CN107454846A - 修饰的肽及其治疗慢性炎性疾病的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及包含氨基酸序列IHMVYSKRSGKPRGYAFIEY或由其组成的肽或其盐，所述氨基酸序列包含一个或多个翻译后修饰，所述肽或其盐用于治疗、预防或改善过度自噬相关的自身免疫疾病或病症。

Description

修饰的肽及其治疗慢性炎性疾病的用途

相关申请的交叉引用

本申请要求2014年12月14日提交的题为“修饰的肽及其治疗自噬相关疾病的用途”的美国临时专利申请号62/091,379的权益，所述文献通过引用的方式并入本文。

通过引用方式并入

含有SEQ ID NO:1-6的文件名：P140_seq_listing_ST15.txt、大小6.5KB的序列表电子版一并提交并且因而通过引用方式完整地并入。

背景技术

1.发明领域

本发明涉及修饰的肽和它们治疗免疫疾病(包括自身免疫疾病和自噬相关的自体免疫疾病)的用途。

2.背景信息

在自身免疫中，患者的免疫系统被激活对抗身体自身组分。不认为自身免疫疾病是罕见疾病。通常，甚至不将它们视为罕见，因为作为整体，它们影响全球数百万人。由于遗传影响，这大多是多基因因素或环境因素和代谢因素，在世界某些部分并且尤其某些人群中存在其发生率或严重程度方面的某种不平衡。根据美国自身免疫相关疾病学会，自身免疫疾病侵袭多达五千万美国人。自身免疫疾病之间存在性别二态性，指向女性群体的不平衡充分确立。全部自身免疫疾病的总体累积流行率是约5％，男性约3％并且女性7％(Hayter和Cook，2012)。这种女性偏倚出现在59％自身免疫疾病中，可能与激素影响和X-染色体编码的基因相关。通常，自身免疫疾病发作出现在年轻人(20-29岁组)中。已经估计，自身免疫疾病位居直至65岁的全部年龄组的女性当中的前十大死因之列。

在术语自身免疫疾病下，存在超过八十种由自身免疫引起的疾病，例如包括，Crohn病/CD；原发性胆汁性肝硬化、重症肌无力、免疫性血小板减少性紫癜、类风湿性关节炎、神经精神系统性红斑狼疮、眼重症肌无力、银屑病性关节炎。另外，某些个体可能同时患有多于一种自身免疫疾病，这令随访和治疗任务复杂化并且使得每个病例独一无二。但是，大部分自体免疫疾病不存在已知的预防措施，并且通常不存在特效治疗。

认识到众多的自身免疫疾病。它们表征为限于某些器官如甲状腺(例如Graves病、自身免疫性甲状腺炎、Hashimoto病)、胰(例如，其中产生胰岛素的β细胞遭毁灭的I型糖尿病)和肌肉(重症肌无力)时，具有“器官特异性”，或涉及在不同位置的特定组织(例如，侵袭肺和肾中基极膜的Goodpasture病)。与之相反，当它们牵涉全身多个器官和组织时，将它们划分为“全身性”。全身性自身免疫疾病庞大家族的最具象征性的代表是其中可能侵袭心脏、关节、皮肤、肺、血管、肝、肾和神经系统的系统性红斑狼疮(SLE)。实际上，在这两个常见描述的家族之间不存在清晰界限。例如，硬皮病，也称作全身性硬化症，作为以皮肤硬化为特征的慢性全身性自身免疫疾病，还以重度形式侵袭血管、肌肉和内脏。

破译导致免疫耐受性破坏和进展成自身免疫疾病的分子机制和细胞机制仍是科学界和临床界中的广阔研究领域。如今，未能鉴定通用特征标识，并且关于自身免疫疾病嗜性的原因以及触发其起始和维持的要素，大多缺乏线索。关于控制某些自身免疫疾病(如SLE中)发作阶段和缓解阶段连续出现的事件，也相对知之甚少。

大部分自身免疫疾病的多因素性质和多态性质令其诊断和可以用来缓和症状的治疗大幅度复杂化。除了在非常罕见的情况下，治疗主要地为姑息性质并且不瞄准疾病的病因。尽管已经在过去数十年间取得巨大进展，导致已明显增加的患者存活率，但仍等待创新性治疗解决方案，所述解决方案将综合有效性、选择性并且因此较少的次生效应和可靠性。在无适用治疗的情况下，生活质量可能在自身免疫疾病患者中相对低劣并且随疾病进展而下降(与特定症状相关的疲乏、疼痛、发热)。不幸地，为最大限度减少症状和减缓炎性综合征(即长期阶段使用的皮质类固醇类、免疫抑制药物和肿瘤坏死因子(TNF-α)阻断剂)所需要的药物引起整个免疫系统改变，导致肠出血、肾衰竭、血压升高、失眠、抑郁、精神病、骨质疏松症、肌肉丢失和糖尿病，更不用说令人窒息的反复感染发作和癌症形成。在某些自身免疫疾病(如影响中枢神经系统的那些)中或可能与SLE相关的抗磷脂综合征中，治疗性解决方案有限、无特异性及有时无效(Carrithers,2014；Hanly,2014；Inglese和Petracca,2014；Jeltsch-David和Muller,2014)。目前正在进行密集研究以开发基于分子靶的新免疫调节策略，所述分子靶涉及失调的自身免疫性过程并且可以特异性再定向。在这种情况下，核心是更好了解奠定自身免疫反应和尤其自身免疫性细胞稳态和调节之基础的细胞机制和分子机制。

自噬是对细胞存活、分化、发展、和稳态发挥关键作用的正常生理过程。选择性或非选择性、规范或非规范性自噬过程明显比最初认为那样更复杂。取决于有利或不利的细胞环境条件，自噬装置将促进细胞存活和细胞死亡，因此例如在制造细胞组分和分解受损或多余细胞器和其他细胞组分之间维持决定性平衡。自噬显示出与几种其他降解性途径如凋亡和蛋白酶体介导的系统的复杂、仍有争议的交织联系。在其已经实验地证明或预测的许多细胞调节功能当中，自噬决定性地控制免疫和炎症，并且任何受损的自噬信号传导可能潜在地导致自身免疫相关性疾病。

因此，本领域持续需要治疗及预防自身免疫疾病的治疗性干预。尤其，需要这样的治疗性干预，其靶向涉及自身免疫疾病起始和迁延的关键细胞过程，例如，自噬过程，所述关键细胞过程涉及免疫耐受性的建立和维持和免疫系统的正确效能，这在自身免疫中具有特殊重要性。因此，存在需要提供能够有利调节自噬过程的治疗性干预作为治疗、预防和/或缓解自体免疫疾病症状的手段。

概述

本说明书提供了治疗性组合物和使用前者的方法，其基于令人惊讶和意料之外的以下发现：如本文所述的化学修饰肽是自噬、尤其CMA过多或增加的强力调节物。本文所述的化学修饰肽衍生自U1-70K剪接体蛋白。所述肽和包含有效量前述肽的组合物有效治疗、预防和/或缓解以自噬通量增加为特征的疾病(即，过度自噬相关的自体免疫疾病如CMA过高相关疾病)的症状。因此，在某些额外的方面，本公开提供制造和使用所述肽和包含前述肽的组合物的方法，所述方法用于治疗、预防和/或改善以自噬通量增加为特征的疾病(例如，CMA)的症状。在不受任何具体理论约束的情况下，假设所描述的组合物通过阻断溶酶体的某些活动减少自噬通量。

因此，在一个方面，本说明书提供SEQ ID NO:1、2、4和5的化学修饰肽，包括其衍生物、类似物和盐形式。

在某些实施方案中，本说明书提供一种分离的肽或其盐，所述分离的肽包含SEQID NO:1的氨基酸序列：RIHMVYSKRSGKPRGYAFIEY[SEQ ID NO:1]

或或由其组成，

所述分离的肽具有至少一个选自丝氨酸残基磷酸化、甲硫氨酸残基氧化和赖氨酸残基乙酰化及其组合的翻译后修饰。在这个方面的一个实施方案中，本说明书提供一种组合物，其包含分离的和/或化学修饰的具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列或由其组成的肽(重组或合成)或其盐，其中肽包含在位置10处的磷酸丝氨酸(即，“P140肽”)。在某些实施方案中，本说明书提供分离的和/或化学修饰的具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列或由其组成的肽(重组或合成)或其盐，其中肽包含在位置10处的磷酸丝氨酸和在位置4处的氧化的甲硫氨酸残基。

在某些额外的实施方案中，SEQ ID NO:1的肽还包含乙酰化的赖氨酸残基。特别地，SEQ ID NO:1的所述肽包含在位置10处的磷酸丝氨酸和在位置4处的氧化的甲硫氨酸残基及在位置8和12处一个或两个赖氨酸的乙酰化，并且更具体地还包含在位置7处的磷酸丝氨酸。

在某些实施方案中，本说明书提供分离的和/或化学修饰的肽(重组或合成)或其盐，所述肽包含以下氨基酸序列或由其组成：IHMVYSKRSGKPRGYAFIEY[SEQ ID NO:2]，

其中位置9处的丝氨酸(S)被磷酸化并且位置3处的甲硫氨酸(M)被氧化。

在某些实施方案中，本说明书提供具有以下式的化合物I的肽：

化合物I也可以如下代表：

IHM(O)VYSKRS(PO₃H₂)GKPRGYAFIEY[SEQ ID NO:5]

其中“M(O)”表示氧化的甲硫氨酸并且“S(PO₃H₂)”表示磷酸丝氨酸。

这些肽衍生自人U1 snRNP 70kDa蛋白(SEQ ID NO:3)，并对应于下述氨基酸区段界定的区域，所述氨基酸区段从SEQ ID NO:3的残基132延伸至残基151。形式上，磷酸化的残基对应于从SEQ ID NO:3起位置140处的氨基酸，并且氧化的残基对应于从SEQ ID NO:3起位置134处的氨基酸。

在额外的方面，本说明书提供分离的和/或化学修饰的肽(重组或合成)，所述包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或由其组成，或其盐，所述肽具有至少一个选自丝氨酸残基磷酸化、甲硫氨酸残基氧化和赖氨酸残基乙酰化及其组合的翻译后修饰。在这个方面的一个实施方案中，本说明书提供一种组合物，其包含分离的和/或化学修饰的具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列或由其组成的肽(重组或合成)或其盐，其中肽包含在位置9处的磷酸丝氨酸，并且在位置3处的氧化甲硫氨酸残基。在某些额外的实施方案中，SEQ ID NO:2的肽还包含乙酰化的赖氨酸残基。

在某些实施方案中，本说明书提供具有以下式的化合物II的肽：

化合物II也可以如下代表：

RIHM(O)VYSKRS(PO₃H₂)GKPRGYAFIEY[SEQ ID NO:4]

其中M(O)表示甲硫氨酸氧化，并且S(PO₃H₂)表示丝氨酸磷酸化。

因此，本说明书提供肽或其盐，所述肽包含选自SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5的氨基酸序列或由其组成。

在一个额外的实施方案中，本说明书提供一种组合物，其包含有效量的至少一种肽或其盐，所述肽或其盐选自氨基酸序列SEQ ID NO:2，包含在位置9处的磷酸丝氨酸和在位置3处的氧化甲硫氨酸；选自氨基酸序列SEQ ID NO:1，包含在位置10处的磷酸丝氨酸和在位置4处的氧化甲硫氨酸；选自SEQ ID NO:1的氨基酸序列或其盐，其中肽包含在位置10处的磷酸丝氨酸，及其组合。

在另一个方面，本说明书提供组合物，所述组合物包含有效量的如本文所述的一种或多种肽和赋形剂或载体。

在一个额外的方面，本说明书提供用于治疗、预防或缓解自身免疫疾病(例如，自噬相关性免疫系统疾病或病症，例如，过度自噬相关的自身免疫疾病或CMA过高相关的自身免疫疾病)的症状的方法，所述方法包括向有需求的受试者施用有效量的如本文所述治疗性组合物，其中组合物有效治疗、预防和/或缓解疾病或病症的至少一种症状。

在某些实施方案中，疾病或病症选自与自噬过多或增加相关的疾病或病症，例如，CMA、类风湿性关节炎(RA)、多发性硬化(MS)、肌病、肌营养不良(MD)、Crohn病(CD)、慢性阻塞性肺病(COPD)纤维肌痛、多发性肌炎、肺病、慢性免疫性血小板减少症(ITP)、神经精神性狼疮、Gougerot-综合征、类风湿性关节炎、Guillain-Barré病(慢性/CIDP)、哮喘(急性或慢性)、嗜酸粒细胞性气道炎症、肠激惹综合征(IBS或IBD)、慢性炎症性脱髓鞘性多神经根神经病(CIDP)、II型糖尿病、再生脂肪组织、硬皮病、银屑病、阿尔茨海默病或帕金森病。

在某些额外的方面，本说明书提供治疗性组合物，所述的治疗性组合物包含有效量的如本文所述的至少一种肽和至少一种额外的生物活性物质，例如，免疫调节药物，例如，能够抑制或减少自噬通量的药物。在某些实施方案中，组合物还包含如本文所述的赋形剂或载体。

前述的一般实用性领域仅以举例方式给出并且不意在限制本公开及所附权利要求书的范围。与本发明组合物、方法和过程相关的额外的目的和优点本将由本领域普通技术人员根据本权利要求书、发明简述和实施例领会。例如，本发明的多个方面和实施方案可以按多种组合方式利用，所述组合均明确地由本说明书构思。这些额外的优点、目的和实施方案明确地包含于本发明的范围内。通过引用的方式并入本文中用来说明本发明背景和在具体情况下用来为实施提供附加详情的出版物和其他资料。

附图简述

并入本说明书中并且形成其部分的附图说明了本发明的几个实施方案，并且与本说明书一起，起到解释本发明原理的作用。附图的目的仅在于说明本发明的实施方案并且不得解释为限制本发明。

图1.自噬途径的示意性描述。(A)三个主要自噬轴：巨自噬、微自噬和CMA。巨自噬过程始于形成所谓的分离膜。后者伸长以吞没胞质物质，形成特征性双膜结构，称作自噬体。后者接着与溶酶体融合，以变成自噬溶酶体，此后吞没的物质降解。从酵母至高等真核细胞，调节自噬的分子途径高度保守。在CMA中，携带五肽KFERQ样信号序列的蛋白质由HSPA8伴侣蛋白识别，后者缔合于LAMP-2A，触发其寡聚化。该事件允许靶向的蛋白质经过需要HSPA8的过程易位入溶酶体腔。微自噬涉及通过溶酶体膜内直接隔绝细胞组分；(B)巨自噬过程的主要步骤；(C)自噬作为由MHCII分子呈递给T细胞的肽的主要来源。缩写：CMA，伴侣蛋白介导的自噬；ER，内质网；HLA，人白细胞抗原；HSPA8/HSC70，热休克同族蛋白70KDa；LAMP-2A，溶酶体相关膜蛋白-2A；MIIC，主要组织相容性复合体II类区室；MHCII，II类主要组织相容性复合体；TCR，T细胞受体。

图2.自噬的药理调节物。说明自噬药理调节物的可能干预位点的简图。从左至右：雷帕霉素和地塞米松抑制激酶mTOR的活性，导致巨自噬上调。还已知地塞米松作用于前自噬体结构。仍争议其靶的海藻糖是借助mTOR非依赖性途径的自噬激活物。巴弗洛霉素A1通过抑制自噬体和溶酶体之间融合，阻止自噬泡成熟。它通过抑制液泡H⁺ATP酶发挥作用。P140肽(▲)，已经在施用至小鼠后展示通过笼形蛋白介导的内吞摄入B淋巴细胞并归巢至溶酶体中，并且DSG既与HSPA8在体外相互作用，又改变溶酶体内pH。P140诱发自噬标志物p62/sequestosome 1和MAP1LC3-II在MRL/lprB细胞中堆积，与自噬通量下调一致。这种肽影响CMA和巨自噬。CQ和HCQ是阻止内体酸化作用的嗜溶酶体剂。它们积累于内体和溶酶体内部，导致抑制需要酸性pH的溶酶体酶、缺陷性的内体和溶酶体融合和自噬溶酶体成熟。缩写：CMA，伴侣蛋白介导的自噬；CQ，氯喹；DSG，15-脱氧精胍菌素；HCQ，羟氯喹；HSPA8，热休克蛋白8；LAMP-2A，溶酶体相关膜蛋白-2A；MAP1LC3，微管相关蛋白轻链3；mTOR，哺乳动物雷帕霉素靶。

图3.展示了本发明肽(化合物II)与SEQ ID NO:1(其中位置10处的丝氨酸经磷酸化)组成的肽的稳定性相比在37℃的稳定性。曲线表示随时间推移的稳定性百分数(以天数表述)。曲线A-C分别代表在浓度200μg/ml、100μg/ml和50μg/ml的化合物II的稳定性。曲线D-F分别代表在浓度200μg/ml、100μg/ml和50μg/ml由SEQ ID NO:1(其中位置10处的丝氨酸磷酸化)组成的肽的稳定性。

图4.Kaplan-Meier曲线代表了随时间推移(以周数表述)的小鼠累积存活率(以百分数计)，所述小鼠以NaCl(带圆圈的线)、由SEQ ID NO:1(其中位置10处的丝氨酸经磷酸化)组成的肽(带正方形的线)和本发明化合物II(带三角形的线)注射。

图5.随时间推移(以周数表述)的小鼠蛋白尿评分，所述小鼠以NaCl(带圆圈的线)、由SEQ ID NO:1(其中位置10处的丝氨酸经磷酸化)组成的肽(带正方形的线)和本发明化合物II(带三角形的线)注射。

图6.测量MRL/lpr小鼠细胞的细胞过多。Y-轴表示小鼠中细胞数目/mL血液(x10⁶)，所述小鼠以NaCl(圆圈)、由SEQ ID NO:1组成的其中位置10处的丝氨酸经磷酸化的肽(正方形)和本发明化合物II(三角形)处理。

图7.测量SEQ ID NO:1组成的肽(其中位置10处的丝氨酸经磷酸化)对HSC70蛋白的亲和力。曲线对应于因在浓度25μM(A)、12.5μM(B)、6.25μM(C)、3.12μM(D)和1.56μM(E)使用由SEQ ID NO:1组成的肽(其中位置10处的丝氨酸磷酸化)，随时间推移(以秒表述)的Biacore反应。

图8.测量本发明化合物II对HSC70蛋白的亲和力。曲线对应于因在浓度25μM(A)、12.5μM(B)、6.25μM(C)、3.12μM(D)和1.56μM(E)使用化合物II，随时间推移(以秒表述)的Biacore反应。

图9.在100μg CII/mL存在下培养物中的CD4⁺T脾细胞增殖。

图10.MRL/lpr B细胞和Raji细胞中对5.4％甘露糖醇或10％海藻糖中荧光P140肽的细胞摄取，如通过流式细胞术可视化。B细胞来自12-14周龄MRL/lpr小鼠(原代细胞)；Raji细胞是1963年从Burkitt淋巴瘤患者的B-淋巴细胞衍生的已建立细胞系。相比甘露糖醇中，在海藻糖中稀释肽时，MRL/lpr B细胞和Raji细胞中细胞摄取P140少得多。

