CN114773436B

CN114773436B - 一种拟穴青蟹抗菌多肽SpRR20及其应用

Info

Publication number: CN114773436B
Application number: CN202210455289.0A
Authority: CN
Inventors: 陈芳奕; 江曼玉; 王克坚; 彭会; 陈慧芸
Original assignee: Xiamen University
Current assignee: Xiamen University
Priority date: 2022-04-27
Filing date: 2022-04-27
Publication date: 2023-01-03
Anticipated expiration: 2042-04-27
Also published as: CN114773436A

Abstract

本发明公开了一种拟穴青蟹抗菌多肽SpRR20及其应用，其分子式为C₁₀₆H₁₈₇N₄₃O₂₇S₂，其氨基酸序列如SEQ ID NO：01所示。本发明具有广谱抗细菌和抗霉菌活性，抗菌效果强，杀菌效率快，对常见水产致病菌有良好的抗菌效果；其来源于甲壳动物，无明显的细胞毒性作用，安全性高，既可以应用于水产饲料添加剂，也可以研制成为抗细菌组合物和抗霉菌组合物等，具有广泛的应用前景。

Description

一种拟穴青蟹抗菌多肽SpRR20及其应用

技术领域

本发明属于海洋分子生物学技术领域，具体涉及一种拟穴青蟹抗菌多肽SpRR20及其应用。

背景技术

我国的水产养殖产量自1991年起一直处于全世界第一的位置，为全球的粮食安全作出了突出的贡献。我国明令自2020年1月1日起全面禁止我国饲料中添加抗生素。因此，亟需开发新的抗生素有效替代品。

抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)是在自然界动植物中广泛存在的一类小分子多肽，是先天性免疫系统的重要组成部分。AMPs通过直接破坏细菌细胞膜或靶向胞内的靶点等多种作用机制来抵御病原微生物入侵，具有有良好的抗细菌、真菌、病毒以及抗寄生虫的活性，且不易诱导细菌产生耐药性。此外，除了直接的抗菌功能，抗菌肽在机体中还发挥免疫调节作用、促进伤口愈合与抑制炎症反应等。因其来源于动植物，生物相容性较好，在农业和医药等领域具有广阔的应用前景。

截至目前，抗菌肽数据库中(APD)包含大约3324条天然抗菌肽和合成肽，其中有585条来源于节肢动物，而仅有72条来源于甲壳动物。已报道的从海洋动物中分离发现的天然抗菌肽，包括甲壳素(Crustin)家族、对虾素(Penaeidins)家族、抗脂多糖因子 (ALFs)家族以及本课题组从拟穴青蟹(Scylla paramamosain)性腺中分离并具有生殖免疫功能的Scygonadin、Scyreprocin、SCY2等，同时也鉴定发现了多种抗菌短肽，如源于拟穴青蟹的Sparamosin_26-54、Sph_12-38、Sp-NPFin等。海洋无脊椎动物生活在复杂的海洋环境中，主要依靠先天性免疫系统来抵御病原微生物的入侵，其中，抗菌肽等多种免疫效应因子起重要的保护作用。因此，加速对海洋甲壳动物来源的新型抗菌多肽的发现，不仅可以为甲壳动物的病害防治策略提供科学依据，而且在未来将其开发成为抗菌药物、饲料添加剂、免疫调节剂等进一步推进新型抗菌肽的应用方面，具有重要的研究意义和应用价值。

发明内容

本发明目的在于提供一种拟穴青蟹抗菌多肽SpRR20。

本发明的另一目的在于提供上述拟穴青蟹抗菌多肽SpRR20的应用。

本发明的技术方案如下：

一种拟穴青蟹抗菌多肽SpRR20，其分子式为C₁₀₆H_1s7N₄₃O₂₇S₂，其氨基酸序列如SEQID NO：01所示。

上述拟穴青蟹抗菌多肽SpRR20在制备抗细菌组合物中的应用。

在本发明的一个优选实施方案中，所述抗细菌组合物对金黄色葡萄球菌、李斯特菌、粪肠球菌、屎肠球菌、表皮葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒状杆菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、大肠杆菌、荧光假单胞菌、施氏假单胞菌和弗氏志贺氏菌具有抑制和杀灭作用。

一种抗细菌组合物，其有效成分包括上述拟穴青蟹抗菌多肽SpRR20。

在本发明的一个优选实施方案中，所述细菌为金黄色葡萄球菌、李斯特菌、粪肠球菌、屎肠球菌、表皮葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒状杆菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、大肠杆菌、荧光假单胞菌、施氏假单胞菌和弗氏志贺氏菌。

