CN111184855A - 一种治疗痤疮组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种治疗痤疮的组合物，包括抗菌肽及海绵骨针，海绵骨针促进抗菌肽对皮肤的渗透。所述抗菌肽Sph12‑38氨基酸序列:KAKAKAVSRSARAGLQFPVGRIHRHLK，最小杀菌浓度7μM。骨针和抗菌肽Sph12‑38结合对兔耳痤疮的治疗效果最明显。

Description

一种治疗痤疮组合物
技术领域
本发明涉及一种治疗痤疮的组合物，特别涉及含抗菌肽的物质。
背景技术
抗菌肽(antimicrobial peptide，AMP)是一类广泛存在于自然界生物体中的小分子多肽，具有广谱的抗菌活性，是生物体先天性免疫防御系统的重要组成部分，在机体对抗外界病原微生物感染和自身免疫调节中发挥着重要作用。1981年Boman等从惜古比天蚕中首次发现抗菌肽—天蚕素以来，人们陆续从植物、昆虫、海洋生物、两栖类动物、哺乳动物和微生物等中发现了近3000种抗菌肽。最初人们发现抗菌肽只对细菌具有较好的抗菌活性，所以又被称为抗细菌肽。天然抗菌肽通常由12～100个氨基酸组成，具有较好的热稳定性和水溶性，抗菌谱广，能够抑杀细菌和真菌。有些抗菌肽甚至具有抑杀病毒、寄生虫、癌细胞等多种生物活性，而对高等动物正常细胞几乎无毒害作用，且不易使病原菌产生耐药性。近年来，随着越来越多的抗生素耐药性微生物的出现，使得抗菌肽在临床医药、食品保存和饲料添加剂等领域具有良好的应用前景。
抗菌肽要成为药物，目前还需要解决一些问题。首先是来源问题。由于抗菌肽的天然资源有限，化学合成是获取抗菌肽的主要手段。目前已有十余种通过美国食品与药品管理局审批上市的抗菌肽类药物，如恩夫韦地(Enfuvirtide)用于抗艾滋病治疗药物，Byetta用于治疗糖尿病等。本实验室前期获得了拟穴青蟹组蛋白Histone 2A序列，根据青蟹组蛋白Histone 2A基因N端序列人工合成其前38个氨基酸，发现其是一种具有广谱抗细菌、抗酵母的抗菌肽，命名为Sphistin。进一步根据抗菌肽Sphistin蛋白二级结构预测结果，对Sphistin进行蛋白分段，通过化学合成获得多段分段肽并进行抗菌活性的分析，筛选获得其主要抗菌功能结构域Sph12-38，与抗菌肽Sphistin相比具有更高抗菌活性，且抗菌谱更广，具有药物研发的潜力。
发明内容
本发明的目的是提供一种抗菌肽的组合物，用于痤疮的治疗，并显著降低抗菌肽的使用量。
一种治疗痤疮的组合物，包括抗菌肽及海绵骨针，海绵骨针促进抗菌肽对皮肤的渗透。
所述抗菌肽Sph12-38，氨基酸序列:KAKAKAVSRSARAGLQFPVGRIHRHLK，最小杀菌浓度7μM。
所述抗菌肽Sphistin，氨基酸序列:
AGGKAGKDSGKSKAKAVSRSARAGLQFPVGRIHRHLK，
最小杀菌浓度12μM。
所述抗菌肽Sph20-38最小杀菌浓度24μM，氨基酸序列：RSARAGLQFPVGRIHRHLK。给药方式：10mg蜂海绵骨针置于给药池内1.77cm2皮肤表面，用电动按摩器以0.3N和300rpm按摩皮肤2min，按摩结束后PBS溶液冲洗皮肤表面3次，再给予1mg/ml的Sph12-38 150μl。
1.抗菌肽对痤疮丙酸杆菌的抗菌活性
表1抗菌肽对痤疮丙酸杆菌的抗菌活性
Figure BDA0002387073940000021
从结果来看，四种抗菌肽中Sph12-38对痤疮丙酸杆菌具有最小杀菌浓度，为7μM。
附图说明：
