CN112159460B

CN112159460B - 一种拟穴青蟹抗菌肽Spamprin4-23及其应用

Info

Publication number: CN112159460B
Application number: CN202011056725.4A
Authority: CN
Inventors: 王克坚; 朱学武; 陈芳奕; 陈慧芸; 彭会; 李双
Original assignee: Xiamen University
Current assignee: Xiamen University
Priority date: 2020-09-29
Filing date: 2020-09-29
Publication date: 2021-12-17
Anticipated expiration: 2040-09-29
Also published as: CN112159460A

Abstract

本发明公开了一种拟穴青蟹抗菌肽Spamprin_4‑23及其应用，该抗菌肽的分子式为C₉₄H₁₅₄N₄₁O₂₇S₁，氨基酸序列为SEQ ID NO.01。本发明的拟穴青蟹抗菌肽Spamprin_4‑23，具有较强的抗细菌活性及抗真菌活性，抗菌效果好，抗菌谱广，杀菌速率快，其来源于甲壳动物，可作为有效成分应用于水产饲料添加剂、防霉防腐药物、抗菌药物之中，具有广泛的应用前景。

Description

一种拟穴青蟹抗菌肽Spamprin4-23及其应用

技术领域

本发明属于海洋分子生物学技术领域，具体涉及一种拟穴青蟹抗菌肽Spamprin_4-23及其应用。

背景技术

拟穴青蟹(Scylla paramamosain)，简称青蟹，是我国东南沿海重要的经济养殖蟹类。青蟹早期发育阶段尤其是幼龄期可能存在一段“危险期”，即母源抗性因子的耗尽而青蟹幼体自身免疫功能还未健全，此时青蟹幼体与自然环境中众多的微生物接触，容易受到外界微生物的侵染而导致大量死亡。故青蟹幼体阶段是其存活的关键阶段，在此阶段机体的模式识别受体(pattern recognition receptor,PRRs)与病原菌表面相关分子结合，促进抗菌肽的合成，来防御病原微生物的入侵。抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs)也称为天然抗生素，是生物体内天然存在的具有抗菌活性的小分子肽，是虾、蟹、贝类等无脊椎动物先天性免疫系统中的重要效应分子，在抵抗病原微生物感染方面发挥着至关重要的作用。故本实验通过LPS和解藻弧菌分别对青蟹幼体阶段进行人工感染，观察青蟹早期不同发育阶段相应的免疫应答变化，从转录组数据库中筛选未知免疫相关因子，从蛋白水平上鉴定其免疫方面的功能。

抗菌肽是一类广泛存在于自然界生物体中的小分子肽物质。其中大部分属于阳离子抗菌肽，只有少部分属于阴离子抗菌肽。尽管抗菌肽的长度、氨基酸组成和二级结构各不相同，但其都具有适合与膜结合的两亲性结构。抗菌肽在生物体内，除了具有抗菌功能外，还能够通过不同的途径调节机体的免疫反应，因此它们是机体先天性免疫系统中的重要组分。由于抗菌肽可以通过使用多种机理杀灭微生物，不易使病原菌产生耐药性，所以它们被视为抗生素的最佳替代品。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了一种拟穴青蟹抗菌肽Spamprin_4-23及其应用，该拟穴青蟹抗菌肽Spamprin_4-23具有较强的抗细菌活性及抗真菌活性和广泛的应用。

本发明的技术方案之一是：提供了一种拟穴青蟹抗菌肽Spamprin_4-23，其氨基酸序列为：

Ala-His-Cys-Gln-Thr-Arg-Arg-Thr-Ala-Ser-Ser-Pro-Arg-Trp-Ser-Arg-His-Arg-Gly-Ala

(SEQ ID NO.01)。

本发明的技术方案之二是：提供了上述的一种拟穴青蟹抗菌肽Spamprin_4-23在制备抗菌药物中的应用。

本发明的技术方案之三是：提供了一种抗菌药物，其有效成分包括拟穴青蟹抗菌肽 Spamprin_4-23，所述拟穴青蟹抗菌肽Spamprin_4-23的氨基酸序列为SEQ ID NO.01。该抗菌药物用于抑制和/或杀灭革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。

