CN108276489A - 胶原蛋白及其制备方法、应用 - Google Patents

胶原蛋白及其制备方法、应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别涉及胶原蛋白及其制备方法、应用。本发明提供的胶原蛋白能够显著增加D‑半乳糖致衰老裸鼠模型皮肤水分含量，与模型对照组相比，胶原蛋白高、中剂量组皮肤及动物肝脏MDA含量明显减少，胶原蛋白高、皮肤羟脯胺酸含量明显增加，胶原蛋白高剂量组皮肤及动物肝脏血浆SOD含量明显增加，胶原蛋白高剂量组动物血浆中T‑AOC明显增加。实验结果表明，胶原蛋白具有抗氧化、清除自由基的作用，对于保持皮肤水分，提高皮肤胶原蛋白含量具有较好的作用。

Description

胶原蛋白及其制备方法、应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及胶原蛋白及其制备方法、应用。
背景技术
八十年代后期，随着我国改革开发政策的深入，人民生活水平逐渐提高。在丰衣足食之余，开始关注个人的外在美，常会因为自己的皮肤问题苦恼，因此，近年来美容的需求也迅速增长。提供能够改善皮肤衰老的药物、化妆品或保健食品具有重要的现实意义。
皮肤衰老是复杂的、多因素综合作用的过程，可导致皮肤组织学和功能性损伤。常表现为：皮肤松弛、结节、皮革样外观、明显干燥和脱屑。
皮肤干燥是指皮肤缺乏水分令人感觉不适的现象。其症状主要为皮肤发紧、个别部位干燥脱皮。冬春季节我国的大部分的确气候寒冷干燥，手足干燥、皲裂、出血的现象及其普遍。一般的护理产品，通过降低表皮的水分透过率来达到皮肤保湿和防止干裂的效果，但是经过水洗后这种对皮肤保护及修护的作用就会降低。
延缓皮肤衰老、皮肤美白与保湿等是目前皮肤美容领域研究的热点问题。胶原蛋白具有良好的保湿和护肤功效，具体表现在以下几个方面：(1)胶原蛋白含亲水性的天然保湿因子，而且三螺旋结构能强劲锁住水分，让皮肤时刻保持湿润、水嫩的状态；(2)活性胶原蛋白对皮肤的渗透性强，可透过角质层与皮肤上皮细胞结合，参与和改善皮肤细胞的代谢，使皮肤中的胶原蛋白活性加强。它能保持角质层水分及纤维结构的完整性，改善皮肤细胞生存环境和促进皮肤组织的新陈代谢，增强血液循环，达到滋润皮肤的目的；(3)胶原蛋白良好的保水能力使皮肤水润亮泽，散发健康的光彩；(4)当胶原蛋白被皮肤吸收后，填充在皮肤真皮之间，增加皮肤紧密度，产生皮肤张力，缩小毛孔，使皮肤紧绷而富有弹性。真皮中丰满的胶原蛋白层，将皮肤细胞撑起，结合保湿和抑制皱纹的作用，共同达到舒展粗纹、淡化细纹的功效；(5)活性胶原蛋白能直接渗入肌肤底层，且与周围组织的亲和性好，可协助细胞制造胶原蛋白，促使皮肤细胞正常成长；(6)活性胶原蛋白本身还具有消炎和更新肌肤的作用。
但目前市售的胶原蛋白制剂的美容功效良莠不齐，因此，提供一种美白补水效果显著的胶原蛋白制剂具有重要的现实意义。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种胶原蛋白及其制备方法、应用。该胶原蛋白具有较好的美白补水效果。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种胶原蛋白，其由鱼皮经酶解制得，胶原蛋白的分子量为1000Da～6000Da。
在本发明的一些具体实施方案中，酶解采用胃蛋白酶或碱性蛋白酶；所述鱼为鳕鱼。
在本发明的一些具体实施方案中，所述胃蛋白酶的添加量为1％～3％，料液比为1:20～1:50，pH值为1～2，所述酶解的温度为37℃～45℃，所述酶解的时间为6h～9h
在本发明的一些具体实施方案中，所述碱性蛋白酶的添加量为1％～3％，料液比为1:20～1:50，pH值为9～11，所述酶解的温度为37℃～50℃，所述酶解的时间为6h～9h。
在本发明的一些具体实施方案中，制备方法中酶解采用胃蛋白酶或碱性蛋白酶；所述鱼为鳕鱼。
在本发明的一些具体实施方案中，制备方法中胃蛋白酶的添加量为1％～3％，料液比为1:20～1:50，pH值为1～2，所述酶解的温度为37℃～45℃，所述酶解的时间为6h～9h。
此外，本发明还提供了胶原蛋白的制备方法，取鱼皮酶解，制得分子量为2000Da～6000Da的胶原蛋白。
在本发明的一些具体实施方案中，制备方法中所述酶解采用胃蛋白酶或碱性蛋白酶；所述鱼为鳕鱼。
在本发明的一些具体实施方案中，制备方法中所述碱性蛋白酶的添加量为1％～3％，料液比为1:20～1:50，pH值为9～11，所述酶解的温度为37℃～50℃，所述酶解的时间为6h～9h。
本发明还提供了上述的胶原蛋白或上述的制备方法制得的胶原蛋白在制备美容的药物、化妆品和/或制剂中的应用。
本发明还提供了一种美容制剂，包括上述的胶原蛋白或上述的制备方法制得的胶原蛋白。
本发明提供了一种胶原蛋白，其由鱼皮经酶解制得，胶原蛋白的分子量为1000Da～6000Da。成纤维细胞是真皮组织的主要效应细胞，能产生胶原、纤维粘连蛋白等多种细胞外基质，成纤维细胞及其所产生的细胞外基质、基质所保持的水分是维持皮肤弹性的物质基础。大量研究证明，成纤维细胞生物学特性改变在皱纹形成过程中发挥着重要的作用，其中成纤维细胞增殖能力降低及胶原蛋白合成的降低是其最为重要的生物学特性改变之一，本实验以体外培养的人皮肤成纤维细胞为研究对象，通过胶原蛋白对成纤维细胞的五个实验，对胶原蛋白的生物活性进行研究，以探讨其保健功能的实验支持。研究显示，R和D组在对细胞的生长曲线，HE染色细胞计数，以及MDA含量测定方面都较另两组好。并由此推测胶原蛋白可能通过促进成纤维细胞增殖延缓皮肤衰老及皱纹的形成。
