CN102167736A - 一种拟穴青蟹抗菌肽Sphistin及其应用 - Google Patents

Abstract

一种拟穴青蟹抗菌肽Sphistin及其应用。涉及甲壳类动物基因工程技术领域，提供一种拟穴青蟹抗菌肽Sphistin及其应用。所述拟穴青蟹抗菌肽Sphistin的分子式为C₁₇₀H₂₉₃N₆₁O₄₆S₁，分子量为3959.61道尔顿。由38个氨基酸组成，来源于拟穴青蟹组蛋白Histone 2A蛋白的N端部分序列，是一种具有抗菌功能的多肽。采用现有的固相化学合成的方法即可获得纯度达95％以上拟穴青蟹抗菌肽Sphistin。所述拟穴青蟹抗菌肽Sphistin对多种革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌有显著的抗菌效果，抗菌谱宽、杀菌速率快，显示出极大的医用价值，在制备抗菌剂方面具有良好的应用。

Description

一种拟穴青蟹抗菌肽Sphistin及其应用

技术领域

本发明涉及甲壳类动物基因工程技术领域，特别涉及一种拟穴青蟹抗菌肽Sphistin及其应用。

背景技术

近年来，随着世界人口的快速增长，以及人们对水产品消费水平的提高，水产业得到迅速发展，但是高密度养殖却引起水产动物病害的频繁发生，有些病害甚至对水产业造成毁灭性打击。在对病害防治途径的探索中，传统抗生素引起致病菌的抗药性和对环境的负面作用，使其面临严重挑战，其应用越来越受到限制。由于抗菌肽具有特异杀灭病原微生物，不会使病原菌产生抗药性，也不会污染环境等优点，因而越来越受到人们的重视，在水产养殖动物病害防治中展现出重要应用潜力。

抗菌肽是动物免疫防御系统产生的一类对外源性致病微生物具有免疫活性的多肽物质，是动物非特异性免疫防御系统的一个重要组成部分。从1981年开始，人们相继从细菌、真菌、两栖类、昆虫、高等植物、哺乳动物乃至人类中发现并分离获得具有抗菌活性的多肽。抗菌肽作为新型杀菌物质的突出特点是分子量小，活性强，功能广泛，具有广谱杀菌作用。抗菌肽可组成性表达，如人的β防御素1(Human beta defensins，HBD)；亦可在创伤或感染后诱导表达，如LL237，HBD22，HBD23，HBD24等。已经发现的大多数抗菌肽对革兰氏阳性菌有较强的杀灭作用，有的则对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌都有作用。随着人们研究工作的深入开展，发现某些抗细菌肽对部分真菌、原虫、病毒及癌细胞等均具有强有力的杀伤作用。某些抗菌肽甚至有抗病毒活性，如抗人类HIV病毒、抗沙眼衣原体病毒等，能破坏肿瘤细胞的细胞膜并选择性地杀伤肿瘤细胞。

组蛋白histone是存在于真核细胞核内的一类碱性蛋白质。易溶于水和稀酸，在稀氨水中沉淀。含精氨酸和赖氨酸比例很高，在细胞核中与脱氧核糖核酸紧密结合，形成球形的核小体结构，是染色质的基本结构。维持其特定的立体结构，使大量遗传信息压缩在细胞核内。1958年小牛胸腺组蛋白的抗菌活性首次得到证实(1、Hirsch JG.Bactericidal action of histone.JExp Med 1958；108：925-944.)，Buforin I是第一个报道的源于Histone2A的抗菌肽(2、Park CB，Kim MS，Kim SC.A novel antimicrobial peptide from Bufo bufo gargarizans.Biochem Biophy ResComm 1996；218：408-413)，近年来多种物种体内源于Histone2A的抗菌肽已被报道，如鲶鱼、虾、贝类、鲍鱼(3、Park IY，Park CB，Kim MS，Kim SC.Parasin I，an antimicrobial peptide derivedfrom histone H2A in the catfish Parasilurus asotus.FEBS Lett 1998；437：258-262；4、Patat SA，Carnegie RB，Kingsbury C，Gross PS，Chapman R，Schey KL.Antimicrobial activity of histonesfrom hemocytes of the pacific white shrimp.Eur J Biochem 2004；271：4825-4833；5、Li C，Song L，Zhao J，Zhu L，Zou H，Zhang H，et al.Preliminary study ona potential antibacterial peptide derivedfrom histone H2A in hemocytes of scallop Chlamys farreri.Fish Shellfish Immunol2007；22：663-672.)。组蛋白的乙酰化和甲基化等翻译后修饰大部分发生在其N端，本发明根据拟穴青蟹Histone 2A序列，合成了拟穴青蟹组蛋白Histone 2AN端前38个氨基酸，发现其是一种具有广谱抗细菌、抗酵母的抗菌肽，命名为Sphistin。本发明为拟穴青蟹体内源于Histone2A的抗菌肽的首次报道。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种拟穴青蟹抗菌肽Sphistin及其制备方法。

