JP2024523959A

JP2024523959A - 毛包新生又は血管新生におけるコラーゲン粒子の使用

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Publication number: JP2024523959A
Application number: JP2023554790A
Authority: JP
Inventors: ダー・ジェンシーエ，; ユン・ジュチェン，; チャオ・イーウェー，
Original assignee: Acro Biomedical Company Ltd
Current assignee: Acro Biomedical Company Ltd
Priority date: 2021-09-17
Filing date: 2021-09-17
Publication date: 2024-07-05
Also published as: WO2023039833A1; EP4403568A1; CN117120465A; KR20230166079A; US20240139374A1

Abstract

被検体における毛包新生又は血管新生を誘導するための医薬品の調製のためのコラーゲン粒子の使用がここに開示される。本出願のコラーゲン粒子は、約１０～２００μｍの直径を有する。本開示のある実施形態によると、コラーゲン粒子は、約０．１ｍｇ／ｃｍ２～約１０００ｍｇ／ｃｍ２の量で被検体に投与される。【選択図】図１

Description

本開示は、医薬の分野に関する。より具体的には、本開示は、コラーゲン粒子を用いることによって毛包新生又は血管新生を誘導する方法に関する。

皮膚は、身体の温度及び水分を調整する人体における最大の器官であり、病原体に対する防御の第一線を形成する。いくつかの皮膚付属器（例えば、毛包、汗腺など）が真皮に存在し、真皮のダメージは、深刻な結果をもたらすことが多い。

具体的には、毛髪は、真皮の毛包から成長し、毛包は、毛包幹細胞を含む様々なタイプの細胞から構成される。毛包の生存周期は、成長期、退行期及び休止期を含む３つの期間に分けられる。毛髪（すなわち、キューティクル構造を有する毛幹）は、毛包幹細胞が増殖してケラチノサイト幹細胞に分化し、ケラチノサイト幹細胞はさらにマトリックスケラチノサイトに分化する成長期に生じる。マトリックスケラチノサイトの誘導体は、毛包の外毛根鞘及び内毛根鞘を形成する。活性化された毛包幹細胞は、表皮細胞に分化する表皮幹細胞を形成し得る。さらに、活性化された毛包幹細胞は、皮脂腺に分化し得る。退行期及び休止期では、毛髪は、毛包から成長しなくなり、毛包は収縮し始める。したがって、異常な毛包周期又は毛包ダメージによって生じた深刻な真皮損傷は、不可逆的な脱毛又は禿頭症を引き起こすことになる。

さらに、熱傷、潰瘍、炎症、放射線療法、外科手術及び糖尿病によって生じる皮膚損傷は、被検体における慢性創傷をもたらす血管の萎縮及び壊死を生じる。臨床現場では、慢性創傷は、持続的な炎症及び血管新生障害を示すことになる。したがって、皮膚の損傷及び異常は、感染症を生じるだけでなく、身体的及び精神的な健康状態に重大な影響を与える皮膚付属器の通常の機能にも影響する（例えば、局所組織における脱毛又は血液供給不足）。しかし、現在診療所で用いられるいずれの薬剤も、問題を解決し得ない。

上述を鑑み、関連技術において、毛包新生又は血管新生を効果的に誘導し得る医薬品又は方法についてのニーズが存在する。

以下に、基本的な理解を読者に与えるために本開示の簡略化した概要を提示する。この概要は、開示の網羅的な概観ではなく、本発明の鍵となる／重要な要素を特定するものでも本発明の範囲を記するものでもない。その専らの目的は、ここに開示される幾つかの概念を、後述のさらに詳細な説明の序章としての簡略な形態で提示することである。

本開示は、毛包新生及び／又は血管新生を誘導する方法を提供することを目的とする。本開示において実現され、広範囲にわたって説明されるように、本開示の第１の態様は、医薬品の調製のためのコラーゲン粒子の使用に向けられ、医薬品は、被検体における毛包新生及び／又は血管新生を誘導するのに有用であり、医薬品は複数のコラーゲン粒子を含む。

本開示のある実施形態によると、コラーゲン粒子は、直径約１０～２００μｍである。好ましくは、コラーゲン粒子は、直径約１００～１５０μｍである。

本開示の特定の実施形態によると、複数のコラーゲン粒子を含む医薬品は、所望の標的部位に経消化管外的に（ｐａｒｅｎｔｅｒａｌｌｙ）投与される。経消化管外的（ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ）経路の例は、経皮的（ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ）投与、皮内投与及び皮下投与を含むが、それらに限定されない。コラーゲン粒子は、０．１～１０００ｍｇ／ｃｍ^２の量で医薬品中に存在する。好ましくは、コラーゲン粒子は、５ｍｇ／ｃｍ^２の量で医薬品中に存在する。

