CN110028568B - 一种拟穴青蟹抗菌多肽Sp-NPFin及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种拟穴青蟹抗菌多肽Sp‑NPFin及其应用，其分子式为C227H373N71O62S1，其氨基酸序列如SEQ ID NO：01所示。本发明的拟穴青蟹抗菌多肽Sp‑NPFin，具有较强的抗细菌活性及抗真菌活性，抗菌效果好，抗菌谱广，杀菌速率快，其来源于甲壳动物，既可以应用于水产饲料添加剂，也可以研制成为防霉防腐剂、抗菌剂和抗菌药物等，具有广泛的应用前景。

Description

一种拟穴青蟹抗菌多肽Sp-NPFin及其应用
技术领域
本发明属于海洋分子生物学技术领域，具体涉及一种拟穴青蟹抗菌多肽Sp-NPFin及其应用。
背景技术
神经肽是由神经系统及各种组织释放的一类有神经活性的高度保守的多效应肽类物质，其广泛存在于从水螅纲到人类的各个器官水平的神经系统中。在脊椎动物与无脊椎动物中，神经肽都具有非常重要的调节功能且十分保守，一些无脊椎动物的神经肽与脊椎动物的神经肽或很相似或是同源。
脊椎动物神经肽Y(Neuropeptide Y，NPY)，又称神经肽酪氨酸，由瑞典科学家Tatemoto等于1982年从猪脑中首次分离出来，属于胰多肽家族。在哺乳动物中，NPY具有促进摄食、调节体温、影响激素分泌、调节心血管功能、改变生物节律及学习记忆等多种功能。近年来，NPY在免疫系统的作用也逐渐被认识，研究表明NPY可直接作用于肥大细胞、中性粒细胞，引起细胞的脱颗粒反应，促进血小板聚集、白细胞黏附、巨噬细胞活化及Th1/Th2细胞分化，从而参与免疫反应。作为NPY在无脊椎动物中的同源肽，神经肽F(Neuropeptide F，NPF)已在绦虫、线虫、甲壳动物、昆虫等多种无脊椎动物上成功得到鉴定。NPF也是一种多效应肽，其大部分生理相关功能，如摄食、攻击行为、生物节律、学习能力等，均在模式生物果蝇中首次被发现，而后在其他无脊椎动物中得到验证。但是关于NPF在免疫反应，尤其是甲壳动物免疫反应中的研究尚少。
抗菌肽(Antimicrobial Peptide，AMP)是一类广泛存在于自然界生物体中的小分子多肽，具有广谱的抗菌活性，是生物体先天性免疫防御系统的重要组成部分，在机体对抗外界病原微生物感染和自身免疫调节中发挥着重要作用。尽管神经肽与抗菌肽在来源及生理上具有多样性，但两者之间也有一些共同的结构和生物物理特征。与传统抗菌肽类似，某些神经肽也具有小分子(＜10KDa)、阳离子、两亲性等结构特征。这些属性使神经肽能够与带负电荷的微生物细胞膜成分相互作用，导致细胞膜屏障功能紊乱，最终导致细胞裂解死亡。
发明内容
本发明的目的在于提供一种拟穴青蟹抗菌多肽Sp-NPFin。
本发明的另一目的在于提供上述拟穴青蟹抗菌多肽Sp-NPFin的应用。
本发明的技术方案之一如下：
一种拟穴青蟹抗菌多肽Sp-NPFin，其分子式为C227H373N71O62S1，其氨基酸序列如SEQID NO：01所示。
本发明的技术方案之二如下：
上述拟穴青蟹抗菌多肽Sp-NPFin在制备抗菌药物中的应用。
本发明的技术方案之三如下：
一种抗菌药物，其有效成分包括上述拟穴青蟹抗菌多肽Sp-NPFin。
在本发明的一个优选实施方案中，其有效成分为上述拟穴青蟹抗菌多肽Sp-NPFin。
本发明的技术方案之四如下：
上述拟穴青蟹抗菌多肽Sp-NPFin在制备防霉防腐药物中的应用。
本发明的技术方案之五如下：
一种制备防霉防腐药物，其有效成分包括上述拟穴青蟹抗菌多肽Sp-NPFin。
在本发明的一个优选实施方案中，其有效成分为上述拟穴青蟹抗菌多肽Sp-NPFin。
本发明的技术方案之六如下：
上述拟穴青蟹抗菌多肽Sp-NPFin在制备水产饲料添加剂中的应用。
本发明的技术方案之七如下：
一种水产饲料添加剂，其有效成分包括上述拟穴青蟹抗菌多肽Sp-NPFin。
在本发明的一个优选实施方案中，其有效成分为上述拟穴青蟹抗菌多肽Sp-NPFin。
本发明的有益效果是：