图11.图10的B细胞的共聚焦图像。全部共聚焦图像均在相同的显微环境下拍摄。在归巢入溶酶体之前，Rab9(红色)鉴定其中存在P140的晚期内体区室，DAPI(蓝色)鉴定DNA。结果证实了流式细胞术结果，即在海藻糖中时，P140肽(绿色)明显更少地进入B细胞。

图12.在小鼠15天高嗜酸性粒细胞气道炎症模型中局部(鼻内)或全身(静脉内)施用时，评价P140磷酸肽的抗炎作用。简而言之，通过腹膜内(i.p.)注射0.1ml盐水中含有50μg OVA和2mg明矾的混合物，致敏九周龄雄性Balb/c小鼠。在第5天通过鼻内施用25μl OVA，随后在第12天、第13天和第14天鼻内施用25μl OVA和/或盐水，攻击小鼠。在第9天通过静脉内注射(2ml/kg)或鼻内施用(1ml/kg)P140或溶剂处理小鼠。

图13.P140磷酸肽对Balb/c小鼠的卵清蛋白所致气道嗜酸粒细胞增多症模型中气道炎性细胞召集的影响。将Balb/c小鼠针对OVA(第0天、第1天和第2天)免疫接种并且用OVA(第5天)和OVA或盐水(第12天、第13天和第14天)攻击。在第9天按剂量4mg/kg鼻内(P140-IN)或静脉内(P140-IV)施用P140。显示BAL中A)嗜酸性粒细胞、B)中性粒细胞、C)巨噬细胞、D)T细胞和E)B细胞的绝对数目。阻断是均数并且标度是SEM值(每组n＝1或6)。###相对于对照组p≤0.001，并且相对于OVA组，*p≤0.05、**p≤0.01和***p≤0.001。

图14.通过鼻内(i.n.)施用HDM提取物(Stallergenes)，致敏九周龄雄性Balb/c小鼠：25μl盐水中第0、第1天、第2天、第3天、第4天1μg，以及第14天和第21天10μg。在第28天、第29天和第30天通过鼻内施用HDM(1μg)和/或盐水，攻击小鼠。在第25天通过静脉内注射(2ml/kg)P140或溶剂处理小鼠。

图15.P140磷酸肽对Balb/c小鼠的HDM所致哮喘模型中气道反应性的影响。用评估基线时和响应于雾化PBS和MCh(50mg/mL)的表述为cm H₂O.s.mL^-1的气道阻力R、表述为cm H₂O.mL^-1的弹性模量E和表述为mL.cm H₂ ^-1的顺应性C。阻断是均数并且标度是SEM值(每组n＝5至8)。在PBS和MCh雾化之间^###p≤0.001，并且慢性哮喘中P140组和溶剂组之间*p≤0.05。

图16.P140磷酸肽对Balb/c小鼠的HDM所致哮喘模型中气道炎性细胞召集的影响。通过鼻内(i.n.)施用HDM(Stallergenes)，致敏Balb/c小鼠：25μl PBS中第0天、第1天、第2天、第3天、第4天1μg，以及第14天和第21天10μg。在第28、第29天和第30天通过鼻内施用HDM和/或PBS，攻击小鼠。在第25天通过静脉内按剂量4mg/kg注射(2ml/kg)P140或溶剂处理小鼠。显示BAL中嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、T细胞、B细胞、巨噬细胞和DC的绝对数目。阻断是均数并且标度是SEM值(每组n＝5至8)。慢性哮喘和变应原攻击中各溶剂组之间，^#p≤0.05和^###p≤0.001，并且慢性哮喘中P140组和溶剂组之间，*p≤0.05。

图17.与未处理的大鼠(□)相比，P140肽处理的CIDP大鼠(●)的体重(A)和临床病程(B)。注射P140肽由红色箭头代表。显示平均值和SEM。

图18.对分离的唾液腺中淋巴细胞亚群的评价。

图19.对分离的唾液腺中炎症水平的评价。

图20.对分离的唾液腺中FS数目的评价。

图21.类风湿性关节炎鼠模型中P140肽的作用。

图22.类风湿性关节炎鼠模型中P140肽的作用。

图23.类风湿性关节炎鼠模型中P140肽的作用。

图24.类风湿性关节炎鼠模型中P140肽的作用。

图25.类风湿性关节炎鼠模型中P140肽的作用。

图26.类风湿性关节炎鼠模型中P140肽的作用。

图27.类风湿性关节炎鼠模型中P140肽的作用。

图28.类风湿性关节炎鼠模型中P140肽的作用。

图29.类风湿性关节炎鼠模型中P140肽的作用。

图30.类风湿性关节炎鼠模型中P140肽的作用。

图31.类风湿性关节炎鼠模型中P140肽的作用。

图32.类风湿性关节炎鼠模型中P140肽的作用。

图33.前直区(straight pane)大小的每日演变，P140与NaCl(非配对T检验)

图34.左前腿大小的每日演变，P140对比NaCl(非配对T检验)

图35.炎症评分的过夜演变，P140/NaCl对比Lupuzor^TM。

发明详述

以下是为辅助本领域技术人员实施本发明所提供的发明详述。本领域普通技术人员可以在本文所述的实施方案中作出修改和变化而不脱离本发明的精神或范围。虽然在本发明的实施或测试中也可以使用与本发明中所述相似或等同的任何方法和材料，这里描述了优选的方法和材料。除非另外限定，否则本文中所用的全部技术与科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。在此描述本发明中所用的术语仅用于描述具体实施例并且不意在限制本发明。本文中提到的全部出版物、专利申请、专利、附图和其他参考文献明确地通过引用方式完整并入。

除非另外限定，否则本文中所用的全部技术与科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。在描述中所用的术语仅用于描述具体实施例并且不意在限制本发明。

在提供一个值范围的情况下，应当理解，除非上下文另外明确指出，否则在本发明内包括在这个范围的上限和下限之间的每个居间值，直至下限单位的十分之一，或这个所指明范围内的任何其他所指明值或居间值。本发明内也包括这些更小范围的可以被独立包括于所述更小范围内的上限和下限，服从于所指明范围内任何明确排除的界限值。当所指明的范围包括这些界值之一或两者时，本发明中还包括排除那些所包括的限值中任何两者的范围。

如本文所用，除非另外指明，否则以下术语可以具有下文归属于它们的含义。但是，应当理解本发明所属的本领域普通技术人员已知或理解的其他意思也是可能的并且处于本发明的范围内。

必须指出，除非上下文另外明确指出，否则如本文中和所附权利要求中所用，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括该冠词的语法对象的复数称谓(即，指一个或指多于一个或至少一个)。例如，“一个要素”意指一个要素或多于一个要素。

如本文中与数值或范围结合时使用，术语“约”反映如下事实：存在本领域认可和容忍的某种变异水平，原因在于实践局限性和/或理论局限。例如，以某些装置运行和/或采取测量的方式容忍因内在变异性所致的轻微变异。根据上文，短语“约”正常情况下用来涵盖在标准偏差或标准误范围内的值。

如本文在本说明书中和权利要求书中所用，短语“和/或”应当是理解为意指如此结合的要素(即，在某些情况下结合存在和在某些情况下分离存在的要素)中的“任一者或两者”。随“和/或”列出的多个要素应当按相同方式解释，即，“一个或多个”如此结合的要素。除通过“和/或”条款具体确定的要素之外，其他要素可以任选地存在，无论是否与具体确定的那些要素相关或不相关。因此，作为一个非限制性例子，对“A和/或B”的称谓，当与使用开放式语言如“包含”联合时，可以在一个实施方案中仅指A(任选地包括除B之外的要素)；在另一个实施方案中，仅指B(任选地包括除A之外的要素)；在又一个实施方案中同时指A和B(任选地包括其他要素)；等。

如本文在本说明书中和权利要求书中所用，“或”应当理解成具有与如上文定义的“和/或”相同的意思。例如，当分隔列表中的各项时，“或”或“和/或”应当解读为包含性，即，包含众多或成系列要素，和任选地、另外未列项中的至少一项，还包含多于一项。仅术语明确表示相反情况，如“仅之一'或“刚好一个”或在权利要求书中使用时，“由……组成”将指包含众多或成系列要素的刚好一个要素。通常，当前置有排他性术语如“任一者”、“一个”、“仅一个”或“刚好一个”时，如本文所用的术语“或”应当仅解读为表示排他性备选(即，“一个或另一个，但不是两个”)。

在权利要求书中以及在以上说明书中，全部连接词如“包含”、“包括”、“携带”、“具有”、“含有”、“涉及”和“容纳”、“由……组成”等应理解成是开放式的，即，应意指包括但不限于。就权利要求而言，仅连接词“由……组成”和“基本上由……组成和”应当分别是封闭或半封闭的连接词，如美国专利局专利审查程序手册第2111.03章中所述。

如本文在本说明书中和权利要求书中所用，短语“至少一个”指具有一个或多个要素的一个列表，应当理解为意指选自要素列表中任一个或更多个要素的至少一个要素，但并非必然地包含该要素列表内部具体所列的每个和每种要素中至少一个要素并且并不排除该要素列表中要素的任何组合。这个定义还允许可以任选地存在除了短语“至少一个”所指的要素列表内部具体确定的要素之外的要素，无论是否与具体确定的那些要素相关或不相关。因此，作为非限制性例子，“A和B中的至少一种”(或，同等地，“A或B中的至少一种”或同等地，“A和/或B中的至少一种”)可以在一个实施方案中，指至少一个A、任选地包括多于一个A，同时不存在B(并且任选地包含除B之外的要素)；在另一个实施方案中，指至少一个B、任选地包括多于一个B，同时不存在A(并且任选地包含除A之外的要素)；在又一个实施方案中，指至少一个A、任选地包括多于一个A，和至少一个B、任选地包括多于一个B(并且任选地包括其他要素)等。

还应当理解，除非上下文指明，否则在本文中所述的包括多于一个步骤或动作的某种方法中，该方法的步骤或动作的顺序不必然地限于例举该方法的步骤或动作的顺序。

术语“共施用”和“共施用了”或“联合治疗”指同时施用(在相同时间施用两种或更多种治疗药)和时间变动的施用(在与施用额外一种治疗药或多种治疗药不同的时间施用一种或多种治疗药)，只要治疗药存在于该患者中到某个程度，优选地在相同时间以有效量施用。在某些优选的方面，本文所述的一种或多种本发明化合物与至少一种额外的生物活性物质(尤其包括抗癌药)组合时共施用。在特别优选的方面，共施用的化合物产生协同活性和/或治疗，包括抗癌活性。

如本文所用，除非另外说明，否则术语“化合物”指本文公开的任何具体化学化合物并且包括互变异构体、位置异构体、几何异构体和(在适用情况下)立体异构体，包括其光学异构体(对映异构体)和其他立体异构体(非对映异构体)，以及在上下文中适用情况下其可药用盐和衍生物(包括前药形式)。在其上下文使用范围内，术语化合物通常指单一化合物，还可以包括其他化合物，如立体异构体、位置异构体和/或光学异构体(包括外消旋混合物)以及所公开化合物的特定对映异构体或其对映异构富集的混合物。在上下文中，该术语还指化合物的前药形式，所述前药形式已经过修饰以促进施用及递送化合物至活性部位。应当指出在描述本发明化合物时，描述了众多取代基和与之相关的变量，连同其他。普通技术人员理解，本文中描述的分子是如下文通常描述的稳定化合物。当显示键时，双键和单键均在所示的化合物背景范围展示。

术语“衍生物”可以意指，但无论如何不限于直接、通过修饰或通过部分置换从天然化合物形成的化学组合物，例如，核酸、核苷酸、多肽或氨基酸。术语“类似物”可以意指，但无论如何不限于具有与天然化合物相似、但与之不相同的结构的化学组合物，例如，核酸、核苷酸、多肽或氨基酸。

术语“有效量/剂量”、“药学有效量/剂量”、“药学有效量/剂量”或“治疗有效量/剂量”可以意指，但无论如何不限于有效药用成分的这种量/剂量，其足以防止病状、病症或疾病状态的症状、抑制其发生、改善、延迟或治疗该症状(减轻症状到某个程度，优选地全部程度)。有效量取决于疾病类型、所用组合物、施用途径、正受到治疗的哺乳动物的类型、所考虑的具体哺乳动物的身体特征、并存药物和医学领域技术人员将认可的其他因素。通常，取决于药物的效价，施用在0.1mg/kg和1000mg/kg体重/日之间量的有效成分。可以通过标准药学方法在细胞培养物或实验动物中确定这类化合物的毒性和治疗功效，例如，确定LD₅₀(对50％群体致死的剂量)和ED₅₀(在50％群体中治疗有效的剂量)。毒性作用和治疗作用之间的剂量比是治疗指数并且它可以表述为LD₅₀/ED₅₀比。优选显示出大治疗指数的化合物。尽管可以使用显示出毒性副作用的化合物，但是应当谨慎设计导引这类化合物至患病组织部位的递送系统，以最小化对未感染细胞的可能损伤并因而减少副作用。从细胞培养测定法和动物研究中获得的数据可以在制定用于人类中的剂量范围时使用。这类化合物的剂量优选地位于毒性低或无毒性情况下包括ED₅₀的一系列循环浓度范围内。该剂量可以在这个范围内根据所用的剂型和所用的施用途径变动。对于本发明方法中所用的任何化合物，可以从细胞培养测定法初步估计治疗有效剂量。可以在动物模型中制定某剂量以实现包括IC₅₀(即，实现症状的半数最大抑制作用的测试化合物浓度)的循环血浆浓度范围，如在细胞培养中所确定。这种信息可以用来更精确地确定用于人类中的剂量。可以测量血浆中的水平，例如，通过高效液相色谱测量。

术语“药物组合物”、“治疗性组合物”、“治疗性制剂”或“可药用制剂”可以意指，但无论如何不限于这样的组合物或制剂，所述组合物或制剂允许由本发明提供的药物有效分布，所述药物处于适合施用至最适合其所需活性的实际位置的形式，例如，全身性施用。

术语“可药用的”或“药理学可接受的”可以意指，但无论如何不限于，施用至动物或人(如果适宜)时不产生不良、变应性或其他不利反应的分子实体和组合物。

术语“可药用载体”或“药理学可接受载体”可以意指，但无论如何不限于，与药物施用相容的任何和全部溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。合适的载体在最新版Remington's Pharmaceutical Sciences(本领域的标准参考教材)中描述，所述文献通过引用方式并入本文。这类载体或稀释剂的优选例子包括但不限于水、盐水、Ringer溶液、右旋糖溶液和5％人血清白蛋白。也可以使用脂质体和非水载体如不挥发性油。用于药学活性物质的此类介质和媒介的用途是本领域熟知的。除了任何常规介质或药物与活性化合物不相容的情况之外，构思了其在这些组合物中的用途。补充性活性化合物也可以并入组合物中。

术语“全身性施用”指一种施用途径，其例如是肠内或肠胃外的并且导致药物的全身性分布，从而引起药物的全身性吸收或蓄积在血流中，随后分布遍及整个身体。合适的形式部分地取决于用法或进入途径，例如口服、经皮或通过注射。这类形式不应当阻止组合物或制剂抵达靶细胞(即，想要向其递送带负电荷聚合物的细胞)。例如，注入血流的药物组合物应当是可溶性的。其他因素是本领域已知的，并且包括多个考虑事项，如毒性和阻止组合物或制剂产生其作用的形式。导致全身性吸收的施用途径包括而不限于：静脉内、皮下、腹膜内、吸入、口服、肺内和肌内。已经显示药物进入循环的速率随分子量或大小变化而变化。使用包含本发明化合物的脂质体或其他药物载体可以潜在地令药物例如局限于某些组织型，如网状内皮系统(RES)的组织。也可用的是可以促进药物与细胞(如，淋巴细胞和巨噬细胞)表面结合的脂质体制剂。

术语“局部施用”指一种施用途径，其中将药物递送至与病灶或疾病适当的部位或其附近(例如，在约10cm内)的部位。

术语“保守性突变”指改变、添加或删除编码性序列中单个氨基酸或少数氨基酸的核酸置换、缺失或添加，其中核酸改变导致置换化学相似的氨基酸。可以彼此充当保守性置换的氨基酸包括以下：碱性：精氨酸(R)、赖氨酸(K)、组氨酸(H)；酸性：天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；亲水：甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)；疏水：苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；含硫：甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)。此外，因保守变异而差异的序列通常是同源的。

“同源性”意指两个或更多个核酸分子的核苷酸序列或两个或更多个核酸序列或氨基酸序列部分地或完全相同。在某些实施方案中，同源核酸序列或氨基酸序列分别与编码SEQ ID NO:1的氨基酸序列的核酸或SEQ ID NO:1具有30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或95％序列相似性或同一性。

“同源物”可以是天然存在的，或通过人工合成一个或多个具有相关序列的核酸或通过修饰一个或多个核酸以产生相关核酸来产生。当核酸天然地或人工地从共同祖先序列(例如，直向同源物或旁系同源物)衍生时，它们是同源的。如果未明确地描述二个核酸之间的同源性，则可以通过两个或更多个序列之间的核酸比较，推断同源性。如果序列展示某种程度的序列相似性，例如，在一级氨基酸结构水平大于约30％的序列相似性，则得出结论：它们共有共同祖先。为了本发明的目的，如果核酸序列足够相似以允许低严格性条件下重组和/或杂交，则基因是同源的。此外，如果多肽的核酸序列足够相似以允许低严格性条件下重组和/或杂交，并且任选地，它们展示出膜修复活性，以及任选地，它们可以由针对SEQID NO:1-6中至少之一的氨基酸序列内部所含的表位特异的抗体识别(即，与之交叉反应)，则将它们视为同源。

术语“细胞”可以意指，但无论如何不限于其通常的生物学含义，并且不指完整的多细胞生物。细胞可以例如是体内的、体外的或离体的，例如，在细胞培养物中或存在于多细胞生物中，所述的多细胞生物例如包括禽、植物和哺乳动物，如人、奶牛、羊、猿、猴、猪、犬和猫。细胞可以是原核的(例如，细菌细胞)或真核的(例如，哺乳动物细胞或植物细胞)。

术语“宿主细胞”可以意指，但无论如何不限于可能用来携带异源核酸或表达异源核酸所编码肽或蛋白质的细胞。宿主细胞可以含有不以细胞的天然(非重组)形式存在的基因；以细胞天然形式存在的基因，其中基因被修饰并通过人工手段再引入细胞；或相对于细胞为内源的核酸，其中所述细胞已经过人工修饰，未从细胞移除核酸。宿主细胞可以是真核或原核的。为细菌培养物必需的一般生长条件可以在多种教材如BERGEY'S MANUAL OFSYSTEMATIC BACTERIOLOGY,第1卷,N.R.Krieg编著,Williams and Wilkins,Baltimore/London(1984)中找到。“宿主细胞”也可以是这样一种细胞，其中内源基因或启动子或二者均已经过修饰以产生本发明复合体的一种或多种多肽组分。

