CN117417426A - 一种大黄鱼抗菌多肽Laricrocin及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种大黄鱼抗菌多肽Laricrocin及其应用，其氨基酸序列如SEQ ID NO.01所示。本发明的大黄鱼抗菌多肽Laricrocin具有较强的抗细菌活性及抗真菌活性，抗菌效果好，抗菌谱广，杀菌速率快，其来源于脊椎动物，既可以应用于水产饲料添加剂，也可以研制成为防霉防腐剂和抗菌药物等，具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于海洋分子生物学技术领域，具体涉及一种大黄鱼抗菌多肽Laricrocin及其应用。
背景技术
由于世界范围内长期广泛的将抗生素应用在医学和养殖等领域，导致抗生素滥用引起的全球性污染问题日益严峻。我国农业农村部发布194号公告，明令自2020年1月1日起全面禁止我国饲料中添加抗生素。因此亟需开发新型抗菌药物减少甚至代替抗生素的使用。
抗菌肽(Antimicrobial Peptide，AMP)是一种存在动植物和微生物体内重要的先天性免疫因子，其结构和功能多样，具有抗细菌、真菌、病毒和寄生虫等活性，且不易产生细菌耐药性。根据携带电荷性质的不同分为阳离子抗菌肽和阴离子抗菌肽。抗菌肽主要通过直接作用于细菌细胞膜或靶向胞内靶点等多种方式来抵御病原微生物的入侵；抗菌肽还可以通过调节宿主的免疫反应来发挥作用，因此抗菌肽被认为是抗生素的最佳替代品。
鱼类是水生动物的主要组成部分，由于鱼体内的抗体数量有限，淋巴细胞成熟较慢，因此先天免疫系统被认为是鱼类对抗病原体的重要免疫系统，而抗菌肽是先天免疫系统的重要免疫因子。目前，已报道从鱼类中分离的抗菌肽主要是piscidins、cathelicidin、defensins和hepcidin等。因此，加速对海洋动物来源的新型抗菌肽的筛选不仅可以为鱼类的病害防治策略提供科学依据，而且在未来还可以将其开发成为抗菌药物、饲料添加剂、免疫调节剂等，对进一步推进新型抗菌肽的应用具有重要的研究意义和应用价值。
发明内容
本发明目的在于提供一种大黄鱼抗菌多肽Laricrocin。
本发明的另一目的在于提供上述大黄鱼抗菌多肽Laricrocin的应用。
本发明的技术方案如下：
一种大黄鱼抗菌多肽Laricrocin，其氨基酸序列如SEQ ID NO.01所示。
上述大黄鱼抗菌多肽Laricrocin在制备抗细菌组合物中的应用。
在本发明的一个优选实施方案中，所述大黄鱼抗菌多肽Laricrocin对金黄色葡萄球菌、屎肠球菌、粪肠球菌、铜绿假单胞菌、荧光假单胞菌、鲍曼不动杆菌和副溶血弧菌具有抑制和杀灭作用。
一种抗细菌组合物，其有效成分包括上述大黄鱼抗菌多肽Laricrocin。
上述大黄鱼抗菌多肽Laricrocin在制备抗真菌组合物中的应用。
在本发明的一个优选实施方案中，所述大黄鱼抗菌多肽Laricrocin对新型隐球菌、白色念珠菌、禾谷镰孢和黑曲霉具有抑制和杀灭作用。
一种抗真菌组合物，其有效成分包括上述大黄鱼抗菌多肽Laricrocin。
上述大黄鱼抗菌多肽Laricrocin在制备水产饲料添加剂中的应用。
在本发明的一个优选实施方案中，其有效成分包括上述大黄鱼抗菌多肽Laricrocin。
本发明的有益效果是：
1、本发明的大黄鱼抗菌多肽Laricrocin由25个氨基酸组成，分子式为C152H228N56O30S1，分子量为3351.90道尔顿，其中含有8个带正电的氨基酸残基和1个带负电的氨基酸残基，根据氨基酸残基电荷预测该抗菌肽等电点为12.22，亲水性平均系数为-1.380，是一种带有正电荷的阳离子多肽。
2、本发明的大黄鱼抗菌多肽Laricrocin对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌均有抗菌效果。此外，Laricrocin对正常哺乳动物细胞如人肾上皮细胞(HEK-293T)和斑马鱼ZF4细胞不具有细胞毒性作用。
3、本发明的大黄鱼抗菌多肽Laricrocin具有较强的抗细菌活性及抗真菌活性，抗菌效果好，抗菌谱广，杀菌速率快，其来源于脊椎动物，既可以应用于水产饲料添加剂，也可以研制成为防霉防腐剂和抗菌药物等，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例3中大黄鱼抗菌多肽Laricrocin对金黄色葡萄球菌和荧光假单胞菌的杀菌动力学图；在图1中，横坐标为时间(min)，纵坐标为菌落数(CFU)。