本发明的技术方案之四是：提供了一种拟穴青蟹抗菌肽Spamprin_4-23在制备防霉防腐药物中的应用。

本发明的技术方案之五是：提供了一种防霉防腐药物，其有效成分包括拟穴青蟹抗菌肽 Spamprin_4-23，所述拟穴青蟹抗菌肽Spamprin_4-23的氨基酸序列为SEQ ID NO.01。该防霉防腐药物用于抑制和/或杀灭黑曲霉、赭曲霉、尖孢镰孢、腐皮镰孢。

本发明的技术方案之六是：提供了一种拟穴青蟹抗菌肽Spamprin_4-23在制备水产饲料添加剂中的应用。

本发明的技术方案之七是：提供了一种水产饲料添加剂，其有效成分包括拟穴青蟹抗菌肽 Spamprin_4-23，所述拟穴青蟹抗菌肽Spamprin_4-23的氨基酸序列为SEQ ID NO.01。该水产饲料添加剂用于抑制和/或杀灭细菌和丝状真菌。

本技术方案与背景技术相比，它具有如下优点：

1.本发明的拟穴青蟹抗菌肽Spamprin_4-23由20个氨基酸组成，分子式为C₉₄H₁₅₄N₄₁O₂₇S₁，分子量为2321.56道尔顿，根据氨基酸残基电荷预测该抗菌肽等电点为12.18，亲水性平均系数为-1.56，具有很强的水溶性，是一种带有正电荷的阳离子肽。

2、本发明的拟穴青蟹抗菌肽Spamprin_4-23对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、丝状真菌均有显著的抗菌效果。

3、本发明的拟穴青蟹抗菌肽Spamprin_4-23，具有较强的抗细菌活性及抗真菌活性，抗菌效果好，抗菌谱广，杀菌速率快，并且对拟穴青蟹血细胞无毒性效果。

附图说明

图1为拟穴青蟹抗菌肽Spamprin_4-23对施氏假单胞菌的杀菌动力学图；在图1中，横坐标为时间(min)，纵坐标为杀菌指数(％)。

图2至图4为拟穴青蟹抗菌肽Spamprin_4-23抑制霉菌孢子萌发实验图：其中，图2为尖孢镰孢菌，图3为腐皮镰孢菌，图4为黑曲霉。上述Spamprin_4-23终浓度为A：0μM；B：1.5μM；C：3μM；D：6μM；E：12μM；F：24μM；G：48μM；H：96μM。

图5为拟穴青蟹抗菌肽Spamprin_4-23与施氏假单胞菌作用后扫描电镜观察图；其中，A：施氏假单胞菌；B：施氏假单胞菌+12μM Spamprin_4-23；C：施氏假单胞菌+24μMSpamprin_4-23。

图6为拟穴青蟹抗菌肽Spamprin_4-23与腐皮镰孢孢子作用后扫描电镜观察图；其中，A：尖孢镰孢；B：尖孢镰孢+12μM Spamprin_4-23；C：尖孢镰孢+24μM Spamprin_4-23。

图7为MTS-PMS法检测拟穴青蟹抗菌肽Spamprin_4-23细胞毒性实验图；其中，横坐标为 Spamprin_4-23蛋白浓度(μM)，纵坐标为细胞增殖率(％)。

具体实施方式

实施例1

本实施例一种拟穴青蟹抗菌肽Spamprin_4-23的氨基酸序列为：

Ala-His-Cys-Gln-Thr-Arg-Arg-Thr-Ala-Ser-Ser-Pro-Arg-Trp-Ser-Arg-His-Arg-Gly-Ala

(SEQ ID NO：01)。

采用现有的固相化学合成的方法即可得到纯度达95％以上拟穴青蟹抗菌肽Spamprin_4-23。本实施例中的拟穴青蟹抗菌肽Spamprin_4-23委托金斯瑞(上海)有限公司以固相合成方法合成获得，并提供肽分子量、HPLC等检测信息。

抗菌肽Spamprin_4-23理化参数如表1所示。

表1抗菌肽Spamprin_4-23理化参数

由表1可知Spamprin_4-23分子量小、稳定性较好，具有较强的水溶性，是一种带有正电荷的阳离子肽。

一、拟穴青蟹抗菌肽Spamprin_4-23最小抑菌浓度(MIC：Minimum InhibitionConcentration)和最小杀菌浓度(MBC：Minimum Bactericidal Concentration)的测定