动物实验结果说明，胶原蛋白及其复方样品的各给药组均可以显著地抑制豚鼠血液中酪氨酸酶含量；能够降低D-半乳糖亚急性衰老模型小鼠血清中MDA含量，升高机体SOD水平，提示其能够明显降低D-半乳糖导致的脂质过氧化物的形成，对机体具有一定的抗氧化保护作用；病理组织切片结果可见，胶原蛋白及其复方样品的各给药组以及阳性对照组均减少豚鼠皮肤毛囊内含有黑色素颗粒细胞的数量；另外胶原蛋白及其复方样品还能够显著地增加D-半乳糖亚急性衰老模型小鼠皮肤的水分含量，具有一定的补水作用。同时能显著改善皮肤羟脯氨酸含量，提示能显著改善亚健康人群的皮肤。
具体实施方式
本发明公开了一种胶原蛋白及其制备方法、应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
材料与方法
试验样品
鳕鱼皮，购于海鲜市场；
试剂
柠檬酸，购于广州化学试剂厂；
乳酸，购于广州化学试剂厂；
盐酸，购于广州化学试剂厂；
氨水，购于广州化学试剂厂；
氢氧化钠，购于广州化学试剂厂；
碱性蛋白酶(30万μ/g)，购于邢台思倍特生物科技有限公司；
胃蛋白酶(10000μ/g)，购于上海如吉生物科技发展有限公司；
木瓜蛋白酶，购于北京鼎国生物技术有限公司；
羟自由基测定试剂盒，购于南京建成生物工程研究所；
超氧阴离子自由基测试试剂盒，购于南京建成生物工程研究所；
DPPH，购于sigma公司；
羟脯氨酸检测试剂盒，购于南京建成生物工程研究所。
仪器
恒温干燥箱、离心机、粉碎机、恒温水浴锅、紫外分光光度计、凝胶渗透色谱。
本发明提供的胶原蛋白及其制备方法、应用中所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
取鳕鱼皮经手术剪剪碎，置于80℃烘箱烘干12小时，后用粉碎机粉碎成粉末，置于阴凉干燥处备用。称取鳕鱼皮粉10g，加入300mL水，然后调节pH1.5，溶液升温至40℃，向溶液中加入0.10g胃蛋白酶，酶解6h，升温至80℃灭酶，再将酶解液离心过滤得到上清液。上清液喷雾干燥后获得2.56g胶原蛋白。经高效体积排阻色谱法测定胶原蛋白分子量为1000Da～5000Da。
实施例2
取鳕鱼皮经手术剪剪碎，置于80℃烘箱烘干12小时，后用粉碎机粉碎成粉末，置于阴凉干燥处备用。称取鳕鱼皮粉10g，加入300mL水，然后调节pH10.5，溶液升温至45℃，向溶液中加入0.15g碱性蛋白酶，酶解8h，升温至100℃灭酶，再将酶解液离心过滤得到上清液。上清液喷雾干燥后获得2.32g胶原蛋白。经高效体积排阻色谱法测定胶原蛋白分子量为1500Da～5500Da。
实施例3
取鳕鱼皮经手术剪剪碎，置于80℃烘箱烘干12小时，后用粉碎机粉碎成粉末，置于阴凉干燥处备用。称取鳕鱼皮粉10g，加入500mL水，然后调节pH2.0，溶液升温至45℃，向溶液中加入0.3g胃蛋白酶，酶解7.5h，升温至100℃灭酶，再将酶解液离心过滤得到上清液。上清液喷雾干燥后获得2.11g胶原蛋白。经高效体积排阻色谱法测定胶原蛋白分子量为1500Da～5500Da。
实施例4
取鳕鱼皮经手术剪剪碎，置于80℃烘箱烘干12小时，后用粉碎机粉碎成粉末，置于阴凉干燥处备用。称取鳕鱼皮粉10g，加入200mL水，然后调节pH1.0，溶液升温至37℃，向溶液中加入0.2g胃蛋白酶，酶解9h，升温至100℃灭酶，再将酶解液离心过滤得到上清液。上清液喷雾干燥后获得2.10g胶原蛋白。经高效体积排阻色谱法测定胶原蛋白分子量为2500Da～6000Da。
实施例5
取鳕鱼皮经手术剪剪碎，置于80℃烘箱烘干12小时，后用粉碎机粉碎成粉末，置于阴凉干燥处备用。称取鳕鱼皮粉10g，加入200mL水，然后调节pH9，溶液升温至37℃，向溶液中加入0.1g碱性蛋白酶，酶解11h，升温至100℃灭酶，再将酶解液离心过滤得到上清液。上清液喷雾干燥后获得2.05g胶原蛋白。经高效体积排阻色谱法测定胶原蛋白分子量为2500Da～6500Da。
实施例6
取鳕鱼皮经手术剪剪碎，置于80℃烘箱烘干12小时，后用粉碎机粉碎成粉末，置于阴凉干燥处备用。称取鳕鱼皮粉10g，加入500mL水，然后调节pH11，溶液升温至40℃，向溶液中加入0.3g碱性蛋白酶，酶解9h，升温至100℃灭酶，再将酶解液离心过滤得到上清液。上清液喷雾干燥后获得2.02g胶原蛋白。经高效体积排阻色谱法测定胶原蛋白分子量为2500Da～6500Da。对比例1
取鳕鱼皮经手术剪剪碎，置于80℃烘箱烘干12小时，后用粉碎机粉碎成粉末，置于阴凉干燥处备用。称取鳕鱼皮粉10g，加入400mL水，然后调节pH6.5，溶液升温至50℃，向溶液中加入0.25g中性蛋白酶，酶解9h，升温至100℃灭酶，再将酶解液离心过滤得到上清液。上清液喷雾干燥后获得1.81g胶原蛋白。经高效体积排阻色谱法测定胶原蛋白分子量为4000Da～6500Da。对比例2
取鳕鱼皮经手术剪剪碎，置于80℃烘箱烘干12小时，后用粉碎机粉碎成粉末，置于阴凉干燥处备用。称取鳕鱼皮粉10g，加入200mL水，然后调节pH3.0，溶液升温至50℃，向溶液中加入0.40g胃蛋白酶，酶解5h，升温至100℃灭酶，再将酶解液离心过滤得到上清液。上清液喷雾干燥后获得1.62g胶原蛋白。经高效体积排阻色谱法测定胶原蛋白分子量为5000Da～6500Da。对比例3