1、本发明的拟穴青蟹抗菌多肽Sp-NPFin由45个氨基酸组成，分子式为C227H373N71O62S1，分子量为5120.957道尔顿，其中含有11个带正电的氨基酸残基和2个带负电的氨基酸残基，根据氨基酸残基电荷预测该抗菌肽等电点为11.48，亲水性平均系数为-0.802，具有很强的水溶性，是一种带有正电荷的阳离子多肽。
2、本发明的拟穴青蟹抗菌多肽Sp-NPFin对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、霉菌均有显著的抗菌效果。此外，Sp-NPFin对正常拟穴青蟹血细胞、正常哺乳动物细胞如小鼠肝实质细胞和人正常肝细胞不具有细胞毒性作用。
3、本发明的拟穴青蟹抗菌多肽Sp-NPFin，具有较强的抗细菌活性及抗真菌活性，抗菌效果好，抗菌谱广，杀菌速率快，其来源于甲壳动物，既可以应用于水产饲料添加剂，也可以研制成为防霉防腐剂、抗菌剂和抗菌药物等，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为拟穴青蟹抗菌多肽Sp-NPFin对铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的杀菌动力学图；在图1中，横坐标为时间(min)，纵坐标为杀菌指数(％)
图2为拟穴青蟹抗菌多肽Sp-NPFin对铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌抗菌活性热稳定性图；在图2中，横坐标为时间(h)，纵坐标为OD600值。
图3至图8为拟穴青蟹抗菌多肽Sp-NPFin抑制霉菌孢子萌发实验图：其中，图3为禾谷镰孢菌，图4为腐皮镰孢菌，图5为尖孢镰孢菌，图6为烟曲霉，图7为赭曲霉，图8为黑曲霉。上述Sp-NPFin终浓度为A：0μM；B：1.5μM；C：3μM；D：6μM；E：12μM；F：24μM；G：48μM；H：DPBS。
图9为拟穴青蟹抗菌多肽Sp-NPFin与铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌作用后扫描电镜观察图；其中，A：金黄色葡萄球菌；B：金黄色葡萄球菌+24μM Sp-NPFin+10min；C：金黄色葡萄球菌+48μM Sp-NPFin+10min；D：金黄色葡萄球菌+24μM Sp-NPFin+30min；E：金黄色葡萄球菌+48μM Sp-NPFin+30min；F：铜绿假单胞菌；G：铜绿假单胞菌+12μM Sp-NPFin+30min；H：铜绿假单胞菌+24μM Sp-NPFin+30min；I：铜绿假单胞菌+12μM Sp-NPFin+60min；J：铜绿假单胞菌+24μM Sp-NPFin+60min。
图10为拟穴青蟹抗菌多肽Sp-NPFin与黑曲霉和尖孢镰孢孢子作用后扫描电镜观察图；其中，A：黑曲霉；B：黑曲霉+6μM Sp-NPFin；C：黑曲霉+12μM Sp-NPFin；D：尖孢镰孢；E：尖孢镰孢+6μM Sp-NPFin；F：尖孢镰孢+12μM Sp-NPFin。
图11为MTS-PMS法检测拟穴青蟹抗菌多肽Sp-NPFin细胞毒性实验图；其中，横坐标为Sp-NPFin蛋白浓度(μM)，纵坐标为细胞增殖率(％)。
具体实施方式
以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
实施例1拟穴青蟹抗菌多肽Sp-NPFin的制备
所述拟穴青蟹抗菌多肽Sp-NPFin的氨基酸序列为：
Arg-Pro-Ser-Thr-Arg-Ser-Ala-Pro-Gly-Pro-Ala-Ser-His-Ile-Gln-Ala-Leu-Glu-Lys-Thr-Leu-Lys-Phe-Leu-Gln-Leu-Gln-Glu-Leu-Gly-Lys-Ile-Tyr-Ser-His-Met-Thr-Arg-Pro-Arg-Phe-Gly-Lys-Arg-Ser(SEQ ID NO：01)
采用现有的固相化学合成的方法即可得到纯度达95％以上拟穴青蟹抗菌多肽Sp-NPFin。本实施例中的拟穴青蟹抗菌多肽Sp-NPFin委托吉尔生化(上海)有限公司以固相合成方法合成获得，并提供多肽分子量、HPLC等检测信息。
抗菌多肽Sp-NPFin理化参数如表1所示。