图2为本发明实施例4中大黄鱼抗菌多肽Laricrocin对金黄色葡萄球菌和荧光假单胞菌抗菌活性热稳定性图；在图2中，横坐标为时间(h)，纵坐标为OD600值。
图3为本发明实施例5中大黄鱼抗菌多肽Laricrocin抑制黑曲霉孢子萌发实验图，其中：Laricrocin终浓度为A：0μM；B：6μM；C：12μM。
图4为本发明实施例5中大黄鱼抗菌多肽Laricrocin抑制禾谷镰孢孢子萌发实验图，其中：Laricrocin终浓度为A：0μM；B：6μM；C：12μM。
图5为本发明实施例6中大黄鱼抗菌多肽Laricrocin与金黄色葡萄球菌作用后的形态结构变化图，其中：A：金黄色葡萄球菌；B：金黄色葡萄球菌+12μM Laricrocin。
图6为本发明实施例6中大黄鱼抗菌多肽Laricrocin与荧光假单胞菌作用后的形态结构变化图，其中：A：荧光假单胞菌；B：荧光假单胞菌+12μM Laricrocin。
图7为本发明实施例6中大黄鱼抗菌多肽Laricrocin与副溶血弧菌作用后的形态结构变化图，其中：A：副溶血弧菌；B：副溶血弧菌+12μM Laricrocin。
图8为本发明实施例7中MTS-PMS法检测大黄鱼抗菌多肽Laricrocin细胞毒性实验图；其中，横坐标为Laricrocin蛋白浓度(μM)，纵坐标为细胞增殖率(％)。
具体实施方式
以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
实施例1大黄鱼抗菌多肽Laricrocin的制备
本实施例中大黄鱼抗菌多肽Laricrocin的氨基酸序列为：
Ile-Gln-Asp-Arg-Arg-Arg-Asn-Leu-Arg-Arg-Trp-Arg-Trp-Trp-Trp-Arg-Trp-Gly-Gly-Pro-Ala-Ile-Arg-Ala-Cys(SEQ ID NO：01，IQDRRRNLRRWRWWWRWGGPAIRAC)
该大黄鱼抗菌多肽Laricrocin采用现有的固相化学合成方法即可得到纯度达95％以上大黄鱼抗菌多肽Laricrocin。本实施例中的大黄鱼抗菌多肽Laricrocin委托金斯瑞(江苏)有限公司以固相合成方法合成获得，并提供多肽分子量、HPLC等检测信息。
抗菌多肽Laricrocin理化参数如表1所示。
表1新型抗菌多肽Laricrocin的理化参数
由表1可知Laricrocin分子量小、稳定性较好，是一种带有正电荷的阳离子多肽。
实施例2大黄鱼抗菌多肽Laricrocin最小抑菌浓度(MIC：Minimum InhibitionConcentration)和最小杀菌浓度(MBC：Minimum Bactericidal Concentration)的测定本实施例中所涉及到的菌株有：3株革兰氏阳性菌分别是金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)；4株革兰氏阴性菌分别是铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、副溶血弧菌(VibrioParahaemolyticus)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)；真菌分为酵母真菌和丝状真菌，酵母真菌分别是新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)和白色念珠菌(Candida albicans)，丝状真菌分别是禾谷镰孢(Fusarium graminearum)和黑曲霉(Aspergillus niger)。其菌株均购自中国科学院微生物研究所菌种保藏中心，由本实验室保种贮藏。
测定的具体方法如下：
(1)将保种的金黄色葡萄球菌、屎肠球菌、粪肠球菌、铜绿假单胞菌、荧光假单胞菌、鲍曼不动杆菌涂布于营养肉汤平板上，在各适宜温度倒置培养18-24h；副溶血弧菌涂布于2216E琼脂平板上，在28℃倒置培养18-24h；新型隐球菌、白色念珠菌划线于YPD平板上，在28℃倒置培养18-24h；禾谷镰孢、黑曲霉涂布于马铃薯葡萄糖平板上，于28℃倒置培养1-7d。