术语“患者”或“受试者”在本说明书通篇范围内用来描述动物、优选地人或驯化动物，其中以本发明组合物向所述动物提供治疗，包括预防性治疗。对于治疗特定动物(如人类患者)特有的那些感染、病状或疾病状态，术语“患者”指特定动物，包括驯化的动物如犬或猫或家畜如马、牛、羊等。通常，在本发明中，除非另外声明或从使用该术语的上下文暗示，否则术语“患者”指人类患者。

如本文所用，“P140肽”可以意指但不限于衍生自剪接体U1-70K蛋白的磷酸化肽，包括在SEQ ID NO:1、2、4和5中例举的那些。在某些情况下，P140用来具体指由氨基酸序列SEQ ID NO:1组成的肽，其中位置10处的丝氨酸经磷酸化。

术语“治疗有效量或剂量”包括能够在有需求的受试者中实现治疗作用的药物剂量。例如，药物治疗有效量可以是能够预防或减轻与疾病或病症(例如，组织损伤或肌肉相关疾病或病症)相关的一种或多种症状的量。精确量可以由本领域技术人员使用已知的技术确定(参见，例如，Lieberman,Pharmaceutical Dosage Forms(第1-3卷,1992)；Lloyd,The Art,Science and Technology of Pharmaceutical Compounding(1999)；Pickar,Dosage Calculations(1999)；和Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第20版,2003,Gennaro编著,Lippincott,Williams&Wilkins)。

“试剂盒”是任何制品(例如，包装物或容器)，其包含用于特异性检测本发明标志物的至少一种试剂，例如探针。该制品可以作为一个用于执行本发明方法的单元推销、分销或出售。这种试剂盒中所包含的试剂包括用于检测灵敏度和抗性基因表达的探针/引物和/或抗体。此外，本发明的试剂盒可以优选地含有描述合适检测分析的说明书。这类试剂盒可以便利地例如用于临床环境中，以诊断显示癌症症状的患者、尤其显示可能存在肿瘤的患者。

本文所提及的全部出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用的方式完整地并入。在矛盾的情况下，本说明书(包括定义)将居主导。此外，所述材料、方法和例子仅是说明性的并且不意在是限制性的。

以下参考文献(其完整公开内容通过引用方式并入本文)为技术人员提供本发明中所用的许多术语的一般定义：Singleton等人,Dictionary of Microbiology andMolecular Biology(第2版,1994)；The Cambridge Dictionary of Science andTechnology(Walker编著,1988)；The Glossary of Genetics,第5版,R.Rieger等人(编著),Springer Verlag(1991)；以及Hale和Marham,The Harper Collins Dictionary ofBiology(1991)。

本说明书提供了治疗性组合物和使用前者的方法，其基于令人惊讶和意料之外的以下发现：如本文所述的化学修饰肽是自噬的强力调节物。特别地，本文所述的肽和组合物令人惊讶地有效减少过量或过度自噬，包括伴侣蛋白介导的自噬(CMA)。因而，本说明书提供了用于治疗过度自噬(例如，CMA过高)相关疾病和病症的组合物和方法。

自噬是基于溶酶体的生理过程，所述生理过程在基础条件下以低水平发生，以连续降解不想要的胞质组分并产生底物供能量生产。在氧化应激、缺氧或营养性饥饿期间，其水平升高以允许细胞存活。自噬因此代表了涉及细胞稳态的重大焦点(Awan和Deng,2014；He和Klionsky,2009；Mizushima,2007；Okamoto,2014；Ravikumar等人,2010)。它还在许多谱系(包括脂肪细胞、红细胞和淋巴细胞)分化和组织重塑中发挥关键作用(Cenci,2014；Lee等人,2014；Mizushima和Komatsu,2011；Mizushima和Levine,2010；Nedjic等人,2008；Pampliega等人,2013)。然而，在特定环境条件下，自噬还可能介导细胞死亡并且在机理上重要的是区分自噬性细胞死亡(其指“因”自噬所致细胞死亡)与“伴随”自噬的细胞死亡(Kroemer和Levine,2008；Marino等人,2014；Ryter等人,2014；Shen等人,2012)。因此，最近的研究表明，自噬过程和凋亡过程密切叠加并且在信号转导要素之间共享交互作用。尤其已经显示某些自噬相关(ATG)的蛋白质在自噬和凋亡调控中发挥双重作用。例如ATG5及其结合配偶体ATG12、BCL-2相互作用性肌球蛋白/膜突蛋白样卷曲螺旋蛋白1(BECLIN1/beclin-1)(酵母Atg6的哺乳动物直向同源物)/自噬体形成期间通过与III类PI3K途径相互作用发挥作用的液泡蛋白分选(Vps)-30、和微管相关蛋白轻链3(MAP1LC3/LC3)(酵母Atg8的哺乳动物直向同源物)就是如此(Kang等人,2011；Konishi等人,2012；Li等人,2012；Marquez等人,2012)。其他形式的细胞死亡也与自噬相互联系，如坏死、坏死性凋亡(受调节的Fas-依赖性、胱天蛋白酶非依赖性非凋亡细胞死亡)和细胞焦亡(胱天蛋白酶-1-依赖性细胞死亡)(Ryter等人,2014)。

已经鉴定三个主要类型的自噬并且它们可以依据其生理功能及它们用来递送胞质载货至溶酶体的机制区分(图1A)。它们是巨自噬、微自噬和伴侣蛋白介导的自噬或CMA(Cuervo,2004；Feng等人,2014；Kaushik和Cuervo,2012；Okamoto,2014)。实际上，已经描述形式更多的自噬。例如可以提到聚集体自噬(针对聚集的蛋白质)、线粒体自噬(针对线粒体)、核糖体自噬(针对核糖体)、过氧化物酶体自噬(过氧化物酶体)、内质网自噬(针对内质网，ER)、和异体吞噬(针对病原体)。因此，我们现在认识到，尽管最初视为一种非选择性(随机)胞质降解系统，但自噬实际上参与高度选择性和严格受调节的底物递送过程。

凭借其庞大捕集大分子和整个细胞器的能力，巨自噬(常称作“自噬”，这可以在一些情况下在文献中造成混淆)仍是主要的自噬过程。细胞器被捕获入双膜自噬体，在那里它们降解。因此巨自噬代表蛋白酶体降解的备选机制，所述蛋白酶体降解反倒处理短寿胞内蛋白，尽管已经描述在泛素-蛋白酶体系统(UPS)和巨自噬之间发生正日益理解的交互作用(Cuervo和Wong,2014；Kirkin等人,2009；Korolchuck等人,2010；Lilienbaum等人,2013；Ravikumar等人,2010)。自噬体与溶酶体融合导致自噬溶酶体的形成，在自噬溶酶体中，吞没的细胞组分-包括脂质小滴和蛋白质聚集物-由以下溶酶体：糖苷酶、蛋白酶、脂肪酶和硫酸酯酶降解(图1B)。关于CMA过程，内化和在溶酶体中降解之前，含有生物化学上与KFERQ相关的特定肽基序的蛋白质由HSPA8/HSC70伴侣蛋白识别(图1A)。相比之下，在微自噬中，通过吞没溶酶体膜直接摄取胞质组分(图1A)。

自噬途径以遗传方式受属于ATG基因家族的蛋白质调节并且在酵母和哺乳动物中充分地表征(Codogno等人,2012；Klionsky和Emr,2000；Lamb等人,2013；Mizushima等人,2011；Oshumi,2014；Shibutani和Yoshimori,2014)。ATG蛋白进化上保守并且各自在自噬期间具有特定功能。正是主要通过以下发现才建立进一步研究以理解自噬和自身免疫之间存在的联系：某些ATG基因可能与多种自身免疫综合征相关。遗传分析有效地报告，ATG基因中的一些多态性可能引起不同自体免疫疾病的易患性。因此，在SLE患者中进行的全基因组关联研究(GWAS)鉴定了位于ATG基因上的几种单核苷酸多态性(SNP)，所述多态性已经与疾病出现相关(Harley等人,2008；Orozco等人,2011)。发现一个位于ATG5和PRDM1之间基因间区的SNP与ATG5mRNA的更多表达相关(Zhou等人,2011)。已经在独立研究中证实ATG5和SLE易患性之间的遗传关联，但是在其他研究中尚未找到(等人,2012)。有趣地，一项在亚洲人中的最新荟萃分析显示了DRAM1上SNP与SLE易患性的强关联性(Yang等人,2013)。这个基因编码响应于p53介导的应激信号的巨自噬激活物。在CD患者中，GWA研究鉴定了定位至ATG16L1基因座的rs2241880作为易患性变体(Hampe等人,2007)。显示了rs2241880和确立的CARD15/NOD2(含有核苷酸结合寡聚化结构域2)易患性变体之间就CD风险方面的统计学上显著互作。有趣地，在rs2241880和溃疡性结肠炎(另一种密切相关的炎性肠病)之间不存在关联。最近数据显示，Atg16L1突变小鼠抵抗模式细菌病原体鼠柠檬酸杆菌引起的肠道疾病(Citrobacter rodentium)(Marchiando等人,2013)。这些小鼠中形成的超免疫表型和保护作用在Atg16L1/Nod2双突变小鼠中丧失，这表明因Nod2缺陷所致的易患性相对于Atg16L1缺陷的益处占优势。ATG16L1在自噬体形成中居核心地位，ATG12-ATG5复合体是组成部分，所述复合体为召集MAP1LC3所需(Mizushima等人,2011)。移除ATG16L1消除了细胞形成自噬体的能力(Saitoh等人,2008)。最近描述在位置300处含有Ala→Thr置换的变体蛋白对细胞应激期间激活的胱天蛋白酶3的剪切作用高度敏感(Murthy等人,2014)。对ATG16L1T300A的破坏损害自噬并增加促炎细胞因子TNF-和IL-1释放。已经联系CD、尤其在所谓的免疫相关GTP酶家族M(IRGM)基因中描述了几种SNP(Glas等人,2013；Lu等人,2013)。结果显示，自噬基因-IRGM多态性引起CD易患性，但是引起溃疡性结肠炎易患性，尤其在欧洲中如此。IRGM是赋予针对胞内病原体如结核分枝杆菌(M.tuberculosis)的自噬防御的干扰素诱导型GTP酶家族成员。IRGM通过增强结核分枝杆菌吞噬体成熟，控制后者(Singh等人,2006)。

总之，这些数据提出自噬要素在免疫的几个方面(包括防范传染因子及控制炎性反应和自身免疫反应)以及在肿瘤形成和癌症方面产生强烈影响。矛盾地，基于细胞和分子研究的实验研究仅最近才揭示自噬涉及免疫。最近已经发表了关于这个主题的多篇综述文章，特别强调自噬在感染和炎症中的作用(Cenci,2014；Deretic,2012；Deretic等人,2013；Gros和Muller,2014；Levine等人,2011；Oliva和Cenci；2014；Puleston和Simon,2013；Ravikumar等人,2010)。本综述主要关注自身免疫中的自噬，涉及可能通过小分子和肽操纵免疫系统以转移有害免疫应答并且至少部分地恢复受损的自身耐受性。

先天免疫应答重大影响在引起和调节自身免疫疾病中的适应性免疫。在天然免疫中，自噬在不同层面发挥作用，尤其通过控制某些细胞因子和趋化因子的激活和释放发挥作用(Deretic 2012；Deretic等人,2013；Gros和Muller,2014；Jones等人,2013；Saitoh和Akira,2010)。自噬将激活TNFα、白介素(IL)-6、IL-8和I型干扰素(IFN)的分泌，同时它控制IL-1α和β产生(通过调节炎性小体活化和通过靶向前IL-1β以降解实现后者)、IL-18和I型IFN的产生。转而，一些分泌型细胞因子影响自噬。因此，辅助T细胞1型(Th1)和促炎细胞因子如IFN-γ(借助IRGM)、TNFα、IL-1α和-β、IL-23、活性氧类别(ROS)和TLR的接合(仍知之甚少机制)诱导自噬。TWEAK(C2C12肌管中的TNF样凋亡弱诱导物)、CD4⁺T细胞中的IL-2、外周血单核细胞(PBMC)中的IL-6和肝癌细胞系中的TGF-β也促进自噬。相反，发现通过影响STAT-3途径或-6途径和丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶(AKT)途径，Th2和调节性细胞因子如IL-4、IL-13和IL-10激活哺乳动物雷帕霉素靶(mTOR)、抑制丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶ULK1并且因此抑制自噬体形成(Gutierrez等人,2004；Jones等人,2013)。通过影响细胞因子分泌、尤其影响抗原呈递细胞(APC)中的细胞因子分泌，自噬代表了免疫应答的关键调节物(Cenci,2014；Deretic等人,2013；Gros和Muller,2014；Levine等人,2011；Nedjic等人,2008；Ravikumar等人,2010；Saitoh和Akira,2010)。

尽管当前教材中尚未认识至这种水平的重要性，自噬实际上对适应性免疫的不同方面产生深刻影响。它是胸腺选择T细胞过程的主要参与者，还影响T细胞稳态、全部能力和极化、B细胞存活、免疫耐受性和抗原呈递。

以下发现已经成为关键的转折点：自噬是向主要组织相容性复合体II(MHCII)分子递送自我抗原的关键调节要素(Dengjel等人,2005；Paludan等人,2005；Zhou等人,2005)。在这项研究结果时，经典地确定MHC I分子向T细胞呈递来自胞内源蛋白质的肽，而MHCII分子呈递来自外源抗原性肽和膜蛋白的抗原性肽。因此明显地再考虑MHCII肽活化T细胞的总体图景，并且提出并进一步分析了免疫应答和细胞应激、细胞代谢、细胞养分和细胞环境之间的新联系。顺便地，有趣的是指出，其中作用于PI3-激酶活性的巨自噬强力抑制剂(即渥曼青霉素、LY294002和3-甲基腺嘌呤(3-MA))与E 52-68-eGFP(从跨膜蛋白I-E散播的肽片段)转染的巨噬细胞细胞系BMC-2温育并且显示没有影响的实验后，得出以下结论：巨自噬不是胞质表达的蛋白质接近MHCII分子的管腔肽结合位点的机制(Dani等人,2004)。在那时，发表了矛盾的数据，这些数据可能因所研究抗原的内在特性、其半寿期和胞内(囊泡或非囊泡)运输和APC类型而产生(等人,2005；Leung等人,2010；Paludan等人,2005)。

更新近的数据已经显示，在蛋白酶解活性比其他细胞更少的APC(如巨噬细胞)中，溶酶体半胱氨酸蛋白酶-通常称作组织蛋白酶-剪切最终抵达自噬溶酶体的粒子和蛋白质产生了这样的蛋白质片段，它们将构成用于MHCII分子的肽的主要来源(图1C)。溶酶体和自噬溶酶体具有组织蛋白酶最适的pH 4-4.5。因此并且重要性在自身免疫的背景下，MHCII分子可以结合从溶酶体蛋白酶解产生的内源抗原产生的肽。这类内源基因抗原可以来自膜来源、胞质来源(包括囊泡组分)或胞核来源并且可能已经通过几种形式的自噬被运输至内体溶酶体网络，供后续加工和MHCII分子呈递以促进CD4⁺T细胞引发(Blum等人,2013；Münz,2012)。有趣地，在他们的先驱工作中，Stevanovic、Rammensee和coll.已经展示，通过饥饿诱导自噬改变了溶酶体中活性蛋白酶的平衡(Dengjel等人,2005)，结果，这可能改变加载于MHCII分子上的肽的质量。

经过最近十年，已经研究充分研究了特定蛋白酶对自我抗原释放和加工的作用和调节(van Kasteren和Overkleeft,2014；Villadangos等人,1999)，并且尤其显示，一组不同的组织蛋白酶在不同的APC(例如树状细胞(DC)和B细胞)中发挥作用(Burster等人,2004；Manoury等人,2002)。还存在涉及控制、甚至在各个内体中控制蛋白酶活性并且强烈影响抗原呈递的多种机制(包括受环境支配的基因上调或下调)(Dengjel等人,2005；vanKasteren和Overkleeft,2014)。内体溶酶体蛋白酶因此是产生最终将呈递给T细胞的抗原中的关键角色。通过一个涉及天冬酰胺内肽酶(AEP)(也称作豆荚蛋白)、半胱氨酸蛋白酶抑制物C、特异性组织蛋白酶和其他尚未明确的蛋白酶的逐步过程，内体溶酶体蛋白酶发挥以下作用；将与MHCII分子连接的恒定(Ii)链加工成II类结合的恒定链肽(CLIP)，因此产生接受肽的MHCII分子，其中通过酶HLA-DM将CLIP肽交换为高亲和力肽(图1C)，之后将其运输至APC的细胞表面以展示给CD4⁺T细胞(Neefjes等人,2011)。内体溶酶体蛋白酶(包括AEP)还发挥产生表位的作用，所述表位将由功能性MHCII分子呈递(Colbert等人,2009；Matthews等人,2010；van Kasteren和Overkleeft,2014)。

在迄今已经研究的许多抗原例子中，发现稳定性是影响抗原呈递的决定性因素。另外，因为借助组织蛋白酶的剪切作用不但可以释放表位，还可以摧毁某些其他表位，所以对确定递送的最终抗原性肽组而言，组织蛋白酶调节作用甚至更有战略性。最后，内体溶酶体蛋白酶在抗原呈递中的另一个重要作用在于它们对TLR-受体信号转导的影响。最初声称，尽管观察到氯喹(CQ)对TLR9信号传导的影响(Hong等人,2004；Matsumoto等人,2008)，后来证实内体溶酶体蛋白酶也激活内体TLR 3、7和8(Manoury,2013)并且作用模式不是首批研究中提出的那一种。实际上，无论对于TLR9或对于内体TLR，内体溶酶体蛋白酶均将通过将受体从无信号传导作用的全长形式转化成从N端区域缺失的较短形式而发挥作用(Ewald等人,2008；Park等人,2008)。尽管这种效应背后的精确机制-尤其考虑涉及的特定蛋白酶-仍在持续争议中，但这种效应仍然可能是战略性的，因为TLR信号传导对DC成熟而言为核心，而DC成熟决定蛋白酶活性并因此影响MHCII分子上呈递的肽的质量。结合天然免疫(参见上文；Xu等人,2007)和适应性免疫，这些数据凸显自噬过程中TLR的重要性。

