CN106986927A - 修饰肽及其用于治疗自体免疫疾病的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种肽或其盐，其包括氨基酸序列IH‑MVYSKRSGKPRGYAFIEY，或由其组成，该肽包括一个或多个翻译后修饰。

Description

修饰肽及其用于治疗自体免疫疾病的用途

本申请是申请日为2011年12月13日、申请号为201180076376.5、发明名称为“修饰肽及其用于治疗自体免疫疾病的用途”的发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及一种修饰肽及其用于治疗自体免疫疾病的用途。

通过引用合并

一包含序列号为1-6的序列表与此一同提交，通过引用将其整体并入本文。

背景技术

自体免疫疾病起因于免疫系统对存在于多细胞生物中的正常物质和组织的过度活跃的免疫反应，即免疫系统攻击自身组件。这可能限于某些器官或涉及不同地方的特定组织。治疗自体免疫疾病一般使用免疫抑制药物，其降低整个免疫反应。

红斑狼疮是一种自体免疫疾病，估计影响到近140万美国人，主要是年龄在20-40岁的妇女。红斑狼疮涉及攻击结缔组织的抗体。红斑狼疮的主要形式是系统性的(系统性红斑狼疮；SLE)。SLE是一种慢性自体免疫疾病，具有很强的遗传因素和环境因素。(例如，见Hochberg M C，Dubois′Lupus Erythematosus.5th ed.，Wallace D J，Hahn B H，eds.Baltimore：Williams and Wilkins(1997)；Wake land E K，et al.，Immunity 2001；15(3)：397-408；Nath S K，et al.，Curr.Opin.Immunol.2004；16(6)：794-800；D′Cruz etal.，Lancet(2007)，369：587-596)。各种其它形式的红斑红斑狼疮，包括，但不限于，皮肤红斑狼疮(CLE)、狼疮性肾炎(LN)、神经红斑狼疮(NPLE)和新生儿红斑狼疮。

不治疗红斑狼疮可致命，因为其从攻击皮肤和关节发展到攻击内部器官，包括肺、心脏和肾(主要考虑肾脏疾病)，因而对发展红斑狼疮进行早期的和准确的诊断和/或风险的评估是至关重要的。红斑狼疮主要表现为一系列突然爆发的，干预时间很少或没有疾病表现。通过测量尿液中的蛋白含量(尿蛋白)测定的肾脏损害是与SLE中病原性相关的最严重损害区域之一，不治疗会导致至少50％的疾病死亡率和发病率。

在临床上，SLE是一种异质性紊乱，其特点是高亲和性自身抗体(autoabs)。AutoAbs在SLE发病机理中发挥重要作用，并且疾病的不同的临床表现是由于包含抗体的免疫复合物在血管中的沉积导致肾、脑和皮肤的炎症。AutoAbs对溶血性贫血和血小板减少也有直接的致病效应。SLE与抗核抗体、循环免疫复合体和补体系统缺陷的产生有关。在20-60岁的黑人妇女中SLE的发生率约为1/700。SLE可影响任何器官系统，并能导致严重的组织损伤。SLE中存在许多不同特异性的autoAbs。SLE患者常产生具有抗DNA、抗Ro和抗血小板特异性的autoAbs，其能够引发疾病的临床特征，例如肾小球性肾炎、关节炎、浆膜炎、新生儿完全性心脏传导阻滞和血液异常。这些autoAbs也可能与中枢神经系统紊乱有关。Arbuckle等人描述了SLE临床发作前的autoAbs的发展(Arbuckle et al.N.Engl.J.Med.349(16)：1526-1533(2003))。

识别RNA-结合蛋白(RBPs，也指可提取的核抗原)的AutoAbs在SLE中第一次表征是在40年前(Holman，Ann N Y Acad.Sci.124(2)：800-6(1965))。这种RBPs包括一组在RNA加工和生化过程中起作用的蛋白-SSA(Ro52/TRIM21和Ro60/TROVE2)、SSB(La)、U1小核核糖核蛋白(RNP)和Smith(Sm)蛋白。抗SSA和抗SSB IgG autoAbs不单止在SLE中发现，还存在于综合症、类风湿性关节炎。抗SSA autoAbs与亚急性皮肤型红斑狼疮有关，以及与抗SSA阳性妇女的小孩中的先天性心脏传导阻滞和新生儿狼疮有关。抗SSB autoAbs几乎总是与抗SSA autoAbs一起被发现，而两种自身抗原与细胞质hYRNA有关(Lerner et al.，Science 211(4480)：400-2(1981))。抗Sm autoAbs对SLE是高度特异性的，通常与抗RNPautoAbs一起被发现。Sm和RNP蛋白都与细胞核RNA剪接体中的特异性snRNA有关(Lerner etal.，Proc Natl Acad Sci USA 76(11)：5495-9(1979))。抗RNP autoAbs还发现在患有混合结缔组织病的患者中。暗示了抗RBP autoAbs的存在可鉴定SLE的发生，该SLE在B细胞清除治疗后显示出较少的持久反应(Cambridge et al.，Ann Rheum Dis 67：1011-16(2008))。

现有技术公开了用于治疗自体免疫疾病的药物。例如，两个国际申请WO 03/020747和WO 03/025014均公开了70kDa的snRNP片段，其通过磷酸化和/或乙酰化修饰，用于治疗这类病症，即自体免疫疾病。但是，进一步实验表明，在WO 03/020747和WO 03/025014中披露的肽相对不稳定，而且给药到哺乳动物时很快被清除掉。此外，所披露的一些肽是没有活性的。

因此，有需要为自体免疫疾病提供更好的治疗方法。

发明内容

本发明提供组合物和使用组合物的方法，其基于意外的、非预期的发现，即序列2的肽的某些修饰形式在给药给哺乳动物时更加稳定。因此，本发明的一个方面是提供包含该肽的修饰形式和一药学上可接受的载体的组合物。

另一方面，本发明提供了一药物组合物或药物，其有助于改善自体免疫疾病，对治疗红斑狼疮有利。

在另外一个方面，本发明提供了治疗自体免疫疾病的方法，包括给予本文描述的一有效量的治疗组合物。

在一些实施方式中，本发明提供了分离肽(重组的或合成的)或其盐，包括以下序列的氨基酸或由其组成：

IHMVYSKRSGKPRGYAFIEY[序列号：2]，

其中在位置9的丝氨酸(s)被磷酸化，在位置3的蛋氨酸(M)被氧化。

在一些实施方式中，本发明提供了化合物I的肽，具有以下通式：

化合物I也可以表示为：

IHM(O)VYSKRS(PO₃H₂)GKPRGYAFIEY[序列号：5]

其中，“M(O)”代表氧化蛋氨酸，″S(PO₃H₂)″代表磷酸化丝氨酸。

这些肽来自人U1snRNP的70kDa蛋白(序列号：3)，对应于序列3中从残基132延伸至残基151的氨基酸片段限定的区域。形式上，磷酸化的残基对应于序列3位置140处的氨基酸(从第一个蛋氨酸起算)，氧化残基对应于序列3位置134处的氨基酸(从第一个蛋氨酸起算)。

在一些方面中，本发明提供一分离肽或其盐，其包括序列1的氨基酸序列或由其组成，该肽具有至少一个翻译后修饰，选自丝氨酸残基磷酸化、蛋氨酸残基氧化、赖氨酸残基乙酰化，以及它们的组合组成的组。在这方面的一种实施方式中，本发明提供一包含一分离肽的组合物或其盐，该分离肽具有序列1的氨基酸序列或由其组成，其中所述肽包含位置10的磷酸丝氨酸和位置4的氧化蛋氨酸残基。在一些另外的实施方式中，序列1的肽也包含一乙酰化赖氨酸残基。特别是，序列1的所述肽包含位置10的磷酸丝氨酸和位置4的氧化蛋氨酸残基，以及位置8和12中的一个或两个的赖氨酸乙酰化，更特别的，进一步包含位置7的磷酸丝氨酸。