(2)从各平板上挑取菌落接种于相应的培养基中，在合适温度的摇床上培养至对数期。用MH液体培养基稀释细菌和TSB+2％NaCl液体培养基稀释弧菌，使得菌体的最终浓度约为5×105CFU/mL。用RPMI1640+0.165M MOPS+0.2％葡萄糖培养基稀释酵母真菌和丝状真菌，酵母真菌终浓度约为5×104CFU/mL，利用血球计数板在光学显微镜下对霉菌孢子计数，调整霉菌孢子最终浓度为2×104CFU/mL。
(3)将已合成的Laricrocin粉末用灭菌Milli-Q水溶解，经过0.22μm滤膜过滤后，倍比稀释蛋白浓度至3μM、6μM、12μM、24μM、48μM、96μM，置于冰上备用。
(4)在96孔细胞培养板上，每种待测菌设置空白对照组、阴性对照组和待测实验组，每组设置三个平行：
a空白对照组：50μL待测蛋白样品和50μL培养基
b阴性对照组：50μL无菌Milli-Q水和50μL菌悬液
c待测实验组：50μL待测蛋白样品和50μL菌悬液
(5)将96孔细胞培养板置于细菌和酵母真菌适宜温度对应培养箱中，培养24h，观察待测实验组中MIC结果；霉菌孢子置于28℃培养箱中培养72h，观察待测实验组中MIC结果；将待测实验组吹打混匀后，吸取适量的菌液滴于相应固体培养基平板上，于适宜温度过夜培养，观察MBC结果。
大黄鱼抗菌多肽Laricrocin MIC、MBC观察结果如表2所示：
表2大黄鱼抗菌多肽Laricrocin的抗菌活性
注：MIC：最小抑菌浓度(μM)，用a-b表示。a：肉眼可见菌体生长的最高蛋白浓度；b：肉眼未见菌体生长的最低蛋白浓度。
MBC：最小杀菌浓度(μM)，杀死99.9％细菌浓度，用a-b表示。a：平板可见菌落生长的最高蛋白浓度；b：平板未见菌落生长的最低蛋白浓度。
实施例3大黄鱼抗菌多肽Laricrocin杀菌动力学曲线
选取金黄色葡萄球菌、荧光假单胞菌作为待测菌，对大黄鱼抗菌多肽Laricrocin的杀菌动力学进行测定。
具体方法如实施例2中所述的抗菌活性测定类似。
将Laricrocin终浓度调整至1倍MBC(金黄色葡萄球菌：12μM；荧光假单胞菌：12μM)。与金黄色葡萄球菌共孵5min、10min、20min、30min、60min、90min、120min、180min，吸取10μL金黄色葡萄球菌菌悬液稀释至990μL MH培养基中，混匀后吸取100μL涂布至营养肉汤平板上，37℃倒置培养24h，计算金黄色葡萄球菌的单克隆数量；与荧光假单胞菌共孵2min、5min、8min、10min、20min，吸取100μL菌悬液涂布至营养肉汤平板上，37℃倒置培养24h，计算荧光假单胞菌单克隆数量，用log表示。结果如图1所示，Laricrocin与金黄色葡萄球菌共孵180min，杀菌指数达到99.9％；与荧光假单胞菌共孵20min，杀菌指数达到99.9％。
实施例4大黄鱼抗菌肽Laricrocin抗菌活性热稳定性
选取金黄色葡萄球菌和荧光假单胞菌作为待测菌，测定大黄鱼抗菌多肽Laricrocin的抗菌活性热稳定性。
具体方法如实施例2中所述的抗菌活性测定类似。调整Laricrocin终浓度至1倍MBC(金黄色葡萄球菌：12μM，荧光假单胞菌：12μM)，分别在20℃、40℃、60℃、80℃、100℃中水浴30min后置于冰上备用。将Laricrocin或者无菌Milli-Q水分别与待测菌共同孵育，在0h、12h、24h、36h、48h时用酶标仪测定OD600的值。结果如图2所示，Laricrocin对金黄色葡萄球菌和荧光假单胞菌仍具有良好的抗菌活性。
实施例5大黄鱼抗菌多肽Laricrocin作用后抑制霉菌孢子萌发显微镜观察
选取黑曲霉、禾谷镰孢作为待测菌，观察大黄鱼抗菌多肽Laricrocin对霉菌孢子萌发的影响。
具体方法如实施例2中所述的抗菌活性测定类似。调整Laricrocin蛋白浓度为6μM、12μM，置于冰上备用；调整各霉菌孢子最终浓度为2×104CFU/mL。将等体积各浓度Laricrocin与霉菌孢子于96孔细胞培养板混匀，置于28℃培养箱中，静置培养72h，在光学显微镜下观察霉菌孢子萌发情况。如图3所示，对照组中的黑曲霉孢子经过72h孵育后萌发成为菌丝，经终浓度12μM Laricrocin处理，有效抑制黑曲霉孢子的萌发。如图4所示，终浓度为12μM的Laricrocin能够有效抑制禾谷镰孢的孢子萌发。