上述拟穴青蟹抗菌多肽SpRR20在制备抗霉菌组合物中的应用。

在本发明的一个优选实施方案中，所述抗霉菌组合物对黑曲霉和腐皮镰孢具有抑制和杀灭作用，对烟曲霉和黄曲霉具有抑制作用。

一种抗霉菌组合物，其有效成分包括上述拟穴青蟹抗菌多肽SpRR20。

在本发明的一个优选实施方案中，所述霉菌为黑曲霉、腐皮镰孢、烟曲霉和黄曲霉。

一种水产饲料添加剂，其有效成分包括上述拟穴青蟹抗菌多肽SpRR20。

本发明的有益效果是：

1、本发明由20个氨基酸组成，分子式为C₁₀₆H₁₈₇N₄₃O₂₇S₂，分子量为2573.057道尔顿，其中含有6个带正电的氨基酸残基和2个带负电的氨基酸残基，根据氨基酸残基电荷预测该抗菌肽等电点为9.12，亲水性平均系数为-1.445，是一种带有正电荷的阳离子多肽。

2、本发明对细菌、霉菌具有明显的抗菌效果，同时对正常哺乳动物细胞人肾上皮细胞和拟穴青蟹正常血细胞在高浓度下不具有细胞毒性作用。

3、本发明具有广谱抗细菌和抗霉菌活性，抗菌效果强，杀菌效率快，对常见水产致病菌有良好的抗菌效果；其来源于甲壳动物，无明显的细胞毒性作用，安全性高，既可以应用于水产饲料添加剂，也可以研制成为抗细菌组合物和抗霉菌组合物等，具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例3中拟穴青蟹抗菌多肽SpRR20对金黄色葡萄球菌、施氏假单胞菌的杀菌动力学图，其中，横坐标为时间(min)，纵坐标为杀菌指数(％)。

图2为本发明实施例4中拟穴青蟹抗菌多肽SpRR20对金黄色葡萄球菌、施氏假单胞菌抗菌活性的热稳定性图，其中，横坐标为时间(h)，纵坐标为OD₆₀₀值。

图3为本发明实施例5中拟穴青蟹抗菌多肽SpRR20抑制腐皮镰孢孢子萌发的实验图，其中，SpRR20浓度为：A：0μM；B：24μM；C：48μM。

图4为本发明实施例5中拟穴青蟹抗菌多肽SpRR20抑制烟曲霉孢子萌发的实验图，其中，SpRR20浓度为：A：0μM；B：24μM；C：48μM。

图5为本发明实施例6中拟穴青蟹抗菌多肽SpRR20与金黄色葡萄球菌作用后的扫描电镜观察图，其中，A：金黄色葡萄球菌；B：金黄色葡萄球菌+12μM SpRR20。

图6为本发明实施例6中拟穴青蟹抗菌多肽SpRR20与施氏假单胞菌作用后的扫描电镜观察图，其中，A：施氏假单胞菌；B：施氏假单胞菌+6μM SpRR20。

图7为本发明实施例7中MTS-PMS法检测拟穴青蟹抗菌多肽SpRR20的细胞毒性实验图；其中，横坐标为SpRR20蛋白浓度(μM)，纵坐标为细胞增殖率(％)。

具体实施方式

以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。

实施例1拟穴青蟹抗菌多肽SpRR20的制备

本发明拟穴青蟹抗菌多肽SpRR20的氨基酸序列为：

Gln-Arg-Arg-Arg-Lys-Ala-Cys-Arg-Glu-Ile-Arg-Arg-Pro-Phe-Arg-Asn-Asp-Cys-Val-Leu (SEQ ID NO：01)

采用现有的固相化学合成的方法即可得到纯度达95％以上拟穴青蟹抗菌多肽SpRR20。本实施例中的拟穴青蟹抗菌多肽SpRR20委托金斯瑞(江苏)有限公司以固相合成方法合成获得并提供多肽分子量和HPLC等检测信息。SpRR20理化参数如表1所示：

表1 SpRR20的理化参数

由表1可知SpRR20分子量小、稳定性较好，是一种带有正电荷的阳离子多肽。

实施例2拟穴青蟹抗菌多肽SpRR20最小抑菌浓度(minimum inhibitionconcentration， MIC)和最小杀菌浓度(minimum bactericidal concentration，MBC)的测定

本实施例中所涉及到的菌株有：金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、李斯特菌(Listeria monocytogenes)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas hydrophila)、荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)、弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri)、黑曲霉(Aspergillusniger)、腐皮镰孢菌(Fusarium solani)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、黄曲霉(Aspergillus flavus)。以上菌株均购自中国科学院微生物研究所菌种保藏中心，由本实验室保种贮藏。

具体方法如下：

(1)将保种的金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、屎肠球菌、粪肠球菌、李斯特菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒状杆菌、大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、荧光假单胞菌、鲍曼不动杆菌、施氏假单胞菌、弗氏志贺氏菌涂布于营养肉汤平板上，在各适宜温度倒置培养 18-24h；黑曲霉、腐皮镰孢菌、烟曲霉、黄曲霉涂布于马铃薯葡萄糖平板上，于28℃倒置培养1-7d。