在其他方面，本发明提供一分离肽，其包括序列2的氨基酸序列或由其组成，或其盐，该肽具有至少一个翻译后修饰，选自丝氨酸残基磷酸化、蛋氨酸残基氧化、赖氨酸残基乙酰化，以及它们的组合组成的组。在这方面的一种实施方式中，本发明提供包含一分离肽或其盐的组合物，该分离肽具有序列2的氨基酸序列或由其组成，其中所述肽包含位置9的磷酸丝氨酸和位置3的氧化蛋氨酸。在一些另外的实施方式中，序列2的肽也包含一乙酰化赖氨酸残基。

在某些方面，本发明提供一组合物，其包含一有效量的一种或多种本文描述的肽。在一些实施方式中，所述组合物进一步包含一药学上可接受的载体。在一个另外的实施方式中，本发明提供一组合物，包含一有效量的至少一种肽或其盐，该肽选自序列2的氨基酸序列，其中包含位置9的磷酸丝氨酸和位置3的氧化蛋氨酸；序列1的氨基酸序列，其中包含位置10的磷酸丝氨酸和位置4的氧化蛋氨酸；及它们的组合组成的组。

在一些实施方式中，本发明提供了化合物II的肽，具有以下通式：

化合物II也可以表示为：

RIHM(O)VYSKRS(PO₃H₂)GKPRGYAFIEY[序列号：4]

其中，M(O)代表氧化蛋氨酸，S(PO₃H₂)代表磷酸丝氨酸。

因此，本发明提供肽或其盐，包含选自由序列4和序列5组成的组的氨基酸序列，或由其组成。

本发明通过下述图1-6及所附描述，实施例和所附权利要求进行更好的描述，本发明各种示例性实施方式不解释为限制本发明。

附图说明

使附图并入并形成说明书的一部分，其阐述了本发明的各种实施方式，以及与说明书一起用于解释本发明原理。附图只是为了说明本发明实施方式，并不解释为限制该发明。

图1表示37℃时，本发明的肽(化合物II)相对于由序列1组成的肽(位置10的丝氨酸被磷酸化)的稳定性；该图表示在一段时间内(以天计)的稳定性百分比；曲线A-C分别代表化合物II在浓度为200、100、50μg/ml时的稳定性；曲线D-F分别代表由序列1组成的肽(位置10的丝氨酸被磷酸化)在浓度为200、100、50μg/ml时的稳定性；

图2是Kaplan-Meier图，表示老鼠注射NaCl(带圆形的线)、由序列1组成的肽(位置10的丝氨酸被磷酸化)(带正方形的线)和本发明的化合物II(带三角形的线)后，随时间(以周表示)的累积生存率(以百分比表示)；

图3表示老鼠注射NaCl(带圆形的线)、由序列1组成的肽(位置10的丝氨酸被磷酸化)(带正方形的线)和本发明的化合物II(带三角形的线)后，随时间(以周表示)的尿蛋白分数；

图4表示MRL/lpr鼠细胞数增加测量；Y轴表示每毫升鼠血液中的细胞数(×10⁶)，该鼠用NaCl(圆形)、由序列1组成的肽(位置10的丝氨酸被磷酸化)(正方形)和本发明的化合物II(三角形)处理；

图5表示由序列1(位置10的丝氨酸被磷酸化)组成的肽对HSC70蛋白的亲和性测定；曲线所对应的是使用由序列1(位置10的丝氨酸被磷酸化)组成的肽在浓度为25μM(A)、12.5μM(B)、6.25μM(C)、3.12μM(D)和1.56μM(E)时随时间(以秒为单位)的Biacore响应；

图6表示本发明化合物II对HSC70蛋白的亲和性测定；曲线所对应的是使用化合物2在浓度为25μM(A)、12.5μM(B)、6.25μM(C)、3.12μM(D)和1.56μM(E)时随时间(以秒为单位)的Biacore响应。

具体实施方式

下面是本发明的详细说明，便于本领域技术人员实现本发明。本领域普通技术人员在不偏离本发明精神或范围的情况下，可在本文描述的实施方式中进行修改和改变。虽然任何与本文描述相似或相等的方法和材料也可以在本发明试验或操作中使用，但现在对优选的方法和材料进行描述。除非另有说明，本文使用的所有技术术语和科技术语具有本领域技术人员所理解的一般含义。在本发明中使用的术语仅用于描述特定实施方式，不用于限制本发明。本文提及的所有的出版物、专利申请、专利、附图和其它参考资料通过引用将其整体清楚的并入本文。

除非另有规定，本文使用的下列术语具有下述规定的意义。然而，应该认识到，也有可能是本领域普通技术人员已知的或能理解的其他含义，并在本发明范围内。

除非文中明确规定，本文提供的值的范围，应当理解为，每个居中值是取到下限的单位的十分位，在这个范围的上限和下限之间，以及在这规定的范围中的任意其他规定的值或居中值，都包括在本发明中。这些较小范围的上限和下限可独立地包括在较小范围中，上限和下限也包括在本发明中，其受到该范围中任何明确排除的限值制约。当所规定的范围包括一个或两个限值时，排除那些已包括的限值的范围同样也包括在本发明中。

必须指出，如本文和所附权利要求中使用的，单数形式“一(a)”，“和(and)”和“该(the)”包括物品语法意义上的复数形式(即，指一个或多个或至少一个)。例如，“一要素”是指一个要素或多个要素。

此处使用的术语“大约”，结合使用的数值或范围，反映了一个事实，即由于实践和/或理论局限性，会存在本领域认识到的和能忍受的某一水平的差异。例如，由于某些设备操作和/或采取的测量方式本身差异，细微的变化是可以容忍的。如上所述，术语“大约”通常用来涵盖在标准偏差或标准误差范围内的值。

此处所使用的“衍生物”指由原始化合物通过直接修饰或通过部分取代形成的组合物。此处所使用的“类似物”是具有与原始化合物结构相似但不相同的组合物。

术语“有效量/剂量”、“药学有效量/剂量”、“药学有效量/剂量”或“治疗有效量/剂量”可以指但绝不限于足以阻止、抑制发生、改善、延迟或治疗(减轻症状到某种程度，优选减轻全部)病症、紊乱或疾病状态的有效药物组分的量/剂量。有效量取决于疾病类型、使用的组合物、给药途径、待治疗的哺乳动物类型、研究中的特定哺乳动物的体质特征、并用药物和其他医疗领域技术人员能够认识到的因素。一般而言，每天给予0.1mg/kg-1000mg/kg体重的活性组分，这取决于试剂效力。这类化合物的毒性和治疗功效，可通过在细胞培养物或实验动物中的标准药物程序测定，例如测定LD50(50％群体的致命剂量)和ED50(在50％群体中治疗有效的剂量)。在毒性和疗效之间的剂量比是治疗指数，可表示为LD50/ED50比值。能展示很大治疗指数的化合物是优选的。在可能使用出现毒副作用的化合物时，应注意设计一输送系统，其将这类化合物靶向到受影响组织位点，以最大程度降低对未感染细胞的潜在损害，从而减少副作用。从细胞培养分析和动物研究中获得的数据可用于制定人类使用的剂量范围。这类化合物的剂量优选处于循环浓度范围内，这些浓度包括几乎或完全没有毒性的ED50。剂量可能会在该范围内变化，这取决于采用的剂量形式或使用的给药途径。对于本发明方法中使用的任何化合物，可以在一开始就从细胞培养分析中估算治疗有效剂量。可在动物模型中制定剂量来达到循环血浆浓度范围，其包括在细胞培养中测定的IC50(即测试化合物达到半最大抑制症状的浓度)。此类信息可用于更精确的测定人体中的有用剂量。例如，可通过高效液相色谱测定在血浆中的水平。