取鳕鱼皮经手术剪剪碎，置于80℃烘箱烘干12小时，后用粉碎机粉碎成粉末，置于阴凉干燥处备用。称取鳕鱼皮粉10g，加入600mL水，然后调节pH8.0，溶液升温至55℃，向溶液中加入0.40g碱性蛋白酶，酶解5h，升温至100℃灭酶，再将酶解液离心过滤得到上清液。上清液喷雾干燥后获得1.57g胶原蛋白。经高效体积排阻色谱法测定胶原蛋白分子量为5000Da～7000Da。测定相对分子量原理：(高效体积排阻色谱法)
以多孔性填料为固定相，依据样品组分分子体积大小的差别进行分离，在肽键的紫外吸收波长220nm条件下检测，使用相对分子质量分布测定的专用数据处理软件(即GPC软件)，对标准品和样品的色谱图及其数据进行处理，根据相对分子质量校正曲线方程，计算得到胶原蛋白肽的相对分子质量大小及分布范围。
试剂：
乙腈：色谱纯；
三氟乙酸：分析纯；
水：GB/T 6682规定的一级水。
相对分子质量校正曲线所用标准品：
细胞色素C(cytochromeC,MW12384)；
抑肽酶(aprotinin,MW6512)；
杆菌酶(bacitracin,MW1423)；
乙氨酸－乙氨酸－酪氨酸－精氨酸(MW451)；
乙氨酸－乙氨酸－乙氨酸(MW189)。
仪器和设备：
高效液相色谱仪：配有紫外检测器和含有GPC数据处理软件的色谱工作站；流动相真空抽滤脱气装置；
超声波振荡器；
分析天平：感量0.0001g。
色谱条件与系统适应性实验：
色谱柱：TSKgel G2000 SWXL 300mm×7.8mm(GEL LOT 502R)或性能与此相近的同类型其他适用于测定肽的分子量分布的凝胶柱；
流动相：乙腈：水：三氟乙酸，体积比为40：60：0.05；
检测波长：220nm；
流速：0.5mL/min；
柱温：30℃；
进样体积：10μL。
为使色谱系统符合检测要求，规定在上述色谱条件下，凝胶色谱柱的柱效即理论塔板数(N)按三肽标准品(乙氨酸－乙氨酸－乙氨酸)峰计算不低于5000，蛋白肽的分配系数(Kd)应在0～1之间。
实施例7
7.1抗超氧阴离子作用研究
原理：
模拟机体中黄嘌呤与黄嘌呤氧化酶反应系统，产生超氧阴离子自由基O2 ·-，加入电子传递物质及gress氏显色剂，使反应体系呈现紫红色，可用分光光度计测其吸光度，当被测样本中含有O2·抑制剂时，则比色时测定管的吸光度低于对照管的吸光度。按试剂盒步骤：
表1抗超氧阴离子活力检测：
混匀，10分钟后倒入1cm光径比色杯中，蒸馏水调零，波长550nm处比色。
抗超氧阴离子活力＝(对照管OD值-测定管OD值)/(对照管OD值-标准管OD值)×标准浓度(0.15mg/ml)×1000ml
7.2羟自由基测定
原理：
Fenton反应是最常见的产生羟自由基的化学反应，H2O2的量和Fenton反应产生的OH.量成正比，当给予电子受体后，用griess试剂显色，形成红色物质，其呈色与OH.的多少成正比关系。按试剂盒步骤：
表2羟自由基测定
混匀，室温放置20分钟后，1cm光径比色杯550nm处测各管吸光度值。
抑制羟自由基能力(U/ml)＝(对照管OD值-测定管OD值)/(标准管OD值-空白管OD值)×标准管浓度(8.824nmol/L)×1ml/取样量。
7.3利用DPPH·评价清除自由基能力
原理：
二苯基苦味肼基自由基[DPPH·]是一种稳定的以氮为中心的自由基，在517nm波长处有最大吸收。[DPPH·]乙醇溶液呈紫色，其浓度与吸光度呈线性关系。当有自由基清除剂存在时，可以与[DPPH·]结合或发生替代，使[DPPH·]数量减少，溶液颜色变浅，因此，可以通过在517nm波长处检测对[DPPH·]自由基的清除效果，计算其抗氧化能力。
步骤：
精密称定DPPH标准品9.06mg，乙醇定容至100mL，配制成质量浓度为0.1mg/mL的标准溶液，置4℃冰箱中保存备用。分别吸取2、4、6、8、10标准溶液，乙醇定容至10mL，517nm测其吸光度，以浓度C为横坐标，以吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线。得曲线标准方程为A＝0.0162C+0.0047
量取酶解后的鱼皮胶原蛋白溶液2ml，加入2mlDPPH溶液，摇匀，放置25min，以无水乙醇为空白管测其吸光度值。
自由基清除率(％)＝[1-(Ai-Aj)/Ao]×100
式中：A0为未加药DPPH溶液的空白吸光度；Ai为加药后DPPH溶液的吸光度；Aj为样品溶液自身的吸光度。
7.4鳕鱼皮胶原蛋白酶解液抗超氧阴离子作用结果
表3抗超氧阴离子作用结果
OD值 抗超氧阴离子活力(U/L)
实施例1制得的鱼皮胶原蛋白酶解液 0.368 100.6*
实施例2制得的鱼皮胶原蛋白酶解液 0.359 105.6**
实施例3制得的鱼皮胶原蛋白酶解液 0.365 102.0**
实施例4制得的鱼皮胶原蛋白酶解液 0.360 105.1**
实施例5制得的鱼皮胶原蛋白酶解液 0.359 105.6**
实施例6制得的鱼皮胶原蛋白酶解液 0.363 103.1**
对照管 0.535 ——
标准管 0.286 ——
阳性对照组(VE) 0.362 103.8
对比例1制得的鱼皮胶原蛋白酶解液 0.392 86.14
对比例2制得的鱼皮胶原蛋白酶解液 0.407 77.11
对比例3制得的鱼皮胶原蛋白酶解液 0.403 79.20