表1抗菌多肽Sp-NPFin理化参数
Figure BDA0001991054820000041
由表1可知Sp-NPFin分子量小、稳定性较好，具有很强的水溶性，是一种带有正电荷的阳离子多肽。
实施例2拟穴青蟹抗菌多肽Sp-NPFin最小抑菌浓度(MIC：Minimum InhibitionConcentration)和最小杀菌浓度(MBC：Minimum Bactericidal Concentration)的测定
本实施例中所涉及到的菌株有：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas Aeruginosa)、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)、弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、哈氏弧菌(Vibrio harveyi)、河流弧菌(Vibrio fluvialis)、解藻朊酸弧菌(Vibrio alginolyticus)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、白假丝酵母(Candida albicans)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、毕赤酵母(Pichiapastoris)、禾谷镰孢(Fusarium graminearum)、尖孢镰孢(Fusarium oxysporum)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、赭曲霉(Aspergillus ochraceus)、黑曲霉(Aspergillusniger)、腐皮镰孢(Fusarium solani)。毕赤酵母GS115购自Invitrogen公司，其余菌株均购自中国科学院微生物研究所菌种保藏中心，由本实验室保种贮藏。
具体方法如下：
(1)将保种的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒状杆菌、蜡状芽孢杆菌、表皮葡萄球菌、溶壁微球菌、大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、施氏假单胞菌、弗氏志贺氏菌、荧光假单胞菌和嗜水气单胞菌涂布于营养肉汤平板上，在各适宜温度倒置培养18-24h；将哈氏弧菌、河流弧菌、解藻朊酸弧菌、副溶血弧菌涂布于2216平板上，于28℃倒置培养18-24h；新型隐球菌、白假丝酵母菌和毕赤酵母涂布于YPD平板上，于28℃倒置培养1-3d；禾谷镰孢、尖孢镰孢、烟曲霉、赭曲霉、黑曲霉、腐皮镰孢孢子涂布于马铃薯葡萄糖平板上，于28℃倒置培养1-7d。
(2)从各平板上挑取菌落接种于相应的培养基斜面上，细菌、弧菌继续培养18-24h，酵母真菌继续培养1-3d，霉菌继续培养1-7d。用10mM磷酸钠缓冲液(pH＝7.4)将细菌、弧菌和酵母真菌从斜面上冲下，调整菌悬液浓度。用MH液体培养基和磷酸钠缓冲液混合液稀释细菌；用YPD液体培养基和磷酸钠缓冲液混合液稀释酵母真菌；用2216液体培养基稀释弧菌，使得菌体的最终浓度为3.3×104cfu/mL。用10mM磷酸钠缓冲液(pH＝7.4)将霉菌孢子从斜面上冲下，用马铃薯葡萄糖液体培养基和磷酸钠缓冲液混合液稀释孢子，利用血球计数板在光学显微镜下对孢子计数，调整孢子浓度，使得霉菌孢子最终浓度为5×104个/mL。
(3)将已合成的Sp-NPFin粉末分别用灭菌MiliiQ水溶解，经过0.22μm滤膜过滤后，倍比稀释蛋白浓度至3μM、6μM、12μM、24μM、48μM、96μM，置于冰上备用。
(4)在96孔细胞培养板上，每种待测菌设置空白对照组、阴性对照组和待测实验组，每组设置三个平行：
a空白对照组：50μL待测蛋白样品和50μL培养基
b阴性对照组：50μL无菌Milli-Q水和50μL菌悬液
c待测实验组：50μL待测蛋白样品和50μL菌悬液
(5)将96孔细胞培养板置于28℃培养箱中，培养1-2d，观察待测实验组中MIC结果；将待测实验组吹打混匀后，吸取适量的菌液滴于相应固体培养基平板上，于适宜温度倒置培养1-2d，观察MBC结果。
