CN117567565A

CN117567565A - 一种大弹涂鱼抗菌多肽Boleopectin及其应用

Info

Publication number: CN117567565A
Application number: CN202311619163.3A
Authority: CN
Inventors: 王克坚; 白玉麒; 陈芳奕
Original assignee: Xiamen University
Current assignee: Xiamen University
Priority date: 2023-11-29
Filing date: 2023-11-29
Publication date: 2024-02-20

Abstract

本发明公开了一种大弹涂鱼抗菌多肽Boleopectin及其应用，其氨基酸序列如SEQ ID NO.01所示。本发明具有较强的抗细菌活性及抗真菌活性，抗菌效果好，抗菌谱广，杀菌速率快，其来源于海洋硬骨鱼，既可以应用于水产饲料添加剂，也可以制备抗真菌组合物(防霉防腐剂)和抗细菌组合物等，具有广泛的应用前景。

Description

一种大弹涂鱼抗菌多肽Boleopectin及其应用

技术领域

本发明属于海洋分子生物学技术领域，具体涉及一种大弹涂鱼抗菌多肽Boleopectin及其应用。

背景技术

抗菌肽(Antimicrobial peptides，AMPs)是一类存在于多种动物免疫防御系统中的具有广谱抗菌活性的小分子多肽。与传统抗生素相比，抗菌肽不易产生耐药性且对机体具有一定的免疫调节作用，因此抗菌肽可作为一种抗生素替代产品应用于水产养殖及医药卫生等领域。

1981年，Steiner等人发现了第一个α螺旋抗菌肽天蚕素(Cecropins)，而后Zasloff从非洲爪蟾(Xenopus laevis)皮肤中分离得到蛙皮素(Magaiin)，此后各国科学家陆续发现了3000多个抗菌肽及合成的抗菌多肽，收录在抗菌肽数据库APD中。目前APD数据库中有来自六大门类的3131个抗菌肽，其中343个是来自细菌的细菌素，5个来自古细菌，20个来自真菌，352个来自植物，2323个来源于动物。而动物来源的抗菌肽又可分为源自原生动物、软体动物、节肢动物、鱼类、两栖类、爬行类、鸟类及哺乳动物，其中两栖类是发现抗菌肽最多的一类，目前有1086个。

海洋作为人类巨大的资源宝库，丰富的物种资源经历进化过程中复杂的环境胁迫，进化出相对完善的免疫系统，其中先天免疫系统中存在的活性物质对于入侵的病原体具有快速应答特性。因此从海洋生物中分离鉴定抗菌活性物质是丰富抗菌肽资源的一个重要手段。大弹涂鱼作为潮间带重要的两栖鱼类，可在近海或滩涂上生存，水陆两种复杂环境中存在大量病原菌，然而鲜有细菌性疾病爆发。因此从大弹涂鱼中鉴定抗菌活性物质引起了研究人员的关注。

发明内容

本发明目的在于提供一种大弹涂鱼抗菌多肽Boleopectin。

本发明的另一目的在于提供上述大弹涂鱼抗菌多肽Boleopectin的应用。

本发明的技术方案如下：

一种大弹涂鱼抗菌多肽Boleopecftin，其氨基酸序列如SEQ ID NO.01所示。

上述大弹涂鱼抗菌多肽Boleopectin在制备抗细菌组合物中的应用。

一种抗细菌组合物，其有效成分包括上述大弹涂鱼抗菌多肽Boleopectin。

在本发明的一个优选实施方案中，其对金黄色葡萄球菌、屎肠球菌、粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、大肠埃希氏菌和铜绿假单胞菌具有抑制和杀灭作用。

上述大弹涂鱼抗菌多肽Boleopectin在制备抗真菌组合物中的应用。

一种抗真菌组合物，其有效成分包括上述大弹涂鱼抗菌多肽Boleopectin。

在本发明的一个优选实施方案中，其对新型隐球菌、尖孢镰孢、黄曲霉和腐皮镰孢具有抑制和杀灭作用。

上述大弹涂鱼抗菌多肽Boleopectin在制备水产饲料添加剂中的应用。

一种水产饲料添加剂，其有效成分包括上述大弹涂鱼抗菌多肽Boleopectin。

本发明的有益效果是：

1、本发明由18个氨基酸组成，分子式为C₉₇H₁₇₅N₃₁O₂₄，分子量为2159.65道尔顿，其中含有5个带正电的氨基酸残基，根据氨基酸残基电荷预测其等电点为12.01，亲水性平均系数为0.222，具有很强的水溶性，是一种带有正电荷的阳离子多肽。