本開示のある実施形態によると、複数のコラーゲン粒子を含む医薬品は、被検体に皮下投与される。

本開示のある実施形態では、コラーゲン粒子は、
（１）厚さ約０．１～２ｍｍの動物の皮膚を、約１００～５００バールの圧力及び約３０～５０℃の温度での超臨界二酸化炭素（ｓｃＣＯ_２）の第１のフローに約２０分～１０時間の期間さらして動物の皮膚を脱細胞化するステップと、
（２）ステップ（１）の脱細胞化された動物の皮膚をアルカリ溶液にさらすステップと、
（３）ステップ（２）のアルカリ溶液で処置された動物の皮膚を過酸化水素溶液にさらすステップと、
（４）ステップ（３）の過酸化水素溶液で処置された動物の皮膚を、共溶媒（又は補助溶媒）の存在下で、約１００～５００バールの圧力及び約３０～５０℃の温度下でのｓｃＣＯ_２の第２のフローに約２０分間～１０時間さらしてコラーゲン足場を生成するステップと、
（５）ステップ（４）のコラーゲン足場を脱水及び顆粒化してコラーゲン粒子を生成するステップと、を備える方法によって調製される。

本開示の実施形態によると、本方法は、有機溶媒も架橋剤も用いないことを特徴とする。

本開示のある実施形態によると、ステップ（１）において、動物の皮膚は、３５０バールの圧力及び４０℃の温度でのｓｃＣＯ_２の第１のフローに９０分間さらされる。

好適な一実施形態によると、ステップ（２）のアルカリ溶液は、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）の溶液である。

本開示の好適な一実施形態によると、ステップ（４）において、動物の皮膚は、３５０バールの圧力及び４０℃の温度でのｓｃＣＯ_２の第２のフローに９０分間さらされる。

本開示の好適な実施形態では、ステップ（４）の共溶媒はエタノールである。一実施例では、共溶媒及びｓｃＣＯ_２の第２のフローは、１：１０の体積比で存在する。

本開示の他の実施形態では、ステップ（５）において、コラーゲン足場は、液体窒素中で複数のコラーゲン粒子へと切断又は粉砕される。

本開示の他の態様は、被検体における毛包新生及び血管新生を誘導する方法に向けられる。方法は、前述の本開示の複数のコラーゲン粒子を含む有効量の医薬品を被検体に投与するステップを備え、コラーゲン粒子は１０～２００μｍの直径を有する。

本開示のある実施形態によると、コラーゲン粒子の各々は、直径約１００～１５０μｍである。

特定の実施形態によると、複数のコラーゲン粒子を含む医薬品は、約０．１～１０００ｍｇ／ｃｍ^２の量で投与される。好ましくは、複数のコラーゲン粒子を含む医薬品は、約５ｍｇ／ｃｍ^２の量で投与される。

本開示のある実施形態では、複数のコラーゲン粒子を含む医薬品は、被検体に皮下投与される。

本開示のある実施形態によると、コラーゲン粒子は、
（１）動物の皮膚を脱細胞化するために、厚さ０．１～２ｍｍの動物の皮膚を、約１００～５００バールの圧力及び約３０～５０℃の温度での超臨界二酸化炭素の第１のフローに約２０分間～１０時間さらすステップと、
（２）ステップ（１）の脱細胞化された動物の皮膚をアルカリ溶液にさらすステップと、
（３）ステップ（２）のアルカリ溶液で処置された動物の皮膚を過酸化水素溶液にさらすステップと、
（４）ステップ（３）の過酸化水素溶液で処置された動物の皮膚を、共溶媒の存在下で、約１００～５００バールの圧力及び約３０～５０℃の温度での超臨界二酸化炭素の第２のフローに約２０分間～１０時間さらしてコラーゲン足場を生成するステップと、
（５）ステップ（４）のコラーゲン足場を脱水及び顆粒化してコラーゲン粒子を生成するステップと、を備える方法によって調製される。