本发明的第二目的在于提供一种拟穴青蟹抗菌肽Sphistin在制备抗菌剂中的应用。

本发明的第二目的在于提供一种拟穴青蟹抗菌肽Sphistin在制备饲料添加剂中的应用。

所述拟穴青蟹抗菌肽Sphistin的氨基酸序列为：

Met Ala Gly Gly Lys Ala Gly Lys Asp Ser Gly Lys Ala Lys Ala Lys

1               5                   10                  15

Ala Val Ser Arg Ser Ala Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg

20                  25                  30

Ile His Arg His Leu Lys

35

所述拟穴青蟹抗菌肽Sphistin的核苷酸序列为：

atggctggtg gcaaggcagg caaggactcc ggcaaggcga aagccaaggc agtatcacgc    60

tcggccaggg ctggtctgca gtttcctgtc ggtcgtatcc atagacacct gaag         114

所述拟穴青蟹抗菌肽Sphistin的分子式为C₁₇₀H₂₉₃N₆₁O₄₆S₁，分子量为3959.61道尔顿。

所述拟穴青蟹抗菌肽Sphistin由38个氨基酸组成，来源于拟穴青蟹组蛋白Histone 2A蛋白的N端部分序列，是一种具有抗菌功能的多肽。该抗菌肽38个氨基酸中包含10个带正电的氨基酸残基和1个带负电荷的氨基酸残基，根据氨基酸残基电荷预测该抗菌肽等电点为12.12，在pH为7.0时带有9.236个正电荷。该抗菌肽具有很强的水溶性，总平均亲水性为-0.684，是一种带有强正电荷的阳离子多肽。

采用现有的固相化学合成的方法即可获得纯度达95％以上拟穴青蟹抗菌肽Sphistin。

所述拟穴青蟹抗菌肽Sphistin对多种革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌有显著的抗菌效果，同时该抗菌肽对酵母也有较高的抗性效果，其中对重要致病菌金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为＜1.5μM，对水产致病菌嗜水气单胞菌的最小抑菌浓度为＜1.5μM；对多种革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌的最小杀菌浓度为1.5～3μM，因此与许多已知的海洋动物抗菌肽比较，其抗菌效果好、抗菌谱宽、杀菌速率快，显示出极大的医用价值，在制备抗菌剂方面具有良好的应用。

细胞毒性试验证明，该抗菌肽对小鼠成骨细胞MC3T3-E1无细胞毒性，预示其可安全用于药物治疗或者作为饲料添加剂使用。

依据海洋动物拟穴青蟹的组蛋白的N端部分蛋白序列，本发明人工合成了一种具有广谱而且显著抗菌的抗菌肽，同时该蛋白无细胞毒性，具有安全性。该抗菌肽来源于水产甲壳动物，既可以应用于水产作为添加剂，也可能用于研制用于哺乳动物的抗菌药物，因而具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为拟穴青蟹抗菌肽Sphistin对金黄葡萄球菌的杀伤指数图。在图1中，横坐标为时间(min)，纵坐标为菌落存活率(％)。