(2)从各平板上挑取菌落接种于相应的培养基斜面上，细菌继续培养18-24h。用10mM磷酸钠缓冲液(pH＝7.4)将细菌从斜面上冲下，调整菌悬液浓度。用MH液体培养基和磷酸钠缓冲液混合液稀释细菌，使得菌体的最终浓度为5×10⁵CFU/mL。用10mM磷酸钠缓冲液(pH＝7.4)将霉菌孢子从斜面上冲下，用马铃薯葡萄糖液体培养基和磷酸钠缓冲液混合液稀释孢子，利用血球计数板在光学显微镜下对孢子计数，调整孢子浓度，使得霉菌孢子最终浓度为5×10⁴个/mL。

(3)将已合成的SpRR20粉末分别用灭菌MiliiQ水溶解，经过0.22μM滤膜过滤后，倍比稀释蛋白浓度至3μM、6μM、12μM、24μM、48μM、96μM，置于冰上备用。

(4)在96孔细胞培养板上，每种待测菌设置空白对照组、阴性对照组和待测实验组，每组设置三个平行：

a空白对照组：50μL待测蛋白样品和50μL培养基；

b阴性对照组：50μL无菌MilliQ水和50μL菌悬液；

c待测实验组：50μL待测蛋白样品和50μL菌悬液。

(5)将96孔细胞培养板置于28℃培养箱中，培养1-2d，观察待测实验组中MIC结果；将待测实验组吹打混匀后，吸取适量的菌液滴于相应固体培养基平板上，于适宜温度倒置培养1-2d，观察MBC结果。

拟穴青蟹抗菌多肽SpRR20对金黄色葡萄球菌、李斯特菌、枯草芽孢杆菌的最小杀菌浓度为6～12μM，对大肠杆菌、鲍曼不动杆菌、屎肠球菌等细菌的最小杀菌浓度为24～48μM，结果如表2所示：

表2拟穴青蟹抗菌多肽SpRR20的抗菌活性分析

注：MIC：最小抑菌浓度(μM)，用a-b表示。a：肉眼可见菌体生长的最高蛋白浓度；b：肉眼未见菌体生长的最低蛋白浓度。MBC：最小杀菌浓度(μM)，用a-b表示。a：平板可见菌落生长的最高蛋白浓度；b：平板未见菌落生长的最低蛋白浓度。

实施例3拟穴青蟹抗菌多肽SpRR20杀菌动力学曲线

选取金黄色葡萄球菌、施氏假单胞菌作为待测菌，对拟穴青蟹抗菌多肽SpRR20的杀菌动力学进行测定。

具体方法如实施例2中所述的抗菌活性测定类似。调整SpRR20终浓度至1倍MBC(金黄色葡萄球菌：12μM；施氏假单胞菌：6μM)。SpRR20与被测细菌共孵一定的时间后，取6μL菌悬液稀释后取适量涂布于营养肉汤平板上，37℃培养1-2d进行克隆计数。灭菌 MillQ水与菌悬液共孵0h的样品作为阳性对照，取6μL经同样稀释倍数涂布于营养肉汤平板上的克隆数定义为100％，杀菌指数用经一定时间孵育的实验组的克隆数相对于阳性对照克隆数的百分比表示，如图1所示，SpRR20在1min内即能杀灭施氏假单胞菌，而金黄色葡萄球菌则在60min内杀灭。

实施例4拟穴青蟹抗菌多肽SpRR20抗菌活性热稳定性

选取金黄色葡萄球菌和施氏假单胞菌作为待测菌，对拟穴青蟹抗菌肽SpRR20的抗菌活性热稳定性进行测定。

具体方法如实施例2中所述的抗菌活性测定类似。调整SpRR20终浓度至2倍MBC(金黄色葡萄球菌：24μM，施氏假单胞菌：12μM)，分别在100℃沸水中水浴10min、20min、30min后置于冰上备用。将SpRR20与待测菌共同孵育，在0h、12h、24h、36h、48h时用酶标仪测定OD₆₀₀的值，如图2所示，SpRR20经沸水浴30min后仍保留良好的抗菌活性。

实施例5拟穴青蟹抗菌多肽SpRR20作用后霉菌孢子萌发显微镜观察

选取腐皮镰孢、烟曲霉作为待测菌，观察拟穴青蟹抗菌肽SpRR20对霉菌孢子萌发的影响。

具体方法如实施例2中所述的抗菌活性测定类似。调整SpRR20蛋白浓度为24μM、48μM，置于冰上备用；调整各霉菌孢子最终浓度为5×10⁴个/mL。将等体积各浓度SpRR20 与各霉菌孢子于96孔细胞培养板混匀，置于28℃培养箱中，静置培养24h，在光学显微镜下观察霉菌孢子萌发情况，结果如图3和图4所示，SpRR20在浓度为24μM时杀灭腐皮镰孢的孢子，在浓度为48μM时抑制烟曲霉的萌发。