本開示の一実施形態では、本方法は、有機溶媒も架橋剤も用いない。

ある実施形態によると、ステップ（１）において、動物の皮膚は、３５０バールの圧力及び４０℃の温度下での第１のｓｃＣＯ_２に９０分間さらされる。

本開示の好適な一実施形態では、アルカリ溶液はＮａＯＨである。

好適な一実施形態によると、ステップ（４）において、動物の皮膚は、３５０バールの圧力及び４０℃の温度下での第２のｓｃＣＯ_２に９０分間さらされる。

本開示のある好適な実施形態では、ステップ（４）において、共溶媒はエタノールである。一実施例では、共溶媒及びｓｃＣＯ_２は、１：１０の体積比で存在する。

他の実施形態によると、ステップ（５）において、コラーゲン足場は、液体窒素中でコラーゲン粒子へと切断又は粉砕される。

上記に基づき、本方法は、被検体における毛包喪失及び／又は血管損傷を処置するために、コラーゲン粒子を含む有効量の医薬品を被検体に投与することを介して、被検体における毛包新生及び血管新生を誘導するのに有用である。

本開示の付随する特徴及び有利な効果の多くは、添付図面との関連で検討される以下の詳細な説明を参照してより深く理解されることになる。

本説明は、添付図面に照らして読まれる以下の詳細な説明により一層深く理解される。

図１は、本開示の一実施例による組織染色の写真に関し、（Ａ）通常の生理食塩水（対照１）、（Ｂ）ポリ－Ｌ－乳酸（対照２）、（Ｃ）ヒアルロン酸（対照３）及び（Ｄ）本コラーゲン粒子を、それぞれウサギの耳に皮下注入し、３０日後、組織を耳から単離し、続いて、染色して顕微鏡によって検出し、４０倍の増幅率下で写真を撮影した。黒色の矢印は血管組織であり、赤色の矢印は毛包細胞である。

添付図面に関連して以下に与えられる詳細な説明は、本実施例の説明としてのものであり、本実施例が構成又は利用され得る唯一の形態を表すものではない。この説明は、本実施例の機能及び本実施例を構成して動作させるためのステップの順序を説明する。ただし、同一又は同等の機能及び順序が、異なる実施例によって実現され得る。

Ｉ．定義
説明の便宜上、明細書、実施例及び付随する特許請求の範囲において採用される特定の用語をここにまとめる。特に断りがない限り、ここで使用される全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術における当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、ここでは文脈が明示的に否定しない限り複数形のものを含むように使用される。

用語「コラーゲン粒子」とは、動物源から特定のサイズへの脱細胞化、滅菌及び粉砕によってコラーゲン粒子が生成される本開示に開示される方法によって調製された顆粒状コラーゲンのことをいう。具体的には、動物の皮膚は、架橋剤を用いずにコラーゲン足場を生成するためにｓｃＣＯ_２によって脱細胞化され、その後にコラーゲン足場は、天然コラーゲンの構造及び構成を保持しつつ特定の直径を有するコラーゲン粒子を生成するために粉砕される。

用語「投与する」、「投与され」及び「投与」とは、コラーゲン粒子を被検体に与えて毛包欠損及び血管新生に関連する症状を軽減及び改善するモードのことをいう。

用語「有効量」とは、毛包新生及び血管新生を誘導するように、疾患に対して所望の効果をもたらし、又は疾患に関連する症候を遅延若しくは最小化する期間内に投与されるコラーゲン粒子又はコラーゲン粒子を含む医薬品の量のことをいう。本開示のコラーゲン粒子又は医薬品の有効量とは、単独で又は他の治療薬と組み合わせて投与された場合に、疾患に対する有用な効果を示し得る量のことをいう。本開示の一例によると、コラーゲン粒子又は医薬品の量は、被検体の真皮における毛包新生及び血管新生を誘導することができる。

用語「被検体」とは、本発明の方法によって処置可能なヒト種を含む哺乳動物のことをいう。哺乳動物とは、ヒト、霊長類、飼育動物、家畜、捕獲動物、スポーツ動物、ペット及びげっ歯類を含む哺乳類の全てのメンバーのことをいう。さらに、用語「被検体」又は「患者」は、一方の性別が特に指定されない限り、雄及び雌の両方のことをいうことが意図される。