图2为拟穴青蟹抗菌肽Sphistin对大肠杆菌MC1061的杀伤指数图。在图1中，横坐标为时间(min)，纵坐标为菌落存活率(％)。

图3为拟穴青蟹抗菌肽Sphistin对谷氨酸棒杆菌的杀伤指数图。在图1中，横坐标为时间(min)，纵坐标为菌落存活率(％)。

图4为抗菌肽Sphistin的细胞毒性实验图，在图4中，A为正常小鼠成骨纤维细胞MC3T3-E1，B为50μg/ml抗菌肽Sphistin与小鼠成骨纤维细胞MC3T3-E1共孵24h，C为100μg/ml抗菌肽Sphistin与小鼠成骨纤维细胞MC3T3-E1共孵24h。

图5为MTT法检测抗菌肽Sphistin的细胞毒性实验图。在图5中，横坐标为Sphistin蛋白浓度(μg/ml)，纵坐标为细胞存活率(％)。

具体实施方式

以下实施例可以使本专业技术领域的技术人员更加全面的了解本发明，本发明并不限于下述实施例。

本实施例所涉及的菌种有：大肠杆菌(Escherichia coli)、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)、溶壁微球菌(Micrococcus lyodeikticus Fleming)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、蜡状芽胞杆菌(Bacillus cereus)、荧光假单胞菌(P.Fluorescens)、嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、福氏志贺氏菌(Shigella flexneri)、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)、绿脓杆菌(P.aeruginosa)、河流弧菌(Vibrio fluvialis)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemloyticus)、解藻朊酸弧菌(Vibrio alginolyticus)、哈氏弧菌(Vibrioharveyi)、白假丝酵母(Candida albicans)等，均购自中国科学院微生物研究所菌种保藏中心。大肠杆菌MC1061(Escherichia coli MC1061)购自Gene Power公司，毕赤酵母(Pichia pastorisGS115)购自Invitrogen公司。

实施例1拟穴青蟹抗菌肽Sphistin的制备

Sphistin来源于拟穴青蟹组蛋白HistoneH2A的N端部分序列，由38个氨基酸组成，具体氨基酸序列为：

Met Ala Gly Gly Lys Ala Gly Lys Asp Ser Gly Lys Ala Lys Ala Lys

1               5                   10                  15

Ala Val Ser Arg Ser Ala Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg

20                  25                  30

Ile His Arg His Leu Lys

35

拟穴青蟹抗菌肽Sphistin的核苷酸序列为：

atggctggtg gcaaggcagg caaggactcc ggcaaggcga aagccaaggc agtatcacgc    60

tcggccaggg ctggtctgca gtttcctgtc ggtcgtatcc atagacacct gaag         114

该抗菌多肽分子式为C₁₇₀H₂₉₃N₆₁O₄₆S₁，分子量为3959.61。抗菌肽38个氨基酸中包含10个带正电的氨基酸残基和1个带负电荷的氨基酸残基，根据氨基酸残基可知：该抗菌肽等电点为12.12，在pH为7.0时带有9.236个正电荷。该抗菌肽具有很强的水溶性，总平均亲水性为-0.684，是一种带有强正电荷的阳离子多肽。

采用现有的固相化学合成的方法即可获得纯度达95％以上拟穴青蟹抗菌肽Sphistin，本实施例中的拟穴青蟹抗菌肽Sphistin委托上海肽仕生物科技有限公司合成获得。

实施例2拟穴青蟹抗菌肽Sphistin最小抑菌浓度(MIC：minimum inhibition concentration)的测定

(a)将保种的大肠杆菌、大肠杆菌MC1061、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、谷氨酸棒杆菌、溶壁微球菌、枯草芽孢杆菌、蜡状芽胞杆菌、藤黄微球菌、志贺氏菌、施氏假单胞菌、绿脓杆菌在营养肉汤平板上划线，副溶血弧菌、解藻朊酸弧菌、哈氏弧菌在2216海水肉汤平板上划线，在相应温度倒置培养12～16h；白假丝酵母、毕赤酵母在YPG平板上划线，于28℃培养1～2周。全部用接种于相应的斜面上，继续培养12～16h，酵母则继续培养3～7天；10mM磷酸钠盐缓冲液(pH 7.4)冲洗新鲜制备的细菌斜面培养物，调整稀释至OD₆₀₀＝0.003；弧菌用海水培养基调整稀释至OD₆₀₀＝0.0006；酵母则调整至OD₆₀₀＝0.00067，使其浓度为3.3×10⁴spores/mL备用。准备好的细菌需在20min内使用。

