或人类在机体损伤、病原性细菌或病毒感染及有毒有害分子侵袭等情况下，经常会引起炎性反应(红、热、肿、痛等)，进而导致机体代谢紊乱甚至死亡。目前，对于感染性炎症和非感染性炎症，传统的的防治策略是使用抗生素和激素类抗炎药(如氢化可的松、地塞米松等)，但此类药物的长期或过量使用存在严重的风险。
抗生素虽然能通过降低或杀死病原菌发挥抗炎作用，但是抗生素的大量、持续使用会导致细菌耐药性、药物残留、破坏动物肠道稳态等一系列严重的问题。另外，许多抗生素在杀死细菌的同时，会促使内毒素即脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)从细菌细胞壁上释放出来(Holzheimer,2001； Hurley,1995)。LPS通常由致病性大肠杆菌、沙门氏杆菌、布氏杆菌、变形杆菌和副猪嗜血杆菌等革兰氏阴性菌的细胞崩解产生，能诱发多种机体促炎细胞因子的释放，如TNF-α、IL-6和IL-1β等。从细菌细胞壁上释放的LPS 不断聚集会加重炎症反应甚至导致全身性炎症反应综合征(Botwinski, 2001)，轻则引起动物发热、厌食、体内能量过度消耗、体组织分解，免疫力和生产性能下降，重则可能导致畜禽死亡(Botwinski,2001；Zinner,1999)。更进一步地，病原微生物或LPS诱发的炎症会导致组织坏死、细胞凋亡并破坏动物肠道屏障完整性。大量研究表明组织的坏死性凋亡与多种炎症疾病紧密相关，如炎症性肠炎(IBD)患者肠道组织内的细胞凋亡率会显著上升，这又会反过来加剧肠道炎症(Pasparakis and Vandenabeele,2015；Pierdomenico等,2014)。另外，LPS诱发的肠道炎症会导致吞噬白细胞的募集及炎症细胞因子和活性氧(ROS)的大量产生(Matricon,2010,Gibson, 2004,Sigman等,2014,Segui等,2005)，这些因子的过量表达是破坏肠道屏障功能的潜在因素(Gibson,2004,Kaser and Tilg,2009)，而肠道上皮屏障功能受损又会导致病原菌、LPS等有害物质进入体内引发更加严重的炎症反应(Park等,2010)，形成恶性循环。更严重的是，有研究表明IBD患者患淋巴瘤和肠癌等高致命疾病的风险明显增加(Beaugerie and Itzkowitz,2015； Kandiel等,2005；Ullman and Itzkowitz,2011)。
激素类抗炎药(如氢化可的松、地塞米松等)，虽能有效控制感染性炎症和非感染性炎症,但持续使用可引起多种副作用，如水盐代谢和糖、脂肪、蛋白质代谢的严重紊乱，并引起肾上腺皮质功能衰退、消化系统并发症或加重感染等。
综上所述，减少或消除LPS、保护肠上皮屏障功能、抑制细胞凋亡和炎症因子表达，能够有效降低或消除患病动物或人的炎症反应。但是，目前的抗生素抗感染和糖皮质激素类抗炎药都存在明显缺陷，不宜持续使用。因此，开发一种新型、安全、无副作用、环保且同时具备消解内毒素、抗炎、抗细胞凋亡、保护肠道屏障及促进伤口愈合(修复损伤肠道)功能的活性肽，对人类健康或动物健康养殖业(特别是无抗养殖)具有重要的现实意义和巨大的应用前景，是抗感染、抗炎和肠道损伤修复策略的新突破和新理念。
抗菌肽Cecropin A(C)是最早发现的来自Hyalophora cecropia的天蚕素家族成员(Steiner等,1981)，研究表明，当炎症爆发时，C不但可以直接抑制TNF-α和IL-1β等炎症因子的过量释放，还可通过ERK，JNK和p38 MAPK等信号通路抑制过度的炎症反应(Lee等,2015)。