*示实施例与其对应的对比例相比具有显著差异(P＜0.05)，**示实施例与其对应的对比例相比具有极显著差异(P＜0.01)；
#示实施例与阳性对照组相比具有显著差异(P＜0.05)，##示实施例与阳性对照组相比具有极显著差异(P＜0.01)。
本发明实施例组分别与其对应的对比例组相比，抗超氧阴离子作用显著(P＜0.05)或极显著(P＜0.01)增强。
7.5鱼皮胶原蛋白酶解液抑制羟自由基能力结果
表4抑制羟自由基能力结果
*示实施例与其对应的对比例相比具有显著差异(P＜0.05)，**示实施例与其对应的对比例相比具有极显著差异(P＜0.01)；
#示实施例与阳性对照组相比具有显著差异(P＜0.05)，##示实施例与阳性对照组相比具有极显著差异(P＜0.01)。
由表10可得，鱼皮胶原蛋白酶解液均有抑制羟自由基能力。
本发明实施例组分别与其对应的对比例组相比，抑制羟自由基能力显著(P＜0.05)或极显著(P＜0.01)增强。
本发明实施例组与阳性对照组相比，抑制羟自由基能力显著(P＜0.05)或极显著(P＜0.01)增强。
7.6鱼皮胶原蛋白酶解液利用DPPH评价清除自由基能力
表5清除自由基能力结果
*示实施例与对比例1～3相比具有显著差异(P＜0.05)，**示实施例与对比例1～3相比具有极显著差异(P＜0.01)；
#示实施例与阳性对照组相比具有显著差异(P＜0.05)，##示实施例与阳性对照组相比具有极显著差异(P＜0.01)。
由表11可得，鱼皮胶原蛋白酶解液均有清除自由基能力，其中，鱿鱼皮胶原蛋白酶解液效果相对较好。
本发明实施例组分别与其对应的对比例组相比，清除自由基能力显著(P＜0.05)或极显著(P＜0.01)增强。
本发明实施例组与阳性对照组相比，清除自由基能力显著(P＜0.05)或极显著(P＜0.01)增强。
7.7结论
本实验结果表明，通过对各种胶原蛋白的酸碱水解条件及酶解条件的研究，得出如下初步结论：鳕鱼皮胶原蛋白经过碱解条件为0.3mol/L氨水碱解2小时，酶解条件为8000U/g胃蛋白酶酶解8小时后，能够得到相对分子量较小的胶原蛋白。
经过本实验酸(或碱)解和酶解之后获得的胶原蛋白，进行了体外抗氧化活性的研究，结果表明，鳕鱼皮胶原蛋白均具有体外抗氧化功能。鳕鱼皮抗超氧阴离子活力及抑制羟自由基能力效果较好。
实施例8
8.1胶原蛋白改善皮肤水份实验
8.1.1被试物质
胶原蛋白高剂量组及胶原蛋白中剂量组中的胶原蛋白有实施例1～实施例6制得。
阳性对照药：维生素E胶丸，广州星群药业股份有限公司生产，规格：50mg/粒，每瓶60粒：批号：GE50003。
8.1.2试验动物
(1)动物种系：BALB I c-nu/nu裸小鼠。
(2)性别：全部雌性。
(3)体重范围：试验时体重：17.6～24.lg。
(4)来源：上海斯莱克实验动物有限责任公司。
(5)等级：SPF级。
(6)实验动物生产许可证号：SCXK(沪)2007-0005。实验动物质量合格证：N0.0066091。实验动物使用许可证号：SYXK(粤):2008-0003，动物实验设施使用证明：N0.0041317。
(7)品系选择理由：裸鼠为改善皮肤水分药物研究适宜选用的动物，该全身无毛有利于药物对皮肤作用的效果进行观察。
8.1.3实验动物饲养管理
广州医药工业研究院10楼SPF级动物房，广东省动物实验环境设施检测合格证号：动物实验环境设施检验报告号：NO.C2009061。
动物饲养条件：检疫观察期为10只/盒饲养；实验期为8-10只/盒。动物房环境控制：动物房环境温度21.3 25.1℃，相对湿度4 1.2 69.7％，换气次数10～20次/小时，12小时照明/12小时黑暗明暗交替，工作照度150-300Lx，动物照度15-20Lx，压差20 50pa。SPF级动物的饲养管理：小鼠饲养盒每周至少更换2次垫料，每两周至少更换一次笼盖，每天及时补充足够的饮用水，每周更换饮水瓶至少2次，换笼后动物的粪便以及垫料收集后交本院后勤保障部统一处理。SPF级动物房内每天工作完毕后由实验人员先用消毒液清洁相关用品然后再用消毒液拖地。
饲料名称：鼠颗粒配合饲料，购自广东省医学实验动物中心，配制标准及营养要求符合GB-14924.3-2001标准。
饮水情况：饮用水为经高温高压灭菌的自来水，由饮水瓶自由摄取。动物饮用水每年检定2次，确保动物饮用水符合国家饮用水标准。
垫料情况：垫料购自广东省医学实验动物中心，每年检测一次。
8.1.4主要试剂
丙二醛(MDA)测定试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒、总抗氧化力(T-AOC)测定试剂盒、羟脯胺酸测定试剂盒、组织蛋白测定试剂盒，均购自南京建成生物工程研究所，批号均为：20090915。
D-半乳糖，国药集团化学试剂有限公司，生化试剂，批号：F20090324,规格：25克/瓶。
Masson三色染色试剂盒：广州市佣科贸易有限公司提供，批号：2009年8月1日，保存：4℃。
弹力纤维染色试剂盒，广州市佣科贸易有限公司提供，批号：2009年8月15日，保存：4℃。
小鼠皮肤I型胶原ELISA试剂盒，批号N0900621,提供单位：大连泛邦化工技术开发有限公司。
《小鼠皮肤III型胶原ELISA试剂盒，批号N0900624,提供单位：大连泛邦化工技术开发有限公司。
小鼠透明质酸ELISA测定试剂盒，批号N0900058,T提供单位：大连泛邦化工技术开发有限公司。