(b)将合成抗菌肽粉末用灭菌MilliQ水溶解，Bradford法测定蛋白浓度，倍比稀释蛋白浓度为3，6，12，24，48，96μM，4℃保存备用。

(c)参照Belén LG.等(Belén LG，Wimal Ubhayasekera，Richard L.Gallo，et al.Parallelevaluation of antimicrobial peptides derived from the synthetic PAF26 and the human LL37，Biochemical and Biophysical Research Communications，2007(356)：107-113)的方法，在96孔细胞培养板上进行，每种被测细菌和真菌按照以下操作设置空白对照组、阴性对照组和待测样品实验组，每组设置3个平行样：

①阳性对照组：加50μL灭菌MilliQ水和30μL菌悬液；

②空白对照组：加50μL待测蛋白样品和30μL磷酸钠盐缓冲液；

③样品实验组：加50μL待测蛋白样品和30μL菌悬液。

对于细菌，每孔加入20μL MH液体培养基，28℃培养24h，观察结果。

对于酵母，每孔加入20μL YPG液体培养基，28℃培养48h，观察结果。

对于弧菌，按照以下操作设置空白对照组、阴性对照组和待测样品实验组，每组设置3个平行样：

①阳性对照组：加50μL灭菌MilliQ水和50μL菌悬液；

②空白对照组：加50μL待测蛋白样品和50μL2216海水培养基；

③样品实验组：加50μL待测蛋白样品和50μL菌悬液。

28℃培养24h，观察结果。

观察结果如表1所示。

表1

CGMCC NO：中国普通微生物菌种保藏管理中心编号；a：购买自Gene Power公司，b：购买自上海Invitrogen公司。

实施例3拟穴青蟹抗菌肽Sphistin最小杀菌浓度(MBC：minimum bactericidalconcentration)的测定

(a)将保种的大肠杆菌、大肠杆菌MC1061、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、谷氨酸棒杆菌、溶壁微球菌、枯草芽孢杆菌、藤黄微球菌、志贺氏菌、施氏假单胞菌、嗜水气单胞菌、荧光假单胞菌在营养肉汤平板上划线，在相应温度倒置培养12～16h；毕赤酵母在YPG平板上划线，于28℃培养一至两周。全部用接种于相应的斜面上，继续培养12～16h，酵母则继续培养3～7天；10mM磷酸钠盐缓冲液(pH 7.4)冲洗新鲜制备的细菌斜面培养物，调整稀释至OD₆₀₀＝0.003；酵母则调整至OD₆₀₀＝0.00067，使其浓度为3.3×10⁴spores/mL备用。准备好的细菌需在20min内使用。

(b)将合成抗菌肽粉末用灭菌MilliQ水溶解，Bradford法测定蛋白浓度，倍比稀释蛋白浓度参照各种细菌及酵母MIC浓度及MIC浓度以上3个浓度梯度，4℃保存备用。

(c)参照Belén LG.等(Belén LG，Wimal Ubhayasekera，Richard L.Gallo，et al.Parallelevaluation of antimicrobial peptides derived from the synthetic PAF26 and the human LL37，Biochemical and Biophysical Research Communications，2007(356)：107-113)的方法，在96孔细胞培养板上进行，每种被测细菌和真菌按照以下操作设置空白对照组、阴性对照组和待测样品实验组，每组设置3个平行样：