抗菌肽LL-37(L)相对分子质量约5000Da(道尔顿)，是迄今在人体中发现的抗菌肽(cathelicidin)家族中的唯一成员，也是人体内唯一具有双亲性α螺旋结构的抗菌肽。L广泛分布在人体的血液细胞和上皮细胞中，具有中和内毒素的作用，能与LPS和CD14结合，中和LPS的生物毒性；能够介导趋化作用，招募免疫细胞到达感染部位，清除病原物并抑制炎症；同时L是一种人体阳离子抗菌肽，能够通过上调紧密连接蛋白增强人表皮角质细胞的屏障防御功能(Akiyama等,2014)。另外，L可以通过抑制多种细胞炎症因子(如IFN-g、TNF-α、IL-4、IL-12等)的过量表达来发挥抗炎作用 (Yu等,2007,Barlow等,2006,Chen等,2013)，也可通过抑制宿主组织中促炎趋化因子和细胞因子的过量表达显著缓解病原微生物诱导的炎症 (Ishida等,2016,Chen等,2013,Jonsson and Nilsson,2012)，是一类研究比较成熟的抗炎肽。
随着对抗炎肽的结构、功能与作用机理研究的不断深入，申请人尝试利用蛋白质工程方法设计安全性更高、活性更强、功能更全面的抗炎肽。已有研究报道通过将不同类型的多肽进行杂合是获得多功能新型杂合肽的有效手段。
发明内容
为了解决前述中现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种兼具解毒、抗炎、抗细胞凋亡、保护肠道屏障及促进伤口愈合(修复损伤组织)的杂合肽及其与应用。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：本发明在对多肽LL-37和天蚕素Cecropin A的序列、结构以及序列结构与功能的关系进行大量研究的基础上，运用蛋白质分子设计技术进行多肽Cecropin A(氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)和LL-37(氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示)的杂合优化，通过对杂合肽的功能和特性筛选及序列优化，最终获得一种新型杂合肽，命名为C-L，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。该杂合肽具有比母源肽更强的抗炎和消解内毒素功能；另外，C-L还可以有效抑制细胞凋亡、肠道上皮屏障损伤并促进伤口愈合等。
首先，本发明提供的杂合肽C-L的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示或为如SEQ IDNO.1所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的替换、缺失或插入得到的具有相同功能多肽的氨基酸序列。
上述在如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的基础上进行改造获得的具有相同功能的杂合肽C-L的衍生多肽包括但不限于如下多肽：
(1)在如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的C端或N端添加蛋白标签序列得到的多肽，例如：在如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的C端或N端添加含有6个His残基的His标签得到的多肽；或在如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的C端或N端添加GST或C-Myc标签得到的多肽；
本领域技术人员应该理解，为实现易于纯化、多肽标记等目的，在多肽的两端添加标签序列是本领域的常规技术手段，并不会对多肽本身固有的功能和活性造成影响，因此，上述在如SEQ ID NO.1所示的杂合肽C-L的两端添加标签序列得到的C-L衍生物也在本发明的保护范围内。
(2)在如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列进行一个或多个氨基酸序列的保守性氨基酸替换得到的多肽，例如：将第5位的Phe替换为Ile不会对蛋白的功能造成实质改变。
基于本发明提供的杂合肽C-L的氨基酸序列，编码该杂合肽的基因序列也属于本发明的保护范围。
以及，含有上述基因序列的生物材料属于本发明的保护范围，所述生物材料包括重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、噬菌体载体、病毒载体或宿主细胞。