术语“药理学组合物”、“治疗组合物”、“治疗剂型”或“药学上可接受的剂型”可指但绝不限于，一组合物或剂型，其允许本发明提供的一试剂进行有效分布，其形式为适于给药到最适合其理想活性的生理位置，例如全身用药。

术语“药学上可接受的”或“药理学上可接受的”可指，但绝不限于当恰当的给药到动物或人体时，不产生不利的、过敏的或其他不良反应的实体和组合物。

术语“药学上可接受的载体”或“药理学上可接受的载体”可指，但绝不限于，任何和所有溶剂，分散介质、涂层、抗菌和抗真菌试剂、等渗剂和吸收延迟剂等，都适合给药。合适的载体在最新版的雷明顿药物科学(Remington’s Pharmaceutical Sciences)中有所描述，其为本领域的标准参考文本，通过引用将其并入本文。这类载体或稀释物的优选实例包括，但不限于，水、生理盐水、finger溶液(finger’s solutions)、葡萄糖溶液和5％人血清白蛋白。脂质体和非水溶性媒介，如固定油也可以使用。为药学上的活性物质使用这种媒介和试剂在本领域是已知的。任何传统媒介或试剂除非与活性化合物不相容，不然都可以想到将其用于组合物中。补充性活性化合物也可以纳入该组合物。

术语“全身用药”是指一种给药途径，其是例如，肠内或肠外给药，造成试剂的全身分布，导致分布到整个身体后，血流内的药物的全身吸收和累积。适当的形式部分取决于使用或进入途径，例如口服、经皮给药或通过注射。这些形式不应阻止组合物或剂型达到靶向细胞(即，带负电聚合物需要到达的细胞)。例如，注射到血流里面的药理学组合物应该是可溶的。其他因素是本领域已知的，包括考虑到例如毒性和阻止组合物或剂型发挥作用的形式。导致全身吸收的给药途径包括，但不限于静脉注射、皮下注射、腹腔注射、吸入、口服、肺内和肌肉注射。药物进入循环的比例(rate)显示为分子量或尺寸的函数。使用包含本发明化合物的脂质体或其他药物载体能够使药物可能地集中在，例如某些组织类型中，例如网状内皮系统(RES)组织。一可促进药物与细胞表面(例如淋巴细胞和巨噬细胞)结合的脂质体剂型也是有用的。

术语“局部给药”指的是一种给药途径，其中试剂是运输到一恰当位点或接近(例如在约10cm内)病变或疾病位点的位点。

术语“衍生物”可指但绝不限于，一些化学成分，例如，核酸、核苷酸、多肽或氨基酸，由原始化合物直接通过修改或通过部分取代形成。术语“类似物”可指但绝不限于，一些化学成分，例如，核酸、核苷酸、多肽或氨基酸，其具有与原始化合物的结构相似但不相同。

术语“保守突变”是指核酸的替换、删除或添加，其在编码序列中改变、增加或删除单个氨基酸或少量氨基酸，其中核酸的改变导致化学性质类似的氨基酸的替换。相互之间可充当保守替换的氨基酸包括以下氨基酸：碱性：精氨酸(R)、赖氨酸(K)、组氨酸(H)；酸性：天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；亲水的：甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)；疏水的：苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；含硫的：蛋氨酸(M)、半胱氨酸(C)。另外，通过保守突变导致不同的序列一般是同源的。

“同源”是指两个或更多核酸分子的核苷酸序列，或两个或更多核酸或氨基酸序列是部分或完全一致。在一些实施方式中，该同源核酸或氨基酸序列分别与编码序列1的氨基酸序列的核酸或与序列1具有30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的序列相似性或一致性。

“同源物”可以是自然产生的，或通过人工合成一个或多个具有相关序列的核酸产生的，或通过修饰一个或多个核酸以得到相关核酸产生的。如果多个核酸是从共同祖先序列中自然或人为衍生而来，它们是同源的(直系同源或旁系同源)。如果两个核酸之间的同源性没有明确说明，可以通过两个或更多序列之间的核酸比对来推断同源性。如果这些序列表现出一定程度的序列相似性，例如，超过30％的主要氨基酸结构，得出的结论是它们共享一个共同的祖先。为了本发明的目的，如果核酸序列足够相似以允许在较低严格条件下重组和/或杂交，那么基因就是同源的。此外，如果多肽的核酸序列足够相似以允许在较低严格条件下重组和/或杂交，以及可选地，它们表现出膜修复活性，以及可选地，它们能够被一抗体(该抗体特异识别包含在序列1-6中的至少一个的氨基酸序列中的表位)识别(即交叉反应)，那么这些多肽可认为是同源的。

术语“细胞”可指但绝不限于，其通常的生物学意义，并不指整个多细胞生物体。例如，该细胞可以是体内的，体外的或离体的，例如在细胞培养物中，或存在于一多细胞生物体，包括，例如，鸟类、植物和哺乳动物如人、牛、羊、猿、猴、猪、狗和猫。细胞可以是原核细胞(例如细菌细胞)或真核细胞(例如，哺乳类动物或植物细胞)。

术语“宿主细胞”可指，但绝不限于，可用于携带异源核酸或表达肽或通过异源核酸编码的蛋白的细胞。宿主细胞可包含细胞原始形式(非重组的)中没有的基因，在细胞原始形式中发现的基因(该基因通过人工手段修饰并重新引入细胞)，或者细胞的内生核酸(该细胞被人工修饰，但没有从细胞移除核酸)。宿主细胞可以是真核或原核细胞。细菌培养所必须的生长条件可参加书本，如1984年出版的伯杰氏系统细菌学手册，第一卷，N.R.Krieg，编辑，Williams和Wilkins，巴尔的摩/伦敦(BERGEY′S MANUAL OF SYSTEMATICBACTERIOLOGY，Vol.1，N.R.Krieg，ed.，Williams and Wilkins，Baltimore/London(1984))。宿主细胞也可以是内生基因或启动子或二者均被修饰以产生本发明复合体的一个或多个多肽组分。

此处所使用的“P140”是指由序列1(其中位置10的丝氨酸被磷酸化)的氨基酸组成的肽。

术语“治疗有效量或剂量”包括能够在需要的主体内实现治疗效果的药物剂量。例如，药物的治疗有效量可以是能够阻止或减轻一种或多种与疾病或紊乱(例如组织损伤或肌肉相关疾病或紊乱)有关的症状的量。本领域技术人员可以使用已知技术(Lieberman，Pharmaceutical Dosage Forms(vols.1-3，1992)；Lloyd，The Art，Science andTechnology of Pharmaceutical Compounding(1999)；Pickar，Dosage Calculations(1999)；and Remington：The Science and Practice of Pharmacy，20th Edition，2003，Gennaro，Ed.，Lippincott，Williams&Wilkins))确定准确的量。