発明の広い範囲を説明する数値範囲及びパラメータは概数であるものの、具体的な実施例で説明される数値は可能な限り厳密に報告される。ただし、いずれの数値も、それぞれの試験測定値に見られる標準偏差から必然的にもたらされる所定の誤差を本来的に含む。また、ここで使用されるように、用語「約」は、所与の値又は範囲の１０％、５％、１％又は０．５％内を一般に意味する。あるいは、用語「約」は、当業者によって考慮される場合の平均の許容標準誤差内を意味する。運用／実施例以外においても、又は明示の断りがない限り、ここに開示されるその材料の量、継続時間、温度、動作条件、量の比率などに対するものなどの数値範囲、量、値及び割合の全ては、いずれの場合においても用語「約」によって変更されるものとして理解されるべきである。したがって、逆のことが示されない限り、本開示及び添付の特許請求の範囲で説明される数値パラメータは、所望のように変わり得る概数である。少なくとも、各数値パラメータは、報告される有効桁数を考慮してかつ通常の四捨五入手段を適用して少なくとも解釈されるべきである。

ＩＩ．本発明の詳細な説明
本開示は、処理手順の間に架橋剤を用いることなしに脱細胞化及び粉砕によって調製されるコラーゲン粒子が、ｉｎｖｉｖｏで、３次元の生物学的足場として作用して細胞がその上で成長し得るという発見に少なくともある程度基づく。さらに、コラーゲン粒子は、毛包新生及び血管新生も誘導し得る。したがって、本開示は、本コラーゲン粒子を含む医薬品を提供することを目的とし、医薬品は、被検体における毛包新生又は血管新生を誘導することなどによって皮膚損傷を修復するのに有用である。

本開示の一態様は、被検体における毛包欠損又は局所的血管損傷を処置する方法に向けられる。本方法は、有効量のコラーゲン粒子を被検体に投与するステップを備え、好ましくは、コラーゲン粒子は、被検体に皮下投与されて局所的な毛包新生及び血管新生を誘導する。

コラーゲン粒子は、調製工程において架橋剤の使用の有無にかかわらず、当業者に公知の方法又は本開示の方法により動物組織から調製され得る。本開示の一実施例では、動物の皮膚を、ｓｃＣＯ_２を介して脱細胞化し、アルカリ溶液及び過酸化水素を含む薬剤で処置し、続いて、粉砕して特定のサイズを有するコラーゲン粒子を生成する。なお、この工程では、有機溶媒（特に生物に有毒であることが公知のもの）及び架橋剤は用いられない。結果として生成されたコラーゲン粒子は、当該分野で公知の任意の方法を介して、例えば、溶液中に保存することによって、ｉｎｖｉｔｒｏで保存され得る。本開示の方法によって生成されたコラーゲン粒子は、その天然構造、シグナル因子及び天然コラーゲンの構成を独立して保持しているので、細胞及び組織がその上で成長する、より良好な微小環境として作用し得る。

本開示における使用に適したコラーゲン粒子は、同種及び／又は異種組織から単離され得る。同種コラーゲン粒子は、同じ種であるが異なる個体の組織又は細胞から得られたものをいい、異種コラーゲン粒子は、異なる種の個体から得られたものをいう。具体的には、コラーゲン粒子は、コラーゲンの豊富な皮膚組織、腱組織又は任意の組織から単離されてもよく、これらの組織は、同じ種又は異なる種の個体によるものであり得る。本開示における組織の供給源の例は、皮膚組織、腱組織及び軟骨組織を含むがそれらに限定されない。特定の実施形態によると、コラーゲン粒子は、ブタ皮膚組織に由来する。

具体的には、本開示のコラーゲン粒子は、有機溶媒も架橋剤も用いることなく、以下の
（１）動物の皮膚を脱細胞化するために、厚さ約０．１～２ｍｍの動物の皮膚を、約１００～５００バールの圧力及び約３０～５０℃の温度でのｓｃＣＯ_２の第１のフローに約２０分間～１０時間さらすステップと、
（２）ステップ（１）の脱細胞化された動物の皮膚をアルカリ溶液にさらすステップと、
（３）ステップ（２）のアルカリ溶液で処置された動物の皮膚を過酸化水素溶液にさらすステップと、
（４）ステップ（３）の過酸化水素溶液で処置された動物の皮膚を、共溶媒の存在下で、約１００～５００バールの圧力及び約３０～５０℃の温度でのｓｃＣＯ_２の第２のフローに約２０分間～１０時間さらしてコラーゲン足場を生成するステップと、
（５）ステップ（４）のコラーゲン足場を脱水及び顆粒化してコラーゲン粒子を生成するステップと、を備える方法によって調製される。