本发明通过体内和体外试验证明，杂合肽C-L不仅能够抑制LPS诱导的炎症反应，降低炎症因子表达量，缓解炎症状态对小鼠体重以及肠道造成的损害，而且可以抑制细胞凋亡及肠道屏障损伤，此外，C-L还能够促进伤口愈合。
基于上述功能，本发明提供所述杂合肽或采用所述制备方法制备得到的杂合肽在制备抗炎制剂中的应用。
作为优选，所述抗炎制剂为炎症抑制剂。
本发明还提供所述杂合肽或采用所述制备方法制备得到的杂合肽在制备消解/抗内毒素制剂中的应用。
本发明还提供所述杂合肽或采用所述制备方法制备得到的杂合肽在制备抗细胞凋亡制剂中的应用。
本发明还提供所述杂合肽或采用所述制备方法制备得到的杂合肽在制备保护肠道屏障和促进伤口愈合制剂中的应用。
本发明所述制剂包括药物、保健品以及食品或饲料添加剂。
上述抗炎制剂或消解内毒素制剂可用于包括LPS诱导的炎症反应在内的多种炎症或内毒素血症的预防和治疗。
上述抗细胞凋亡制剂可用于包括炎症反应导致的细胞凋亡在内的多种细胞凋亡症状的预防和治疗。
上述保护肠道屏障功能制剂可用于包括炎症反应导致的肠道屏障损伤在内的多种肠道屏障功能损伤症状的预防和治疗。
上述促伤口愈合制剂可用于促进包括机械损伤导致的伤口在内的多种伤口的愈合和治疗。
本发明还提供一种产品，所述产品为药物、保健品以及食品或饲料添加剂，所述产品包含所述杂合肽C-L或包含采用上述杂合肽的制备方法制备得到的杂合肽。
所述产品中，可以以所述杂合肽为有效成分或将所述杂合肽复配其它活性成分组成药物、保健品以及食品或饲料添加剂的有效成分。
作为优选，所述药物组合物还包含药学领域可接收的载体或辅料。
本发明的有益效果在于：本发明首次通过将LL-37和Cecropin A杂合，经优化和筛选得到免疫抗炎杂合肽C-L，多肽C-L与母源肽LL-37和Cecropin A的相应活性相比，其抗炎活性和消解内毒素活性更强。在炎症状态下，C-L 不但可以抑制机体炎症反应，还可以抑制炎症导致的细胞凋亡和肠道屏障损伤。另外，C-L可以促进机体伤口愈合，可见，C-L的特殊优点是在抗炎消炎的同时，不仅能消除常见的炎症诱因--内毒素，而且还能消除由于炎性反应给机体或组织带来的不良反应，如细胞凋亡和肠道屏障损伤，最后还能修复损伤的细胞或组织。同时，C-L具有细胞毒性低、安全性高，制备方便、成本低廉的优势，可作为理想的抗炎剂、抗细胞凋亡剂、肠道屏障损伤修复剂或保护剂、伤口愈合促进剂及内毒素解毒剂，可广泛用于人和动物的医药、食品、保健、饲料、营养等领域，具有巨大的应用价值。
附图说明
图1为本发明实施例1中多肽与TLR4/MD2分子动力学3D模拟作用图。
图2为本发明实施例2中杂合肽C-L及其母源肽LL-37、Cecropin A对LPS 的中和活性效果图。
图3为本发明实施例3中杂合肽C-L及其母源肽LL-37、Cecropin A对小鼠巨噬细胞的细胞存活率的影响示意图。
图4A-图4D为本发明实施例4中杂合肽C-L对小鼠炎症反应的抑制作用；其中，图4A为C-L对小鼠体重的影响；图4B为C-L对小鼠肠道组织完整性影响；图4C为C-L对小鼠细胞因子IFN-γ释放量的影响；图4D为C-L对小鼠细胞因子IL-6释放量的影响；Control代表空白组，LPS代表模型组，C+LPS代表用Cecropin A预处理后再注射LPS试验组，L+LPS代表用LL-37预处理后再注射LPS试验组，C-L+LPS代表用C-L预处理后再注射LPS试验组；NS P≥0.05，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，****P＜0.0001。
图5为本发明实施例5中杂合肽C-L及其母源肽LL-37、Cecropin A对肠上皮细胞凋亡的抑制作用；Control代表空白组，LPS代表模型组，C+LPS代表用Cecropin A预处理后再注射LPS试验组，L+LPS代表用LL-37预处理后再注射LPS试验组，C-L+LPS代表用C-L预处理后再注射LPS试验组；NS P≥0.05， *P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，****P＜0.0001。