实施例6大黄鱼抗菌多肽Laricrocin与细菌作用后的扫描电镜观察
选取金黄色葡萄球菌、荧光假单胞菌和副溶血弧菌作为待测菌株，扫描电镜样品的制备按以下步骤进行：
(1)如实施例2所述制备金黄色葡萄球菌、荧光假单胞菌和副溶血弧菌菌悬液(OD600＝0.1)冰上放置备用。
(2)用灭菌Milli-Q水溶解合成肽Laricrocin，并调整蛋白浓度为24μM，冰上放置备用。(3)菌悬液和蛋白等体积混合后在适宜温度孵育适宜时间。其中金黄色葡萄球菌菌悬液与12μM Laricrocin于37℃孵育30min；荧光假单胞菌菌悬液与12μM Laricrocin于28℃孵育30min；副溶血弧菌菌悬液与12μM Laricrocin于28℃孵育45min。
(4)加入等体积戊二醛固定液，4℃过夜固定。
(5)6000g离心5min，去上清，PBS清洗三次。
(6)离心去上清，制备高浓度菌悬液，滴在载玻片上，4℃静置30min。
(7)随后乙醇逐级脱水，分别是30％(5min)-50％(5min)-70％(10min)-80％(10min)-95％(15min)-100％(15min)-100％(15min)(v/v)。
(8)临界点干燥样品。
(9)喷金后用扫描电子显微镜观察及拍照。如图5至图7所示：对照组黄色葡萄球菌、荧光假单胞菌和副溶血弧菌表面完整，细胞呈完整的形态，分布扩散；Laricrocin处理组菌出现聚集，表面变得粗糙，内容物流出，起泡，皱缩失去原有形态。
实施例7大黄鱼抗菌多肽Laricrocin细胞毒性测定
选取人肾上皮细胞(HEK-293T)和斑马鱼ZF4细胞，对大黄鱼抗菌多肽Laricrocin细胞毒性进行测定。
(1)收集生长状态良好的人肾上皮细胞(HEK-293T)和斑马鱼ZF4细胞，调整细胞浓度为1×105个/mL，将细胞均匀吹散，在96孔细胞培养板中每孔加入100μL细胞悬液，每孔约1×104个细胞，置于适宜温度培养箱培养至80％以上细胞贴壁。
(2)小心吸出培养基，加入含有不同浓度(0μM、1.5μM、3μM、6μM、12μM、24μM、48μM)Laricrocin的培养基，置于适宜温度培养箱培养24h。
(3)加入20μL MTS-PMS溶液后避光孵育2h后，使用酶标仪测得OD492值，评价Laricrocin的细胞毒性。结果如图8所示，不同浓度的Laricrocin与正常细胞共孵24h，细胞活性无显著性差异。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。
Claims (9)
1.一种大黄鱼抗菌多肽Laricrocin，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO.01所示。
2.权利要求1所述的大黄鱼抗菌多肽Laricrocin在制备抗细菌组合物中的应用。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述大黄鱼抗菌多肽Laricrocin对金黄色葡萄球菌、屎肠球菌、粪肠球菌、铜绿假单胞菌、荧光假单胞菌、鲍曼不动杆菌和副溶血弧菌具有抑制和杀灭作用。
4.一种抗细菌组合物，其特征在于：其有效成分包括权利要求1所述的大黄鱼抗菌多肽Laricrocin。
5.权利要求1所述的大黄鱼抗菌多肽Laricrocin在制备抗真菌组合物中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述大黄鱼抗菌多肽Laricrocin对新型隐球菌、白色念珠菌、禾谷镰孢和黑曲霉具有抑制和杀灭作用。
7.一种抗真菌组合物，其特征在于：其有效成分包括权利要求1所述的大黄鱼抗菌多肽Laricrocin。
8.权利要求1所述的大黄鱼抗菌多肽Laricrocin在制备水产饲料添加剂中的应用。
9.一种水产饲料添加剂，其特征在于：其有效成分包括权利要求1所述的大黄鱼抗菌多肽Laricrocin。
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