本方法を開始する前に、好ましくは、動物の皮膚組織に洗浄、除毛及び脂質抽出工程を行う。本発明での使用のための皮膚組織の供給源として作用し得る動物は、ブタ、畜牛、雌牛、雄牛、ヒツジ、ヤギ、ロバ、ウサギ、アヒル、ガチョウ及びニワトリを含むが、それらに限定されない経済動物である。除毛及び脂質抽出は、当技術分野で公知の任意の物理的又は化学的方法を用いることによって行われてもよい。例えば、皮膚組織に、その上の毛髪を除去するように酸性処置を行ってもよく、又はそこからの脂質を除去するように酵素的（例えば、リパーゼ）若しくは化学的（例えば、洗浄剤）処置を行ってもよい。あるいは、脂質は、ナイフ又は切断手段の使用によって直接切除されてもよい。

そして、上記の皮膚組織は、好ましくは、厚さ約０．１～２ｍｍ、例えば、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９又は２．０ｍｍの皮膚へとスライスされる。好ましくは、動物の皮膚は、厚さ約０．３ｍｍである。

ステップ（１）において、厚さ約０．１～２ｍｍの無毛及び無脂肪の動物の皮膚を、ｓｃＣＯ_２の第１のフローを介して脱細胞化する。ステップ（１）の目的は、組織足場として用いられ得るように、コラーゲンの物理的及び生化学的特性を保護しつつ、動物の皮膚から細胞成分を除去することである。好ましくは、ステップ（１）において、動物の皮膚は、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０又は５００バールなどの約１００～５００バール、より好ましくは、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０又は４００バールなどの約２００～４００バールの圧力下でのｓｃＣＯ_２の第１のフローにさらされる。さらに、ステップ（１）を約３０～５０℃、例えば、約３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９及び５０℃の温度で実行し、好ましくは、ステップ（１）を約３５～４２℃の温度で実行する。ステップ（１）における処置は、約２０分～１０時間（例えば、２０、３０、４０、５０若しくは６０分間又は２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０時間）にわたって続く。本開示のある実施形態によると、厚さ約０．１～２ｍｍの動物の皮膚は、４０℃の温度及び３５０バールの圧力でのｓｃＣＯ_２に９０分間さらされる。基本的に、脱細胞化を体温（すなわち、３７℃）に近い温度で実行して生物学的に活性な物質を除去する。

ステップ（２）において、ステップ（１）の脱細胞化された動物の皮膚をアルカリ溶液にさらして、あらゆる細胞残渣を洗浄及び除去する。具体的には、動物の皮膚をアルカリ溶液に０．５～２時間、例えば、約０．５、１、１．５又は２時間、好ましくは約２時間浸漬する。本開示における使用に適したアルカリ溶液の例は、水酸化ナトリウム溶液、水酸化カルシウム溶液、水酸化カリウム溶液、炭酸ナトリウム溶液、炭酸水素ナトリウム溶液などを含むが、それらに限定されない。本開示の好適な一実施形態によると、ステップ（１）の脱細胞化された動物の皮膚を、１Ｎの濃度の水酸化ナトリウム溶液で処置する。

ステップ（３）において、ステップ（２）のアルカリ溶液で処置された動物の皮膚を、さらに過酸化水素溶液で約０．５～２時間、例えば、０．５、１、１．５及び２時間処置する。ある好適な実施形態では、過酸化水素溶液は、約０．１～２重量％の濃度、例えば、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．５又は２重量％の濃度を有する。好適な一実施形態によると、ステップ（２）のアルカリ溶液で処置された動物の皮膚を、１％の過酸化水素溶液で約１時間処置する。

次に、ステップ（４）において、ステップ（３）で生成された過酸化水素溶液で処置された動物の皮膚を、共溶媒の存在下でｓｃＣＯ_２の第２のフローにさらして、細胞及び生物活性成分を基本的に含まないコラーゲン足場を生成する。なお、ステップ（４）において、動物の皮膚を共溶媒とともにｓｃＣＯ_２で処置すること以外は、ステップ（４）をステップ（１）のものと同様の条件で実行する。すなわち、ステップ（３）の動物の皮膚を、共溶媒の存在下で、１００～５００バールの圧力及び３０～５０℃の温度でのｓｃＣＯ_２で２０分間～１０時間処置する。本開示の好適な実施形態によると、ステップ（４）において、過酸化水素溶液で処置された動物の皮膚を、共溶媒の存在下で、４０℃の温度及び３５０バールの圧力でのｓｃＣＯ_２に９０分間さらす。