图6为本发明实施例6中杂合肽C-L及其母源肽LL-37、Cecropin A对小鼠紧密连接蛋白表达的影响；Control代表空白组，LPS代表模型组，C+LPS 代表用Cecropin A预处理后再注射LPS试验组，L+LPS代表用LL-37预处理后再注射LPS试验组，C-L+LPS代表用C-L预处理后再注射LPS试验组；NS P ≥0.05，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，****P＜0.0001。
图7为本发明实施案例7中杂合肽C-L对对IPEC-J2单层细胞愈合的影响； Control代表空白组，LPS代表模型组，C+LPS代表用Cecropin A预处理后再注射LPS试验组，L+LPS代表用LL-37预处理后再注射LPS试验组，C-L+LPS 代表用C-L预处理后再注射LPS试验组；NSP≥0.05，*P＜0.05，**P＜0.01， ***P＜0.001，****P＜0.0001。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1杂合肽C-L的设计和获得
通过对多肽LL-37和天蚕素Cecropin A的序列、结构以及序列结构与功能的关系进行研究，利用蛋白质分子设计技术进行多肽Cecropin A(其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)和LL-37(其氨基酸序列如SEQ ID NO.3 所示)的杂合，得到杂合肽C-L，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
髓样分化蛋白-2(MD-2)与TLR4(Toll受体4)结合，形成TLR4/MD2 复合受体。LPS主要通过与细胞膜表面的TLR4/MD2结合从而引起下游的 NF-κB、MAPK等炎症信号通路的激活从而导致炎症爆发，因而TLR4/MD2 是天然免疫中的调控分子，在感染、炎症、免疫等病理生理过程中具有广泛的生物学功能。
本发明利用计算机生信分子模拟技术研究了母源肽和杂合肽C-L与 TLR4/MD2的分子动力学，建立了LPS与C-L或其母源肽的分子作用方式及模拟打分情况，对其抗炎效果进行预测，结果如图1和表1所示，三种多肽与TLR4/MD2相互作用强弱不同，其中杂合肽C-L在氢键数、盐桥数及结合面积方面都要大于其母源肽，说明C-L与LPS结合力最强。三条多肽与TLR4/MD2的结合都会释放能量，其中C-L释放能量最多，说明其与 TLR4/MD2结合最稳定。另外，如表2所示，C-L与TLR4/MD2的结合位点与LPS与TLR4/MD2的结合位点存在部分重叠(Seolhee et al.，2017)，因此可以竞争性地抑制LPS与TLR4/MD2的结合，从而抑制炎症的产生。以上数据都表明，C-L具有最强的抗炎活性，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1 所示。
表1为本实施例中多肽与TLR4/MD2间相互作用的关键数据，包括氢键数、盐桥数、结合面积以及对接过程中吸收或释放的能量(正值代表吸收能量，负值代表释放能量)。表2为本实施例中多肽与MD2之间的氨基酸配对，及其之间的距离和盐桥数。
表1
表2
实施例2杂合肽C-L对LPS的中和消解作用
利用无热源内毒素检查用水将杂合肽C-L及其母源肽LL-37、Cecropin A溶解稀释为不同浓度的溶液(0-64μg/mL)，分别取100μL的上述各浓度的多肽溶液与LPS(1EU/mL)混合。37℃孵育30min后，采用显色基质鲎试剂盒检测多肽Cecropin A、LL-37、C-L对LPS的中和率。结果如图 2所示，多肽C-L具有较高的LPS中和消解活性，且其中和活性高于其母源肽LL-37及Cecropin A。在达到50％LPS中和率时，C-L、L、C浓度分别接近2、4和8μg/mL，说明C-L中和LPS能力约为其母源肽L和C的2 倍和4倍。