8.1.5主要仪器
(1)电子天平：TE4100-L，赛多利斯科学仪器(北京〉有限公司(2)电子天平：124S,北京赛多利斯科学仪器有限公司
(3)BS224S电子天平：德国Sartorius公司
(4)BP2100电子天平：德国Sartorius公司
(5)酶标仪：Emax，美国Molecular Devices公司
(6)Leica ASP 300全密封自动脱水机：德国Leica
(7)Leica EG 1160石蜡包埋机：德国Leica
(8)Microm HM400平推式切片机：德国MICROM
(9)日立7020自动血液生化分析仪：日本HITACHI公司
(10)高分辨率专业显微数码照相机，型号：DP71-IPP6.0，日本奥林巴斯株式会社生产。
(11)病理图像分析软件：Image-Pro Plus 6.0,Media Cyberneti cs公司
(12)数字皮肤水份检测仪：日本SCALAR Corp生产
8.2试验方法
5.2.1试验设计
(1)模型建立的依据：D-半乳糖所致的亚急性皮肤衰老模型系在一定时间内(一般为六周)通过皮下连续注射D-半乳糖，使机体细胞内半乳糖浓度增高，在醛糖还原酶催化下，还原成半乳糖醇，该物质不能在细胞内进一步代谢而堆积，影响细胞正常渗透压，导致细胞代谢紊乱，自由基堆积，造成细胞损伤，又由于糖代谢在三大物质代谢中具有重要作用，糖代谢的紊乱进而影响到蛋白质、脂质的代谢，也影响到细胞内抗氧化酶的合成，且D半乳糖在代谢过程中产生了H202从而使细胞清除自由基的能力下降，细胞发生一系列退行性变化，呈现衰老状态。据报道青年鼠造模后，某些衰老指标检测可达21月龄的自然衰老鼠的衰老程度。动物出现皮肤的衰老导致角质层含水量减少与其天然保湿因子减少，从而导致皮肤水份减少。本专题通过改善皮肤水分复方对D-半乳糖造成的皮肤衰老裸鼠模型的抗氧化能力、皮肤含水量及皮肤胶原纤维、弹性纤维等的研究，考察该美容产品改善皮肤含水量、抗氧化、抗衰老的功效及作用机制，为临床提供基础理论依据。
(2)剂量设计及理由：本项目的受试药的剂量设计如下：
表6组别及剂量设计
8.2.2试验具体方法
(1)造模方法：取检疫合格的雌性昆明种小鼠50只，随机分成5组，正常组按2mL/kg体重肌肉注射灭菌药用级植物油：造模方法：除正常对照组外，其余各组裸鼠每天上午皮下注射经过滤除菌的D-半乳糖IOOOmg/kg，正常对照组裸鼠每天皮下注射等量生理盐水，连续40d。造模时实行无菌操作。
(2)给药方法：试验设三项共5个动物组组别：正常、模型对照组、阳性(维生素E)对照组各1组；给药组2组：胶原蛋白高、低剂量组。每组不少于8只动物。
各组造模同时开始灌服相应的药物20mL/kg,正常组与模型组灌服蒸馆水20mL/kg，每天1次，连续40d。
(3)末次处理：末次给药1h后，各组裸鼠腹主动脉采血，盛于含有肝素(己干燥)的加盖塑料管内，离心取血浆进行相关指标的研究。处死各组裸鼠，取皮肤、肝脏适量，经预冷生理盐水漂洗。
(4)肝脏匀浆的方法：量取该组织块9倍重量预冷生理盐水，用移液器取重量2/3的生理盐水于平皿中，用眼科小剪尽快剪碎组织块。将剪碎的组织倒入玻璃匀浆器中，再将剩余的1/3生理盐水用来冲洗残留在平皿中的组织块，于冰浴制成10％组织匀浆。匀浆液以3000rpm离心10分钟，取上清液放入-20℃冰箱中储存并尽快检测。
(5)皮肤匀浆的方法：
小鼠皮肤除去皮下脂肪和其他结缔组织，滤纸拭干，称重：用眼科小剪尽快剪碎组织块。量取该组织块9倍重量预冷生理盐水，连同将剪碎的组织转移入lOmL的塑料离心管中，用手提式高速分散器以20000rpm左右的转速，每次作用5-10秒，反复2-3次，于冰浴中制成10％组织匀浆。匀浆液以3000rpm离心10分钟，取上清液放入20℃冰箱中储存并尽快检测。
(6)指标检测：
①常规指标：观察各组裸鼠活动情况、情绪、肤色、二便性状、食欲等，每3d测体重1次并记录。
②血清、皮肤及肝中SOD、MDA、总抗氧化力(T-AOC)的测定。制备取血浆和皮肤及肝匀浆，测试按试剂盒说明书进行。
a.皮肤及肝脏组织蛋白含量测定
原理：采用考马斯亮兰比色法。蛋白质分子具有一NH3 +基团，当棕红色的CBBG250加显色剂加入蛋白标准液或样品中时，CBBG250染料上的阴离子与蛋白
-NH3 +结合，使溶液变为蓝色，通过测吸光度可计算出蛋白含量。测定方法如下表：
表7考马斯亮兰比色法测定蛋白含量操作步骤：
试剂 空白管 标准管 测定管
蒸馏水 0.05
0.615g/mL标准液(mL) 0.05
1％组织匀浆样品(mL) 0.05
考马斯亮兰显色剂(mL) 3.0 3.0 3.0
混匀，静置10分钟，于595nm处，1cm光径，用蒸馏水调零，测各管OD值，代入以下公式计算：
(蛋白含量＝(测定管OD值一空白管OD值)/(标准管OD
值一空白管OD值)×标准管浓度(g/L)
b.皮肤及肝脏SOD测定
测定方法为：①分别在测定管及对照管加试剂1.OmL。②在测定管加皮肤或肝脏匀浆液0.03mL，在对照管加蒸馏水0.3mL。③分别在测定管和对照管加试剂二、试剂三、试剂四各0.1mL。④用旋涡混匀器充分混匀，置37℃恒温水浴40分钟。⑤分别在测定管及对照管加显色剂2mL混匀，室温放置10分钟，于波长550nm处，1cm光径比色杯，蒸馏水调零，比色。
组织SOD活力(U/mgprot)(对照管吸光度一测定管吸光度)/