图1痤疮丙酸杆菌形态学变化：痤疮丙酸杆菌与(a)7μM Sph12-38，(b)12μMSphistin，(c)24μMSph20-38，(d)18μMAS-hepc3-1，(e)0.2μM克林霉素，(f)0.2μM盐酸多西环素，(g)PBS培养20min；
图2人体角质细胞存活率；
图3人体角质细胞形态变化：人体角质细胞与抗菌肽Sph12-38(a)0.1μg/ml(b)1μg/ml(c)10μg/ml(d)100μg/ml(e)0μg/ml共同培养24h后形态变化；
图4 FITC-Sph12-38体外渗透率；
图5FITC-Sph12-38荧光定性切片：(a)骨针按摩组为10mg蜂海绵骨针按摩按摩2min，(b)对照组为无蜂海绵骨针按摩；
图6兔耳痤疮治疗效果：
(a-o)抗菌肽Sph12-38(使用剂量，84.7μl/cm2)协同蜂海绵骨针(使用剂量，5.6mg/cm2)治疗兔耳痤疮0-14天；
图7兔耳痤疮治疗效果：
(a-o)蜂海绵骨针(使用剂量，5.6mg/cm2)治疗兔耳痤疮0-14天；
图8兔耳痤疮治疗效果：
(a-o)抗菌肽Sph12-38(使用剂量，84.7μl/cm2)治疗兔耳痤疮0-14天；
图9对照组兔耳痤疮效果：
(a-o)生理盐水(使用剂量，84.7μl/cm2)治疗0-14天；
图10兔耳痤疮治疗前后参数变化：
结果如治疗效果图和兔耳痤疮参数变化图10所示，骨针和抗菌肽Sph12-38结合对兔耳痤疮的治疗效果最明显。
图11兔耳痤疮病理切片：
(a)造模完成后(b)生理盐水治疗14d(c)蜂海绵骨针治疗14d(d)Sph12-38治疗14d(e)Sph12-38协同蜂海绵骨针治疗14d，箭头所指部位为毛囊皮脂腺
具体实施方式：
实施例1：
1.扫描电子显微镜观察痤疮丙酸杆菌形态学变化
图1为痤疮丙酸杆菌形态学变化：
痤疮丙酸杆菌与(a)7μM Sph12-38，(b)12μMSphistin，(c)24μMSph20-382，(d)18μMAS-hepc3-1，(e)0.2μM克林霉素，(f)0.2μM盐酸多西环素，(g)PBS培养20min
从结果来看，Sph12-38与痤疮丙酸杆菌培养后形态学发生明显变化，细菌表面产生泡状突起。
实施例2：
2.Sph12-38对人体角质细胞毒性
图2人体角质细胞存活率，图3人体角质细胞形态变化：人体角质细胞与抗菌肽Sph12-38(a)0.1μg/ml(b)1μg/ml(c)10μg/ml(d)100μg/ml(e)0μg/ml共同培养24h后形态变化。
从结果来看，人体角质细胞与Sph12-38共同培养24h后，人体角质细胞的存活率较高，细胞形态无明显变化，Sph12-38对人体角质细胞毒性较小。
实施例3：
3.FITC-Sph12-38体外透皮实验
(1)定量结果
图4 FITC-Sph12-38体外渗透率；
从结果可以看出，骨针按摩组的抗菌肽透皮量高于对照组，骨针按摩对抗菌肽的体外渗透有促进作用。
(2)定性结果，图5FITC-Sph12-38荧光定性切片
(a)骨针按摩组为10mg蜂海绵骨针按摩按摩2min，(b)对照组为无蜂海绵骨针按摩；
结果显示，与定量结果相符，骨针按摩组荧光强度高于对照组，骨针按摩显著增加FITC-Sph12-38的皮肤渗透率。
实施例4：
4.兔耳痤疮模型
(1)兔耳治疗效果
图6兔耳痤疮治疗效果：
(a-o)抗菌肽Sph12-38(使用剂量，84.7μl/cm2)协同蜂海绵骨针(使用剂量，5.6mg/cm2)治疗兔耳痤疮0-14天；
结果如图6所示，兔耳外耳道随治疗时间增加，兔耳外耳道炎症反应消失，兔耳红肿消退，丘疹囊肿明显减少，兔耳柔软度增加，可见清晰毛细血管网，毛囊口黑色角栓减少，毛孔变小。