实施例3杂合肽C-L对小鼠巨噬细胞细胞存活率的影响
取对数生长期的巨噬细胞RAW264.7接种于96孔板中，初始细胞培养密度为1×104个/mL，每孔100μL，在37℃，5％CO2的条件下培养过夜后，分别加入一系列浓度梯度的C-L、LL-37及Cecropin A(0-100μg/mL)溶液，培养24h后，利用CCK8法检测多肽C-L对小鼠巨噬细胞存活率的影响。结果如图3所示，杂合肽C-L的细胞毒性较其母源肽明显降低，且在0-70 μg/mL浓度范围内巨噬细胞的存活率大于80％，表明C-L的细胞毒性较低，具有较高的安全性。
实施例4杂合肽C-L对炎症状态小鼠的抗炎作用
本实施例采用C57BL/6系雄性小鼠(购买自北京维通利华实验动物技术有限公司)进行动物实验，整个试验过程都参照欧洲实验动物伦理委员会的指导原则(86/609/EEC)，并且获得中国农业大学实验动物伦理委员会的许可。动物饲养环境为清洁级，环境温度22±2℃，湿度50％～55％， 8:00～20:00光照。小鼠每笼6～8只饲养，可自由摄食饮水。
1、杂合肽C-L对炎症状态小鼠的体重及肠道形态的影响
取60只健康雄性小鼠随机分为5组，每组12只。分为空白组(Control)：生理盐水；模型组(LPS)：LPS(10mg/kg)；C+LPS组：Cecropin A(8mg/kg)、 LPS(10mg/kg)；L+LPS组：LL-37(8mg/kg)、LPS(10mg/kg)；C-L+LPS 组：C-L(8mg/kg)、LPS(10mg/kg)；
对试验组小鼠进行腹腔注射给药三种多肽C、L和C-L(给药剂量为8 mg/kg)，连续7天，每天一次，对空白组及模型组小鼠给予相应体积的生理盐水。在末次给药1h后，对模型组和试验组小鼠进行腹腔注射LPS(10 mg/kg)，空白组给予等量生理盐水，6h后小鼠颈椎脱臼处死，记录小鼠的体重，取小鼠空肠进行H&E染色切片观察。
试验结果如图4A和图4B所示，结果表明，模型组小鼠的体重比空白组显著降低，并且通过切片观察发现模型组的肠绒毛出现萎缩、破损等现象，说明LPS诱导的炎症反应会导致小鼠体重下降，肠道损伤；而多肽C、 L和C-L可以不同程度缓解LPS导致的小鼠体重下降和肠道绒毛损伤，其中C-L缓解效果优于其母源肽，说明杂合肽C-L可有效缓解LPS诱导的炎症反应对小鼠体重及肠道造成的损伤。
2、杂合肽C-L对炎症状态小鼠的细胞因子表达量的影响
取60只健康雄性小鼠随机分为5组，每组12只。分为空白组(Control)：生理盐水；模型组(LPS)：LPS(10mg/kg)；C+LPS组：Cecropin A(8mg/kg)、 LPS(10mg/kg)；L+LPS组：LL-37(8mg/kg)、LPS(10mg/kg)；C-L+LPS 组：C-L(8mg/kg)、LPS(10mg/kg)；
空白组、模型组和试验组的给药方式同上述1中所述，在末次给药1h 后，对模型组和试验组小鼠进行腹腔注射LPS(10mg/kg)，空白组给予等量生理盐水，6h后安乐死进行采样。
提取小鼠空肠组织蛋白上清后，利用凯基蛋白含量检测试剂盒测定空肠组织蛋白上清浓度。采用eBioscience公司小鼠ELISA试剂盒测定空肠组织蛋白上清样品的细胞因子IL-6、IFN-γ含量，操作步骤严格按照eBioscience 公司小鼠ELISA试剂盒说明书进行。具体步骤如下：
1)加样：将100μL标准品通用稀释液加入空白孔中，其余各孔分别加入空肠组织蛋白上清或者不同浓度标准品，37℃下孵育90min；
2)洗板：弃掉上清，甩干，向各孔中分别加入300μL洗涤液，浸泡1.5 min后，将洗涤液移除，拍干。重复5次。
3)抗体孵育：除空白孔外其余各孔每孔加100μL生物素化抗体工作液，与此同时，空白孔中加入等量生物素化抗体稀释液，37℃孵育60min后弃去液体，洗板5次(步骤同上)。