对照管吸光度÷50％×反应体系稀释倍数÷组织中蛋白质含量
(mgprot/mL)
c.皮肤及肝脏MDA测定
采用改良TBA法。具体方法如下：①在标准管加入1OnmoL/mL标准品0.2mL，在标准空白管加入无水乙醇0.2mL，在测定管及测定空白管分别加待测10％肝脏或皮肤匀浆液0.2mL，②在标准管、标准空白管、测定管分别加入测定管混合试剂4mL，测定空白管加入对照管混合试剂4mL。③旋涡混匀器混匀，试管口用保鲜膜扎紧，用针头刺一小孔，95℃水浴40分钟。④取出后流水冷却，然后3500转/分，离心10分钟，取上清，532nm处，1cm光径比色杯。蒸馏水调零，测定各管吸光度。
组织中MDA含量(nmoL/mgprot)＝(测定管吸光度-测定空白管吸光度)/(标准管吸光度-标准空白管吸光度)×10nmol/mL(标准品浓度)÷组织中蛋白质含量(mgprot/mL)。
d.皮肤及肝脏T-AOC的测定
测定原理:采用Fe3+还原法测定，按测定试剂盒说明书操作。根据皮肤组织中有许多抗氧化物质能使Fe3+还原成Fe2+，后者可与菲啉类物质形成稳固的络合物的原理，通过比色可测出其抗氧化能力的高低。操作步骤见下表：
表8 T-AOC测定操作步骤
用旋涡混匀器充分混匀，37℃水浴30分钟。
表9
试剂 对照管 测定管
4号试剂(1mL) 0.2 0.2
蒸馏水(mL) 0.2
旋涡混匀器充分混匀，放置10分钟，对照管(或蒸馏水管)调零，1cm光径比色杯。蒸馏水调零，520nm处测定各管吸光度。
计算公式：定义：在37℃时，每分钟每毫克蛋白样品，使反应体系的吸光度(OD)值每增加0.01时，为一个抗氧化能力单位。
总抗氧化能力(U/mgprot)＝(所测得OD值-对照管OD值)÷0.0 1÷30×(反应液总体积-取样量mL)×样品测试前稀释倍数÷蛋白含量
③皮肤水分测试：采用数字皮肤水份检测仪测定干预前后各组裸鼠皮肤水分，皮肤水分测试在给药前测定一次，给药后每周测定一次，每次皮肤水分测定在给药后1小时进行。
④在动物末次处理后，剪下取下皮肤组织约0.5克，再精密称皮肤湿重，放置80℃干燥箱中48h，称皮肤干重。皮肤含水量＝(湿重-干重)/湿重×100％。
⑤皮肤羟脯氨酸含量测定：精确称取皮肤湿重0.03～0.05g，先根据羟脯氨酸试剂盒说明书进行前处理，再根据羟脯氨酸在氧化剂的作用下所产生的氧化产物与二甲氨基苯甲醛作用呈现紫红色的原理，按照试剂盒说明书进行羟脯氨酸含量测定。
测定方法：样本先进行前处理：a样品水解：精确称取组织湿重30～100mg放入试管中，准确加水解液lmL，混匀。加盖后95℃或者沸水浴水解20分钟。b调pH值至6.0-6.8左右：将各试管流水冷却后各管加指示剂1滴，摇匀；各管准确加入调pH甲液1.0mL，混匀，用200μL的加样器吸取调pH的乙液向各管内逐滴加入，每滴加入后要混匀，直至液体中指示剂的颜色变成黄绿色。此时pH值在6.0-6.8左右，加蒸馏水至lOmL，混匀：取3-4mL稀释的水解液加适量活性炭(约20-30mg左右，以上清液离心后澄清无色为准)，混匀，3500转/分离心10分钟，小心取上清1mL作检测。C试验操作方法见表10：
表10皮肤羟脯氨酸测定操作步骤
混匀，60℃水浴15分钟，冷却后，3500转/分离心10分钟，取上清在550nm处，1cm光径，蒸馏水调零，测各管吸光度。
羟脯氨酸含量(μg/mL)＝(测定管吸光度-空白管吸光度)/(标准管吸光度-空白管吸光度)*标准管含量*水解液总体积/取样量
⑥皮肤透明质酸检测：
按上述方法制备10％皮肤匀浆液，匀浆液在4℃中7000rpm离心，去上清液(含游离型透明质酸)-20℃储存待测。用酶联免疫法测得透明质酸的含量，计算匀浆液中透明质酸含量。检测方法根据试剂盒说明书进行：a.先把标准品进行稀释，b.加样：分别设空白孔(除不加样品及酶标试剂，其余步骤相同)、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品孔加上稀释好的标准品50μL。在酶标包被板上待测样品孔先加上样品稀释液40μL，然后再加待测样品10μL，注意不要有气泡，轻轻混匀，酶标板加上盖，37℃反应120分钟。c.弃去液体，甩干，每孔加满30倍稀释后洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。如此重复5次，拍干。d.每孔加入酶标试剂50μL，空白孔除外。轻轻晃动混匀37℃温育30分钟。e.弃去液体，甩干，每孔加满30倍稀释后洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。如此重复5次，拍干。f.每孔加显色液A50μL，再加加显色液B50μL，轻轻晃动混匀，37℃避光显色10分钟。g.依序每孔加终止溶液50μL，终止反应。用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)。计算方法：用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
⑦皮肤I、III型胶原比例检测：取皮肤组织匀浆液上清，用酶联免疫法测皮肤I、III型胶原的含量，并计算皮肤I、III型胶原比例。皮肤I、III型胶原检测方法根据试剂盒说明书进行：具体方法与上述皮肤透明质酸检测的方法大致相同。