图7兔耳痤疮治疗效果
(a-o)蜂海绵骨针(使用剂量，5.6mg/cm2)治疗兔耳痤疮0-14天；
结果如图7所示，兔耳外耳道随治疗时间增加，兔耳外耳道炎症反应消失，兔耳红肿消退，兔耳柔软度增加，毛囊口黑色角栓减少，毛孔变小,但仍存在明显的丘疹囊肿。
图8兔耳痤疮治疗效果
(a-o)抗菌肽Sph12-38(使用剂量，84.7μl/cm2)治疗兔耳痤疮0-14天；
结果如图8所示，兔耳外耳道随治疗时间增加，兔耳外耳道炎症反应消失，兔耳红肿消退，丘疹囊肿明显减少，兔耳柔软度增加，毛囊口黑色角栓减少，毛孔变小。
图9对照组兔耳痤疮效果
(a-o)生理盐水(使用剂量，84.7μl/cm2)治疗0-14天；
结果如图9所示，兔耳外耳道随治疗时间增加，丘疹囊肿明显逐渐变大，毛囊口黑色角栓无明显变化，毛孔未见变小。
图10兔耳痤疮治疗前后参数变化
结果如治疗效果图和兔耳痤疮参数变化图所示，骨针和抗菌肽Sph12-38结合对兔耳痤疮的治疗效果最明显。
实施例5：
(2)兔耳病理切片观察
图11兔耳痤疮病理切片：
(a)造模完成后(b)生理盐水治疗14d(c)蜂海绵骨针治疗14d(d)Sph12-38治疗14d(e)Sph12-38协同蜂海绵骨针治疗14d，箭头所指部位为毛囊皮脂腺；
从病理切片结果来看，抗菌肽Sph12-38协同蜂海绵骨针治疗完成后兔耳病理切片复层鳞状上皮厚度变薄，炎症细胞浸润程度减小，毛囊皮脂腺扩张程度减轻，毛囊角栓缩小。
(3)兔耳治愈率
表2兔耳痤疮治愈率
Figure BDA0002387073940000061
从兔耳治愈率结果来看，抗菌肽Sph12-38协同蜂海绵骨针组兔耳病变清除率最高，兔耳痤疮治愈率为100％。
本领域的技术人员应当明了，尽管为了举例说明的目的，本文描述了本发明的具体实施方式，但可以对其进行各种修改而不偏离本发明的精神和范围。因此，本发明的具体实施方式和实施例不应当视为限制本发明的范围。本发明仅受所附权利要求的限制。本申请中引用的所有文献均完整地并入本文作为参考。

Claims (8)

1.一种治疗痤疮的组合物，包括抗菌肽及海绵骨针，海绵骨针促进抗菌肽对皮肤的渗透。
2.根据权利要求1所述的一种治疗痤疮的组合物，其特征在于所述抗菌肽Sph12-38，氨基酸序列为:KAKAKAVSRSARAGLQFPVGRIHRHLK。
3.根据权利要求1所述的一种治疗痤疮的组合物，其特征在于所述抗菌肽Sphistin，氨基酸序列为:AGGKAGKDSGKSKAKAVSRSARAGLQFPVGRIHRHLK。
4.根据权利要求1所述的一种治疗痤疮的组合物，其特征在于所述抗菌肽Sph20-38，氨基酸序列为：RSARAGLQFPVGRIHRHLK。
5.根据权利要求1所述的一种治疗痤疮的组合物，其特征在于所述抗菌肽AS-hepc3-1，氨基酸序列为：SPAGRNSRRRRCRFCCGCCPDMIGCGTCCKF。
6.根据权利要求1至5之一所述的一种治疗痤疮的组合物的给药方式，其特征在于将蜂海绵骨针置皮肤表面，经按摩后，给药所述的抗菌肽。
7.根据权利要求1至5之一所述的一种治疗痤疮的组合物的给药方式，其特征在于将蜂海绵骨、抗菌肽混合后针置皮肤表面，经按摩给药。
8.根据权利要求1至5之一所述的一种治疗痤疮的组合物的给药方式，将5-20mg蜂海绵骨针置于1-5cm2皮肤表面，按摩皮肤1-5min，再给予1-5mg/ml的Sph12-38 150-1000μl。
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