共溶媒は、Ｃ_１－４アルコールであってもよく、その例は、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、イソブタノール、２－ブタノール、２－メチル－２－プロパノール及びシクロブタノールを含むが、それらに限定されない。特定の好適な実施形態では、共溶媒はエタノールであり、ｓｃＣＯ_２とともに用いられ、共溶媒及びｓｃＣＯ_２は１：２０～１：４、例えば、１：２０、１：１９、１：１８、１：１７、１：１６、１：１５、１：１４、１：１３、１：１２、１：１１、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５又は１：４の体積比で存在する。好適な一実施形態では、エタノール及びｓｃＣＯ_２は、１：１０の体積比で存在する。

最後に、顆粒化ステップ（すなわち、ステップ（５））において、ステップ（４）のコラーゲン足場を液体窒素中で切断又は粉砕して特定の直径を有するコラーゲン粒子を生成する。本開示のある実施形態によると、コラーゲン粒子は、直径１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５又は２００μｍなどの、直径約１０～２００μｍである。ある好適な実施形態では、コラーゲン粒子は、直径約１００～１５０μｍ、例えば、直径約１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５又は１５０μｍである。

上述の方法は、出発材料として無傷の動物の皮膚を用い、続いて脱細胞化して細胞マトリックス及び活性成分を除去し、そして粉砕処置を行うことを特徴とする。工程全体は、強酸及び／又は強塩基を用いず、したがって、コラーゲンの主要アミノ酸（すなわち、グリシン、プロリンなど）を誘導して２次構造又は３次構造に重合するための架橋剤を用いる必要がない。したがって、結果として生成されたコラーゲン粒子は、その天然構造及び立体配座を保持するコラーゲン線維を有することを特徴とし、コラーゲン粒子を細胞成長のための生物学的足場として使用可能とする。

本開示のある実施形態によると、上述の方法によって調製されたコラーゲン粒子の投与は、被検体における毛包新生及び血管新生を誘導する。本開示の特定の実施形態によると、コラーゲン粒子は、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０又は１０００ｍｇ／皮膚面積ｃｍ^２などの、０．１～１０００ｍｇ／皮膚面積ｃｍ^２の量で被検体に投与される。好ましくは、コラーゲン粒子は、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０又は５００ｍｇ／皮膚面積ｃｍ^２などの、０．１～５００ｍｇ／皮膚面積ｃｍ^２の量で被検体に投与される。より好ましくは、コラーゲン粒子は、約０．１～５０ｍｇ／皮膚面積ｃｍ^２、例えば、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０ｍｇ／皮膚面積ｃｍ^２の量で投与される。本開示の特定の一実施形態では、コラーゲン粒子は、約５ｍｇ／ｃｍ^２の有効量で、その必要のある被検体に投与される。さらに、コラーゲン粒子は、１日に１回～３か月に１回の範囲の頻度で投与され得る。ある実施形態では、本開示のコラーゲン粒子は、１日に１回、２日に１回、３日に１回、１週間に１回、２週間に１回、１か月に１回、２か月に１回又は３か月に１回の頻度で投与される。特定の実施形態では、コラーゲン粒子は、１週間に１回～１か月に１回の頻度で投与される。

コラーゲン粒子は、適切な経路を通じて所望の標的部位に投与され得る。ある実施形態では、コラーゲン粒子は、非経口（ｎｏｎ－ｏｒａｌ）投与又は経消化管外的投与を介して所望の標的部位に投与される。例示的な非経口投与経路は、経皮投与、皮内投与及び皮下投与を含むが、それらに限定されない。具体的には、非経口投与経路は、コラーゲン粒子の標的部位への、皮下投与（例えば、皮下注入）及び／又は経皮投与（すなわち、アプリケータを用いて被検体の皮膚の創傷にコラーゲン粒子を局所的に塗布すること）をいう。処置される疾患、疾患の重症度、（年齢、生理的状態、体型、性別及び体重を含む）被検体の健康状態、処置期間、（もしあれば）併存する病状、有効成分の投与量及び性質、遺伝子的要因並びに医療専門家によって一般的に知られて理解されている他の同様の要因に応じて適切な経路が異なることを、当業者は理解し得ることが分かるはずである。これらの要因は当技術分野で公知であり、当業者は二重の実験をすることなくそれらを実施可能である。一般に、最良の投与経路は、様々な要因、例えば、循環系における医薬品の安定性及び／又は（被検体が皮下注入に耐えられるか否かなどの）被検体の身体的状態に依存する。本開示のある実施形態によると、コラーゲン粒子は、皮下注入を介して被検体に投与される。ある好適な実施形態では、コラーゲン粒子は、被検体の真皮に投与される。