4)酶联反应：每孔加入100μL酶结合物工作液，空白孔加入等量酶结合物稀释液，37℃下避光孵育30min后弃去液体，洗板5次。
5)显色反应：每孔加显色底物90μL，37℃避光孵育20min后，加入 50μL终止液，终止反应；
在450nm波长下检测各孔OD值。各孔OD值需减去空白孔OD值，并根据标准品OD值以及浓度制作标准曲线，以计算空肠蛋白上清液中细胞因子含量。
试验结果如图4C、图4D所示，结果表明，与空白组相比，模型组小鼠的细胞因子(IFN-γ、IL-6)含量显著升高；而试验组给药多肽会不同程度地抑制炎症因子的过量表达，且C-L抑制效果最明显。对于促炎因子IFN-γ，杂合肽C-L可将其空肠表达水平降低至约220pg/mg，而母源肽C和L只能降低至约620和320pg/mg；对于促炎因子IL-6，C-L及L可将其表达水平降低至约30pg/mg，而C只能将其降低至约75pg/mg。由此可见，杂合肽C-L可显著抑制LPS诱导的细胞因子(IFN-γ、IL-6)的过量表达，进而抑制炎症反应，且其抑制效果优于其母源肽。
实施例5杂合肽C-L对炎症状态小鼠细胞凋亡的抑制作用
取60只健康雄性小鼠随机分为5组，每组12只。分为空白组(Control)：生理盐水；模型组(LPS)：LPS(10mg/kg)；C+LPS组：Cecropin A(8mg/kg)、LPS(10mg/kg)；L+LPS组：LL-37(8mg/kg)、LPS(10mg/kg)；C-L+LPS 组：C-L(8mg/kg)、LPS(10mg/kg)；
空白组、模型组和试验组的给药方式同上述1中所述，在末次给药1h 后，对模型组和试验组小鼠进行腹腔注射LPS(10mg/kg)，空白组给予等量生理盐水，6h后安乐死进行采样。
小鼠空肠石蜡切片荧光tunel试验步骤
1)石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯I15min-二甲苯Ⅱ15min- 无水乙醇I5min-无水乙醇Ⅱ5min-85％酒精5min-75％酒精5min-蒸馏水洗。
2)修复：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈(防止液体流走)，在圈内滴加蛋白酶K工作液覆盖组织，37度温箱孵育25min。将玻片置于PBS (pH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
3)破膜：切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育 20min，将玻片置于PBS(pH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
4)加试剂：按片子数量和组织大小取tunel试剂盒内适量试剂1(TdT)和试剂2(dUTP)按1:9混合，加到圈内覆盖组织，切片平放于湿盒内，37℃恒温箱孵育2小时，湿盒内加少量水保持湿度。
5)DAPI复染细胞核：切片用PBS(pH7.4)洗涤3次，每次5min。去除PBS后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。
6)封片：玻片置于PBS(pH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次 5min。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。
7)镜检拍照：切片于荧光显微镜下观察并采集图像(DAPI紫外激发波长330-380nm，发射波长420nm，发蓝光；FITC激发波长465-495nm，发射波长515-555nm)。
石蜡切片荧光tunel结果判读：DAPI染出来的细胞核在紫外的激发下为蓝色，Roche试剂盒为FITC荧光素标记，阳性凋亡细胞核为绿色。