试剂盒是任意制品(例如包装或容器)，包含至少一种试剂，例如探针，用于特异性检测本发明的标记。该制品可以作为用于执行本发明的方法的单元进行推销、分销或销售。包括在该试剂盒内的试剂包括探针/引物和/或抗体，用于检测灵敏度和抗性基因表达。此外，本发明的试剂盒可优选包括说明书，描述相配的检测分析。这些试剂盒可以方便地使用于，例如临床设置中，以诊断显示出癌症症状的病人，尤其是显示出可能存在肿瘤的病人。

除非另有说明，本文使用的所有技术术语和科学术语具有本领域技术人员所理解的一般含义。本文提及的所有的出版物、专利申请、专利和其它参考资料通过引用将其整体并入本文。如果发生冲突，由本发明书，包括定义进行约束。此外，材料、方法和实例仅用于说明，不是进行限制。

以下参考文献的整体公开内容通过引用并入本文，给技术人员提供本发明使用的许多术语的通常定义：Singleton等人，微生物和分子生物学(第二版，1994)；剑桥科技词典(Walker编辑，1988)；基因术语表，第5版，R.Rieger等人(编辑)，Springer Verrlag(1991)；以及，Hale&Marham，《生物学词典》(1991)(Singleton et al.，Dictionary ofMicrobiology and Molecular Biology(2nd ed.1994)；The Cambridge Dictionary ofScience and Technology(Walker ed.，1988)；The Glossary of Genetics，5th Ed.，R.Rieger et al.(eds.)，Springer Verlag(1991)；and Hale&Marham，the HarperCollins Dictionary of Biology(1991))。

本发明提供组合物和使用组合物的方法，其基于意外的、非预期的发现，即序列2的肽的某些修饰形式在给药到哺乳动物时是稳定的。因此，本发明的一个方面是提供包含该肽的修饰形式和一药学上可接受的载体的组合物。

另一方面，本发明提供了一药物组合物或药物，其有助于改善自体免疫疾病，对治疗红斑狼疮有利。

在另外一个方面，本发明提供了治疗自体免疫疾病的方法，包括给予一有效治疗量的本文描述的组合物。

在一些实施方式中，本发明提供了分离肽(重组的或合成的)或其盐，包括以下的氨基酸序列或由其组成：

IHMVYSKRSGKPRGYAFIEY[序列号：2]，

其中在位置9的丝氨酸(s)被磷酸化，在位置3的蛋氨酸(M)被氧化。

在一些实施方式中，本发明提供了化合物I的肽，具有以下通式：

化合物I也可以表示为：

IHM(O)VYSKRS(PO₃H₂)GKPRGYAFIEY[序列号：5]

其中，“M(O)“代表氧化蛋氨酸，“S(PO₃H₂)”代表磷酸化丝氨酸。

这些肽来自人U1 snRNP的70kDa蛋白(序列号：3)，对应于序列3中从残基132延伸至残基151的氨基酸片段限定的区域。形式上，磷酸化的残基对应于序列3位置140处的氨基酸(从第一个蛋氨酸起算)，氧化残基对应于序列3位置134处的氨基酸(从第一个蛋氨酸起算)。

在一些实施方式中，本发明提供一分离肽或其盐，包括序列1的氨基酸序列或由其组成，该肽具有至少一个翻译后修饰，选自丝氨酸残基磷酸化、蛋氨酸残基氧化、赖氨酸残基乙酰化，以及它们的组合组成的组。在这方面的一种实施方式中，本发明提供包含一分离肽的组合物或其盐，该分离肽具有序列1的氨基酸序列或由其组成，其中肽包含位置10的磷酸化丝氨酸和位置4的氧化蛋氨酸残基。在一些另外的实施方式中，序列1的肽也包含一乙酰化赖氨酸残基。

在其他方面，本发明提供一分离肽或其盐，其包括序列2的氨基酸序列或由其组成，该肽具有至少一个翻译后修饰，选自丝氨酸残基磷酸化、蛋氨酸残基氧化、赖氨酸残基乙酰化，以及它们的组合组成的组。在这方面的一种实施方式中，本发明提供包含一分离肽的组合物或其盐，该分离肽具有序列2的氨基酸序列或由其组成，其中肽包含位置9的磷酸化丝氨酸和位置3的氧化蛋氨酸残基。在一些另外的实施方式中，序列2的肽也包含一乙酰化赖氨酸残基。

在某些方面，本发明提供一组合物，包含一有效量的一种或多种本文描述的肽。在一些实施方式中，所述组合物进一步包含一药学上可接受的载体。在一个另外的实施方式中，本发明提供一组合物或其盐，包含一有效量的至少一种肽，该肽选自由序列2的氨基酸序列(包含位置9的磷酸化丝氨酸和位置3的氧化蛋氨酸)；序列1的氨基酸序列(包含位置10的磷酸化丝氨酸和位置4的氧化蛋氨酸)及它们的组合组成的组。

在一些实施方式中，本发明提供了化合物II的肽，具有以下通式：

化合物II也可以表示为：

RIHM(O)VYSKRS(P0₃H₂)GKPRGYAFIEY[序列号：4]

其中，M(O)代表氧化蛋氨酸，S(PO₃H₂)代表磷酸化丝氨酸。

本发明提供肽或其盐，包含选自由序列4、序列5和它们的组合组成的组的氨基酸序列，或由其组成，以及提供包含该肽或其盐的组合物。

在一些实施方式中，本发明提供一分离肽(例如序列4)，具有序列1的氨基酸序列(包含位置10的磷酸化丝氨酸和位置4的氧化蛋氨酸)(此处也指化合物II或P140(MO))。

根据本发明，分离肽分别具有序列4或5的氨基酸序列，通过至少两个翻译后修饰进行修饰(修饰发生在肽合成之后)。在一些实施方式中，所述翻译后修饰选自由磷酸化(添加磷酸基PO₃H₂)，例如丝氨酸残基磷酸化；氧化，例如蛋氨酸残基氧化；乙酰化，例如赖氨酸残基乙酰化；和它们的组合组成的组。

在一优选实施方式中，本发明提供一分离肽或其盐，具有序列2的氨基酸序列，包含位置9的磷酸化丝氨酸和位置3的氧化蛋氨酸。在一些实施方式中，本发明提供一分离肽或其盐，具有序列2的氨基酸序列(包含位置9的磷酸化丝氨酸和位置3的氧化蛋氨酸)，以及一载体，例如药学上可接受的载体。在一些实施方式中，本发明提供一组合物，例如一治疗性组合物，包含一有效量的肽或其盐，以及一载体，例如药学上可接受的载体，该肽具有序列2的氨基酸序列(包含一位置9的磷酸化丝氨酸和位置3的氧化蛋氨酸)。

在另一个实施方式中，本发明提供一分离肽或其盐，具有序列4的氨基酸序列，其包含位置10的磷酸化丝氨酸和位置4的氧化蛋氨酸。在一些实施方式中，本发明提供一分离肽或其盐，具有序列4的氨基酸序列(包含位置10的磷酸化丝氨酸和位置4的氧化蛋氨酸)，以及一载体，例如药学上可接受的载体。在一些另外的实施方式中，本发明提供一组合物，例如一治疗性组合物，包含一有效量的肽或其盐，以及一载体，例如药学上可接受的载体，该肽具有序列4的氨基酸序列(包含位置10的磷酸化丝氨酸和位置4的氧化蛋氨酸)。

