CN117106051A - 一种拟穴青蟹抗菌肽Spasin及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种拟穴青蟹抗菌肽Spasin及其应用，其分子式为C121H217N35O31S1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.01所示。本发明是一种带有正电荷的阳离子多肽，具有易合成、抗菌谱广、抗菌活性高且稳定等特点，在防霉防腐、抗菌等药物研究方面具有很好应用前景。
Description
技术领域
本发明属于海洋分子生物学技术领域，具体涉及一种拟穴青蟹抗菌肽Spasin及其应用。
背景技术
抗菌肽(AMPs)是一类进化上保守的分子，作为先天免疫的介质，几乎存在于所有生物体中。早期对抗菌肽的研究包括从斑蛙(Bombina Variegate)皮肤中分离纯化Bombinin，从天蚕蛾(Hyalophora Cecropia)血淋巴中分离纯化天蚕素，以及从人中性粒细胞中鉴定的防御素等。缺乏适应性免疫系统的无脊椎动物尤其依赖抗菌肽和其他先天免疫因子来抵抗入侵的病原体。其主要功能是直接杀死或抑制入侵的微生物，包括细菌、病毒、真菌和寄生虫。
抗菌肽的快速合成和释放是无脊椎动物宿主防御的关键策略。AMPs的主要功能是直接杀死或抑制入侵的微生物，包括细菌、病毒、真菌和寄生虫。AMPs发挥直接抗菌能力的主要方式是与微生物膜相互作用，这种相互作用导致脂质双层结构的解体。AMPs的亲水和疏水区域赋予了结合微生物膜的脂质成分和磷脂基的能力。
海洋甲壳动物拟穴青蟹生活史中伴随多次蜕壳过程，因其自身是开放系统，其蜕壳过程是脆弱的发育阶段，易受微生物侵染，拟穴青蟹在进化过程中形成多样且有效地先天性免疫系统，甲壳动物能够产生不同于脊椎动物的天然免疫抗菌因子，其细胞免疫及体液免疫系统是开发新型高效广谱抗病原微生物抗菌肽的重要来源。
发明内容
本发明目的在于提供一种拟穴青蟹抗菌肽Spasin及其应用。
本发明的技术方案如下：
一种拟穴青蟹抗菌肽Spasin，其分子式为C121H217N35O31S1，其氨基酸序列如SEQ IDNO.01所示。
上述拟穴青蟹抗菌肽Spasin在制备抗菌组合物中的应用。
在本发明的一个优选实施方案中，其对藤黄微球菌、溶壁微球菌、屎肠球菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒状杆菌、施氏假单胞菌、鲍曼不动杆菌和荧光假单胞菌具有抑制和杀灭作用。
一种抗菌组合物，其有效成分包括上述拟穴青蟹抗菌肽Spasin。
在本发明的一个优选实施方案中，其有效成分为上述拟穴青蟹抗菌肽Spasin。
上述拟穴青蟹抗菌肽Spasin在制备抗真菌组合物中的应用。
在本发明的一个优选实施方案中，其对腐皮镰孢、尖孢镰孢、禾谷镰孢和黑曲霉具有抑制和杀灭作用。
一种抗真菌组合物，其有效成分包括上述拟穴青蟹抗菌肽Spasin。
在本发明的一个优选实施方案中，其有效成分为上述拟穴青蟹抗菌肽Spasin。
本发明的有益效果是：
1、本发明的拟穴青蟹抗菌肽Spasin由25个氨基酸组成，分子式为C121H217N35O31S1，分子量为2690.33道尔顿，其中含有7个带正电的氨基酸残基，根据氨基酸残基电荷预测该抗菌肽等电点为10.24，亲水性平均系数为0.422，具有很好的水溶性，是一种带有正电荷的阳离子多肽，具有易合成、抗菌谱广、抗菌活性高且稳定等特点，在防霉防腐、抗菌等药物研究方面具有很好应用前景。
2、本发明的拟穴青蟹抗菌肽Spasin对藤黄微球菌、溶壁微球菌、屎肠球菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒状杆菌、施氏假单胞菌、鲍曼不动杆菌、荧光假单胞菌、腐皮镰孢、尖孢镰孢、禾谷镰孢和黑曲霉具有抑制和杀灭作用。
3、本发明的拟穴青蟹抗菌肽Spasin对人肾上皮细胞HEK-293T和斑马鱼ZF4细胞无细胞毒性。
附图说明