试验结果如图5所示，结果表明，与空白组相比，模型组小鼠空肠上皮凋亡细胞数量显著升高；而试验组三种多肽会不同程度地抑制细胞凋亡的产生，且C-L抑制效果最明显。C-L可以将肠道细胞凋亡率降低至约7％，而其母源肽C和L分别只能将肠道细胞凋亡率降低到约20％和13％。由此可见，杂合肽C-L可显著抑制LPS诱导的细胞凋亡，且其抑制效果优于其母源肽。
实施例6杂合肽C-L对炎症状态小鼠肠道上皮屏障的保护作用
取60只健康雄性小鼠随机分为5组，每组12只。分为空白组(Control)：生理盐水；模型组(LPS)：LPS(10mg/kg)；C+LPS组：Cecropin A(8mg/kg)、 LPS(10mg/kg)；L+LPS组：LL-37(8mg/kg)、LPS(10mg/kg)；C-L+LPS 组：C-L(8mg/kg)、LPS(10mg/kg)；
空白组、模型组和试验组的给药方式同上述1中所述，在末次给药1h 后，对模型组和试验组小鼠进行腹腔注射LPS(10mg/kg)，空白组给予等量生理盐水，6h后安乐死进行采样。
1)配制所需溶液
电泳缓冲液：3.03g Tris，14.4g Gly，1g SDS，利用ddH2O定容至1L，调整溶液pH至8.3；
10×转膜缓冲液：30.3g Tris，144g Gly，利用ddH2O定容至1L；
1×转膜缓冲液：80mL 10×转膜缓冲液，200mL甲醇，利用ddH2O定容至1L。
2)蛋白样品制备及定量
提取空肠组织蛋白，利用裂解缓冲液对空肠组织进行裂解，30min后，离心10min，对空肠组织蛋白上清进行收集。空肠蛋白组织上清液中总蛋白浓度利用BCA蛋白含量检测试剂盒测定。
3)变性处理蛋白样品
向上述蛋白样品加入4×Loading buffer并将其用蛋白裂解缓冲液稀释至3μg/mL，将蛋白样品置于沸水浴中5min，冷却后分装保存于-80℃。
4)蛋白胶配制配制10％的分离胶与4％的浓缩胶。
5)电泳将蛋白胶放入电泳仪，在电泳槽中加入电泳缓冲液，每泳道中加入70μg的空肠蛋白样品或4μL预染maker.电泳条件：浓缩胶恒压80V 电泳30min，分离胶恒压电泳60min。
6)转膜将胶取出后，根据Marker条带，剪切目的蛋白所载位置的胶条，并将滤纸/PVDF膜/凝胶/滤纸平放入转模系统中，加入1×转膜缓冲液，转膜50min。
7)抗体与目的蛋白孵育加入脱脂牛奶封闭，1h后，用ZO-1、Occludin 以及β-actin抗体，4℃振荡孵育过夜。1×TBST洗涤3次，每次10min。将膜与辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗室温振荡孵育1h。然后用1×TBST 洗涤3次，每次10min。
8)显色反应及图像分析
将显影液ECL加到PVDF膜上，室温孵育2min。置于化学发光仪中曝光拍照，使用Image J软件分析条带灰度值。
试验结果如图6所示，结果表明，与空白组相比，模型组小鼠空肠具有代表性的紧密连接蛋白ZO-1和Occludin表达量显著下降，说明肠上皮通透性明显增加，肠屏障功能受到较大破坏，肠腔中致病菌及有毒有害小分子进入体内的风险并引起疾病的风险显著增加；而试验组三种多肽会不同程度地增加肠上皮紧密连接蛋白ZO-1和Occludin的表达，且C-L促进效果最明显。由此可见，杂合肽C-L可有效保护动物肠道上皮屏障物理和功能完整性，且其保护效果优于其母源肽。
实施例7杂合肽C-L对细胞伤口愈合的促进作用
用细胞刮伤试验研究杂合肽C-L对伤口愈合的促进作用。将猪空肠上皮细胞IPEC-J2置于含有DMEM完全培养基的细胞培养皿中培养，至长成单层致密的上皮细胞。用无菌枪头沿培养皿直径将IPEC-J2细胞划伤，利用 PBS洗涤脱落的细胞。然后，利用细胞培养基或含8μg/mL抗菌肽C-L的培养基培养划伤细胞，在0h、24h、48h时间梯度下观察IPEC-J2单层细胞伤口愈合情况并拍照记录，测量IPEC-J2单层细胞48h后的划痕宽度。
利用细胞刮伤试验检测杂合肽对IPEC-J2细胞修复的影响(图7A和 7B)，试验结果表明，相较于空白对照组，48h时添加杂合肽C-L的IPEC-J2 单层细胞伤口宽度和面积显著低于空白对照组。以上结果表明，杂合肽C-L 可提高IPEC-J2细胞的伤口愈合速度，提高受损肠道上皮组织的自我修复能力。