在另一个实施方式中，本发明提供一分离肽或其盐，具有序列5的氨基酸序列，其包含位置9的磷酸化丝氨酸和位置3的氧化蛋氨酸。在一些实施方式中，本发明提供一分离肽或其盐，具有序列5的氨基酸序列(包含位置9的磷酸化丝氨酸和位置3的氧化蛋氨酸)，以及一载体，例如药学上可接受的载体。在一些另外的实施方式中，本发明提供一组合物，例如一治疗性组合物，包含一有效量的肽或其盐，以及一载体，例如药学上可接受的载体，该肽具有序列5的氨基酸序列(包含位置9的磷酸化丝氨酸和位置3的氧化蛋氨酸)。

令人惊讶和意外的是，我们发现本文描述的肽在体外比它们的非氧化对应形式更为稳定。稳定性测量如实例部分所公开的。磷酸化-氧化肽在溶液中与其非氧化对应形式相比，较少发生自发降解，所述稳定性增强了其生物属性。

此外，发明者意外地发现，蛋氨酸氧化增强了肽的稳定性，但不影响该肽的的生物效应，这与现有技术的教导相反。事实上，本领域大量报道了包含氧化的蛋氨酸的蛋白和肽破坏了它们的三维结构和/或生物活性。本文描述的修饰肽对HSC70蛋白具有亲和性，本质上与实例部分公开的非氧化对应形式一致。

在某些实施方式中，氧化发生在序列2位置9或序列1位置10的蛋氨酸(M)上，该位置与序列3的位置134相对应。如下所示，硫原子被氧化。

上述肽(序列1、2、4和5)可通过普通的现有技术合成，例如生物合成或化学合成。生物合成是指在体内、体外或离体，通过编码所述肽的核酸分子的转录和翻译生产目标肽。

例如，核酸序列：

MGNATHCAYATGGTNTAYWSNAARMGNWSNGGNAARCCNMGNGGNTAYGCNTTYATHGARTAYTRR[序列号：6]

在体内系统或宿主生物中转录和翻译，以产生序列1的肽。因而，得到的肽根据现有已知技术进行纯化。

化学合成通过添加所需氨基酸以聚合所需肽来实现。在实例部分公开了方法。

可通过经典的芴甲氧羰基(Fmoc)(N-[9-芴基]甲氧羰基)固相化学合成序列1和2的肽，并用反相高效液相色潽法纯化(HPLC；Neimark and Briand，1993；Monneaux et al.，2003，Eur.J.Immunol.33，287-296；Page et al.，2009，PloS ONE 4，e5273)。

也可能直接合成序列1和2的肽，其中各自的位置10和9的残基被磷酸化。为此目的，在肽合成期间，在所需位置使用Fmoc-Ser(PO(Obz)OH)-OH-类型的丝氨酸衍生物。

磷酸基团(-PO₃H₂)也可以在肽合成之后根据本领域已知的实验方案添加。

在三磷酸腺苷(ATP)存在下，通过将序列1或2的肽与特异性丝氨酸激酶(选自蛋白激酶A或C(PKA或PKC)或酪蛋白激酶II)一起孵育，能够使丝氨酸磷酸化。从而，肽在一个丝氨酸(序列2中的位置6或9，或者序列1中的位置7或10)或两个丝氨酸位置被磷酸化。所需磷酸化多肽通过例如色谱法与其他物质分离。

通过使用特异性保护基团，化学添加物-PO₃H₂也可以添加在特定位置(序列2的位置9或序列1的位置10)，本领域技术人员根据普通技术知识可容易的进行选择。

也可使用其他允许丝氨酸特异性磷酸化的技术。

在一些实施方式中，蛋氨酸氧化是根据下列工艺进行的：

用20mM的双氧水在37℃下处理4小时，或者

在0.1M二甲基亚砜(DMSO；Me₂SO)和0.5M HCl溶液中在22℃处理30-180分钟。

也可使用其他允许蛋氨酸特异性氧化的技术。

在本文描述的任何方面或实施方式中，本发明提供的肽以本领域技术人员已知的盐形式存在，例如，钠盐、铵盐、钙盐、镁盐、钾盐、醋酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐、氯盐、硫酸盐、氨基盐酸盐(amino chlorhydate salts)、硼氢化盐、苯磺酸盐、磷酸盐、磷酸二氢盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、乳酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐(mesylate)或对甲苯磺酸盐(tosylate)。通过举例提供此列表，但并不意味着限制本发明。例如，本领域技术人员可根据其知识容易地确定合适的盐。

在一个另外的实施方式中，本发明提供一肽或其盐，包含以下氨基酸序列或由其组成：

RIHMVYSKRSGKPRGYAFIEY[序列号：1]，

其包含位置10的磷酸化丝氨酸和位置4的氧化蛋氨酸。在一个有优势的实施方式中，本发明涉及上述定义的肽或其盐，由序列4的氨基酸序列组成。

在另一方面，本发明提供一治疗性组合物，包含本文描述的至少一种肽或其盐，以及具有免疫抑制效果的药物。在某些实施方式中，治疗性组合物包含一有效量的本文描述的肽，以及一有效量的具有免疫抑制效果的药物。在一个实施方式中，肽具有序列1的氨基酸序列(包含位置10的磷酸化丝氨酸)，和一具有免疫抑制效果的药物。

所述肽由序列1的氨基酸序列组成，其中在位置10的丝氨酸被磷酸化，对应于下列化合物III：

此处所使用的“具有免疫抑制效果”的药物是抑制或阻止对象(例如哺乳动物如人类)免疫系统活性的药物。例如，“具有免疫抑制效果”的药物包括：肾上腺皮质素，如甲基强的松龙；环磷酰胺；咪唑硫嘌呤；羟化氯喹；抗疟药；霉酚酸酯；氨甲蝶呤；生物药如英夫利昔单抗、依那西普、戈利木单抗、阿达木单抗、赛妥珠单抗；及其上述药物的组合。

此列表并不旨在限制本发明。例如，本领域人员可容易的确定其他具有免疫抑制或免疫调节效果的药物，它们的有效量和给药途径。

在一些实施方式中，本发明提供一治疗性组合物，包含一有效量的肽以及一有效量的具有免疫抑制或免疫调节效果的药物，所述肽具有序列4、5或它们的组合(即包含序列5和序列4的肽)中的至少一个氨基酸序列。在另外的实施方式中，所述组合物可另外包含一肽，所述肽具有序列1的氨基酸序列，并包含位置10的磷酸化丝氨酸。

在另外的方面，本发明也提供一治疗自体免疫疾病的方法，包括将本文描述的一有效量的药物组合物给予需要该类治疗的对象(例如患者，如哺乳动物，如人类)，其中所述组合物足以实现所述治疗。在另一个方面，本发明提供一描述的组合物，用于治疗自体免疫疾病的方法，包括将本文描述的一有效量的药物组合物给予需要该类治疗的患者，其中所述组合物足以实现所述治疗。

在某些实施方式中，自体免疫疾病选自：结缔组织疾病家族的自体免疫疾病(非特异性全身器官疾病)，例如全身性红斑狼疮(SLE)、风湿性关节炎、混合性结蒂组织病、综合症或慢性幼年型关节炎；和/或器官特异性自体免疫疾病，如多发性硬化症、胰岛素依赖型糖尿病、克罗恩氏病或大疱性疾病。在一优选实施方式中，自体免疫疾病是SLE。

本发明还提供一药物，包含本文描述的一肽，和/或本文描述的一用作药物的组合，尤其用于治疗自体免疫疾病。

在某些实施方式中，自体免疫疾病选自：结缔组织疾病家族的自体免疫疾病(非特异性全身器官疾病)，例如全身性红斑狼疮(SLE)、风湿性关节炎、混合性结蒂组织病、综合症，或慢性幼年期关节炎；和/或器官特异性自体免疫疾病，如多发性硬化症、胰岛素依赖型糖尿病、克罗恩氏病或大疱性疾病。在一优选实施方式中，自体免疫疾病是SLE。