⑧皮肤组织形态学指标检测：用HE染色在光学显微镜下观察表皮组织结构完整性、细胞分层情况、真皮层纤维组织等；用自主品红染色(Gonori染色)法进行弹力纤维染色；用Masson 3色染色法进行胶原纤维的染色。
HE染色的方法如下：制成的石蜡切片烘干后，浸入透明剂I中30分钟以上，此时切片转成透明状态。将切片分别移入透明剂II、III中，并在其缸内提取一、二次，借以洗涤，每缸5-0分钟即可。滤净残留于切片上的透明剂，再移入无水乙醇I、II内，洗去透明剂，每缸2-5分钟。移入95％乙醇内浸洗约5分钟。移入80％乙醇内浸洗约5分钟。再以蒸馏水清洗，1分钟左右。将经过蒸馏水洗涤后的切片投入Mayer改良苏木素染液中，一般浸染3分钟左右，作胞核染色。放入流水中洗去残存在切片上的染液。0.5％盐酸乙醇分化数秒钟，然后投入流水中返蓝10分钟左右。经过充分水洗之后，移入95％乙醇中浸染约5分钟，再移入0.5％伊红乙醇溶液中复染胞浆约1分钟。移入95％乙醇中1-2秒分化。依次无水酒精I、II中进行彻底脱水，每缸约5分钟。再依次移入透明剂I、II、III中，等待切片的透明，每缸浸入5-10分钟即可，放置较久亦无妨碍。最后以封固剂病理封片胶将切片封固。结果观察：核——蓝色或紫蓝色，胞浆——不同程度的粉红色，肌纤维——较深的粉红色，胶原纤维——粉红色，红血球——桔红色。
用醛品红染色(Gonori染色〉法进行弹力纤维染色方法(根据试剂盒说明书操作进行)如下：切片脱蜡至70％酒精(方法同HE染色中的脱蜡至水)，A液染色1小时，70％酒精洗去A液，自来水冲洗5-10分钟，加B液3-5分钟，自来水冲洗5-10分钟，常规脱水透明(方法同HE染色中的脱水透明)，中性树胶封片。结果观察：弹力纤维深棕色，细胞核蓝色。
Masson三色进行胶原纤维的染色方法如下：切片脱蜡至水(方法同HE染色中的脱蜡至水)，加Al液A2液(1:1)混合液(即配即用)染色5-10分钟。流水稍洗。1％酒精分化。流水冲洗10分钟。加B液5-10分钟。蒸馏水洗去B液约1-2分钟。加C液5分钟。不用水洗，倒去C液，直接加D液约1分钟。加1％冰醋酸洗去D液约1分钟。11.95％酒精洗3次，每次约1分钟。无水酒精脱水。二甲苯透明(方法同HE染色中的脱水透明)，中性树胶封。结果观察：胶原纤维蓝色，胞质、肌纤维、红细胞红色，胞核蓝褐色。
8.3试验结果
8.3.1一般观察结果
试验前全部小鼠均状态良好。与正常对照组相比，随着试验时间的延长，模型对照组出现活动减少、食欲下降、皮肤皱折稍有增加的现象。
8.3.2对动物体重的影响
试验结果(表11)表明：实验前各组动物体重接近(p>0.05)，从试验开始至试验结束，正常对照组体重增加最多，实施例2制得的胶原蛋白组体重也显著增加。
8.3.3对动物皮肤水分的影响
试验结果(表12)表明：实验前各组动物用皮肤水分测定仪所检测的皮肤水分含量无明显差异(p>0.05)，与空白对照组相比，模型对照组在造模17天至实验结束，皮肤水分含量均明显降低(p<0.05)。与模型对照组相比，在给药第10天各给药组皮肤水分有增加的趋势(p>0.05)；在给药第17天，胶原蛋白高剂量组皮肤水分明显增加：在给药第24天和第31天，胶原蛋白高、低剂量组皮肤水分明显增加(p<0.05或0.01)；给药第38天，维生素E组，胶原蛋白高、低剂量组皮肤水分明显增加(p<0.05或0.01)。而用烘干法在试验结束时测得的皮肤水分含量，与正常组相比，模型对照组皮肤水分明显减少，与模型对照组相比，维生素E组，胶原蛋白高剂量组皮肤水分明显增加(p<0.05)。
8.3.4对动物皮肤各种生化指标的影响
试验结果(表13、续表13)表明：与空白对照组相比，模型对照组皮肤下AOC、SOD含量、羟脯氨酸含量、透明质酸含量、I型胶原含量明显减少(p<0.05)，皮肤MDA含量有增加的趋势，皮肤III型胶原含量以及皮肤I/II型胶原比值有减少的趋势(p>0.05)。与模型对照组相比，维生素E组、胶原蛋白高、低剂量组皮肤MDA的含量明显减少(p<0.05或0.01)，维生素E组皮肤下AOC明显增加(p<0.05)，维生素E、胶原蛋白高剂量组SOP含量明显增加(p<0.05),胶原蛋白高剂量组皮肤羟脯氨酸含量明显增加(p<0.05),维生素E组、胶原蛋白高低剂量组皮肤I/III型胶原比值有增加的趋势(p>0.05)。
8.3.5对动物肝脏生化指标的影响
试验结果(表14表明)：与空白对照组相比，模型对照组肝脏SOD含量明显减少(p<0.01),MDA含量明显增加(p<0.05),T-AOC略有减少(p>0.05)。维生素E组、胶原蛋白低剂量组肝脏MDA含量明显减少(p<0.05)；维生素E组T-AOC明显增加(p<0.05)。
5.3.6对动物血浆生化指标的影响
试验结果(表15表明)：与空白对照组相比，模型对照组血浆SOD含量有减少的趋势(p>0.05)，MDA含量明显增加(p<0.05)，T-AOC明显减少(p<0.05)。与模型对照组相比，维生素E组、胶原蛋白高、低剂量组血浆SOD含量均明显增加(p<0.05)；维生素E组、胶原蛋白高剂量组、T-AOC明显增加(p<0.05)。
8.4结果讨论及评价
机体的衰老与自由基反应有密切的关系，随着年龄的增长，抗氧化酶活性下降，机体不能完全清除自由基，自由基对机体的损伤不断积累，进而引起衰老现象。而SOD、MDA、总抗氧化力(T-AOC)与机体的抗氧化能力及自由基的清除密切相关。本实验结果提示：维生素E胶原蛋白高低剂量组、均有不同程度的抗氧化、清除自由基的作用。