自噬在免疫中的重要性还来自采用已经接受操作以不足表达ATG基因的小鼠或细胞进行的实验。利用这种策略，结合我们对某些个体中似乎缺陷的基因的了解日益增长，已经可能更好地着手处理某些ATG蛋白的潜在作用并且确立与人类疾病的某些联系(Choi等人,2013；Jiang和Mizushima,2014；Majai等人,2014)。因此，使用具有B细胞特异的Atg5(一个涉及自噬体膜伸长的基因)缺失的小鼠，已经显示在自噬缺陷型B细胞祖细胞中，骨髓中从原B细胞阶段至前B细胞阶段的转变有缺陷(Miller等人,2008)。研究其中B淋巴细胞的Atg5条件性缺失的小鼠，进一步揭示这个基因是浆细胞(PC)稳态必需的(Conway等人,2013)。这些小鼠中的确出现类别转换，但是特异性免疫、寄生虫感染和粘膜炎症后，抗体应答强烈地减少。这些数据和其他数据(Pengo等人,2013)凸显ATG5不仅在早期B细胞发育中重要，在晚期B细胞活化和PC分化中也重要。必需自噬基因Atg5(Stephenson等人,2009)、Atg7(Pua等人,2009；Jia和He、2011)、Atg3(Jia和He、2011)的条件性缺失还显示，巨自噬对外周T细胞的存活至关重要。一些Atg基因在感染背景下重要。

因此，使用缺少人ATG16L1或鼠Atg7、Atg9a或Atg14的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)，Oshima等人(2014)显示ATG16L1、ATG7和ATG16L1在IFN-γ诱导的免疫相关GTP酶召集至胞内病原体岗地弓形虫(T.gondii)中重要，而ATG9A和ATG14则否。已经描述了不同形式的自噬过程(包括巨自噬、CMA和线粒体自噬)下其中自噬基因已经缺失或在某些情况下特定组织中过量表达的多个例子。例子是Pink1/parkin敲除(KO)小鼠、上文描述的Atg16L1突变和Atg16L1/Nod2双突变小鼠、Sqstm1/p62/A170(编码SQSTM1多功能蛋白，又称作信号传导接头/支架蛋白)突变小鼠、Beclin-1或Vps34无效的条件性缺失模型，仅例举数个。还引入一些影响自噬途径关键要素的结合配偶体的突变。因此，最近显示在T细胞中缺失编码溶酶体相关膜蛋白2(LAMP-2A)的基因引起体内对单核增生李斯特菌(L.monocytogenes)免疫接种或感染的反应缺陷(Valdor等人,2014)。在这些小鼠中，发现T细胞中的CMA随年龄改变。这里应当提到，HSPA8无效的小鼠无法生存，子宫内死亡的Beclin-1KO小鼠或出生后24小时内死亡Atg5KO小鼠也是如此，至少部分地归因于氨基酸产生的缺陷。

上文报告的自噬和免疫间的密切关系容易地解释了任何的自噬装置失调可能影响免疫应答的多个方面并导致形成自身免疫(Gros和Muller,2014；Lleo等人,2007；Pierdominici等人,2012)。增强的自噬，允许自反应性淋巴细胞存活，可以促进自身免疫。另外，自噬，通过胞内蛋白消化产生自体抗原，可以参与自身免疫的启动或维持。除SNP和易患性基因之外，多项研究还已经突出显示，与自噬过程相关的某些基因的表达在自身免疫期间受调节。在类风湿性关节炎(RA)中，已经显示来自患者的破骨细胞中ATG7和BECLIN-1基因表达增加(Lin等人,2013)。通过调节滑膜发炎，发现Atg7表达因促炎细胞因子TNF-α(发病机制的关键要素)而增加。其他研究也已经显示，在自身免疫性脱髓鞘综合征和多发性硬化(MS)中，与健康对照相比，ATG5基因表达也显著地升高(Alirezaei等人,2009)。

基于遗传证据，已经提出自噬和自身免疫之间的潜在联系持续十年。然而，在细胞和分子水平显示自噬在自身免疫疾病启动和/或进展中作用的实验证据通常仍匮乏(表1)。在SLE患者中和两种遗传不相关的小鼠狼疮模型即MRL/lpr小鼠和(NZBxNZW)F1(NZB/W)小鼠中，我们在学术报告中显示，自噬在T淋巴细胞中失调(Gros等人,2012)。发现T细胞中自噬液泡过量存在，这表明自噬过度活化。当T细胞受T细胞受体(TCR)相关信号传导途径的化学激活物刺激时，这种失调甚至更明显。升高的自噬区室不存在于全部T细胞中，而限于它们的亚群。由于已知自噬涉及细胞存活，这些结果表明自噬可能促进疾病期间自身反应性T细胞的存活。Alessandri等人(2012)显示，T细胞中自噬体相关的MAP1LC3-II同工型增加主要出现在分离自SLE患者的初始CD4T细胞中。证实我们自身数据的这些结果表明，SLE T细胞中存在自噬活性的内在失调。作者在结论中提出另一种解释：SLE T细胞抵抗巨自噬诱导作用并且可能因此变得更易于凋亡。他们通过用雷帕霉素或用自体(促自噬)血清再刺激T细胞，得出这个结论。然而，SLE T细胞可能已经处于最高的自噬体装载水平并且再暴露于其自身血清并未进一步影响自噬活性。在任何情况下，这些数据证实SLE血清对正常T细胞的促自噬作用。Pierdominici与她的同事还观察到，自噬增加与疾病活动度评分(可以在未来治疗策中利用的重要信息)相关(Alessandri等人,2012；Pierdominici等人,2012；2014)。

更新近的研究已经强化并拓展上文描述的首创工作。因此，Clarke等人(2014)首次在NZB/W小鼠中显示，巨自噬激活还出现在B细胞中并且更具体地出现在B细胞的早期发育及转变阶段(在疾病发作之前)。在狼疮患者，与健康个体相比，自噬也激活，并且这种激活又主要出现在初始B细胞中。当使用自噬抑制剂如3-MA、巴弗洛霉素A1或CQ时，几乎不出现浆母细胞分化和存活。这些结果必定与狼疮易感小鼠和狼疮患者的血清中自身抗体过量产生相关。在他们的研究中，作者证实除B细胞之外，自噬在来自狼疮患者的T细胞中增加，并且在两个病例中，这种激活可能与疾病活动度相关。Li等人(2014)还描述令人信服的结果，这些结果显示与对照相比，在采集自狼疮诱导型小鼠模型(在施用弗氏佐剂中活化淋巴细胞衍生的同源性DNA后形成狼疮样疾病的BALB/c小鼠)的巨噬细胞中和狼疮患者的PBMC中，自噬显著激活。过继转移Beclin-1KO巨噬细胞显著地改善了受者小鼠的临床状况(蛋白尿水平下降、常见的肾脏复合物沉积减少、肾小球肾炎改善)以及生物学特征(血清抗dsDNA抗体水平和循环型促炎细胞因子IL-6和TNF-α下降，如通过ELISA所测量)。

一些研究已经凸显自噬在其他自身免疫疾病中、尤其在人RA中(Lin等人,2013；Kato等人,2014；Xu等人,2013)和实验性自身免疫性脑脊髓炎(MS模型)中(Bhattacharya等人,2014)的作用。自噬似乎在来自RA患者的破骨细胞中激活并且调节破骨细胞分化(Lin等人,2013)。这种增加的自噬过程(与骨关节炎滑膜成纤维细胞相比，Kato等人(2014)发现还存在于RA滑膜成纤维细胞中)与RA滑膜组织中降低的凋亡水平相关(Xu等人,2013)。从这些观察结果得出结论：过量产生的TFN-α引起的自噬激活导致关节中凋亡减少并且更重要地，造成负责病变的滑膜成纤维细胞存活。这再次凸显自噬的双重作用，即当它消除错误折叠的或太过富余的细胞组分时保护细胞，但是过度时，可能变得有害并产生不利作用。

多项新近研究结果强调了巨自噬在控制肌肉质量中的关键作用，并且已经在肌病和肌肉营养障碍中描述了自噬的错误调节作用(Sandri等人,2013)。然而，就纤维肌痛患者或多发性肌炎(一种具有自身免疫性组分的以肌肉炎症和变性为特征的罕见疾病)患者(Temiz等人,2009；Lloyd,2010)而言，与可能的自噬过程障碍相关的信息匮乏。在另一方面，已经在几种自身免疫背景(包括CD，SLE、可能RA和MS)中(表1)以及在炎性综合征中、尤其在肺病中(Mizumura等人,2012)观察到(或怀疑)自噬缺陷。强烈地预计，在全部这些情况下，自噬的调节作用，尤其旨在重新建立正确的通量调节作用，可能挽救所治疗患者的变更并且改善其临床状态。

如最近强调(Gros和Muller,2014)，已经太晚地发现多年用来治疗炎性疾病能够和自身免疫疾病的一些分子靶向一个或另一个类型的自噬过程。时至今日，实际上，存在极少数精确靶向自噬途径步骤和尤其甚至单一途径的特定化合物(Anguiano等人,2013)，并且相当令人惊讶地，并不真正已知向患者开具的某些自噬调节剂的靶。CQ和羟氯喹(HCQ)或地塞米松尤其如此，其作用模式(MOA)仍存在争议(参见下文)。

最近，多篇综述文章已经详尽囊获了已生成以直接或间接调节自噬的化合物(激活剂和抑制剂)家族的各个结构和功能方面(Baek等人,2012；Cheong等人,2012；Fleming等人,2011；Gros和Muller,2014；Jiang和Mizushima,2014；Renna等人,2010；Rubinsztein等人,2012；vanKasteren和Overkleeft,2014；Vidal等人,2014)。在严格校准的体外和体内进行的测定法中评价时(Mizushima等人,2010；Klionsky等人,2012)，这些小分子中的某些可能证明对适宜背景下调节自身免疫疾病有意义。在后续部分中所示的例子中，我们将自我限于自身免疫疾病中临床疗效确立或有前景的一些药理学自噬调节物。

药理学小分子和肽显示多种有利特性，这些特征使其成为优异治疗药，尤其对自身免疫疾病而言。除其可以高度优化和在一些情况下与一些生物制品相比明显简单以及可自动化的合成和生产之外，选择作为药物组合物中活性组分的小分子和肽以其稳定性和稳健性、易于操作、相对低的不得不向患者施用的剂量和其相对于大部分生物制品而言仍合理的成本为特征。小分子和短肽本身无免疫原性，这是治疗慢性自身免疫疾病患者时另一个可观的优点(Schall和Muller,2014)。

本说明书提供了治疗性组合物和使用前者的方法，其基于令人惊讶和意料之外的以下发现：如本文所述的化学修饰肽是自噬的强力调节物。如本文所述的化学修饰肽，例如，P140肽，衍生自U1-70K剪接体蛋白。所述肽和包含有效量前述肽的组合物有效治疗、预防和/或缓解以自噬通量增加为特征的疾病(即，过度自噬相关(如CMA过高)疾病)的症状。因此，在某些额外的方面，本公开提供制造和使用所述肽和包含前述肽的组合物的方法，所述方法用于治疗、预防和/或改善以过度自噬(例如，CMA过高)通量为特征的疾病的症状。

因此，在一个方面，本说明书提供SEQ ID NO:1、2、4和5的化学修饰肽，包括其衍生物、类似物和盐形式。

在某些实施方案中，本说明书提供一种分离的肽或其盐，所述分离的肽包含SEQID NO:1的氨基酸序列：RIHMVYSKRSGKPRGYAFIEY[SEQ ID NO:1]

或或由其组成，

所述分离的肽具有至少一个选自丝氨酸残基磷酸化、甲硫氨酸残基氧化和赖氨酸残基乙酰化及其组合的翻译后修饰。在这个方面的一个实施方案中，本说明书提供一种组合物，其包含分离的和/或化学修饰的具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列或由其组成的肽(重组或合成)或其盐，其中肽包含在位置10处的磷酸丝氨酸。在某些实施方案中，本说明书提供分离的和/或化学修饰的具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列或由其组成的肽(重组或合成)或其盐，其中肽包含在位置10处的磷酸丝氨酸和在位置4处的氧化的甲硫氨酸残基。

在某些额外的实施方案中，SEQ ID NO:1的肽还包含乙酰化的赖氨酸残基。特别地，SEQ ID NO:1的所述肽包含在位置10处的磷酸丝氨酸和在位置4处的氧化的甲硫氨酸残基及在位置8和12处一个或两个赖氨酸的乙酰化，并且更具体地还包含在位置7处的磷酸丝氨酸。

在某些实施方案中，本说明书提供分离的和/或化学修饰的肽(重组或合成)或其盐，所述肽包含以下氨基酸序列或由其组成：IHMVYSKRSGKPRGYAFIEY[SEQ ID NO:2]，

其中位置9处的丝氨酸(S)被磷酸化并且位置3处的甲硫氨酸(M)被氧化。

在某些实施方案中，本说明书提供具有以下式的化合物I的肽：

化合物I也可以如下代表：

IHM(O)VYSKRS(PO₃H₂)GKPRGYAFIEY[SEQ ID NO:5]

其中“M(O)”表示氧化的甲硫氨酸并且“S(PO₃H₂)”表示磷酸丝氨酸。

这些肽衍生自人U1snRNP 70kDa蛋白(SEQ ID NO:3)，并对应于下述氨基酸区段界定的区域，所述氨基酸区段从SEQ ID NO:3的残基132延伸至残基151。形式上，磷酸化的残基对应于从SEQ ID NO:3起位置140处的氨基酸，并且氧化的残基对应于从SEQ ID NO:3起位置134处的氨基酸。

在某些方面，本说明书提供分离的和/或化学修饰的肽(重组或合成)或其盐，所述包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或由其组成，所述肽具有至少一个选自丝氨酸残基磷酸化、甲硫氨酸残基氧化和赖氨酸残基乙酰化及其组合的翻译后修饰。在这个方面的一个实施方案中，本说明书提供一种组合物，其包含分离的具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列或由其组成的肽或其盐，其中肽包含在位置10处的磷酸丝氨酸。在某些实施方案中，SEQ ID NO:1还具有在位置4处的氧化的甲硫氨酸残基。在某些额外的实施方案中，SEQ ID NO:1的肽还包含乙酰化的赖氨酸残基。

在额外的方面，本说明书提供分离的和/或化学修饰的肽(重组或合成)，所述包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或由其组成，或其盐，所述肽具有至少一个选自丝氨酸残基磷酸化、甲硫氨酸残基氧化和赖氨酸残基乙酰化及其组合的翻译后修饰。在这个方面的一个实施方案中，本说明书提供一种组合物，其包含分离的和/或化学修饰的具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列或由其组成的肽(重组或合成)或其盐，其中肽包含在位置9处的磷酸丝氨酸，并且在位置3处的氧化甲硫氨酸残基。在某些额外的实施方案中，SEQ ID NO:2的肽还包含乙酰化的赖氨酸残基。

在某些实施方案中，本说明书提供具有以下式的化合物II的肽：

化合物II也可以如下代表：

RIHM(O)VYSKRS(PO₃H₂)GKPRGYAFIEY[SEQ ID NO:4]

其中M(O)表示甲硫氨酸氧化，并且S(PO₃H₂)表示丝氨酸磷酸化。

因此，本说明书提供肽或其盐，所述肽包含选自SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5的氨基酸序列或由其组成。

在一个额外的实施方案中，本说明书提供一种组合物，其包含有效量的至少一种肽或其盐，所述肽或其盐选自氨基酸序列SEQ ID NO:2，包含在位置9处的磷酸丝氨酸和在位置3处的氧化甲硫氨酸；选自SEQ ID NO:1的氨基酸序列或其盐，其中该肽包含在位置10处的磷酸丝氨酸；选自氨基酸序列SEQ ID NO:1，包含在位置10处的磷酸丝氨酸及在位置4处的氧化甲硫氨酸；及其组合。

本说明书提供肽和/或其盐，所述肽包含选自SEQ ID NO:1、2、4、5或其组合的氨基酸序列或由其组成，以及包含前述肽的组合物。

在某些实施方案中，本说明书提供分离的和/或化学修饰的具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的肽(重组或合成)，所述肽包含在位置10处的磷酸丝氨酸。在某些实施方案中，P140肽还包含在位置4处的氧化甲硫氨酸(例如，SEQ ID NO:4)(本文中也称作化合物II或P140(MO))。在某些实施方案中，本说明书提供具有如SEQ ID NO:1中所述的氨基酸序列的肽，所述肽包含在位置10处的磷酸丝氨酸和在位置4处的氧化甲硫氨酸，或其盐，和载体，例如，可药用载体。在某些额外的实施方案中，本说明书提供一种组合物，例如，治疗性组合物，所述组合物包含有效量的具有如SEQ ID NO:1中所述的氨基酸序列的肽，所述肽包含在位置10处的磷酸丝氨酸和在位置4处的氧化甲硫氨酸，或其盐，和载体，例如，可药用载体。

根据本说明书，通过至少一个翻译后修饰(在肽合成后出现的修饰)，修饰分离的和/或化学修饰的分别具有SEQ ID NO:1、2、4或5的氨基酸序列的肽(重组或合成)。在某些实施方案中，翻译后修饰选自磷酸化(添加磷酸根PO₃H₂)，例如，氨酸残基磷酸化；氧化，例如，甲硫氨酸残基氧化；乙酰化，例如，赖氨酸残基乙酰化；及其组合。在某些实施方案中，通过至少两个翻译后修饰，修饰分离的和/或化学修饰的分别具有SEQ ID NO:1、2、4或5的氨基酸序列的肽(重组或合成)。

在一个优选实施方案中，本说明书提供分离的和/或化学修饰的具有如SEQ IDNO:2中所述的氨基酸序列的肽(重组或合成)，所述肽包含在位置9处的磷酸丝氨酸和在位置3处的氧化甲硫氨酸，或其盐。在某些实施方案中，本说明书提供具有如SEQ ID NO:2中所述的氨基酸序列的肽，所述肽包含在位置9处的磷酸丝氨酸和在位置3处的氧化甲硫氨酸，或其盐，和载体，例如，可药用载体。在某些额外的实施方案中，本说明书提供一种组合物，例如，治疗性组合物，所述组合物包含有效量的具有如SEQ ID NO:2中所述的氨基酸序列的肽，所述肽包含在位置9处的磷酸丝氨酸和在位置3处的氧化甲硫氨酸，或其盐，和载体，例如，可药用载体。

在另一个实施方案中，本说明书提供分离的和/或化学修饰的具有如SEQ ID NO:4中所述的氨基酸序列的肽(重组或合成)，所述肽包含在位置10处的磷酸丝氨酸和在位置4处的氧化甲硫氨酸，或其盐。在某些实施方案中，本说明书提供具有如SEQ ID NO:4中所述的氨基酸序列的肽，所述肽包含在位置10处的磷酸丝氨酸和在位置4处的氧化甲硫氨酸，或其盐，和载体，例如，可药用载体。在某些额外的实施方案中，本说明书提供一种组合物，例如，治疗性组合物，所述组合物包含有效量的具有如SEQ ID NO:4中所述的氨基酸序列的肽，所述肽包含在位置10处的磷酸丝氨酸和在位置4处的氧化甲硫氨酸，或其盐，和载体，例如，可药用载体。