本发明也提供一药物组合物，包含本文描述的至少一种肽，或上述组合产品，其进一步包括一药学上可接受的载体。

在此描述的肽(在此也称为“活性化合物”)，可结合到药物组合物中适于给药。这种组合物通常包括肽和一药学上可接受的载体。在此使用的术语“药学上可接受的载体”可指任何和所有适合给药的溶剂、分散介质、涂层、抗菌和抗真菌试剂、等渗剂和吸收延迟剂等。为药学上的活性物质使用这种媒介和试剂在本领域是已知的。任何传统媒介或试剂除非与活性化合物不相容，不然都可以想到将其用于组合物中。补充性活性化合物也可以纳入该组合物。

本发明提供制备药物组合物的方法。这些方法包含将本文描述的肽与药学上可接受的载体配制成配方。这种组合物可以进一步包含本文描述的额外的活性试剂。因此，本发明进一步包括制备药物组合物的方法，通过将药学上可接受的载体与本文描述的肽，以及一种或多种额外的活性化合物配制成配方。

配制的本发明药物组合物适用于预期的给药途径。给药途径的实例包括胃肠外给药，例如，静脉给药、皮内给药、皮下给药、口服给药、鼻腔给药(例如吸入)、经皮给药(局部)、透粘膜给药和直肠给药。用于胃肠外给药、皮内给药或皮下给药应用的溶剂或悬浮液可包括以下组分：无菌稀释剂如注射用水、生理盐水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗菌试剂如苄醇；抗氧化剂如抗坏血酸或硫酸氢钠；螯合剂如乙二胺四乙酸；缓冲液如醋酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐以及用于调整渗透压的试剂如氯化钠或右旋糖。可用酸碱调整pH值，如盐酸或氢氧化钠。胃肠外制剂可密封在安瓶中、一次性注射器中或玻璃或塑料制造的多剂量瓶中。

适合注射使用的药物组合物包括：无菌水溶液(水溶的)或分散体，和用于临时制备无菌注射溶液或分散体的无菌粉末。对于静脉给药，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、聚氧乙烯蓖麻油(Cremophor EL，BASF；帕西帕尼；新泽西州)或磷酸盐缓冲液(PBS)。在所有情况下，组合物必须是无菌的，并且流动性应该达到容易注射的程度。其在制造和储存条件下必须是稳定的，并必须保存以对抗微生物例如细菌和真菌的污染。载体可以是溶剂或分散介质，包含例如水、乙醇、多元醇(例如，丙三醇、丙二醇、液态聚乙二醇等)，和它们的合适的混合物。可以维持适当的流动性，例如，通过使用一个涂层如卵磷脂，通过在分散体中维持所需的颗粒大小，和通过使用表面活性剂。预防微生物活动可通过各种抗菌和抗真菌剂来实现，例如氯丁醇、苯酚、抗坏血酸等。在很多情况下，优选在组合物中包括等渗剂，例如，糖、多元醇如甘露醇、山梨醇或氯化钠。通过在组合物中包含延长吸收的试剂，如单硬脂酸铝和明胶，可使可注射组合物的吸收延长。

可通过将在合适溶剂中的活性化合物(如多肽或抗体)以所需量和根据需要具有上述列举的组分中的一种或组合过滤除菌后，混合制备无菌注射溶液。通常，通过将活性化合物结合到包含碱性分散介质的无菌载体上，然后结合上述列举那些所需的其他组分，制备分散体。在用无菌粉末制备无菌可注射溶液的情形下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，产生活性组分粉末，加上任何其他之前灭菌过滤溶液中的所需组分。

一般地，口服组合物包括惰性稀释剂或可食用载体。它们可密封在明胶胶囊中，或压成片剂。针对口服治疗给药的目的，活性化合物能与赋形剂联合，并以药片、锭剂或胶囊的形式使用。口服组合物也可使用流体载体制备，用于漱口，其中流体载体中的化合物通过口服和漱口后吐出或吞下来应用。

对于吸入给药，化合物以喷雾剂形式从加压容器或分配器输送，该容器或分配器包含合适的推进剂，例如一气体如二氧化碳或雾化器。

全身给药也可是通过透粘膜或经皮给药方式。对于透粘膜或经皮给药，在剂型中使用适合穿透屏障的渗透剂。这类渗透剂在现有技术中通常是已知的，包括，例如，用于透粘膜给药的表面活性剂、胆盐和梭链孢酸衍生物。透粘膜给药可通过使用鼻喷雾剂或栓剂实现。对于经皮给药，将活性化合物配制成现有技术通常已知的软膏、药膏、胶体或霜的形式。

化合物也可以制备成栓剂形式(例如，与常规的栓剂基质，如可可油和其他甘油酯)或保留灌肠剂，用于直肠递送。

在一个实施例中，活性化合物与保护化合物防止身体的快速排泄的载体一起配制，如缓释剂型，包括埋植剂和微胶囊输送系统。可以使用生物可降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。对于本领域技术人员来说，制备这些剂型的方法是显而易见的。这些材料也可从Alza公司(AlzaCorporation)和Nova制药股份有限公司(Nova Pharmaceuticals，Inc)获得。脂质体悬浮物(包括具有单克隆抗体结合到其里或其上的脂质体)也可用作药学上可接受的载体。这些可根据本领域技术人员已知的方法制备，例如，美国专利US 4,522,811中记载的。

以剂量单元形式配制口服或胃肠外组合物，这对于给药便利性和剂量一致性是尤其有利的。本文使用的剂量单元形式是指，用于待治疗对象的适合作为单一剂量的身体上不连续单元；每个单元包含一通过计算的预定量活性化合物，从而与所需药物载体一起产生所需治疗效果。对本发明剂量单元形式通过以下说明并直接依赖以下说明：活性化合物的独特特征和要达到的特定治疗效果，以及本领域组合这一活性化合物用于治疗个体的固有限制。

在本文提供的方法的一些实施方式中，该方法包括给予本文描述的治疗或药学组合物，约100ng至约5mg剂量。在一些实施方式中，例如在人体中，本文描述的药物组合物可包含甘露醇作为载体，并且在一次给药中，该组合物的给药量是从10μg至500μg，优选是200μg。

在一些另外的方面，给药方案可以是重复1-3次/周，每周至每四周，只要治疗窗需要，并因此重复几年。在一优选实施方式中，给药方案是12周治疗，但可以一年重复两次，重复几年。一种给药实例是：一次注射200μg肽，每四周注射一次，治疗12周(即3次注射，每次相隔4周)。

通过每六个月给药，治疗可以延长。

优选的药学上可接受的载体可包含例如，黄原胶、槐树豆胶、半乳糖、其他糖类、寡糖和/或多糖、淀粉、淀粉片段、葡聚糖、糊精以及它们的混合物。有利地，药学上可接受的载体是天然的。药学上可接受的载体可以是或可进一步包括选自单糖或二糖的惰性糖类稀释物。优选的糖是甘露醇。

有利地，本发明涉及上述定义的药物组合物，其是锭剂、片剂、胶制品、胶囊、药滴、药丸、脂质体，或纳米颗粒，或溶液形式。一种有利的溶液是包含5-15％，尤其是约10％甘露醇的溶液。溶液应该是等渗(isooasmolar)的。