本開示で説明される被検体は、本方法で処置可能でその利益を有する任意の動物をいう。例示的な動物は、ヒト、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、サル、ブタ、ヒツジ、雌牛、ウマ、イヌ及びネコを含むが、それらに限定されない。効果的な実施例では、被検体はウサギである。他の実施例では、被検体はヒトである。

本開示は、本開示の方法によって調製され、脱細胞化された皮膚由来のコラーゲンから構成されるコラーゲン粒子を、その必要のある被検体に投与することを介して、皮膚損傷を修復することを目的とし、コラーゲン粒子は１０～２００μｍの直径を有し、その天然構造、シグナル因子及び無傷の線維立体配座を保持する。したがって、コラーゲン粒子は、被検体の皮下組織への投与後、細胞の活性化及び増殖に適した環境を提供する３Ｄ生体足場として作用し、細胞（例えば、幹細胞、線維芽細胞、内皮細胞）はその上で成長可能となり得る。したがって、コラーゲン粒子は、皮膚損傷を修復するために、被検体の真皮における毛包新生及び血管新生を誘導する手段を提供する。

ここで、限定ではなく例証を目的として提供される以下の実施形態を参照して、本発明をより具体的に説明する。

材料及び方法
動物
研究には、ニュージーランド白ウサギ（各々約５キログラム）を用いた。各ウサギを、餌及び水の摂取が自由な動物施設内のケージに別個に収容した。施設では、温度を１９～２５℃に維持し、湿度を約５０～６０％とした。体重、体温及び他の生理値を毎日測定した。各実験の前に、動物を隔離し、実験環境に順応させた。

実施例１：コラーゲン粒子の生成
無毛及び無脂肪のブタの皮膚（厚さ０．３ｍｍ）を、４℃で２４時間脱水し、そして３５０バールの圧力及び４０℃の温度下でのｓｃＣＯ_２に９０分間さらすことによって脱細胞化して、細胞成分を除去した。

そして、脱細胞化されたブタの皮膚を、ＮａＯＨ、過酸化水素溶液、低温脱水及び第２のｓｃＣＯ_２で順に処置した。具体的には、脱細胞化されたブタの皮膚を、１ＮのＮａＯＨ溶液に２時間、そして１％の過酸化水素溶液に１時間浸漬した。そして、ブタの皮膚に、エタノール及びｓｃＣＯ_２が１：１０の体積比で存在する共溶媒としてのエタノールの存在下で、３５０バール及び４０℃でのｓｃＣＯ_２の第２の処置を、９０分間行い、不純物のないコラーゲン足場を生成した。

コラーゲン足場を４℃で８～３０時間脱水し、粉砕機（Ｒｅｔｓｃｈ社、ＺＸ２００）によって独立して直径約１００～１５０μｍのコラーゲン粒子に粉砕した。結果として生成されたコラーゲン粒子をガンマ線（１０～５０ｋＧｙ）で照射し、さらに使用するまで無菌条件で保存した。上述の方法によって生成されたコラーゲン粒子を電子顕微鏡によって観察し、ＥＭ写真は、各コラーゲン粒子の原線維構造が粉砕後に無傷のままであることを明らかにした。

実施例２：実施例１のコラーゲン粒子による毛包新生又は血管新生の誘導
実施例１のコラーゲン粒子が皮膚組織において生物学的足場として作用し得るか否かを調べるために、ウサギの耳の特定の一領域（約１ｃｍ×１ｃｍ）に、実施例１のコラーゲン粒子（直径１００～１５０μｍ）を含むコラーゲン溶液（１００μＬ、３５ｍｇ／ｍＬ）を注入し、一方で、同じ耳の他の領域に、対照としてそれぞれ同体積のポリ乳酸（３０ｍｇ／ｍＬ）、ヒアルロン酸（２０ｍｇ／ｍＬ）又は通常の生理食塩水を注入した。注入の３０日後、耳から皮膚組織を採取し、免疫組織化学染色によって試験した。結果を表１及び図１に示す。
表１．様々な処置後のウサギ皮下組織における毛包新生及び血管新生