拟穴青蟹抗菌肽Sp-NPFin MIC、MBC观察结果如表2所示：
表2拟穴青蟹抗菌肽Sp-NPFin的抗菌活性
Figure BDA0001991054820000061
Figure BDA0001991054820000071
注：MIC：最小抑菌浓度(μM)，用a-b表示。a：肉眼可见菌体生长的最高蛋白浓度；b：肉眼未见菌体生长的最低蛋白浓度
MBC：最小杀菌浓度(μM)，用a-b表示。a：平板可见菌落生长的最高蛋白浓度；b：平板未见菌落生长的最低蛋白浓度
实施例3拟穴青蟹抗菌多肽Sp-NPFin杀菌动力学曲线
选取铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌作为待测菌，对拟穴青蟹抗菌多肽Sp-NPFin的杀菌动力学进行测定。
具体方法如实施例2中所述的抗菌活性测定类似。调整Sp-NPFin终浓度至1倍MBC(铜绿假单胞菌：12μM，金黄色葡萄球菌：24μM)。在共孵后10min、30min、60min、120min、180min、360min，将96孔细胞培养板取空白对照组、阴性对照组、待测实验组混匀，吸取6μL铜绿假单胞菌菌悬液稀释至600μL DPBS中，混匀后吸取40μL涂布至营养肉汤平板上，37℃倒置培养1-2d，记录铜绿假单胞菌单克隆数量，计算杀菌指数。在共孵后2min、4min、6min、8min、10min、30min、60min，将96孔细胞培养板取空白对照组、阴性对照组、待测实验组混匀，吸取20μL金黄色葡萄球菌菌悬液涂布至营养肉汤平板上，37℃倒置培养1-2d，记录金黄色葡萄球菌单克隆数量，计算杀菌指数。
杀菌指数是指经过一定时间共孵后，待测实验组的克隆数与阴性对照组克隆数的比值，用百分比表示(参见图1)。
实施例4拟穴青蟹抗菌肽Sp-NPFin抗菌活性热稳定性
选取铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌作为待测菌，对拟穴青蟹抗菌肽Sp-NPFin的抗菌活性热稳定性进行测定。
具体方法如实施例2中所述的抗菌活性测定类似。调整Sp-NPFin终浓度至1倍MBC(铜绿假单胞菌：12μM，金黄色葡萄球菌：24μM)，分别在100℃沸水中水浴10min、20min、30min后置于冰上备用。将Sp-NPFin或者无菌DPBS分别与待测菌共同孵育，在0h、12h、24h、36h、48h时用酶标仪测定OD600的值(参见图2)。
实施例5拟穴青蟹抗菌多肽Sp-NPFin作用后霉菌孢子萌发的光学显微镜观察
选取禾谷镰孢、尖孢镰孢、烟曲霉、赭曲霉、黑曲霉、腐皮镰孢作为待测菌，观察拟穴青蟹抗菌肽Sp-NPFin对各霉菌孢子萌发的影响。
具体方法如实施例2中所述的抗菌活性测定类似。调整Sp-NPFin蛋白浓度为3μM、6μM、12μM、24μM、48μM、96μM，置于冰上备用；调整各霉菌孢子最终浓度为5×104个/mL。将等体积各浓度Sp-NPFin与各霉菌孢子于96孔细胞培养板混匀，置于28℃培养箱中，静置培养24h，在光学显微镜下观察霉菌孢子萌发情况(参见图3-8)。
实施例6拟穴青蟹抗菌多肽Sp-NPFin与细菌、真菌孢子作用后的扫描电镜观察
选取铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、黑曲霉、尖孢镰孢作为待测菌株，扫描电镜样品的制备按以下步骤进行：
(1)如实施例2所述制备铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌悬液(OD600＝0.4)，制备黑曲霉和尖孢镰孢孢子悬液(5×106个/mL)，冰上放置备用。
(2)用灭菌纯水溶解合成肽Sp-NPFin，并调整蛋白浓度为6μM、12μM、24μM、48μM，冰上放置备用。