本发明还涉及一药物，其包含上述定义的组合产品，用于同时、单独或连续使用。

实例

统计信息

统计测试使用GraphPad Prism 5.0版本进行。使用双向方差试验分析鼠对照组和肽处理组尿蛋白差异的统计显著性。对照和P140类似物处理的雌性MRL/lpr鼠的存活率通过Kaplan-Meier方法分析，差异显著性通过Log-Rank检验确定。对于其他变量，使用学生t检验(Student′s t-test)评估统计显著性。p值小于0.05可视为显著的。

实施例1化学合成肽。

通过经典的芴甲氧羰基(N-[9-芴基]甲氧羰基)固相化学合成P140肽和P140(MO)，并用反相高效液相色潜法纯化(HPLC；Neimark and Briand，1993；Monneaux et al.，2003，Eur.J.Immunol.33，287-296；Page et al.，2009，PloS ONE 4，e5273)。通过分析HPLC检查他们的同质性，并在Finnigan LCQ Advantage Max系统上通过LC/MS评估其一致性(ThermoFischer Scientific)。反应完成后，肽通过HPLC纯化。

为了在对应于序列3的残基140的丝氨酸残基位置引入磷酸化，使用Fmoc-Ser(PO(Obz)OH)-OH-类型的丝氨酸衍生物。连接时间增加到30min，并系统地执行第二连接。在酸培养基中解开后，每个肽通过冷乙醚沉淀，溶解在水和乙腈溶液中并最终冻干。然后，将多肽通过RP-HPLC纯化，其完整性和纯度通过HPLC和质谱(Maldi-TOF)分析。

通过上述引入氧化。

实施例2肽的稳定性。

在37℃，在10％(v/v)甘露醇溶液中测定序列1(其中位置10的丝氨酸被磷酸化，位置4的蛋氨酸被氧化(P140(MO))和序列1(其中丝氨酸在位置10被磷酸化(P140))的肽的稳定性。每个肽测试三个浓度：200、100和50μg/mL。

在指定的时间，在盐溶液中通过高效液相色谱从完整肽对应的峰面积测定P140和P140(M(O)肽的完整性。

结果如图1所示。

以下表1和表2汇总了结果：

表1：

表2：

通过使用HPLC峰表面测定稳定性。

在37℃下超过100天，对于每个测试浓度(50到200μg/ml)，P140M(O)稳定性保持不变(100％、99.1％和99.4％)。

在37℃下，对于每个测试浓度(50到200μg/ml)，P140稳定性随着时间降低，并在100后减少(97.4％、93.4％和89.6％)。

这些数据表明，在肽P140中的蛋氨酸氧化提高了肽的稳定性。P140(MO)在所有测试浓度超过100天时都是稳定的。

实施例2肽在MRL/lpr鼠中的治疗效果。

MRL/lpr鼠系是一种鼠亚系品种，其遗传上倾向于发展出系统性红斑狼疮类综合症，其在临床上类似于人类疾病。已确定此鼠系在fas基因上带有突变。此外，在研究自体免疫疾病的行为和认知缺陷以及免疫抑制剂的功效方面，MRL/lpr是一非常有用的模型(Monneaux et al.，2003，Eur.J.Immunol.33，287-296)。

2.1-存活分析

通过所述静脉注射，5周大雌性MRL/lpr鼠接受了P140或肽P140(MO)(Monneaux etal.，2003，Eur.J.Immunol.33，287-296)。所有实验方案的执行得到了当地实验动物使用与管理委员会(CREMEAS)的支持。鼠注射NaCl作为对照。

每种肽或NaCl使用二十只鼠。

结果见图2。

采用Log-Rank(Mantel-Cox)检验，结果如下：NaCl vs P140p＝0.0686，NaCl vsP140(MO)p＝0.0026，P140vs P140M(O)p＝0.2366.

鼠的生存中值为：NaCl＝25周，P140＝29周，并且P140(MO)＞40周。这些结果显示出P140(MO)肽在鼠体内治疗红斑狼疮的功效。

2.2-尿蛋白分析

在上述鼠的新鲜尿液中使用尿蛋白试纸(Albustix)(拜耳诊断)测量尿蛋白，并根据制造商建议的0-4段进行半定量评估(无尿蛋白＝0；微量＝1；1+＝2；2+＝3；3+＝4；4+＝5)。

结果见图3。

在上图中，可以看到，与未处理鼠相比，P140M(O)处理的鼠的尿蛋白不太重要，且较迟出现。

2.3-细胞性分析

给MRL/lpr鼠注射100μg/100uL的P140或P140(MO)，在这次唯一的注射5天后研究其细胞性(外周血)。此计数包括所有白细胞。鉴于测试鼠数量较少，进行非参数统计检验Mann-Whitney。

结果见图4。

因此，在急性红斑狼疮鼠模型中，序列4的肽能够减少外周细胞过多，并延迟疾病的生物和临床症状，效力至少与P140的相似，或更好。

实施例3对HSC70蛋白的肽亲和性。

使用BIAcore 3000系统(Biacore AB)来评估P140肽对HSC70蛋白的结合(Page etal.，2009，2011)。传感芯片CM5，表面活性剂P20，胺连接试剂盒(包含N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和N-乙基-N′-二甲基氨基丙基碳化二亚胺(EDC)、2-(2-吡啶基二硫基)乙胺(PDEA)和乙醇胺)来自Biacore AB。用HBS-EP缓冲液作为运行缓冲液(10mM HEPES、150mM NaCl、3mMEDTA、0.005％表面活性剂P20，pH 7.4)进行生物传感器分析。化合物在运行缓冲液中被稀释。在每次实验后，通过注射10μL的10mM HCl再生传感芯片表面。在NHS/EDC激活的基质上使用35μL PDEA(50mM硼酸盐缓冲剂中)，pH为8.3，重组牛HSC70抗体(Stressgen)通过其巯基固定到CM5传感芯片的流通池上。然后，注射35μL HSC70(在甲酸盐缓冲液中，100μg/mL，pH4.3)直到13000响应单元(RU)的响应(相当于固定的HSC70为13ng/mm²)。使用20μL 50mM丝氨酸/1M氯化钠溶液使芯片的空位点饱和。P140肽对HSC70的直接结合测量在25℃、20μL/min的恒定流速下进行。将P140肽和类似物以不同浓度注射到流量(flux)中，3min后，用解离相运行3min。在个人电脑上使用BIAeval 3.1软件计算动力学参数。使用简单的1∶1Langmuir结合模型进行分析。通过减掉从对照的空通道和从空白缓冲液注射中的响应信号后，获得特异性结合谱。每个模型的拟合通过相对于理论模型的χ²值和残基分布的随机性判断。

结果如表3和4、图5和6所示。

这些表说明P140和P140M(O)肽对HSC70的亲和性没有统计学差异。

因此，这两种肽对HSC70的结合效率相同。

表3：HSC70上的P140

表4：HSC70上的P140(MO)