表皮、真皮水分大量丢失，含水量减少，会导致皮肤干燥，萎瘪，出现皮肤老化，缺乏弹性，出现皱纹。因此皮肤的水分含量与皮肤的衰老密切相关。本实验采用两种方法测定皮肤含水量。使用数字皮肤水份检测仪测定皮肤水分是根据皮肤角质层的电容量来反应角质层的含水量，而烘干法是根据皮肤湿重及烘干后的干重推算皮肤的总含水量，故两者测定结果并不是相同的。从本实验结果表明：D-半乳糖连续皮下注射40天能导致裸小鼠的皮肤水分减少，而维生素E、胶原蛋白高剂量组有较好的提高皮肤含水量的作用。
皮肤真皮层的主要骨架是胶原纤维，在维持皮肤的韧性和弹性方面起主要作用。在衰老的过程中，分子内与分子间的交联现象日益增加，加剧了胶原纤维的老化和作用失常。胶原纤维的合成主要通过成纤维细胞的参与完成，在人体衰老过程中，胶原纤维的数量减少，导致皮肤松弛、干燥、缺乏弹性。本实验结果表明动物用D-半乳糖造模后可导致皮肤中胶原蛋白含量的减少，而维生素E组能提高皮肤中I型胶原蛋白的含量，胶原蛋白高低剂量组亦有提高I型胶原蛋白的含量的趋势。研究发现婴儿及青年人皮肤I型胶原的含量约占70％,III型胶原占30％。而皮肤衰老时，两者的比例逐渐倒置。本实验中模型对照组I/III型胶原比例略有减少，可能与D-半乳糖导致动物机体的衰老有关，维生素E、胶原蛋白高低剂量组I/III型胶原比例有一定程度的提高。
羟脯氨酸是一种非必需氨基酸，是胶原纤维和胶原蛋白中的一种主要而又相对恒定的氨基酸，在胶原蛋白中占13.4％，而胶原蛋白大部分分布在皮肤、肌腱、软骨、血管等处，随着年龄的增长，胶原蛋白交联、老化皮肤僵硬缺乏弹性，羟脯氨酸含量降低，因此可以把皮肤中注脯氨酸的测定作为反映实验动物皮肤衰老的一个指标。本实验结果提示：模型对照组羟脯氨酸含量明显减少，而胶原蛋白高剂量组能提高皮肤中羟脯氨酸的含量。
弹力纤维虽然只占真皮中的一小部分，但对皮肤及其他器官的伸展及回缩能力至关重要。而皮肤弹性是判断皮肤老化的重要标志之一。本实验用地衣红染色法观察皮肤组织中的弹力纤维。本实验中可见模型对照组弹力纤维有所减少，而胶原蛋白高低剂量组弹力纤维有一定的增加。
8.5试验结论
在本试验条件下，裸小鼠连续皮下注射D-半乳糖40天可导致的机体抗氧化及清除自由基能力的下降，皮肤水分减少，皮肤胶原蛋白含量减少，从而导致皮肤的衰老。实验结果表明，维生素E、胶原蛋白高低剂量组均有不同程度的抗氧化、清除自由基的作用。维生素E、胶原蛋白高低剂量组对保持皮肤水分，提高皮肤胶原蛋白含量有较好的作用。
表11胶原蛋白对裸小鼠体重的影响
注：与模型对照组进行比较，*表示P<0.05，**表示P<0.01
表12胶原蛋白对裸小鼠皮肤水分的影响
注：与模型对照组进行比较，*表示P<0.05，**表示P<0.01
表13胶原蛋白对小鼠皮肤生化指标的影响
注：与模型对照组进行比较，*表示P<0.05，**表示P<0.01
续表13胶原蛋白对小鼠皮肤生化指标的影响
注：与模型对照组进行比较，*表示P<0.05，**表示P<0.01.
表14胶原蛋白对小鼠肝脏生化指标的影响
注：与模型对照组进行比较，*表示P<0.05，**表示P<0.01
表15胶原蛋白对小鼠血浆生化指标的影响
注：与模型对照组进行比较，*表示P<0.05，**表示P<0.01
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种胶原蛋白，其特征在于，其由鱼皮经酶解制得，所述胶原蛋白的分子量为1000Da～6000Da。
2.根据权利要求1所述的胶原蛋白，其特征在于，所述酶解采用胃蛋白酶或碱性蛋白酶；所述鱼为鳕鱼。
3.根据权利要求2所述的胶原蛋白，其特征在于，所述胃蛋白酶的添加量为1％～3％，料液比为1:20～1:50，pH值为1～2，所述酶解的温度为37℃～45℃，所述酶解的时间为6h～9h。
4.根据权利要求2或3所述的胶原蛋白，其特征在于，所述碱性蛋白酶的添加量为1％～3％，料液比为1:20～1:50，pH值为9～11，所述酶解的温度为37℃～50℃，所述酶解的时间为6h～9h。
5.一种胶原蛋白的制备方法，其特征在于，取鱼皮酶解，制得分子量为2000Da～6000Da的胶原蛋白。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述酶解采用胃蛋白酶或碱性蛋白酶；所述鱼为鳕鱼。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述胃蛋白酶的添加量为1％～3％，料液比为1:20～1:50，pH值为1～2，所述酶解的温度为37℃～45℃，所述酶解的时间为6h～9h。
8.根据权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于，所述碱性蛋白酶的添加量为1％～3％，料液比为1:20～1:50，pH值为9～11，所述酶解的温度为37℃～50℃，所述酶解的时间为6h～9h。
9.根据权利要求1至4任一项所述的胶原蛋白或如权利要求5至8任一项所述的制备方法制得的胶原蛋白在制备美容的药物、化妆品和/或制剂中的应用。
10.一种美容制剂，其特征在于，包括如权利要求1至4任一项所述的胶原蛋白或如权利要求5至8任一项所述的制备方法制得的胶原蛋白。
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