实施例6拟穴青蟹抗菌多肽SpRR20与细菌作用后的扫描电镜观察

选取金黄色葡萄球菌、施氏假单胞菌作为待测菌株，扫描电镜样品的制备按以下步骤进行：

(1)如实施例2所述制备金黄色葡萄球菌、施氏假单胞菌菌悬液(OD₆₀₀＝0.4)冰上放置备用。

(2)用灭菌纯水溶解合成肽SpRR20，并调整蛋白浓度为12μM和6μM，冰上放置备用。

(3)菌悬液和蛋白等体积混合后在适宜温度孵育适宜时间。其中金黄色葡萄球菌菌悬液与12μM SpRR20于37℃孵育30min；施氏假单胞菌菌悬液与6μM SpRR20于37℃孵育30min。

(4)加入等体积戊二醛固定液，4℃固定2h后，1000g离心10min。

(5)去尽上清，PBS清洗一次，1000g离心10min。

(6)去除大部分上清，留约10μL液体，将剩余悬液滴在玻片上，4℃静置过夜。

(7)PBS清洗一次。

(8)30％-50％-70％-80％-90％-95％-100％-100％(v/v)乙醇逐级脱水，每级脱水15min。

(9)临界点干燥法干燥样品。

(10)喷金后用扫描电子显微镜观察及拍照。

结果如图5和图6所示，SpRR20处理后，金黄色葡萄球菌及施氏假单胞菌菌体细胞膜破裂，内容物渗出，细菌死亡。

实施例7拟穴青蟹抗菌多肽SpRR20细胞毒性测定

选取人肾上皮细胞(HEK-293T)和拟穴青蟹正常血细胞，对拟穴青蟹抗菌肽SpRR20细胞毒性进行测定。

(1)收集生长状态良好的拟穴青蟹血细胞、人肾上皮细胞，调整细胞浓度为1×10⁵个/mL，将细胞均匀吹散，在96孔细胞培养板中每孔加入100μL细胞悬液，置于适宜温度培养箱培养至80％以上细胞贴壁。

(2)小心吸出培养基，加入含有不同浓度(0μM、3μM、6μM、12μM、24μM、 48μM)SpRR20的培养基，置于适宜温度培养箱培养24h。

(3)加入20μL MTS-PMS溶液后避光孵育2h后，使用酶标仪测得OD₄₉₂值，评价SpRR20的细胞毒性。

结果如图7所示，浓度高达48μM的SpRR20对人肾上皮细胞和拟穴青蟹血细胞不具毒性作用。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

序列表

<110> 厦门大学

<120> 一种拟穴青蟹抗菌多肽SpRR20及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> PRT

<213> 拟穴青蟹(Scylla paramamosain)

<400> 1

Gln Arg Arg Arg Lys Ala Cys Arg Glu Ile Arg Arg Pro Phe Arg Asn

1 5 10 15

Asp Cys Val Leu

20

Claims

1.一种拟穴青蟹抗菌多肽SpRR20，其特征在于：其分子式为C₁₀₆H₁₈₇N₄₃O₂₇S₂，其氨基酸序列如SEQ ID NO：01所示。

2.权利要求1所述的拟穴青蟹抗菌多肽SpRR20在制备抗细菌组合物中的应用，其特征在于：所述抗细菌组合物对金黄色葡萄球菌、李斯特菌、屎肠球菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒状杆菌、鲍曼不动杆菌、大肠杆菌、荧光假单胞菌、施氏假单胞菌和弗氏志贺氏菌具有抑制和杀灭作用。

3.一种抗细菌组合物，其特征在于：其有效成分包括权利要求1所述的拟穴青蟹抗菌多肽SpRR20，所述细菌为金黄色葡萄球菌、李斯特菌、屎肠球菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒状杆菌、鲍曼不动杆菌、大肠杆菌、荧光假单胞菌、施氏假单胞菌和弗氏志贺氏菌。

4.权利要求1所述的拟穴青蟹抗菌多肽SpRR20在制备抗霉菌组合物中的应用，其特征在于：所述抗霉菌组合物对腐皮镰孢具有抑制和杀灭作用。

5.一种抗霉菌组合物，其特征在于：其有效成分包括权利要求1所述的拟穴青蟹抗菌多肽SpRR20，所述霉菌为腐皮镰孢。

6.一种水产饲料添加剂，其特征在于：其有效成分包括权利要求1所述的拟穴青蟹抗菌多肽SpRR20。