図１に示すように、通常の生理食塩水（対照群、図１のパネル（Ａ））、ポリ乳酸（図１のパネル（Ｂ））及びヒアルロン酸（図１のパネル（Ｃ））の処置と比較して、毛包新生（図１のパネル（Ｄ）、赤色矢印）及び血管新生（図１のパネル（Ｄ）、黒色矢印）が、本コラーゲン粒子溶液を注入したウサギの耳で検出された。一方で、ポリ乳酸又はヒアルロン酸を注入した領域では毛包新生又は血管新生は検出されなかった。

結果として、無傷の原線維構造を有する本コラーゲン粒子は、幹細胞及び線維芽細胞の成長を支持する皮下組織を保持し、幹細胞は特定の細胞に分化可能となり、ｄｅｎｏｖｏコラーゲンを含むより多くの成長因子及び細胞外マトリックスを分泌するように線維芽細胞を誘導して、パラクラインシグナル伝達を介して毛包成長を刺激して線維芽細胞の血管新生を誘導するため、ｉｎｖｉｖｏで生体足場として用いられ得る。

実施形態の上記説明は例示としてのみ与えられること及び種々の変形が当業者によってなされ得ることが理解されるはずである。上記仕様、実施例及びデータは、発明の例示的実施形態の構造及び使用の完全な説明を与える。発明の種々の実施形態がある程度の特殊性で又は１以上の個別の実施形態を参照して上述されたが、当業者であれば、この発明の趣旨又は範囲から逸脱することなく開示の実施形態に対して多数の変更を行うことができるはずである。

Claims

被検体における毛包新生又は血管新生を誘導するための医薬品の調製のためのコラーゲン粒子の使用であって、前記医薬品はコラーゲン粒子を含み、前記コラーゲン粒子は直径約１０～２００μｍである、使用。
前記コラーゲン粒子は、直径約１００～１５０μｍである、請求項１に記載の使用。
前記コラーゲン粒子は、０．１～１０００ｍｇ／ｃｍ^２の量で前記被検体に投与される、請求項１に記載の使用。
前記コラーゲン粒子は、５ｍｇ／ｃｍ^２の量で前記被検体に投与される、請求項３に記載の使用。
前記コラーゲン粒子は、前記被検体に皮下投与される、請求項１に記載の使用。
前記コラーゲン粒子は、
（１）厚さ約０．１～２ｍｍの動物の皮膚を、約１００～５００バールの圧力及び約３０～５０℃の温度での超臨界二酸化炭素の第１のフローに約２０分間～１０時間さらして、前記動物の皮膚を脱細胞化するステップと、
（２）ステップ（１）の脱細胞化された前記動物の皮膚をアルカリ溶液にさらすステップと、
（３）ステップ（２）の前記アルカリ溶液で処置された前記動物の皮膚を過酸化水素溶液にさらすステップと、
（４）ステップ（３）の前記過酸化水素溶液で処置された前記動物の皮膚を、共溶媒の存在下で、約１００～５００バールの圧力及び約３０～５０℃の温度での超臨界二酸化炭素の第２のフローに約２０分間～１０時間さらして、コラーゲン足場を生成するステップと、
（５）ステップ（４）の前記コラーゲン足場を脱水及び顆粒化して前記コラーゲン粒子を生成するステップと、
を備える方法であって、
有機溶媒も架橋剤も用いない方法によって調製される、請求項１に記載の使用。
ステップ（１）において、前記動物の皮膚は、３５０バールの前記圧力及び４０℃の前記温度での前記超臨界二酸化炭素の第１のフローに９０分間さらされる、請求項６に記載の使用。
ステップ（２）において、前記アルカリ溶液は水酸化ナトリウム溶液である、請求項６に記載の使用。
ステップ（４）において、前記動物の皮膚は、３５０バールの前記圧力及び４０℃の前記温度での前記超臨界二酸化炭素の第２のフローに９０分間さらされる、請求項６に記載の使用。
ステップ（４）において、前記共溶媒はエタノールである、請求項６に記載の使用。
ステップ（５）において、前記コラーゲン足場は、液体窒素中で前記コラーゲン粒子へと切断又は粉砕される、請求項６に記載の使用。