综上所述，杂合肽C-L具有抗炎、抗细胞凋亡、保护肠道上皮屏障、促进伤口愈合(修复损伤肠道)及消解内毒素的作用，且其在以上几方面的综合作用效果显著优于其母源肽，并且细胞毒性较低。一方面，C-L可消解内毒素，抑制炎症反应，降低炎症状态下细胞因子的释放量，缓解炎症反应对机体造成的损伤。因此，杂合肽C-L可用于炎症性疾病(如肠炎、感染炎症等)的治疗。
另一方面，杂合肽C-L能够抑制肠道上皮细胞凋亡、保护肠道上皮屏障结构和功能的完整性，从而阻止炎症的加剧及其他疾病的发生。因此，杂合肽C-L又可用于各种致病因子导致的细胞凋亡及肠道上皮损伤的防治。
此外，杂合肽C-L能够有效促进细胞生长，促进伤口愈合。因此，本发明的杂合肽C-L也可以用于促进伤口愈合药物的制备。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国农业大学
<120> 一种兼具解毒、抗炎、抗细胞凋亡、保护肠道屏障及促进伤口愈合的杂合肽及其应用
<130> KHP191113025.3
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile
1 5 10 15
Lys Asp Phe Leu Arg Asn
20
<210> 2
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Glu Lys Val Gly Gln Asn Ile Arg
1 5 10 15
Asp Gly Ile Ile Lys Ala Gly Pro Ala Val Ala Val Val Gly Gln Ala
20 25 30
Thr Gln Ile Ala Lys
35
<210> 3
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Leu Leu Gly Asp Phe Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Glu
1 5 10 15
Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val
20 25 30
Pro Arg Thr Glu Ser
35
Claims (10)
1.一种生物活性杂合肽，其特征在于，所述杂合肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，或为如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的替换、缺失或插入得到的具有相同功能多肽的氨基酸序列。
2.编码权利要求1所述杂合肽的基因。
3.含有权利要求2所述基因的生物材料，其特征在于，所述生物材料包括重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、噬菌体载体、病毒载体或宿主细胞。
4.权利要求1所述杂合肽或权利要求2所述基因或权利要求3所述生物材料在制备消解或抗内毒素制剂、或消毒剂中的应用。
5.权利要求1所述杂合肽或权利要求2所述基因或权利要求3所述生物材料在制备抗炎制剂中的应用。
6.权利要求1所述杂合肽或权利要求2所述基因或权利要求3所述生物材料在制备抗细胞凋亡制剂中的应用。
7.权利要求1所述杂合肽或权利要求2所述基因或权利要求3所述生物材料在制备保护肠道屏障制剂中的应用。
8.权利要求1所述杂合肽或权利要求2所述基因或权利要求3所述生物材料在制备促进伤口愈和制剂中的应用。
9.如权利要求4-8任一所述的应用，其特征在于，所述的制剂为药物、保健品、食品或饲料添加剂。
10.一种产品，所述产品包括药物、保健品以及食品或饲料添加剂，其特征在于，包含权利要求1所述杂合肽或权利要求2所述基因。
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