(3)悬液和蛋白等体积混合后在适宜温度孵育适宜时间。其中铜绿假单胞菌菌悬液分别与12μM Sp-NPFin、24μM Sp-NPFin于37℃孵育30min、60min；金黄色葡萄球菌菌悬液分别与24μM Sp-NPFin、48μM Sp-NPFin于37℃孵育10min、30min；黑曲霉孢子悬液分别与6μM Sp-NPFin、12μM Sp-NPFin于28℃孵育60min；尖孢镰孢孢子悬液分别与6μM Sp-NPFin、12μM Sp-NPFin于28℃孵育60min。
(4)加入等体积戊二醛固定液，4℃固定2h后，1000g离心10min。
(5)去尽上清，PBS清洗一次，1000g离心10min。
(6)去除大部分上清，留约10μL液体，将剩余悬液滴在玻片上，4℃静置过夜。
(7)PBS清洗一次。
(8)30％-50％-70％-80％-90％-95％-100％-100％(v/v)乙醇逐级脱水，每级脱水15min。
(9)用叔丁醇置换乙醇，4℃过夜冷冻；或者醋酸异戊酯置换乙醇后待干燥。
(10)叔丁醇脱水的用冷冻干燥仪冷冻干燥；醋酸异戊酯脱水的用临界点干燥仪干燥。
(11)喷金后用扫描电子显微镜观察及拍照。(参见图9和图10)
实施例7拟穴青蟹抗菌多肽Sp-NPFin细胞毒性测定
选取正常拟穴青蟹血细胞、人肾上皮细胞(293T)和人正常肝细胞(L02)，对拟穴青蟹抗菌肽Sp-NPFin细胞毒性进行测定。
(1)收集生长状态良好的拟穴青蟹血细胞、人肾上皮细胞和人正常肝细胞，调整细胞浓度为1×105个/mL，将细胞均匀吹散，在96孔细胞培养板中每孔加入100μL细胞悬液，置于适宜温度培养箱培养至80％以上细胞贴壁。
(2)小心吸出培养基，加入含有不同浓度(0μM、0.75μM、1.5μM、3μM、6μM、12μM、24μM、48μM)Sp-NPFin的培养基，置于适宜温度培养箱培养24h。
(3)加入20μL MTS-PMS溶液后避光孵育2h后，使用酶标仪测得OD492值，评价Sp-NPFin的细胞毒性(参见图11)。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。
序列表
<110> 厦门大学
<120> 一种拟穴青蟹抗菌多肽Sp-NPFin及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 45
<212> PRT
<213> 拟穴青蟹(Scylla paramamosain)
<400> 1
Arg Pro Ser Thr Arg Ser Ala Pro Gly Pro Ala Ser His Ile Gln Ala
1 5 10 15
Leu Glu Lys Thr Leu Lys Phe Leu Gln Leu Gln Glu Leu Gly Lys Ile
20 25 30
Tyr Ser His Met Thr Arg Pro Arg Phe Gly Lys Arg Ser
35 40 45

Claims (7)

1.一种拟穴青蟹抗菌多肽Sp-NPFin，其特征在于：其分子式为C227H373N71O62S1，其氨基酸序列如SEQ ID NO：01所示。
2.权利要求1所述的拟穴青蟹抗菌多肽Sp-NPFin在制备抗菌药物中的应用，其特征在于：该抗菌药物对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒状杆菌、大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、施氏假单胞菌、弗氏志贺氏菌、荧光假单胞菌、尖孢镰孢、黑曲霉和腐皮镰孢具有抗菌作用。
3.一种抗菌药物，其特征在于：其有效成分包括如权利要求1所述的拟穴青蟹抗菌多肽Sp-NPFin。
4.如权利要求3所述的抗菌药物，其特征在于：其有效成分为如权利要求1所述的拟穴青蟹抗菌多肽Sp-NPFin。
5.权利要求1所述的拟穴青蟹抗菌多肽Sp-NPFin在制备水产饲料添加剂中的应用。
6.一种水产饲料添加剂，其特征在于：其有效成分包括如权利要求1所述的拟穴青蟹抗菌多肽Sp-NPFin。
7.如权利要求6所述的水产饲料添加剂，其特征在于：其有效成分为如权利要求1所述的拟穴青蟹抗菌多肽Sp-NPFin。
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