图1为本发明实施例3中拟穴青蟹抗菌多肽Spasin对鲍曼不动杆菌抗菌活性热稳定性图。在图1A中，横坐标为温度(℃)，纵坐标为菌落数(CFU/mL)；图1B中，横坐标为时间(min)，纵坐标为菌落数(CFU/mL)。
图2为本发明实施例4中拟穴青蟹抗菌多肽Spasin抑制尖孢镰孢孢子萌发实验图。上述Spasin终浓度为A：0μM；B：1.5μM；C：3μM；D：6μM；E：12μM；F：24μM；G：48μM；H：96μM。
图3为本发明实施例5中MTS-PMS法检测拟穴青蟹抗菌多肽Spasin细胞毒性实验图。其中，A图为293T细胞；B图为ZF4细胞。横坐标为Spasin浓度(μM)，纵坐标为细胞增殖率(％)。
具体实施方式
以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
实施例1拟穴青蟹抗菌多肽Spasin的制备
本实施例中的拟穴青蟹抗菌多肽Spasin的氨基酸序列为：
Lys-Lys-Leu-Gly-Lys-Ile-Pro-Glu-Lys-Lys-His-Lys-Val-Lys-Ser-Lys-Val-Val-Ala-Ser-Cys-Ser-Gly-Leu-Pro(SEQ ID NO.01)
该拟穴青蟹抗菌多肽Spasin采用现有的固相化学合成的方法即可得到纯度达95％以上拟穴青蟹抗菌多肽Spasin。本实施例中的拟穴青蟹抗菌多肽Spasin委托金斯瑞生物科技有限公司以固相合成方法合成获得并提供多肽分子量和HPLC等检测信息。Spasin理化参数如表1所示：
表1Spasin的理化参数
由表1可知Spasin分子量小、稳定性较好，是一种带有正电荷的阳离子多肽。
实施例2拟穴青蟹抗菌多肽Spasin最小抑菌浓度(minimum inhibitionconcentration，MIC)和最小杀菌浓度(minimum bactericidal concentration，MBC)的测定
本实施例中所涉及到的菌株有：藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)、腐皮镰孢(Fusarium solani)、尖孢镰孢(Fusariumoxysporum)、禾谷镰孢(Fusarium graminearum)、黑曲霉(Fusarium oxysporum)。以上菌株均购自中国科学院微生物研究所菌种保藏中心，由本实验室保种贮藏。
具体方法如下：
(1)将保种细菌涂布于营养肉汤平板上倒置培养过夜，真菌孢子涂布于马铃薯葡萄糖平板上，于28℃倒置培养1-7d。
(2)从各平板上挑取菌落培养至对数期，用无菌10mM磷酸钠缓冲液将待测菌从斜面上冲下，调整菌悬液浓度至为5×105CFU/mL。
(3)将已合成的Spasin粉末分别用灭菌MilliQ水溶解至3μM、6μM、12μM、24μM、48μM、96μM，置于冰上备用。
(4)在96孔细胞培养板上，每种待测菌设置空白对照组、阴性对照组和待测实验组，每组设置三个平行：
a空白对照组：50μL待测蛋白样品和50μL培养基；
b阴性对照组：50μL无菌MilliQ水和50μL菌悬液；
c待测实验组：50μL待测蛋白样品和50μL菌悬液。
(5)将96孔细胞培养板置于37℃培养箱中，培养1-2d，观察待测实验组中MIC结果；将待测实验组吹打混匀后，吸取适量的菌液滴于相应固体培养基平板上，于适宜温度倒置培养1-2d，观察MBC结果。
Spasin的抗菌活性结果如表2所示，Spasin具有广谱抗菌活性。
表2拟穴青蟹抗菌多肽Spasin的抗菌活性
注：MIC：最小抑菌浓度(μM)，用a-b表示。a：肉眼可见菌体生长的最高蛋白浓度；b：肉眼未见菌体生长的最低蛋白浓度。MBC：最小杀菌浓度(μM)，用a-b表示。a：平板可见菌落生长的最高蛋白浓度；b：平板未见菌落生长的最低蛋白浓度。
实施例3拟穴青蟹抗菌多肽Spasin抗菌活性热稳定性
本实施例选取鲍曼不动杆菌作为待测菌，对拟穴青蟹抗菌多肽Spasin抗菌活性热稳定性进行测定。