在另一个实施方案中，本说明书提供分离的和/或化学修饰的具有如SEQ ID NO:5中所述的氨基酸序列的肽(重组或合成)，所述肽包含在位置9处的磷酸丝氨酸和在位置3处的氧化甲硫氨酸，或其盐。在某些实施方案中，本说明书提供具有如SEQ ID NO:5中所述的氨基酸序列的肽，所述肽包含在位置9处的磷酸丝氨酸和在位置3处的氧化甲硫氨酸，或其盐，和载体，例如，可药用载体。在某些额外的实施方案中，本说明书提供一种组合物，例如，治疗性组合物，所述组合物包含有效量的具有如SEQ IDNO:5中所述的氨基酸序列的肽，所述肽包含在位置9处的磷酸丝氨酸和在位置3处的氧化甲硫氨酸，或其盐，和载体，例如，可药用载体。

令人惊讶并且出乎意料地，发现与未氧化的对应物相比，如本文所述的肽在体外更稳定。稳定性如实施例部分中公开那样测量。与未氧化的对应物相比，磷酸化的氧化肽在溶液中较少自发降解，所述稳定性增强其生物学特性。此外，发明人已经令人惊讶地确定，与现有技术的教导相反，甲硫氨酸氧化增强肽稳定性，同时不影响这类肽的生物学作用。实际上，本领域中主要报告，含有氧化甲硫氨酸的蛋白质或肽在其三维结构和/或生物活性方面遭受破坏。如本文所述的修饰肽对HSC70蛋白具有基本上与未氧化的对应物相同的亲和力，如实施例部分中公开。

在某些实施方案中，氧化在SEQ ID NO:2的位置9处或SEQ ID NO:1的位置10处的甲硫氨酸(M)发生，所述位置是与SEQ ID NO:3的位置134等同的位置。硫原子如下文所示氧化：

上述肽(SEQ ID NO:1、2、4和5)可以通过本领域常使用的技术(如生物学合成法或化学合成法)合成。生物学合成法涉及通过转录和翻译编码目的肽的核酸分子，体内、体外或离体产生所述肽。

例如核酸序列：

MGNATHCAYATGGTNTAYWSNAARMGNWSNGGNAARCCNMGNGGNTAYGCNTTYATHGARTAYTRR[SEQ ID NO:6]

在体外系统中或宿主生物中转录并翻译，以产生肽SEQ ID NO:1。因此根据熟知的技术纯化产生的肽。

化学合成法由添加要求的氨基酸聚合所需的肽组成。实施例部分中公开了一种方法。

可以通过经典的Fmoc(N-[9-芴基]甲氧羰基)固相化学，化学合成肽SEQ ID NO:1和2并且通过反相高效液相色谱纯化之(HPLC；Neimark和Briand,1993；Monneaux等人,2003，Eur.J.Immunol.33,287-296；Page等人,2009,PloS ONE 4,e5273)。

还可能直接合成肽SEQ ID NO:1和2，其中位置10和9处的相应残基磷酸化。为此目的，在肽合成期间，在所需的位置使用Fmoc-Ser(PO(Obz)OH)-OH型丝氨酸衍生物。

根据本领域熟知的方案，也可以在肽合成后添加磷酸酯基团(-PO₃H₂)。

可以通过将肽SEQ ID NO:1或2与选自蛋白激酶A或C(PKA或PKC)或酪蛋白激酶II的特异性丝氨酸激酶在三磷酸腺苷(ATP)存在下温育，使丝氨酸磷酸化。肽因此在一个丝氨酸(在SEQ ID NO:2的位置6或9处或在SEQ ID NO:1的位置7或10处)或两个丝氨酸磷酸化。例如通过色谱，将所需的磷酸化肽与其他肽分离。

也可以通过使用技术人员可以根据其常识容易选择的特定保护基，在特定位置(在SEQ ID NO:2的位置9处，或在SEQ ID NO:1的位置10处)进行-PO₃H₂的化学添加。

可以使用本领域已知的允许特异性磷酸化丝氨酸的任何其他技术。

在某些实施方案中，甲硫氨酸的氧化根据以下过程进行：

在37℃用20mM H₂O₂处理4小时，或

在22℃在0.1M二甲基亚砜溶液中(DMSO；Me₂SO)用加HCl 0.5M中处理30至180分钟。

可以使用本领域已知的允许特异性氧化甲硫氨酸的任何其他技术。

在本文所述的任何方面或实施方案中，本说明书提供的肽可以按本领域技术人员已知的盐形式存在，例如，钠盐、铵盐、钙盐、镁盐、钾盐、乙酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐、氯化物盐、硫酸盐、氨基盐酸盐、溴酸盐、苯磺酸盐、磷酸盐、磷酸二氢盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、乳酸盐、扁桃酸盐、甲烷磺酸盐(甲磺酸盐)或对甲苯磺酸盐(甲苯磺酸盐)。这个列表通过示例方式提供并且不意在限制本发明。例如，根据其知识，技术人员可以容易地确定适宜的盐。

在一个额外的实施方案中，本说明书提供包含氨基酸序列：RIHMVYSKRSGKPRGYAFIEY[SEQ ID NO:1]或由其组成的肽，

所述肽包含在位置10处的磷酸丝氨酸。在某些实施方案中，磷酸化的肽还包含在位置4处的氧化甲硫氨酸或其盐。在一个有利实施方案中，本发明涉及如上文定义的由氨基酸序列SEQ ID NO:4组成的肽或其盐。

药物组合物

在另一个方面，本说明书提供组合物，所述组合物包含有效量的如本文所述的一种或多种肽和赋形剂或载体。因此，在额外的实施方案中，本说明书还提供药物组合物，所述药物组合物至少包含如本文所述的肽或如上文所述的组合产物，还包含可药用载体。

如本文所述的肽(本文也称作“活性化合物”)可以并入适于施用的药物组合物中。这类组合物一般包含肽和可药用载体。如本文所用，语言“可药用载体”意在包括与药物施用相容的任何和全部溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。用于药学活性物质的此类介质和媒介的用途是本领域熟知的。除了任何常规介质或药物与活性化合物不相容的情况之外，构思了其在这些组合物中的用途。补充性活性化合物也可以并入组合物中。

本说明书提供了用于制备药物组合物的方法。这类方法包括将可药用载体与如本文所述的肽一起配制。这类组合物还可以包含如上文所述的额外活性物质。因此，本发明还包括通过将可药用载体与如本文所述的肽和一种或多种额外的活性化合物一起配制，制备药物组合物的方法。

将本发明的药物组合物配制成与其预期施用途径相容。施用途径的例子包括肠胃外施用，例如，静脉内、皮内、皮下、口服、经鼻(例如，吸入)、透皮(局部用)、经粘膜和直肠施用。用于肠胃外、皮内或皮下施加的溶液剂或混悬剂可以包含以下组分：无菌稀释剂如注射用水、盐溶液、不挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗细菌剂如苄醇；抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；络合剂如乙二胺四乙酸；缓冲剂如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐和用于调节张力的物质如氯化钠或右旋糖。可以用酸或碱，如氢氯酸或氢氧化钠调节pH。可以将肠胃外制剂装入由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。

适于可注射用途的药物组合物包括无菌水溶液剂(其为水溶性)或用于现场配制无菌注射溶液剂或分散剂的分散体和无菌粉末。对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor EL(BASF；Parsippany,N.J.)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在全部情况下，组合物必须是无菌的并且应当保持流动至存在易注射性(easy syringability)的程度。它必须在制造和储存条件下稳定并且必须针对微生物(如细菌和真菌)的污染作用进行保护。载体可以是溶剂或分散介质，其例如包括水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)和合适的其混合物。可以例如通过使用包衣如卵磷脂，在分散剂的情况下通过维持要求的粒度和通过使用表面活性剂，维持适宜的流动性。可以用各种抗菌剂和抗真菌剂，例如，氯丁醇、苯酚、抗坏血酸等实现对微生物作用的阻止。在许多情况下，将优选在组成上包括等渗剂例如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇或氯化钠。可以通过在组合物中包含延迟吸收的物质例如单硬脂酸铝和明胶，引起可注射组合物的吸收延长。

可以通过将活性化合物(例如，多肽或抗体)在以要求的量连同上文所列举的一种成分或成分组合在合适的溶剂中并入，根据需要，随后过滤除菌，配制无菌可注射溶液剂。通常，通过将活性化合物并入含有基础分散介质的无菌载体并随后并入来自上文列举的那些成分中的所需其他成分，制备分散剂。在用于配制无菌注射溶液剂的无菌粉末情况下，优选的配制方法是从其先前无菌过滤的溶液产生有效成分的粉末外加来任何额外所需成分的真空干燥和冷冻干燥。

口服组合物通常包含惰性稀释剂或可食用载体。可以将它们封闭于明胶胶囊中或压缩成片剂。出于口服治疗性施用的目的，活性化合物可以随赋形剂一起掺入并且以片剂、药锭剂或胶囊剂形式提供。口服组合物也可以是预制使用流体载体用作漱口剂，其中将流体载体中的化合物经口施加并洗出或咳出或吞咽。

对于通过吸入施用，这些化合物可以按气溶胶喷雾剂的形式从含有合适推进剂(例如，气体如二氧化碳)的加压容器或分配器或雾化器递送。

全身性施用也可以通过经粘膜或经皮方式进行。对于透粘膜或经皮施用，制剂中使用适于待渗透屏障的渗透剂。这类渗透剂通常是本领域已知的，并且例如对于透粘膜施用，包括去垢剂、胆盐和夫西地酸衍生物。透黏膜施用可以通过鼻喷雾剂或栓剂完成。对于经皮施用，将活性化合物配制成油膏剂、软膏剂、凝胶剂或乳膏剂，如本领域公知。

还可以将化合物以栓剂(例如，用常规的栓剂基料如可可脂和其他甘油酯)或保留灌肠剂形式配制用于直肠递送。

在一个实施方案中，将活性化合物随将会保护化合物避免从身体快速消除的载体一起制备，如控释制剂，包括植入物和微囊化递送系统。可以使用生物可降解、生物相容性聚合物，如乙烯-乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。用于配制这类制剂的方法将是本领域技术人员显而易见的。这些材料也可以从Alza Corporation和Nova Pharmaceuticals,Inc.商业获得。脂质体悬液(包含具有并入其中或其表面的单克隆抗体的脂质体)也可以用作可药用载体。这些悬液可以根据本领域技术人员已知(例如，如美国专利号4,522,811中所述)的方法制备。

特别有利的是以剂量单位形式配制口服或肠胃外组合物以易于剂量的施用和均匀性。如本文所用的剂量单位形式指适合作为用于待治疗受试者的单一剂量的物理分立的单元；每个单元含有预定量的活性化合物，所述的预定量经计算与所要求的药用载体结合时产生所需的治疗作用。用于本发明剂量单位形式的规定由以下决定并且直接取决于此：活性化合物的独特特征和待实现的特定治疗作用决定，及复配这种活性化合物供治疗个体的现有技术中固有的限制作用。

在本文提供的方法的某些实施方案中，该方法包括步骤：施用剂量约100ng至约5mg的如本文所述的治疗性组合物或药物组合物。在某些实施方案中，例如，在人类中，如本文所述的药物组合物可以含有甘露糖醇作为载体，并且组合物在单次施用中从10μg至500μg，优选地200μg施用。

在某些额外的方面，剂量方案可以从1至3次/周、每周至每四周重复，只要治疗窗口需要，并且因此持续几年。在一个优选实施方案中，剂量方案是每4周一次治疗，但是可以一年重复两次，持续几年。施用的例子是：每4周一次注射200μg肽，持续12周(即3次注射，彼此相隔4周)。可以通过每6个月施用，延长治疗。

优选的可药用载体可以例如包括黄原胶、刺槐豆胶、半乳糖、其他糖、低聚糖和/或多糖、淀粉、淀粉片段、糊精、British胶及其混合物。有利地，可药用载体是天然来源的。可药用载体可以是或还可以包括选自单糖或二糖的惰性糖稀释剂。有利的糖是甘露糖醇。

有利地，本发明涉及如上文定义的处于脂质体或纳米粒子形式或处于溶液形式的药物组合物。有利的溶液是包含1％至15％、尤其约10％甘露糖醇的溶液。溶液应当是等渗的。

本发明还涉及包含如上文定义的组合产物的药物，供同时、分别或依次使用。

治疗方法

在一个额外的方面，本说明书提供用于治疗、预防或缓解自身免疫疾病或慢性炎性疾病或病症的症状的方法，所述方法包括向有需求的受试者施用有效量的如本文所述治疗性组合物，其中组合物有效治疗、预防和/或缓解慢性炎症相关疾病或病症的至少一种症状。

在一个额外的方面，本说明书提供用于治疗、预防或缓解过度自噬相关的免疫系统疾病或病症(例如，CMA过高相关的自身免疫疾病)的症状的方法，所述方法包括向有需求的受试者施用有效量的如本文所述治疗性组合物，其中组合物有效治疗、预防和/或缓解过度自噬(例如，CMA过高)相关疾病或病症(例如，下表3)的至少一种症状。

在某些实施方案中，疾病或病症是与过多或增加的自噬(例如，CMA)相关的慢性炎性疾病或病症。在某些实施方案中，疾病或病症至少是如下一种：类风湿性关节炎(RA)、多发性硬化(MS)、肌病、肌营养不良(MD)、Crohn病(CD)、慢性阻塞性肺病(COPD)纤维肌痛、多发性肌炎、肺病、慢性免疫性血小板减少症(ITP)、神经精神性狼疮、Gougerot-综合征、类风湿性关节炎、Guillain-Barré病(慢性/CIDP)、哮喘(急性或慢性)、嗜酸粒细胞性气道炎症、肠激惹综合征(IBS或IBD)、慢性炎症性脱髓鞘性多神经根神经病(CIDP)、II型糖尿病、脂肪组织再生、硬皮病、银屑病、阿尔茨海默病或帕金森病。

在某些实施方案中，自身免疫疾病选自：结缔组织病(非特异性全身性器官病)家族的自身免疫性病变，例如，系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎、混合型结缔组织病、综合征或慢性青少年关节炎；和/或器官特异性自身免疫性病变，例如，多发性硬化、胰岛素依赖性糖尿病、Crohn病或大疱性疾病。在一个优选实施方案中，自身免疫疾病是SLE。

在一个额外的方面，本说明书还提供治疗自身免疫疾病的方法，所述方法包括步骤：向需要这种治疗的受试者施用(例如，患者，如哺乳动物，例如，人类)有效量如本文所述的药物组合物，其中组合物足以实现所述治疗。在另一个方面，本说明书提供如本文所述的用于治疗自身免疫疾病的方法中的组合物，所述方法包括步骤：向需要它的受试者施用有效量如本文所述的药物组合物，其中组合物足以实现所述治疗。

在某些实施方案中，自身免疫疾病选自：结缔组织病(非特异性全身性器官病)家族的自身免疫性病变，例如，系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎、混合型结缔组织病、综合征或慢性青少年关节炎；和/或器官特异性自身免疫性病变，例如，多发性硬化、Crohn病或大疱性疾病。在一个优选实施方案中，自身免疫疾病是SLE。

本说明书还提供包含如本文所述的肽和/或如本文所述的组合的药物，供其作为药物使用，尤其供治疗自身免疫疾病。

在不受任何具体理论约束的情况下，发明人假设HSC70结合作用对介导磷酸肽结合和内化重要，并且因此，介导了如本文所述的肽的治疗作用。因此，本说明书还提供一种治疗或缓解由HSC70在细胞表面过量表达引起的病状的方法，所述方法包括步骤：向需要它的患者施用有效量的磷酸肽，例如，如本文所述的修饰肽，其中肽治疗病状的至少一种症状或实现其改善。

由氨基酸序列SEQ ID NO:1组成的肽，其中位置10处的丝氨酸经磷酸化，对应于以下化合物III：

实施例

实施例1：肽的化学合成。

使用经典的Fmoc(N-[9-芴基]甲氧羰基)固相化学，合成P140肽和P140(MO)，并且通过反相高效液相色谱纯化之(HPLC；Neimark和Briand,1993；Monneaux等人,2003，Eur.J.Immunol.33,287-296；Page等人,2009,PloS ONE 4,e5273)。通过分析性HPLC检验它们的均一性，并且在Finnigan LCQ Advantage Max(Thermo Fischer Scientific)系统上通过LC/MS评估其身份。在完成反应后，通过HPLC纯化肽。

为了在等同于SEQ ID NO:3中残基140的丝氨酸残基处引入磷酸化，使用Fmoc-Ser(PO(Obz)OH)-OH型丝氨酸衍生物。偶联时间增加到30分钟并且系统地实施第二次偶联。在酸性介质中剪切后，将每种肽通过冷醚沉淀，在水和乙腈的溶液中增溶并最终冻干。随后通过RP-HPLC纯化肽，已经通过分析HPLC和通过质谱法(Maldi-TOF)分析它们的完整性和它们的纯度。如上文提到那样引入氧化。

实施例2：肽的稳定性。

在37℃在10％(v/v)甘露糖醇溶液中测量其中位置10处的丝氨酸被磷酸化且位置4处的甲硫氨酸被氧化的肽SEQ ID NO:2(P140(MO))和其中位置10处的丝氨酸经磷酸化的肽SEQ ID NO:1(P140)的稳定性。对于每种肽，测试3种浓度：200、100和50μg/mL。

在所指示的时间，在盐水中通过高效液相色谱从对应于完整肽的峰的面积测量P140和P140(MO)肽的完整性。

图3中显示结果。

下表1和2概括结果：

表1

表2

通过使用HPLC峰表面测量稳定性。

对于每个测试的浓度(50至200μg/ml)，P140M(O)稳定性在37℃历经100天保持不变(100％、99.1％和99.4％)。

对于每个测试的浓度(50至200μg/ml)，P140稳定性随时间推移下降并且在37℃100天后降低(97.4％、93.4％和89.6％)。

这些数据显示肽P140中甲硫氨酸的氧化增强肽的稳定性。P140(MO)在全部测试浓度历经100天均稳定。

实施例2：MRL/lpr小鼠中肽的治疗作用。

MRL/lpr小鼠品系是遗传上倾向于形成系统性红斑狼疮样综合征的小鼠子品系，已经发现所述综合征临床上类似于人类疾病。已确定这个小鼠品系在fas基因中携带突变。另外，MRL/lpr是研究自身免疫疾病中存在的行为和认知缺陷存和免疫抑制剂有效性的可用模型[Monneaux等人,2003,Eur.J.Immunol.33,287-296]。

2.1存活率分析

五周龄雌性MRL/lpr小鼠如所述那样静脉内接受P140或肽P140(MO)(Monneaux等人,2003,Eur.J.Immunol.33,287-296)。全部实验方案均在当地研究机构动物护理和使用委员会(CREMEAS)批准下实施。作为对照，对小鼠注射NaCl。