序列表

<110> CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE

IMMUPHARMA France SA

MULLER, Sylviane

BRIAND, Jean-Paul

ZIMMER, Robert

<120> 修饰肽及其用于治疗自体免疫疾病的用途

<130> IWB 11 CJ CNR P140

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 来自U1 snRNP 70 kDa

<400> 1

Arg Ile His Met Val Tyr Ser Lys Arg Ser Gly Lys Pro Arg Gly Tyr

1 5 10 15

Ala Phe Ile Glu Tyr

20

<210> 2

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 来自U1 snRNP 70 kDa

<400> 2

Ile His Met Val Tyr Ser Lys Arg Ser Gly Lys Pro Arg Gly Tyr Ala

1 5 10 15

Phe Ile Glu Tyr

20

<210> 3

<211> 437

<212> PRT

<213> 人

<400> 3

Met Thr Gln Phe Leu Pro Pro Asn Leu Leu Ala Leu Phe Ala Pro Arg

1 5 10 15

Asp Pro Ile Pro Tyr Leu Pro Pro Leu Glu Lys Leu Pro His Glu Lys

20 25 30

His His Asn Gln Pro Tyr Cys Gly Ile Ala Pro Tyr Ile Arg Glu Phe

35 40 45

Glu Asp Pro Arg Asp Ala Pro Pro Pro Thr Arg Ala Glu Thr Arg Glu

50 55 60

Glu Arg Met Glu Arg Lys Arg Arg Glu Lys Ile Glu Arg Arg Gln Gln

65 70 75 80

Glu Val Glu Thr Glu Leu Lys Met Trp Asp Pro His Asn Asp Pro Asn

85 90 95

Ala Gln Gly Asp Ala Phe Lys Thr Leu Phe Val Ala Arg Val Asn Tyr

100 105 110

Asp Thr Thr Glu Ser Lys Leu Arg Arg Glu Phe Glu Val Tyr Gly Pro

115 120 125

Ile Lys Arg Ile His Met Val Tyr Ser Lys Arg Ser Gly Lys Pro Arg

130 135 140

Gly Tyr Ala Phe Ile Glu Tyr Glu His Glu Arg Asp Met His Ser Ala

145 150 155 160

Tyr Lys His Ala Asp Gly Lys Lys Ile Asp Gly Arg Arg Val Leu Val

165 170 175

Asp Val Glu Arg Gly Arg Thr Val Lys Gly Trp Arg Pro Arg Arg Leu

180 185 190

Gly Gly Gly Leu Gly Gly Thr Arg Arg Gly Gly Ala Asp Val Asn Ile

195 200 205

Arg His Ser Gly Arg Asp Asp Thr Ser Arg Tyr Asp Glu Arg Pro Gly

210 215 220

Pro Ser Pro Leu Pro His Arg Asp Arg Asp Arg Asp Arg Glu Arg Glu

225 230 235 240

Arg Arg Glu Arg Ser Arg Glu Arg Asp Lys Glu Arg Glu Arg Arg Arg

245 250 255

Ser Arg Ser Arg Asp Arg Arg Arg Arg Ser Arg Ser Arg Asp Lys Glu

260 265 270

Glu Arg Arg Arg Ser Arg Glu Arg Ser Lys Asp Lys Asp Arg Asp Arg

275 280 285

Lys Arg Arg Ser Ser Arg Ser Arg Glu Arg Ala Arg Arg Glu Arg Glu

290 295 300

Arg Lys Glu Glu Leu Arg Gly Gly Gly Gly Asp Met Ala Glu Pro Ser

305 310 315 320

Glu Ala Gly Asp Ala Pro Pro Asp Asp Gly Pro Pro Gly Glu Leu Gly

325 330 335

Pro Asp Gly Pro Asp Gly Pro Glu Glu Lys Gly Arg Asp Arg Asp Arg

340 345 350

Glu Arg Arg Arg Ser His Arg Ser Glu Arg Glu Arg Arg Arg Asp Arg

355 360 365

Asp Arg Asp Arg Asp Arg Asp Arg Glu His Lys Arg Gly Glu Arg Gly

370 375 380

Ser Glu Arg Gly Arg Asp Glu Ala Arg Gly Gly Gly Gly Gly Gln Asp

385 390 395 400

Asn Gly Leu Glu Gly Leu Gly Asn Asp Ser Arg Asp Met Tyr Met Glu

405 410 415

Ser Glu Gly Gly Asp Gly Tyr Leu Ala Pro Glu Asn Gly Tyr Leu Met

420 425 430

Glu Ala Ala Pro Glu

435

<210> 4

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 来自U1 snRNP 70 kDa

<220>

<221> MOD_RES

<222> (4)..(4)

<223> 氧化

<220>

<221> MOD_RES

<222> (10)..(10)

<223> 磷酸化

<400> 4

Arg Ile His Met Val Tyr Ser Lys Arg Ser Gly Lys Pro Arg Gly Tyr

1 5 10 15

Ala Phe Ile Glu Tyr

20

<210> 5

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 来自U1 snRNP 70 kDa

<220>

<221> MOD_RES

<222> (3)..(3)

<223> 氧化

<220>

<221> MOD_RES

<222> (9)..(9)

<223> 磷酸化

<400> 5

Ile His Met Val Tyr Ser Lys Arg Ser Gly Lys Pro Arg Gly Tyr Ala

1 5 10 15

Phe Ile Glu Tyr

20

<210> 6

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 来自U1 snRNP 70 kDa

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(3)

<223> n 是 a, c, g, 或 t

<220>

<221> misc_feature

<222> (15)..(15)

<223> n 是 a, c, g, 或 t

<220>

<221> misc_feature

<222> (21)..(21)

<223> n 是 a, c, g, 或 t

<220>

<221> misc_feature

<222> (27)..(27)

<223> n 是 a, c, g, 或 t

<220>

<221> misc_feature

<222> (30)..(30)

<223> n 是 a, c, g, 或 t

<220>

<221> misc_feature

<222> (33)..(33)

<223> n 是 a, c, g, 或 t

<220>

<221> misc_feature

<222> (39)..(39)

<223> n 是 a, c, g, 或 t

<220>

<221> misc_feature

<222> (42)..(42)

<223> n 是 a, c, g, 或 t

<220>

<221> misc_feature

<222> (45)..(45)

<223> n 是 a, c, g, 或 t

<220>

<221> misc_feature

<222> (51)..(51)

<223> n 是 a, c, g, 或 t

<400> 6

mgnathcaya tggtntayws naarmgnwsn ggnaarccnm gnggntaygc nttyathgar 60

taytrr 66

Claims (10)

1.一种肽或其盐，所述肽由其中包含位置9的磷酸化丝氨酸以及位置3的氧化蛋氨酸的氨基酸序列IHMVYSKSGKPRGYAFIEY组成。

2.一种肽或其盐，所述肽由与其中包含位置10的磷酸化丝氨酸以及位置4的氧化蛋氨酸的氨基酸序列RIHMVYSKRSGKPRGYAFIEY具有95％或100％序列同源性的氨基酸序列组成。

3.一种组合物，其包含根据权利要求1或2所述的肽，和具有免疫抑制或免疫调节作用的药物。

4.一种药物组合物，其包含根据权利要求1或2所述的肽或者根据权利要求3所述的组合物，进一步包含药学上可接受的载体。

5.根据权利要求4所述的药物组合物，其中所述药物组合物是锭剂、片剂、胶制品、胶囊、药滴、药丸、脂质体、纳米颗粒或溶液形式。

6.根据权利要求1或2所述的肽在制备用于治疗自体免疫疾病的药物组合物中的用途。

7.根据权利要求6所述的用途，其中所述自体免疫疾病选自：结缔组织疾病家族的自体免疫疾病(非特异性全身器官疾病)；和/或器官特异性自体免疫疾病。

8.根据权利要求6或7所述的用途，其中所述自体免疫疾病是全身性红斑狼疮。

9.根据权利要求6或7所述的用途，其中所述自体免疫疾病是全身性红斑狼疮、类风湿性关节炎、混合性结缔组织病、综合征或慢性幼年期关节炎。

10.根据权利要求6或7所述的用途，其中所述自体免疫疾病是多发性硬化症、胰岛素依赖型糖尿病、克罗恩氏病或大疱性疾病。