所涉及到的菌株有：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas Aeruginosa)、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)、弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri)、荧光假单胞菌 (Pseudomonas fluorescens)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、尖孢镰孢(Fusarium oxysporum)、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)、赭曲霉(Aspergillus ochraceus)、腐皮镰孢(Fusarium solani)。菌株均购自中国科学院微生物研究所菌种保藏中心，由本实验室保种贮藏。

具体方法如下：

(1)将保种的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒状杆菌、溶壁微球菌、大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、施氏假单胞菌、弗氏志贺氏菌、荧光假单胞菌涂布于营养肉汤平板上，在各适宜温度倒置培养18-24h；新型隐球菌涂布于YPD平板上，于28℃倒置培养1-3d；尖孢镰孢、烟曲霉、赭曲霉、腐皮镰孢孢子涂布于马铃薯葡萄糖平板上，于28℃倒置培养3-7d。

(2)从各平板上挑取菌落接种于相应的培养基斜面上，细菌继续培养18-24h，酵母真菌继续培养1-3d，霉菌继续培养3-7d。用10mM磷酸钠缓冲液(pH＝7.4)将细菌、弧菌和酵母真菌从斜面上冲下，调整菌悬液浓度。用MH液体培养基和磷酸钠缓冲液混合液稀释细菌；用 YPD液体培养基和磷酸钠缓冲液混合液稀释酵母真菌。用10mM磷酸钠缓冲液(pH＝7.4)将霉菌孢子从斜面上冲下，用马铃薯葡萄糖液体培养基和磷酸钠缓冲液混合液稀释孢子，利用血球计数板在光学显微镜下对孢子计数，调整孢子浓度，使得霉菌孢子最终浓度为5×10⁴个/mL。

(3)将已合成的Spamprin_4-23粉末分别用灭菌MiliiQ水溶解，经过0.22μm滤膜过滤后，倍比稀释蛋白浓度至1.5μM、3μM、6μM、12μM、24μM、48μM、96μM，置于冰上备用。

(4)在96孔细胞培养板上，每种待测菌设置空白对照组、阴性对照组和待测实验组，每组设置三个平行：

a空白对照组：50μL待测蛋白样品和50μL培养基

b阴性对照组：50μL无菌Milli-Q水和50μL菌悬液

c待测实验组：50μL待测蛋白样品和50μL菌悬液

(5)将96孔细胞培养板置于28℃培养箱中，培养1-2d，观察待测实验组中MIC结果；将待测实验组吹打混匀后，吸取适量的菌液滴于相应固体培养基平板上，于适宜温度倒置培养 1-2d，观察MBC结果。

拟穴青蟹抗菌肽Spamprin_4-23 MIC、MBC观察结果如表2所示：

表2拟穴青蟹抗菌肽Spamprin_4-23的抗菌活性

注：MIC：最小抑菌浓度(μM)，用a-b表示。a：肉眼可见菌体生长的最高蛋白浓度；b：肉眼未见菌体生长的最低蛋白浓度

MBC：最小杀菌浓度(μM)，用a-b表示。a：平板可见菌落生长的最高蛋白浓度；b：平板未见菌落生长的最低蛋白浓度。

二、拟穴青蟹抗菌肽Spamprin4-23杀菌动力学曲线

选取施氏假单胞菌作为待测菌，对拟穴青蟹抗菌肽Spamprin_4-23的杀菌动力学进行测定。

具体方法如实施例2中所述的抗菌活性测定类似。调整Spamprin_4-23终浓度为(12μM)。在共孵后5min、10min、20min、30min、45min、60min，将96孔细胞培养板取空白对照组、阴性对照组、待测实验组混匀，吸取6μL施氏假单胞菌菌悬液稀释至600μL DPBS中，混匀后吸取40μL涂布至营养肉汤平板上，37℃倒置培养1-2d，记录施氏假单胞菌单克隆数量，计算杀菌指数。

杀菌指数是指经过一定时间共孵后，待测实验组的克隆数与阴性对照组克隆数的比值，用百分比表示(参见图1)。

三、拟穴青蟹抗菌肽Spamprin_4-23作用后霉菌孢子萌发的光学显微镜观察

选取尖孢镰孢、黑曲霉、腐皮镰孢作为待测菌，观察拟穴青蟹抗菌肽Spamprin_4-23对各霉菌孢子萌发的影响。

具体方法如一中所述的抗菌活性测定类似。调整Spamprin_4-23蛋白浓度为1.5μM、3μM、6 μM、12μM、24μM、48μM、96μM，置于冰上备用；调整各霉菌孢子最终浓度为5×10⁴个/mL。将等体积各浓度Spamprin_4-23与各霉菌孢子于96孔细胞培养板混匀，置于28℃培养箱中，静置培养24h，在光学显微镜下观察霉菌孢子萌发情况(参见图2-4)。