对于每种肽或NaCl，使用二十只小鼠。

图4中显示结果。

已经应用对数秩(Mantel-Cox)检验应用并且结果如下：NaCl与P140p＝0.0686；NaCl与P140(MO)p＝0.0026；P140与P140M(O)p＝0.2366。

小鼠的中位生存期是：NaCl＝25周，P140＝29周并且P140(MO)>40周。这些结果展示了P140(MO)肽在小鼠中治疗狼疮的体内有功效。

2.2蛋白尿分析

使用Albustix(Bayer Diagnostics)在新鲜尿中测量上述小鼠的蛋白尿并且根据生产商推荐的0-4量表，对其半定量估计(无蛋白尿＝0；痕量＝1；1+＝2；2+＝3；3+＝4；4+＝5)。

图5中显示结果。

在该图中，与未处理的小鼠相比，观察到蛋白尿较不明显并且在P140M(O)-处理的小鼠中出现晚。

2.3细胞性质分析

对MRL/lpr小鼠注射100μg/100μL P140或P140(MO)并且在这个唯一注射后5天研究细胞性质(外周血)。计数包括全部白细胞。考虑到测试的小鼠数目少，已经实现一项非参数统计检验(Mann-Whitney)。图6中显示结果。

因此，在狼疮的急性鼠模型中，SEQ ID NO:4的肽能够降低外周细胞过多并且延迟疾病的生物学体征和临床体征，功效至少类似于P140或更好。

统计学

使用GraphPad Prism 5.0版进行统计检验。两因素ANOVA检验用来分析对照小鼠组和肽处理小鼠组之间蛋白尿差异的统计显著性。通过Kaplan Meier方法分析对照和P140类似物处理的雌性MRL/lpr小鼠的存活率，并且通过对数秩检验确定差异的显著性。对于其他变量，使用Student t检验评定统计显著性。小于0.05的p值视为显著。

实施例3：肽对HSC70蛋白的亲和力。

BIAcore 3000系统(Biacore：AB)用来评价P140肽与HSC70蛋白的结合(Page等人,2009和2011)。传感芯片CM5、表面活性剂P20、含有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和N-乙基-N’-二甲氨基丙基碳二亚胺(EDC)、2-(2-吡啶基二硫代)乙胺(PDEA)和乙醇胺的胺偶联试剂盒来自Biacore AB。以HBS-EP缓冲液作为运行缓冲液(10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA、0.005％表面活性剂P20，pH 7.4)进行生物传感器测定法。将化合物稀释于运行缓冲液中。在每次实验后通过注射10μL 10mM HCl，再生传感芯片表面。在NHS/EDC活化的基质上使用50mM pH 8.3硼酸盐缓冲液中的35μL PDEA，将重组牛HSC70(Stressgen)借助其硫醇基固定在CM5传感芯片的流动小室上。随后，注射35μL HSC70(甲酸盐缓冲液中的100μg/mL，pH4.3)直至对应于13ng/mm²HSC70的13,000响应单位(RU)响应固定化。使用20μL 50mM半胱氨酸/1M NaCl溶液饱和芯片上未占据的位点。在25℃以恒定流量20μL/分钟实施P140肽与HSC70结合的直接测量。将P140肽和类似物在该通量中按不同的浓度注射3分钟，随后是3分钟的解离相。在个人计算机上使用BIAeval 3.1软件计算动力学参数。使用简单1:1朗格缪尔结合模型进行分析。从对照空通道和从空白缓冲液注射扣除响应信号后，获得具体的结合特征。与理论模型比较，通过残基分布的χ²值和随机性，判定对每种模型的拟合。

在表3和4中和图7和图8中显示结果。

这些表格显示P140肽和P140M(O)肽之间对HSC70的亲和力并无显著差异。

因此，这两种肽以相同效率结合HSC70。

实施例3：P140肽在RA中的作用。

在这个实施例中，测试了涵盖剪接体U1-70K蛋白的序列131-151并且位置140处含有磷酸丝氨酸残基的P140肽(21聚线型肽)。在P140处理后，在MRL/lprB细胞中观察到自噬标志物SQSTM1和MAP1LC3的堆积，与自噬通量下调一致(Page等人,2011)。还发现伴侣蛋白介导的自噬(CMA)是P140肽的靶，并且显示P140肽对CMA的抑制性作用可能与其相互作用于HSPA8伴侣蛋白的能力有关(Page等人,2009)并且与改变HSPA8异质复合体的组成有关(Macri等人,待发表)。HSPA8和LAMP-2A的限制性CMA组分表达均在MRL/lpr B细胞中增加，并以P140肽处理小鼠后下调(Page等人,2011；Macri等人,待发表)。进一步显示，P140，而不是在小鼠中无防范疾病形成的非磷酸化肽(Monneaux等人,2003)，利用笼形蛋白依赖的内体性溶酶体途径进入MRL/lpr B淋巴细胞并积累于溶酶体腔中，在那里，它可以直接阻碍溶酶体HSPA8伴侣功能，并且还使溶酶体中的LAMP-2A去稳定化，原因在于其影响HSP90(Macri等人,待发表)。这种双重作用可能干扰内源(自身)抗原加工和加载于MHCII分子，并且因此，导致先前实验证实的自身反应性T细胞活化较少(Monneaux等人,2004；Monneaux等人,2007)。

最近研究表明，自噬在RA以及在其他自身免疫疾病中可能增加(表3；Wilhelm和Muller，已提交)。已经对Crohn病(CD)、RA、多发性肌炎(PM)和多发性硬化(MS)提出这种激活作用，但在自身免疫性糖尿病中未提出，相反，在自身免疫性糖尿病中自噬可能减少。

表3：出现自噬失败的自身免疫疾病的列表

(1)缩略语：ATG，自噬相关基因；BECN1，beclin-1；CD，Crohn病；CMA，伴侣蛋白介导的自噬；CTSB，组织蛋白酶B；CTSD，组织蛋白酶D；DRAM1，损伤调节的自噬调节物；EM，电子显微镜检查；FM，荧光显微术；HSPA8，热休克蛋白8；IRGM，免疫相关的GTP酶家族M蛋白；LAMP-2A，溶酶体-相关膜蛋白2A；MaA，巨自噬，MAP1LC3，微管相关蛋白轻链3；MS，多发性硬化；PCR，聚合酶链反应；PM，多发性肌炎；PRDM1，正向调节结构域I结合因子1；RA，类风湿性关节炎；SLE，系统性红斑狼疮；WB，蛋白质印迹法。(2)括号中给出用来评价这些变更的方法。

在体外，P140未诱导来自狼疮患者的外周T细胞增殖(与诱导外周T细胞增殖的非磷酸化形式相反并且与MRL/lpr背景下离体所示的数据相反)，但是在细胞培养物中形成调节性细胞因子IL-10的高水平分泌(Monneaux等人,2005)。当测试来自患有其他自身免疫疾病的患者的T细胞时，培养物中未观察到增殖和IL-10产生(Monneaux等人,2005)。评价了以下疾病的患者(n＝27)：类风湿性关节炎(RA)、原发性综合征、自身免疫耳聋、多发性肌炎、原发性胆汁性肝硬化和自身免疫肝炎，以及4位因非自身免疫疾病或传染性疾病住院的患者。

这些数据(随一小群患者升高)导致我们做出结论：肽P140很可能非常特异性地刺激狼疮外周CD4⁺T细胞，但不刺激来自存在其他病理生理状况的患者的T细胞(Monneaux等人,2005)。这些数据还与P140肽作为这些疾病中可能的自噬缺陷调节物的潜在作用相悖。

接下来，在形成RA样疾病的模型小鼠中施用P140肽(我们预计使用这个小鼠模型作为MRL/lpr-狼疮易感小鼠的阴性对照)。这个模型，称作胶原诱导型关节炎(CIA)小鼠模型，是最常见研究的RA自身免疫模型。在这个模型中，通过用弗氏完全佐剂(CFA)和II型胶原蛋白(CII)的乳液免疫接种DBA/1小鼠，诱导自身免疫关节炎，并且一般首个关节炎体征出现免疫接种后21 28天(Brand等人,2007)。CIA与人RA共有几种病理学特征，并且CII是软骨(RA的靶组织)中的主要蛋白。病理学特征包括滑膜增生、单核细胞浸润和软骨降解。这些小鼠中的易患性与特定MHC II类基因表达关联，DBA/1具有H-2^q单倍型。

因此将P140肽在第-1、+7、+14和+20天在接近于我们在MRL/lpr小鼠中所用的设定(100μg/注射/小鼠)下静脉内施用至DBA/1小鼠。将CFA中的CII在第+1和+21天注射(200μg，皮内途径)。使用非常经典的程序跟踪小鼠体重及其临床评分。还评价生物学参数(即T细胞反应、抗体应答、关节病理学等)。

这个实验中获得的结果显示，来自接受乱序肽ScP140的小鼠的CD4⁺T脾细胞在添加至培养物的CII存在下(图9；100μg CII/mL；使用CFSE测定法通过FACS测量)离体正常增殖。然而，形成明显对比的是，从接受P140肽的小鼠的脾采集CD4 T细胞时，增殖强烈削弱(ScP140和P140之间p＝0.0539)。

在相同条件测试CD8⁺T细胞时，未观察到影响。等待将更充分详细地表征这种应答的其他结果。组织学也将完成这些细胞数据。

在任何情况下，不能预计到的这些结果提示一种可操作方案，所述方案可能在RA中模仿当我们测试来自P140处理的MRL/lpr狼疮易感小鼠的CD4⁺T细胞时发现的那种方案。在MRL/lpr小鼠中，P140引起MHCII在B细胞表面的表达显著减少(借助其影响CMA)，因而降低抗原呈递细胞呈递抗原性肽，因而，导致自身反应性外周T细胞的反应性降低和疾病状况改善。因此，数据显示P140肽可以在将需要减少CMA活性的多种其他病理条件下有效。

迄今，在细胞水平不存在显示RA中CMA改变的可用数据。不存在关于这种病变中溶酶体特性的信息。未来研究应当聚焦于以下可能的证实：自噬通量在RA小鼠和来自RA患者的B细胞中增加，并且在这种设定下CMA改变。

将测试其他病理生理背景以积累相关数据，尤其在CD、PM、硬皮病(SSc)和MS中测试。既有的鼠模型可用于CD(例如IL-10KO小鼠，SAMP1/YitFc小鼠或肽使用近交大鼠的聚糖-多糖模型)和MS(实验性自身免疫脑脊髓炎(EAE)小鼠模型和大鼠模型)。然而，迄今不存在PM和SSc的良好动物模型。

实施例4：P140颗粒的内吞。

对于P140肽活性，HSC70结合和内吞似乎重要。据信内吞必须经笼形蛋白途径发生。这提示肽+赋形剂应当具有直径30nm至500nm的大小。例如，P140+甘露糖醇处于100nm范围内，而P140+海藻糖低于10nm并且因此无法有效与HSC70结合。例如，图10显示细胞对MRL/lpr B细胞和Raji细胞中5.4％甘露糖醇或10％海藻糖中荧光P140肽的摄取，如通过流式细胞术可视化。B细胞来自12-14周龄MRL/lpr小鼠(原代细胞)；Raji细胞是1963年从Burkitt淋巴瘤患者的B-淋巴细胞衍生的已建立细胞系。相比甘露糖醇中，在海藻糖中稀释肽时，MRL/lpr B细胞和Raji细胞中细胞摄取P140少得多。使用共聚焦显微术证实这个结果(图11)。共聚焦图像显示了归巢入溶酶体之前其中存在P140的晚期内体区室；DAPI鉴定DNA。结果证实了流式细胞术结果，即在海藻糖中时，P140肽明显更少地进入B细胞(参见表4和表5)。

表4：HSC70上的P140

表5：HSC70上的P140(MO)

实施例5.P140磷酸肽在小鼠中卵清蛋白所致嗜酸粒细胞性气道炎症15天模型中的抗炎性作用。

在小鼠15天高嗜酸性粒细胞气道炎症模型中局部(鼻内)或全身(静脉内)施用时，评价P140磷酸肽的抗炎作用。

在无菌水(Braun)中溶解P140磷酸肽并且添加10x浓度的无菌盐水以调节克分子渗透压浓度至300mosm。克分子渗透压浓度用微量渗透计(型号15)控制并验证(302mosm)。

P140磷酸肽以剂量4mg/kg通过鼻内(i.n.)和静脉内(i.v.)途径体内使用。对照动物接受等同体积(鼻内1ml/kg和静脉内2ml/kg)的盐水(表6)。

通过腹膜内(i.p.)注射0.1ml盐水中含有50μg OVA(Sigma-Aldrich)和2mg明矾(Sigma-Aldrich)的混合物，致敏九周龄雄性Balb/c小鼠。在第5天通过鼻内施用25μl OVA，随后在第12天、第13天和第14天鼻内施用25μl OVA和/或盐水，攻击小鼠。在第9天通过静脉内注射(2ml/kg)或鼻内施用(1ml/kg)P140或溶剂处理小鼠(参见图12)。

表6.

组编号	小鼠数目	处理	攻击
				1	1	溶剂	盐水
2	2	P140(i.n.)	盐水
				3	2	P140(i.v.)	盐水
4	5	溶剂	OVA
				5	6	P140(i.n.)	OVA
6	6	P140(i.v.)	OVA

在如所述那样LPS攻击后二十四小时进行BAL(Daubeuf,F.和Frossard,N.2012.Performing Bronchoalveolar Lavage in the Mouse.Curr Protoc Mouse Biol2:167-175)。小鼠经IP(氯胺酮150mg/kg赛拉嗪10mg/kg)麻醉。从心脏采集血液，以10,000g离心2分钟并且在-20℃储存血清。在气管半切除后，插入一根塑料导管，并用1ml注射器注射的0.5ml 0.9％NaCl洗涤气腔。这个程序进行10次。采集前2次灌洗的初始浓缩上清液(体积＝施用2x0.5ml，回收约0.5ml)供细胞因子测量。将剩余BAL液离心(300g 5分钟，4℃)，并汇集细胞沉淀物。将细胞沉淀物悬浮于500μl 0.9％NaCl中并且用于CellAnalyser上评价总细胞计数。通过流式细胞术(细胞仪，BD Bioscience)评估细胞分类计数。将BAL细胞随FCblock(0.5μl，553142，BD Bioscience)一起添加黑色微量平板中，在室温温育20分钟。随后，添加标志物抗体：CD11c-FITC(557400,BD bioscience)、Gr-1-Pe-eFluor610(61-5931-82,eBioscience)、CD11b-APC-Cy7(557657,BD bioscience)、CD45-AlexaFluor700(103128,BioLegend)、CD3-BV605(564009,BD bioscience)、CD19-PE-Cy7(552854,BD bioscience)。将抗体与BAL细胞在室温温育30分钟，之后添加DAPI(5μl，BDbioscience)，并且立即进行流式细胞术。

数据展示为均数±SEM。使用单因素方差分析(one-way ANOVA)随后Tukey后检验，检验各组之间差异的统计显著性。为了统计分析，汇总对照组1、2和3。当p≤0.05时，认为数据有显著差异。

对盐水攻击的对照小鼠的BAL液中回收的气道细胞分析，显示如与溶媒(盐水)相比，鼻内或静脉内施用的P140磷酸肽本身对BAL液中回收的细胞数目几乎没有影响，并且尤其没有促炎作用。(参见表7)。

表7.

在卵清蛋白攻击的小鼠中，BAL液中回收的炎性细胞总数显著地增加。这种作用与嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、T细胞和B细胞的内流明显增加相关(###p<0.001；图13)。

静脉内施用(4mg/kg)的P140磷酸肽显著地减少嗜酸性粒细胞召集(-50％，***p<0.001)、T细胞召集(-66％，**p<0.01)和B细胞召集(-42％，*p<0.05)，以及中性粒细胞召集(-38％)，不过未低于显著性临界值。相比之下，通过鼻内途径局部施用时，P140磷酸肽显示几乎不影响BAL中的炎性细胞召集，提示P140通过全身作用起效。

本项目旨在研究通过鼻内局部施用或通过静脉内全身施用的P140磷酸肽是否在用卵清蛋白致敏和攻击的Balb/c小鼠的15天气道嗜酸粒细胞增多症模型中可能具有抗炎作用。我们比较了在OVA或盐水攻击之前2天(即在通过支气管肺泡灌洗法回收气道炎性细胞之前6天)鼻内或静脉内施用的P140的作用。

因此，静脉内施用(4mg/kg)P140在Balb/c小鼠针对OVA的这个气道嗜酸粒细胞增多症模型中显示抗炎作用，而鼻内施用仍旧没有明显作用。这提示P140的抗炎活性是全身性作用(例如，脾、淋巴器官、骨髓)而非局部作用。

实施例6.在结肠炎症小鼠模型(DSS所致模型)中研究P140肽的作用。

正常小鼠(C57BL/6；7周龄；雄性)已经在第-2天和第-1天接受P140肽(100/注射，静脉内途径；10只小鼠)或仅盐水(对照组；10只小鼠)。在第0天，施用葡聚糖硫酸钠(DSS；2-3％)以诱导疾病。

每天对动物检查体重减轻、粪便稠度、腹泻和粪便中的血液。约第14天或如果动物病得很重(体重减轻>25％)则在任何时间处死动物。统计学：Mann-Whitney(精确)

DAI差异微小(p＝0.5386)。但是，这个临床指标并不非常充分适用于小鼠模型。结肠尺寸存在明显增加，反映炎症减少(p＝0.0011)。两个组之间未观察到体重的差异。但是，在第+3天和第+4天存在倾向性。对照组中在第+6天，粪便中出现血液，相比之下P140组中仅第+8天如此。

实施例7.P140磷酸肽在小鼠的屋尘螨提取物(HDM)所致嗜酸粒细胞性气道炎症31天模型中的作用。

这项研究的目的是在小鼠的HDM所致哮喘31天模型中评价全身施用(静脉内)的P140磷酸肽的作用。在无菌水(Braun)中溶解P140磷酸肽并且添加10x浓度的无菌盐水以调节克分子渗透压浓度至300mosm。克分子渗透压浓度用微量渗透计(型号15)控制并验证(303mosm)。P140磷酸肽以剂量4mg/kg通过静脉内(i.v.)途径体内使用。对照动物接受等同体积(2ml/kg)的盐水(表8)。

表8.