具体方法如实施例2中所述的抗菌活性测定类似。(1)调整Spasin终浓度至1倍MBC，将抗菌多肽Spasin溶液在0℃、4℃、10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃、121℃处理30min，置于冰上降温10min后与待测菌共孵(对照等体积无菌ddH2O共孵)4h后涂板，37℃恒温培养箱培养10h后计数(参见图1A)；(2)在100℃沸水中加热5min、10min、20min、30min、60min、120min、240min，置于冰上备用。将Spasin与待测菌共同孵育，在4h后涂板37℃恒温培养箱培养10h后计数(参见图1B)。如图1所示，Spasin在不同温度条件或在100℃持续热处理后仍能保持其抗菌活性。
实施例4拟穴青蟹抗菌多肽Spasin作用后真菌孢子萌发的光学显微镜观察
本实施例选取尖孢镰孢作为待测菌，观察拟穴青蟹抗菌多肽Spasin对真菌孢子萌发的影响。
具体方法如实施例2中所述的抗菌活性测定类似。调整Spasin浓度为3μM、6μM、12μM、24μM、48μM、96μM、192μM，置于冰上备用；调整真菌孢子最终浓度为5×104个/mL。将等体积各浓度Spasin与各真菌孢子于96孔细胞培养板混匀，并设置空白对照组，置于28℃培养箱中，静置培养24h，在光学显微镜下观察真菌孢子萌发情况，如图2所示。
实施例5拟穴青蟹抗菌多肽Scycin(62-85)细胞毒性测定
本实施例选取人肾上皮细胞(HEK-293T)和ZF4细胞，对拟穴青蟹抗菌肽Scycin(62-85)细胞毒性进行测定。
(1)收集生长状态良好的人肾上皮细胞和ZF4细胞，细胞计数板计数并用培养基将细胞浓度调至1×105个/mL，将细胞悬液混匀，在96孔细胞培养板中每孔加入100μL细胞悬液，置于适宜温度培养箱培养至80％以上细胞贴壁。
(2)吸出培养基，加入含有不同浓度Scycin(62-85)的培养基，置于适宜温度培养箱培养24h。
(3)每孔加入20μL MTS-PMS溶液后避光孵育2h后，用酶标仪测得OD492值，评价Scycin(62-85)的细胞毒性。
结果如图3所示，浓度高达96μM的Scycin(62-85)对人肾上皮细胞和ZF4细胞不具毒性作用。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。
Claims (9)
1.一种拟穴青蟹抗菌肽Spasin，其特征在于：其分子式为C121H217N35O31S1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.01所示。
2.权利要求1所述的拟穴青蟹抗菌肽Spasin在制备抗菌组合物中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：其对藤黄微球菌、溶壁微球菌、屎肠球菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒状杆菌、施氏假单胞菌、鲍曼不动杆菌和荧光假单胞菌具有抑制和杀灭作用。
4.一种抗菌组合物，其特征在于：其有效成分包括权利要求1所述的拟穴青蟹抗菌肽Spasin。
5.如权利要求4所述的一种抗菌组合物，其特征在于：其有效成分为权利要求1所述的拟穴青蟹抗菌肽Spasin。
6.权利要求1所述的拟穴青蟹抗菌肽Spasin在制备抗真菌组合物中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于：其对腐皮镰孢、尖孢镰孢、禾谷镰孢和黑曲霉具有抑制和杀灭作用。
8.一种抗真菌组合物，其特征在于：其有效成分包括权利要求1所述的拟穴青蟹抗菌肽Spasin。
9.如权利要求8所述的一种抗真菌组合物，其特征在于：其有效成分为权利要求1所述的拟穴青蟹抗菌肽Spasin。
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