①阳性对照组：加50μL灭菌MilliQ水和30μL菌悬液；

②空白对照组：加50μL待测蛋白样品和30μL磷酸钠盐缓冲液；

③样品实验组：加50μL待测蛋白样品和30μL菌悬液。

对于细菌，每孔加入20μL MH液体培养基，28℃培养24h后，各浓度取10μL混合液滴于营养肉汤平板，28℃培养24h后观察结果。

对于酵母，每孔加入20μL YPG液体培养基，28℃培养48h后，各浓度取10μL混合液滴于YPD平板，28℃培养48h后观察结果。

观察结果如表2所示。

表2

CGMCC NO：中国普通微生物菌种保藏管理中心编号；a：购买自Gene Power公司，

b：购买自上海Invitrogen公司。

实施例4拟穴青蟹Histone 2A来源抗菌肽Sphistin杀菌动力学曲线

本部分选取两种革兰氏阳性菌：金黄色葡萄球菌和谷氨酸棒杆菌，以及一种革兰氏阴性菌：大肠杆菌MC1061作为被测菌进行拟穴青蟹Histone 2A来源抗菌肽Sphistin杀菌动力学曲线的测定。

(a)将保种的大肠杆菌MC1061、金黄色葡萄球菌、谷氨酸棒杆菌、在营养肉汤平板上划线，在相应温度倒置培养12～16h。全部用接种于MH斜面上，继续培养12～16h，10mM磷酸钠盐缓冲液(pH 7.4)冲洗新鲜制备的细菌斜面培养物，调整稀释至OD₆₀₀＝0.003。准备好的细菌需在20min内使用。

(b)将合成抗菌肽粉末用灭菌MilliQ水溶解，Bradford法测定蛋白浓度，倍比稀释蛋白浓度参照各种细菌MBC浓度，4℃保存备用。

(c)参照Belén LG.等(2007)的方法(Belén LG，Wimal Ubhayasekera，Richard L.Gallo，et al.Parallel evaluation of antimicrobial peptides derived from the synthetic PAF26 and the humanLL37，Biochemical and Biophysical Research Communications，2007(356)：107-113)，在96孔细胞培养板上进行，每种被测细菌按照以下操作设置空白对照组、阴性对照组和待测样品实验组，每组设置3个平行样：

①阳性对照组：加50μL灭菌MilliQ水和30μL菌悬液；

②空白对照组：加50μL待测蛋白样品和30μL磷酸钠盐缓冲液；

③样品实验组：加50μL待测蛋白样品和30μL菌悬液并加入20μL MH液体培养基。

对于金黄色葡萄球菌，取未加入蛋白样品的菌悬液，以及在蛋白样品与菌悬液混合后的20s、40s、1min、2min、3min、5min、7min、8min、10min、30min分别取出5μL蛋白样品与菌悬液混合样品，用磷酸钠盐缓冲液稀释至400μL，混合均匀后取80μL稀释样品用涂布棒均匀涂抹在营养肉汤平板，每个时间点样品平行重复3次，28℃培养24h后，记录营养肉汤平板上生长的金黄色葡萄球菌的单克隆数量，结果表明：将Sphistin(3μM/L)与革兰氏阳性敏感菌菌株金黄色葡萄球菌孵育10min后，超过85％的金黄色葡萄球菌被杀死，孵育15min后，杀菌指数将近100％(参见图1)。

对于大肠杆菌MC1061，取未加入蛋白样品的菌悬液，以及在蛋白样品与菌悬液混合后的2min、5min、10min、15min、30min、1h、2h、3h、4h、5h分别取出5μL蛋白样品与菌悬液混合样品，用磷酸钠盐缓冲液稀释至400μL，混合均匀后取80μL稀释样品用涂布棒均匀涂抹在营养肉汤平板，每个时间点样品平行重复3次，28℃培养24h后，记录营养肉汤平板上生长的大肠杆菌MC1061的单克隆数量，结果表明：Sphistin(25μM/L)对革兰氏阴性敏感菌菌大肠杆菌MC1061的杀伤指数趋于平缓，在5小时后趋于杀死全部大肠杆菌MC1061(参见图2)。