组编号	小鼠数目	处理	攻击(D28-D30)
				1	6	溶剂	盐水
2	5	P140(i.v.)4mg/kg	盐水
				3	8	溶剂	HDM
4	8	P140(i.v.)4mg/kg	HDM

通过鼻内(i.n.)施用HDM提取物(Stallergenes)，致敏9周龄雄性Balb/c小鼠：25μl盐水中第0、第1天、第2天、第3天、第4天1μg，以及第14天和第21天10μg。在第28天、第29天和第30天通过鼻内施用HDM(1μg)和/或盐水，攻击小鼠。在第25天通过静脉内注射(2ml/kg)P140或溶剂处理小鼠(参见图14)。

气道对乙酰甲胆碱的反应。在第31天，使用如(Daubeuf等人,Bioprotocol,645,2013)所述的受迫振动技术(SCIREQ，蒙特利尔，加拿大)评估气道对PBS随后乙酰甲胆碱的反应。通过以下方式麻醉小鼠：腹膜内注射赛拉嗪(1mg/kg)，十五分钟后接着腹膜内注射戊巴比妥钠(3.64mg/Kg)。暴露气管并将一根18号金属针头插入气管。将气道连接至计算机控制的小动物呼吸机，并且以潮气量10ml/kg按频率150次呼吸/分钟和呼气末正压2cm H₂O半正弦通气，以实现接近于自发呼吸的平均呼吸量。在基线测量后，用内嵌式雾化器生成并通过呼吸机直接施用的PBS气溶胶攻击每只小鼠10秒。随后，将雾化的乙酰甲胆碱(MCh)按50mg/ml施用10秒。将乙酰甲胆碱的作用计算为峰反应，即，为计算气道阻力(R，cm H₂O.s.mL^-1)、弹性模量(E，cm H₂O.mL^-1)和顺应性(C，mL.cm H₂O^-1)积分的三个最大值的均数。

在如所述那样HDM攻击后(Daubeuf等人,2012)，在气道反应性测量后二十四小时进行BAL。小鼠经IP(氯胺酮150mg/kg赛拉嗪10mg/kg)麻醉。从心脏采集血液，以10,000g离心2分钟并且在-20℃储存血清。

在气管半切除后，插入一根塑料导管，并用1ml注射器注射的0.5ml0.9％NaCl洗涤气腔。这个程序进行10次。采集前2次灌洗的初始浓缩上清液(体积＝施用2x0.5ml，回收大约0.5ml)供细胞因子测量。将剩余BAL液离心(300g 5分钟，4℃)，并汇集细胞沉淀物。将细胞沉淀物悬浮于500μl 0.9％NaCl中并且用于Cell Analyser(Millipore)上评价总细胞计数。通过流式细胞术(细胞仪，BD Bioscience)评估细胞分类计数。将BAL细胞随FCblock(0.5μl，553142，BD Bioscience)一起添加黑色微量平板中，在室温温育20分钟。随后，添加标志物抗体：CD11c-FITC(557400,BD bioscience)、Gr-1-PeeFluor610(61-5931-82,eBioscience)、F4/80-PE(12-4801-82,eBioscience)、CD11b-APC-Cy7(557657,BD bioscience)、CD45-AlexaFluor700(103128,BioLegend)、CD3-BV605(564009,BD bioscience)、CD19-PE-Cy7(552854,BD bioscience)。将抗体与BAL细胞在室温温育30分钟，之后添加DAPI(5μl，BD bioscience)，并且立即进行流式细胞术。

全部小鼠均在第0天、第1天、第2天、第3天、第4天、第14天、第21天针对HDM致敏并用盐水(慢性哮喘)或HDM(变应原攻击)攻击。结果展示为均数±SEM。对于炎性细胞，使用Student t检验并且对于气道反应，使用两因素ANOVA随后Bonferroni后检验，检验各组之间差异的统计显著性。当p≤0.05时，认为数据有显著差异。

表9.

慢性哮喘中的气道反应

在盐水攻击、溶剂处理的小鼠中，吸入PBS不影响通过技术评估的基线气道阻力、弹性模量和顺应性(图15A-C)。如与溶剂处理的小鼠相比，用P140(静脉内，4mg/kg，第25天)处理也不影响任何参数(图15A-C)。但是，在盐水攻击、溶剂处理的小鼠中，吸入乙酰甲胆碱(50mg/ml)引起明显的气道阻力和弹性模量增加，伴随顺应性下降(分别是图15A，B和C)。如与溶剂组相比，P140处理显著地降低弹性模量(-65％，*p<0.05)并增加气道顺应性(+115％，*p<0.05)(图15)，以及减少气道阻力(-42％)，不过并非显著减少(n＝5)。

变应原(HDM)攻击的小鼠中的气道反应

在HDM攻击、溶剂处理的小鼠中，吸入PBS不影响基线气道阻力、弹性模量和顺应性。与溶剂组相比，P140处理不影响致敏原攻击的小鼠中的气道阻力、弹性模量或顺应性。但是，在HDM攻击、溶剂处理的小鼠中，吸入乙酰甲胆碱显著地增加气道阻力和弹性模量，伴随顺应性下降(图15)。

慢性哮喘(HDM致敏、盐水攻击的小鼠)中的作用

溶剂处理的小鼠中盐水攻击时的BAL液中回收嗜酸性粒细胞(3.8x10⁵)、中性粒细胞(0.7x10⁵)、巨噬细胞(0.4x10⁵)、T淋巴细胞和B淋巴细胞(1.9x10⁵和0.3x10⁵)和树状细胞(0.2x10³)(图16)。如与溶剂组相比，P140处理(4mg/kg静脉内，第25天)显著地减少中性粒细胞(-71％，*p<0.05)的数目，以及嗜酸性粒细胞(-25％)和B细胞(-40％)的数目，不过并非显著，并且显著地增加巨噬细胞的数目4.5倍(*p<0.05)(图16)。

变应原攻击(HDM致敏和HDM攻击)的小鼠中的作用

如与慢性哮喘(盐水攻击)相比，HDM攻击的小鼠中，BAL液中回收的炎性细胞的数目显著地增加(图2)。这种作用与响应于HDM攻击的嗜酸性粒细胞(11.7x105，###p<0.001)、中性粒细胞(3.4，#p<0.05)、T细胞和B细胞(5.8x105和0.9x105，#p<0.05)内流明显增加相关(图16)。因此与溶剂组相比，在HDM攻击的小鼠中，P140处理显示不影响BAL中的炎性细胞召集。

这项研究的目的是在屋尘螨(HDM)提取物致敏的Balb/c小鼠的31天哮喘模型中评价全身施用时P140磷酸肽是否可能具有平喘作用。在HDM或盐水攻击之前2天，即，在评估气道对MCh的反应和支气管肺泡灌洗液中回收气道炎性细胞之前6天，在HDM致敏的小鼠中静脉内施用P140。

我们选择将本研究设计为令全部动物对HDM致敏，作为i)动物进一步遭受盐水攻击(HDM致敏、盐水攻击的小鼠)时的慢性哮喘模型，和ii)动物进一步遭受HDM攻击(HDM致敏、HDM攻击的小鼠)时，变应原攻击所致哮喘发作模型。因此，方案设计可以显示P140i)在日常慢性哮喘中，以及ii)在哮喘危象期间的作用。

在(HDM致敏和盐水攻击的)慢性哮喘小鼠中，乙酰甲胆碱引起作为气道阻力(R)和弹性模量(E)测量的气道阻塞大幅度增加，伴发气道顺应性下降(C)。如与我们用来观察对照、未致敏和未受攻击的Balb/c小鼠的正常值(基线R、E和C)相比，这些值表示这些慢性哮喘小鼠中存在气道高反应性。我们显示，如与溶剂处理组相比，P140处理显著地减少气道对MCh的反应，伴随气道弹性模量E显著减少和顺应性C增加，以及气道阻力R下降，尽管不明显。这提示P140降低在我们的过敏性慢性哮喘模型中观察到的气道高反应性。

此外在这项研究中，我们观察到P140处理影响慢性哮喘的气道中存在的炎症反应。我们的慢性哮喘模型以嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、树状细胞、T细胞和B细胞浸润为特征。如与溶剂处理的小鼠相比，P140处理引起支气管肺泡灌洗液中回收的中性粒细胞的数目显著减少，以及嗜酸性粒细胞和B细胞的数目减少，不过并非显著，并且引起巨噬细胞显著增加。哮喘称作嗜酸粒细胞性气道炎症。更重要地，将困难的未控制的哮喘描述为浸润的炎性细胞表型发生变化的气道炎性疾病，最重要地，中性粒细胞浸润气道的气道炎性疾病。这种表型经常抵抗糖皮质激素治疗。因此，随P140磷酸肽观察到的作用表明，P140在慢性哮喘中对气道高反应性以及气道炎症具有平喘潜力。

在不受任何具体理论约束的情况下，P140似乎增强哮喘的气道中存在的慢性炎症消散，尤其对于中性粒细胞是这样，伴随气道高反应性(其是哮喘患者中一个最无效症状)消散。在变应原攻击(HDM致敏和HDM攻击)的小鼠中，HDM引起气道高反应性和BAL中回收的气道炎性细胞浸润进一步增加。但是，P140处理几乎不影响这种变应原攻击诱导的气道对MCh高反应性增加，也不影响BAL中的炎性细胞召集。这表明在变应原攻击之前2天施用时，P140处理并不象阻断哮喘危象反应那样有力，不过在无HDM攻击的情况下，哮喘性气道反应性和炎症的基础水平降低。

在盐水攻击之前2天，全身性施用P140(4mg/kg静脉内)具有恢复基线气道反应性和使日常慢性哮喘中炎症消退的潜力。相比之下，在用于P140施用的条件下，即HDM攻击之前2天，P140不影响变应原攻击的结果，表明它既不改善，也未加重变应原在已致敏气道中的影响。在哮喘31天模型中测量的这类P140活性表明，P140可能在慢性哮喘中有效。增加P140处理和致敏原攻击之间的延迟在可能引起P140在哮喘中的活性增加。我们预计P140可以防止因反复接触变应原所致的气道高反应性以及气道炎症，即，使日常慢性哮喘的症状消退。

实施例8.p140肽对慢性炎症性脱髓鞘性多神经根神经病大鼠模型的影响

慢性炎症性脱髓鞘性多神经病(CIDP)是自身免疫介导的外周神经系统(PNS)炎性疾病，其疗法有限/缺少。最近，已经表征CIDP的一个新动物模型—慢性EAN(Brun S,BeainoW,Kremer L,Taleb O,Mensah-Nyagan AG,Lam CD,Greer JM,De Seze J和Trifilieff T(2015).Characterizaton a new rat model for chronic inflammatory demyelinatingpolyradiculoneuropathies.J.Neuroimmunol.278:1-10)。这个模型符合脱髓鞘伴轴突变性的电生理学标准，通过免疫组织化学确认。这种慢性病的晚期阶段以坐骨神经中IL 17细胞因子阳性细胞和巨噬细胞堆积和高血清IL 17水平为特征。它是可靠和可重复的CIDP动物模型，可以用于PNS和尤其CIDP的人类自身免疫介导慢性炎性疾病的转换性药物研究，对于所述疾病，存在新靶向免疫疗法的重大需求。因此，这项研究力图研究P140肽在这个新的CIDP临床前大鼠模型中的可能作用。

使用购自Charles River(Domaine des Oncins,L’Arbresle,法国)的雄性Lewis大鼠，7 8周龄，体重250 270g。为了诱导慢性EAN(CIDP)，在尾根通过皮下注射200μL含有200μg肽(Ac(palm)KRGRQTPVLYAMLDHSRS)和0.5mg结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)(菌株H37RA，Difco，底特律，密西根州，美国)的在100μL盐水溶液和100μL弗氏不完全佐剂(SIGMA-Aldrich，St-Quentin Fallavier，法国)中乳化的接种物，用S palmP0(180-199)肽免疫接种大鼠。

体重评分和临床评分每日评估直至免疫接种后60天(dpi)。如下评定轻瘫的严重程度：0＝无疾病；1＝尾软弱；2＝中度下肢轻瘫；3＝重度下肢轻瘫；4＝四肢轻瘫；5＝死亡。

使用总计15只大鼠并如下表中所示处理：

表10

小鼠编号	在第0天注射的乳液剂	名称	处理
				4	S-palm p0(180-189)+CFA	对照CIDP
7	S-palm p0(180-189)+CFA	处理的CIDP	P140

在免疫接种后第5天、第7天、第9天、第13天并且从免疫接种后第22天起每周3次腹腔内注射500μL水/盐水(1:10)中100μg/大鼠的P140肽直至研究结束。

a)细胞因子ELISA

将在免疫接种后第18天、第40天和第60天从处理的和未处理的大鼠采集血清。将使用大鼠IL-17特异的商业ELISA试剂盒(eBioscience,San Diego,CA,美国)，按照生产商的说明，在未稀释的血清中一式两份测量IL 17细胞因子的浓度。

b)抗体ELISA

还将在免疫接种后第18天、第40天和第60天，使用ELISA对来自处理的和未处理的大鼠的血清检验抗P0(180-199)抗体的存在。肽将按20μg/mL在0.05M碳酸盐-碳酸氢盐缓冲溶液(pH 9.6，100μL/孔)中包被到96孔板上并在4℃温育过夜。随后将用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤平板并在37℃用PBS中的1％牛血清白蛋白封闭1小时。在洗涤后，将一式两份添加按1/5000稀释的血清(100μL/孔)并且在37℃温育2小时。在洗涤后，平板将与偶联过氧化物酶的山羊抗大鼠IgG(1:2000，SIGMA--Aldrich)在37℃温育2小时。在充分洗涤后，每个孔将与75μL TMB在室温温育直至显色。将通过添加1M H₂SO₄(25μL/孔)终止反应。

c)免疫组织化学

为了评价在PNS中的炎性细胞浸润和病理学变化，处理的和未处理的大鼠将免疫接种后第60天处死。将用氯胺酮/Rompun深度麻醉大鼠并以4℃，PBS中的4％(v/v)多聚甲醛(PFA)心内灌注。将剖出坐骨神经和马尾，在Bouin中固定并包埋在石蜡中。

在脱蜡后，将在80℃在柠檬酸盐缓冲液中加热切片(5μm)10分钟。将用水中的0.02％H₂O₂抑制内源性过氧化物酶10分钟。非特异性结合位点将用PBS中的5％胎牛血清(Gibco Invitrogen,Camarillo,CA,美国)封闭30分钟并且随后用以下单克隆抗体封闭：针对髓鞘质的抗MBP(1:500；内部生产)；针对神经微丝的SMI 311(1:1000；Abcam，法国，巴黎)；针对巨噬细胞的ED1(1:400；Serotec，Oxford，UK)和抗白介素-17(IL 17；1:100；SantaCruz Biotechnology，Santa Cruz，CA，美国)。与组织切片结合的抗体将用生物素酰化的抗小鼠IgG(1:200；Vector Laboratories,Burlingame,CA,USA)和抗生物素蛋白-生物素(ABC过氧化物酶试剂盒；Vector Laboratories)可视化，随后用针对IL 17的DAB底物(DAB SK-4100,Vector Laboratories)和针对其他抗体的VIP底物(VIP SK-4600,Vector Laboratories)显色。

P140肽显示对CIDP大鼠中疾病严重程度的影响并且消除慢性化。为了研究P140肽对CIDP大鼠的影响，将动物在免疫接种后第5天、第7天、第9天、第13天并且从免疫接种后第22天起每周3次用P140(100μg/大鼠)腹腔内处理直至研究结束。图17A显示病程期间体重的演变，最大体重减轻对应于疾病的最大临床评分。与未处理的大鼠相比，治疗组中这种体重减轻较不明显。如图17B中所示，与未处理的大鼠相比，P140处理不仅延迟疾病发作并降低最大临床评分，还似乎消除疾病的慢性化。

实施例9.研究P140肽在MRL/lpr小鼠的Gougerot-综合征鼠模型中的作用(聚焦于唾液腺)

在这项研究中，使用MRL/lpr雌性11-12周龄小鼠，每组10只小鼠供统计分析。每只小鼠通过眶后接受单次注射9‰NaCl中100μl的100μg肽P140。在5天后，在肝素化管中采集小鼠血液并取出唾液腺(GSS)并置于含有pH 7.4PBS的微量离心管中。

已经在几种系统中研究了肽P140的作用。

外周血中研究细胞性质：根据供应商提供的方案(程序B)在3ml DAKO EasyLyse(ref S2364)中裂解300μl小鼠血液。在pH 7.4PBS-2％(v/v)胎牛血清中洗涤两次后，将细胞溶解于300μL相同的缓冲液中。随后在Malassez室上计数在土耳其蓝存在下细胞以分类计数白细胞，留下红细胞。我们推断细胞数目/ml血液，以在不同治疗组之间比较，旨在观察P140肽是否引起血液中白细胞的量变动。

准备器官低温恒温器

将唾液腺(SG)在PBS pH 7.4中洗涤并且随后置于专用于制备低温恒冷切片的杯中。将杯灌充“OCT”介质(Cell path，参考号03803126)直至组织被完全覆盖。随后将杯浸没于液氮中并且随后储藏在-80℃直至使用。

将组织切制成5微米冷冻切片。将切片留在室温过夜(12小时)。次日，将切片在100％丙酮中温育30分钟。切片随后可以储藏在-80℃供稍后使用。在免疫染色之前五分钟，则在pH 7.4PBS中再水化切片。

免疫染色：

方案如下：

在PBS-2％(w/v)BSA中温育切片30分钟

用切片PBS pH 7.4洗涤两次5分钟

稀释目的抗体，一般按1/200在PBS-2％BSA中稀释，并且在切片上在室温直接温育2小时(或在4℃过夜)

用pH 7.4PBS洗涤三次10分钟

用PBS中1/5000稀释的DAPI进行胞核染色15分钟

用pH 7.4PBS洗涤三次10分钟

用多聚甲醛(PFA)4％(v/v)固定切片20分钟。

除去过量PFA，随后在载玻片上用“DAKO封片剂”封闭盖玻片并且允许在室温遮光干燥2小时。

用显微镜可视化。

标出苏木精/伊红：

确定每只小鼠的病灶部位(FS)数目。将病灶定义为50个或更多个细胞的聚集物。

通过评分系统(0-3标度)半定量确定炎症SG的水平：0级：无炎性细胞；1级：少数血管周炎性和导管周围浸润(<100个细胞)；2级：中等数目的血管周炎性和导管周围浸润(100-500个细胞)；3级：广泛炎症伴炎性病灶宽阔(>500个细胞)。

通过流式细胞术研究唾液腺

荧光染色的总唾液腺的细胞用抗体在4℃标记40分钟，通过FACSCalibur采集数据。

表11

提供研究外周血中细胞性质的结果。

在切除后测量唾液腺的重量。DNA酶I(1mg/ml)和胶原蛋白酶D(50μg/ml)用来消化唾液腺。消化后评价总细胞计数。

在这个实验中，施用(一次单一静脉内注射)后5天评价小鼠，P140肽未统计学上显著地影响SG的重量(图18)。

通过流式细胞术研究唾液腺

P140处理(5天；一次单一静脉内注射)并未明显影响MRL/lpr小鼠的已处理SG中细胞的总数(图18)。

但是，当检查淋巴细胞亚群时，检测到P140肽对特定淋巴细胞亚群的影响。P140减少MRL/lpr小鼠的SG中的CD4⁺T细胞(但不减少CD8⁺T细胞)(图18)。在初步实验(未显示)中，我们观察到CD4+T细胞是SG中浸润的优势细胞亚群。这些T细胞主要地是βTCR+T细胞。P140肽未统计学上显著地影响B细胞总数。