四、拟穴青蟹抗菌肽Spamprin_4-23与细菌、真菌孢子作用后的扫描电镜观察

选取施氏假单胞菌、尖孢镰孢作为待测菌株，扫描电镜样品的制备按以下步骤进行：

(1)如实施例2所述制备施氏假单胞菌(OD₆₀₀＝0.2)，制备尖孢镰孢孢子悬液(5×10⁶个 /mL)，冰上放置备用。

(2)用灭菌纯水溶解合成肽Spamprin_4-23，并调整蛋白浓度为12μM、24μM，冰上放置备用。

(3)悬液和蛋白等体积混合后在适宜温度孵育适宜时间。

(4)加入等体积戊二醛固定液，4℃固定2h后，1000g离心10min。

(5)去尽上清，PBS清洗一次，1000g离心10min。

(6)去除大部分上清，留约10μL液体，将剩余悬液滴在玻片上，4℃静置过夜。

(7)PBS清洗一次。

(8)30％－50％－70％－80％－90％－95％－100％－100％(v/v)乙醇逐级脱水，每级脱水15 min。

(9)用叔丁醇置换乙醇，4℃过夜冷冻；或者醋酸异戊酯置换乙醇后待干燥。

(10)叔丁醇脱水的用冷冻干燥仪冷冻干燥；醋酸异戊酯脱水的用临界点干燥仪干燥。

(11)喷金后用扫描电子显微镜观察及拍照。(参见图5和图6)

五、拟穴青蟹抗菌肽Spamprin_4-23细胞毒性测定

选取正常拟穴青蟹血细胞，对拟穴青蟹抗菌肽Spamprin_4-23细胞毒性进行测定。

(1)收集生长状态良好的拟穴青蟹血细胞，调整细胞浓度为1×10⁵个/mL，将细胞均匀吹散，在96孔细胞培养板中每孔加入100μL细胞悬液，置于适宜温度培养箱培养至80％以上细胞贴壁。

(2)小心吸出培养基，加入含有不同浓度(0μM、3μM、6μM、12μM、24μM、48μM、 96μM)Spamprin_4-23的培养基，置于适宜温度培养箱培养24h。

(3)加入20μL MTS-PMS溶液后避光孵育2h后，使用酶标仪测得OD₄₉₂值，评价Spamprin_4-23的细胞毒性(参见图7)。

本发明的拟穴青蟹抗菌肽Spamprin_4-23具有较强的抗细菌活性及抗真菌活性，抗菌效果好，抗菌谱广，杀菌速率快，其来源于甲壳动物，可作为有效成分应用于水产饲料添加剂、防霉防腐药物、抗菌药物中。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

序列表

<110> 厦门大学

<120> 一种拟穴青蟹抗菌肽Spamprin<sub>4-23</sub>及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> PRT

<213> 拟穴青蟹(Scylla paramamosain)

<400> 1

Ala His Cys Gln Thr Arg Arg Thr Ala Ser Ser Pro Arg Trp Ser Arg

1 5 10 15

His Arg Gly Ala

20

Claims

1.一种拟穴青蟹抗菌肽Spamprin_4-23，其特征在于：其氨基酸序列为SEQ ID NO.01。

2.如权利要求1所述的一种拟穴青蟹抗菌肽Spamprin_4-23在制备抗菌药物中的应用。

3.一种抗菌药物，其特征在于：其有效成分包括拟穴青蟹抗菌肽Spamprin_4-23，所述拟穴青蟹抗菌肽Spamprin_4-23的氨基酸序列为SEQ ID NO.01。

4.如权利要求1所述的一种拟穴青蟹抗菌肽Spamprin_4-23在制备水产饲料添加剂中的应用。

5.一种水产饲料添加剂，其特征在于：其有效成分包括拟穴青蟹抗菌肽Spamprin_4-23，所述拟穴青蟹抗菌肽Spamprin_4-23的氨基酸序列为SEQ ID NO.01。