对于谷氨酸棒杆菌，取未加入蛋白样品的菌悬液，以及在蛋白样品与菌悬液混合后的1min、3min、5min、10min、30min、1h、2h、3h分别取出5μL蛋白样品与菌悬液混合样品，用磷酸钠盐缓冲液稀释至400μL，混合均匀后取80μL稀释样品用涂布棒均匀涂抹在营养肉汤平板，每个时间点样品平行重复3次，28℃培养24h后，记录营养肉汤平板上生长的谷氨酸棒杆菌的单克隆数量，结果表明：Sphistin(1.5μM/L)与革兰氏阳性敏感菌菌株谷氨酸棒杆菌孵育5min后即有70％的氨酸棒杆菌被杀死，随后杀菌速率趋于平缓，在3h后杀菌指数趋于100％(参见图3)。

实施例5拟穴青蟹Histone 2A来源抗菌肽Sphistin的细胞毒性实验

本发明使用的细胞为小鼠成骨细胞MC3T3-E1，来自中国典型培养物保藏中心；培养基为改良型α-MEM来自于HYCLONE公司；血清为GIBCO热灭活胎牛血清来自于Invitrogen公司，MTT试剂来自于南京碧云天公司。

收集对数期的小鼠成骨细胞，调整细胞悬液浓度为10⁵/mL，加入6孔细胞培养板中，5％CO₂，37℃孵育至细胞单层铺满孔底。加入高浓度的拟穴青蟹Histone 2A来源抗菌肽Sphistin，分别为50μg/mL和100μg/mL，与细胞共同孵育24h后在LEICADMIRB倒置显微镜400倍放大下观察细胞形态采集图像，实验结果表明：从细胞形态学上观察，对于细胞小鼠成骨细胞MC3T3-E1，在0～100μg/mL浓度范围内Sphistin没有表现出明显的细胞毒性(参见图4)。

在Sphistin(浓度为0μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、75μg/mL和100μg/mL)分别与细胞共同孵育24h后的6孔细胞培养中加入10％体积的MTT溶液，5％CO₂，37℃避光共孵6h后，将上清去掉，加入150μL的二甲基亚砜，置摇床上低速震荡至结晶物充分溶解，在酶联检测仪OD450nm处测量各孔的吸光值，测定结果以均数±标准差表示，数据使用SPSS软件进行统计分析，在方差齐性检验基础上作单因素方差分析(One Way ANOVA)，以P＜0.05表示有统计学意义。

高浓度的抗菌肽Sphistin与小鼠成骨细胞MC3T3-E1共孵24h的情况下无明显细胞毒性(参见图5)。

Claims (5)

1.一种拟穴青蟹抗菌肽Sphistin，其特征在于，所述拟穴青蟹抗菌肽Sphistin的氨基酸序列为：

Met Ala Gly Gly Lys Ala Gly Lys Asp Ser Gly Lys Ala Lys Ala Lys

1               5                   10                  15

Ala Val Ser Arg Ser Ala Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg

            20                  25                  30

Ile His Arg His Leu Lys

        35

所述拟穴青蟹抗菌肽Sphistin的分子式为C₁₇₀H₂₉₃N₆₁O₄₆S₁，分子量为3959.61道尔顿。

2.如权利要求1所述的一种拟穴青蟹抗菌肽Sphistin，其特征在于其核苷酸序列为：

atggctggtg gcaaggcagg caaggactcc ggcaaggcga aagccaaggc agtatcacgc    60

tcggccaggg ctggtctgca gtttcctgtc ggtcgtatcc atagacacct gaag         114。

3.如权利要求1所述的一种拟穴青蟹抗菌肽Sphistin的制备方法，其特征在于所述拟穴青蟹抗菌肽Sphistin通过固相化学法合成。

4.如权利要求1所述的一种拟穴青蟹抗菌肽Sphistin在制备抗菌剂中的应用。

5.如权利要求1所述的一种拟穴青蟹抗菌肽Sphistin在制备饲料添加剂中的应用。

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