以显微术研究唾液腺

对MRL/lpr小鼠(每组10只小鼠)注射肽P140(静脉内100μl/小鼠)。注射后五天，如上文所示处死小鼠并收集SG。将组织切制成5μm冷冻切片。切片用组织结构中最频繁使用的苏木精/伊红染色法标记。确定炎症水平和FS数目(图19和图20)。代表性照片来自样品对照组4和处理的样品组(标度500μm)。

结果显示，只要一次单一施用肽P140后5天，MRL/lpr小鼠的SG中的淋巴细胞浸润显著减少。

实施例10.类风湿性关节炎鼠模型中P140肽的作用。

类风湿性关节炎(RA)是侵袭关节的慢性炎性疾病。该疾病通过持续时间和强度不同的炎症暴发演变。尤其，它在掌和腕造成关节肿胀。可获得几个RA动物模型，通常为诱导型。以下报告描述了RA急性模型(即K/BxN小鼠模型)中获得的结果。已经在“治愈”方案和“预防”方案中测试P140在这个小鼠中的潜在作用。

表达KRN和MHC II类A^g7分子的TCR转基因小鼠(K/BxN小鼠)已经形成重度炎性关节炎。向健康受者小鼠施用这些小鼠的血清造成历经约15天的炎性关节炎，在注射后约第7天达到峰值。

进行两次来自K/BxN的小鼠血清施用(第0天和第2天)。在小鼠C57BL/6(或B6)中通过腹内(ip)注射进行血清(100μl/小鼠)的注射持续8周(n＝10)；未处理的小鼠(n＝10)。

P140肽(100μg/100μl；眶后静脉内)如下施用：

治愈性治疗：在第1天和第4天注射，以引导炎性疾病的最高状态。预防性治疗：在第-7天和第-2天注射。采血S0(在第0天)之后，每6天实施放血以处置血清。当炎症已经返回其基础水平至约第20日时，研究结束(参见图21)。

在炎症高峰期间，每天评价动物，并且建立关节的肿胀评分。该评分的范围从0至4并且基于动物的关节观察结果。在实施中，对每条腿给出这种评分(4个值)并且加总这些值以得到范围从0至16的总评分(图22)。

在这个实验中，疾病的诱导已经达到次优。我们没有观察到疾病的临床体征明显增加。

在第2天(注射K/BxN血清后二天，和第2次注射K/BxN血清当日)，P140NaCl处理的小鼠开始丢失体重(15％和10％)。从第5天起，动物开始重新增重：我们注意到在第5天和结束研究之间P140处理的小鼠增重20％，而对照小鼠增重超过5％。这两条曲线之间差异统计学上显著(两因素ANOVA)(图23)。

动物腿部尺寸的演变

右后腿：我们从第0天至第6天观察到后腿宽度增加，在第5-6天之间最大值为30％。从第6天起，这种增加逆转并且我们在约第10天观察到恢复正常。这两条曲线之间差异统计学上显著(两因素ANOVA)(图24)。

左后腿：我们观察到腿宽度增加约30％，约第5-6天达到最大，并且随后从第6天起逐渐地恢复正常。这两条曲线之间差异统计学上显著(两因素ANOVA)(图25)。

炎症评分演变

对于这个实验，独立地并且对每条腿(左后腿和右后腿)计算炎症评分。对于P140处理的小鼠或小鼠对照，评分最多仅超过1.5。^*对于处理的小鼠，在两因素ANOVA中，二条曲线不显示任何统计学上显著差异(图26)。

这个初步实验期间获得的结果已经让我们能够确定对设计后续实验将非常有用的某些重点：

1)炎症非常温和(腿尺寸微小增加、体重轻微减轻、评分很低的炎症)。血清K/BxN施用模式将从100μl血清连同50μl溶媒(NaCl)改变成无溶媒的100μl血清。

2)仅检查了动物的两只后爪。但是最终，观察到前腿受疾病影响最大。接下来，对于足部切片中测量的关节高度，将考虑动物的四条腿。

3)在接下来的实验中，将计算动物的总体炎症评分(增加四条腿的单独评分)。

预防性方案：动物体重的演变

对动物体重的分析显示P140处理的小鼠丢失5％重量并且对照小鼠丢失10％重量。这种体重减轻在起始阶段期间出现(第1天至第7天)。我们注意到与对照相比，处理小鼠略快地返回原始体重。但是，两条曲线之间无显著统计学上差异(两因素ANOVA)(图27)。

动物腿部尺寸的演变

右后腿：处理的小鼠中关节尺寸增加约12％并且对照小鼠中为约22％。关节尺寸的这种增加在第0天和第7天之间出现，之后逐渐地恢复正常。我们注意二条曲线中的轻微差异，但是无统计学上显著差异(两因素ANOVA)(图28)。

左后爪：处理的小鼠中关节大小增加约15％和对照小鼠当中约30％。这种增加在第0天和第7天之间出现，随后观察到恢复正常。我们观察到二条曲线的迟滞，但无统计学上差异意义(两因素ANOVA)(图29)。

右前腿：与后腿一样，对于处理的小鼠，炎症在第0天和第7天之间出现并且在第7天后恢复正常，显示右前腿关节中度肿胀(+20％)，而小鼠对照出现几乎45％的增加。两因素ANOVA中二条曲线之间的差异统计学上显著(p＝0.0069；**)(图30)。

如果曲线间不整体比较曲线，而通过配合炎症高峰(在第4天和第12天之间；图30和图33)逐日(非配对t检验)比较，我们观察到炎症最高峰(第7天)，对照比处理的小鼠更受疾病影响：p＝0.0037；**。

左前腿：处理的小鼠显示其关节尺寸增加20％，而小鼠对照为45％。两因素ANOVA中二条曲线之间的差异统计学上显著(两因素ANOVA-P＝0.0397；*)(图31)。我们还从左前腿关节尺寸的增长曲线了解炎症的构架。与先前曲线相比(图30)，它在约第3天和第10天之间。

我们注意在炎症高峰时(第7天)，更多对照小鼠比处理的小鼠受疾病的临床体征影响：p＝0.0064；**。以上表述(图31和图34)每日比较了相比于对照，处理小鼠的左前腿尺寸的增长(非配对t检验)。

炎症评分演变

独立计算每条腿(左后腿和右后腿及左前腿和右前腿)的炎症评分并且随后加总以获得每只小鼠的总体炎症评分(图32)。对照小鼠的评分约第7天到最大值，而处理的小鼠不超过第5天。第4天至第12天在代表炎症消散评分的两条曲线上实现了该构架(图32和图35)。两个曲线有显著差异：p＝0.0156；*(两因素ANOVA)(图32)。

在这项研究中，展示了P140肽在模拟RA的K/BxN模型中的重要作用。全部临床体征(肿胀关节、体重减轻和炎症出现评分)倾向于减弱。

在预防模型中并且以统计学上显著方式，我们发现：处理的小鼠体重减轻较少并且较快恢复正常；爪中炎症和其变形限制较少；它们炎症评分的在炎症处于最大时急剧下降。

对于治愈模型，鉴于疾病的诱导已经非常温和或甚至为零，我们不能就肽P140的作用得出结论。

在某些方面，本说明书提供一种组合物，其包含有效量的至少一种选自SEQ IDNO:1、2、4、5及其组合的肽，其中所述肽中的至少一个丝氨酸磷酸化，用于治疗或缓解慢性炎性疾病或过度自噬相关的免疫性疾病或病症的症状，其中将组合物施用至需要这种治疗的患者并且其中组合物有效治疗或缓解疾病或病症的至少一种症状。

在某些方面，本说明书提供一种组合物，其包含有效量的至少一种选自SEQ IDNO:1、2、4、5及其组合的肽，其中所述肽中的至少一个丝氨酸磷酸化，用于治疗或缓解慢性炎性疾病或过度自噬相关的免疫性疾病或病症的症状的方法中，其中所述方法包括将组合物施用至需要这种治疗的患者并且其中组合物有效治疗或缓解疾病或病症的至少一种症状。

在某些方面，说明书提供有效量的至少一种肽选自SEQ ID NO:1、2、4、5及其组合的用途，其中所述肽中的至少一个丝氨酸磷酸化，用于制备供治疗或缓解慢性炎性疾病或过度自噬相关的免疫性疾病或病症的症状的药物，其中将组合物施用至需要这种治疗的患者并且其中组合物有效治疗或缓解疾病或病症的至少一种症状。

在本文所述的任何方面或实施方案中，过度自噬相关的免疫性疾病或病症是过度的伴侣蛋白介导的自噬(CMA)相关的疾病或病症。

在任何方面或实施方案中，CMA相关的疾病或病症选自类风湿性关节炎(RA)、多发性硬化(MS)、类风湿性关节炎(RA)、肌营养不良(MD)、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、神经精神性狼疮、Crohn病(CD)、慢性炎症性脱髓鞘性多神经根神经病(CIDP)、纤维肌痛、II型糖尿病、多发性肌炎、肺病和慢性免疫性血小板减少症(ITP)。

在本文所述的任何方面或实施方案中，药物组合物按约100ng至约5mg的剂量施用。

在本文所述的任何方面或实施方案中，药物组合物包含如本文所述的冻干肽和可药用赋形剂。在本文所述的任何方面或实施方案中，赋形剂是甘露糖醇。

在本文所述的任何方面或实施方案中，肽具有以下结构：

在本文所述的任何方面，肽具有以下结构：

尽管已经本文中显示并描述了本发明的优选实施方案，但应当理解这类实施方案仅以示例方式提供。本领域技术人员将想到众多变型、变化和替换，而不脱离本发明的精神。因此，意图是所附权利要求书覆盖全部这类变型，因为其落于本发明的精神和范围内。

本申请通篇范围内引用的全部参考文献、专利、待决专利申请和已公开专利的内容因而通过引用的方式明确并入。

利用不超出常规的实验，本领域那些普通技术人员会认识到，或将能够确定与本文中所述的本发明具体实施例的许多等同物。此类等同物意在由以下权利要求书涵盖。可以理解，本文所述的详述示例和实施方案以举例方式给出仅供说明目的，并且无论如何不视为限制本发明。在其影响下的多种修改或改变将会启发本领域技术人员并且纳入本申请的精神与权限范围内并视为处于所附权利要求书的范围内。例如，可以变动成分的相对量以优化所需的作用，可以添加额外成分，和/或可以将相似成分替换一种或多种描述的成分。与本发明系统、方法和过程相关的额外的有利特征和官能团将从所附权利要求书显而易见。另外，利用不超出常规的实验，本领域那些普通技术人员会认识到或将能够确定与本文中所述的本发明具体实施例的许多等同物。此类等同物意在由以下权利要求书涵盖。

序列表

<110> 国家科研中心

安姆弗拉玛法国股份公司

S·穆勒

J-P·布里安德

R·H·齐默

<120> 修饰的肽及其治疗慢性炎性疾病的用途

<130> 62/091,379

<131> 2014年12月14日

<160> 6

<170> PatentIn 版本 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> derived from U1 snRNP 70 kDa

<400> 1

Arg Ile His Met Val Tyr Ser Lys Arg Ser Gly Lys Pro Arg Gly Tyr

1 5 10 15

Ala Phe Ile Glu Tyr

20

<210> 2

<211> 20

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> derived from U1 snRNP 70 kDa

<400> 2

Ile His Met Val Tyr Ser Lys Arg Ser Gly Lys Pro Arg Gly Tyr Ala

1 5 10 15

Phe Ile Glu Tyr

20

<210> 3

<211> 437

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3

Met Thr Gln Phe Leu Pro Pro Asn Leu Leu Ala Leu Phe Ala Pro Arg

1 5 10 15

Asp Pro Ile Pro Tyr Leu Pro Pro Leu Glu Lys Leu Pro His Glu Lys

20 25 30

His His Asn Gln Pro Tyr Cys Gly Ile Ala Pro Tyr Ile Arg Glu Phe

35 40 45

Glu Asp Pro Arg Asp Ala Pro Pro Pro Thr Arg Ala Glu Thr Arg Glu

50 55 60

Glu Arg Met Glu Arg Lys Arg Arg Glu Lys Ile Glu Arg Arg Gln Gln

65 70 75 80

Glu Val Glu Thr Glu Leu Lys Met Trp Asp Pro His Asn Asp Pro Asn

85 90 95

Ala Gln Gly Asp Ala Phe Lys Thr Leu Phe Val Ala Arg Val Asn Tyr

100 105 110

Asp Thr Thr Glu Ser Lys Leu Arg Arg Glu Phe Glu Val Tyr Gly Pro

115 120 125

Ile Lys Arg Ile His Met Val Tyr Ser Lys Arg Ser Gly Lys Pro Arg

130 135 140

Gly Tyr Ala Phe Ile Glu Tyr Glu His Glu Arg Asp Met His Ser Ala

145 150 155 160

Tyr Lys His Ala Asp Gly Lys Lys Ile Asp Gly Arg Arg Val Leu Val

165 170 175

Asp Val Glu Arg Gly Arg Thr Val Lys Gly Trp Arg Pro Arg Arg Leu

180 185 190

Gly Gly Gly Leu Gly Gly Thr Arg Arg Gly Gly Ala Asp Val Asn Ile

195 200 205

Arg His Ser Gly Arg Asp Asp Thr Ser Arg Tyr Asp Glu Arg Pro Gly

210 215 220

Pro Ser Pro Leu Pro His Arg Asp Arg Asp Arg Asp Arg Glu Arg Glu

225 230 235 240

Arg Arg Glu Arg Ser Arg Glu Arg Asp Lys Glu Arg Glu Arg Arg Arg

245 250 255

Ser Arg Ser Arg Asp Arg Arg Arg Arg Ser Arg Ser Arg Asp Lys Glu

260 265 270

Glu Arg Arg Arg Ser Arg Glu Arg Ser Lys Asp Lys Asp Arg Asp Arg

275 280 285

Lys Arg Arg Ser Ser Arg Ser Arg Glu Arg Ala Arg Arg Glu Arg Glu

290 295 300

Arg Lys Glu Glu Leu Arg Gly Gly Gly Gly Asp Met Ala Glu Pro Ser

305 310 315 320

Glu Ala Gly Asp Ala Pro Pro Asp Asp Gly Pro Pro Gly Glu Leu Gly

325 330 335

Pro Asp Gly Pro Asp Gly Pro Glu Glu Lys Gly Arg Asp Arg Asp Arg

340 345 350

Glu Arg Arg Arg Ser His Arg Ser Glu Arg Glu Arg Arg Arg Asp Arg

355 360 365

Asp Arg Asp Arg Asp Arg Asp Arg Glu His Lys Arg Gly Glu Arg Gly

370 375 380

Ser Glu Arg Gly Arg Asp Glu Ala Arg Gly Gly Gly Gly Gly Gln Asp

385 390 395 400

Asn Gly Leu Glu Gly Leu Gly Asn Asp Ser Arg Asp Met Tyr Met Glu

405 410 415

Ser Glu Gly Gly Asp Gly Tyr Leu Ala Pro Glu Asn Gly Tyr Leu Met

420 425 430

Glu Ala Ala Pro Glu

435

<210> 4

<211> 21

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> derived from U1 snRNP 70 kDa

<220>

<221> MOD_RES

<222> (4)..(4)

<223> OXIDATION

<220>

<221> MOD_RES

<222> (10)..(10)

<223> PHOSPHORYLATION

<400> 4

Arg Ile His Met Val Tyr Ser Lys Arg Ser Gly Lys Pro Arg Gly Tyr

1 5 10 15

Ala Phe Ile Glu Tyr

20

<210> 5

<211> 20

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<220>

<223> derived from U1 snRNP 70 kDa

<220>

<221> MOD_RES

<222> (3)..(3)

<223> OXIDATION

<220>

<221> MOD_RES

<222> (9)..(9)

<223> PHOSPHORYLATION

<400> 5

Ile His Met Val Tyr Ser Lys Arg Ser Gly Lys Pro Arg Gly Tyr Ala

1 5 10 15

Phe Ile Glu Tyr

20

<210> 6

<211> 66

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> derived from U1 snRNP 70 kDa

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(3)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (15)..(15)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (21)..(21)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (27)..(27)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (30)..(30)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (33)..(33)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (39)..(39)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (42)..(42)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (45)..(45)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (51)..(51)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 6

mgnathcaya tggtntayws naarmgnwsn ggnaarccnm gnggntaygc nttyathgar 60

taytrr 66

Claims (19)

1.一种组合物，包含有效量的至少一种选自SEQ ID NO:1、2、4、5及其组合的肽，其中所述肽中的至少一个丝氨酸被磷酸化，用于治疗或缓解过度自噬相关的免疫性疾病或病症的症状，其中将组合物施用至需要这种治疗的患者并且组合物有效治疗或缓解所述疾病或病症的至少一种症状。

2.根据权利要求所述1的组合物，其中过度自噬相关的免疫性疾病或病症是过度的伴侣蛋白介导的自噬(CMA)相关的疾病或病症。

3.根据权利要求1或2中任一项所述的组合物，其中CMA相关的疾病或病症选自类风湿性关节炎(RA)、多发性硬化(MS)、类风湿性关节炎(RA)、肌营养不良(MD)、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、神经精神性狼疮、Crohn病(CD)、慢性炎症性脱髓鞘性多神经根神经病(CIDP)、纤维肌痛、I型糖尿病、多发性肌炎、肺病和慢性免疫性血小板减少症(ITP)。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中所述免疫性疾病选自MD、CD、RA和MS。

5.根据权利要求3所述的组合物，其中所述免疫性疾病是纤维肌痛。

6.根据权利要求3所述的组合物，其中所述免疫性疾病是RA。

7.根据权利要求3所述的组合物，其中所述免疫性疾病是MS。

8.根据权利要求3所述的组合物，其中所述免疫性疾病是MD。

9.根据权利要求3所述的组合物，其中所述免疫性疾病是COPD。

10.根据权利要求3所述的组合物，其中所述免疫性疾病是CIDP。

11.根据权利要求3所述的组合物，其中所述免疫性疾病是CD。

12.根据权利要求3所述的组合物，其中所述免疫性疾病是I型糖尿病。

13.根据权利要求1-12中任一项所述的组合物，其中药物组合物按约100ng至约5mg的剂量施用。

14.根据权利要求1-13中任一项所述的组合物，其中所述药物组合物包含冻干的根据权利要求1所述的肽和可药用赋形剂。

15.根据权利要求14所述的组合物，其中赋形剂是甘露糖醇。

16.根据权利要求1-15所述的组合物，其中肽是在位置10处包含磷酸丝氨酸的SEQ IDNO:1。

17.根据权利要求1-16所述的组合物，其中肽是在位置10处包含磷酸丝氨酸并包含被氧化的甲硫氨酸的SEQ ID NO:1。

18.根据权利要求1-16中任一项所述的组合物，其中肽具有以下结构：

19.根据权利要求1-17中任一项所述的组合物，其中肽具有以下结构：