2、本发明的对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、霉菌均有显著的抗菌效果，且对正常斑马鱼胚胎细胞、正常哺乳动物细胞如人正常肝细胞在24μM浓度以下不具有细胞毒性作用。

3、本发明具有较强的抗细菌活性及抗真菌活性，抗菌效果好，抗菌谱广，杀菌速率快，其来源于海洋硬骨鱼，既可以应用于水产饲料添加剂，也可以制备抗真菌组合物(防霉防腐剂)和抗细菌组合物等，具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例3中大弹涂鱼抗菌多肽Boleopectin对金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌的杀菌动力学图；在图1中，A为金黄色葡萄球菌+12μM Boleopectin；B为鲍曼不动杆菌+12μM Boleopectin。横坐标为时间(min)，纵坐标为杀菌指数(％)

图2为本发明实施例4中大弹涂鱼抗菌多肽Boleopectin对鲍曼不动杆菌抗菌活性热稳定性图；在图2A中，横坐标为温度(℃)，纵坐标为菌落数(CFU/mL)；图2B中，横坐标为时间(min)，纵坐标为菌落数(CFU/mL)。

图3至5为本发明实施例5中大弹涂鱼抗菌多肽Boleopectin抑制霉菌孢子萌发实验图：其中，图3为尖孢镰孢，图4为黄曲霉，图5为腐皮镰孢。上述Boleopectin终浓度为A：0μM；B：1.5μM；C：3μM；D：6μM；E：12μM；F：24μM；G：48μM；H：96μM。

图6为本发明实施例6中大弹涂鱼抗菌多肽Boleopectin与鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌以及铜绿假单胞菌作用后扫描电镜照片；其中A：鲍曼不动杆菌；B：鲍曼不动杆菌+12μM；C：金黄色葡萄球菌；D：金黄色葡萄球菌+12μM；E：铜绿假单胞菌；F铜绿假单胞菌+24μM。

图7为本发明实施例6中大弹涂鱼抗菌多肽Boleopectin与黄曲霉和尖孢镰孢孢子作用后扫描电镜照片；其中，A：黄曲霉；B：黄曲霉+192μM Boleopectin；C：尖孢镰孢；D：尖孢镰孢+96μM Boleopectin；

图8为本发明实施例7中MTS-PMS法检测大弹涂鱼抗菌多肽Boleopectin细胞毒性实验图：其中，A图为293T细胞；B图为ZF4细胞。横坐标为Boleopectin蛋白浓度(μM)，纵坐标为细胞增殖率(％)。

具体实施方式

以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。

实施例1大弹涂鱼抗菌多肽Boleopectin的制备

本实施例中的大弹涂鱼抗菌多肽Boleopecfin的氨基酸序列为：

1le-Leu-Ser-Val-Thr-Leu-Thr-Ser-Leu-Ile-Leu-Tyr-Arg-Arg-Lys-Arg-Ala-Arg(SEQ ID NO.01，ILSVTLTSLILYRRKRAR)

采用现有的固相化学合成的方法即可得到纯度达95％以上大弹涂鱼抗菌多肽Boleopectin。本实施例中的大弹涂鱼抗菌多肽Boleopectin委托南京金斯瑞生物科技有限公司以固相合成方法合成获得，并提供多肽分子量、HPLC等检测信息。

抗菌多肽Boleopectin理化参数如表1所示。

表1抗菌多肽Boleopectin理化参数

由表1可知Boleopectin分子量小、稳定性较好，具有很强的水溶性，是一种带有正电荷的阳离子多肽。

实施例2大弹涂鱼抗菌多肽Boleopectin最小抑菌浓度(MIC：Minimum InhibitionConcentration)和最小杀菌浓度(MBC：Minimum Bactericidal Concentration)的测定

本实施例中所涉及到的菌株有：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、尖孢镰孢(Fusarium oxysporum)、黄曲霉(Aspergillus flavus)、腐皮镰孢(Fusarium solani)。菌株均购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，由本实验室保种贮藏。

具体方法如下：

(1)将保种的金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、粪肠球菌、屎肠球菌涂布于营养肉汤平板上，在各适宜温度倒置培养18-24h；新型隐球菌涂布于YPD平板上，于28℃倒置培养1-3d；尖孢镰孢、黄曲霉、腐皮镰孢孢子涂布于马铃薯葡萄糖平板上，于28℃倒置培养1-7d。

(2)从各平板上挑取菌落接种于相应的培养基斜面上，细菌、弧菌继续培养18-24h，酵母真菌继续培养1-3d，霉菌继续培养1-7d。用10mM磷酸钠缓冲液(pH＝7.4)将细菌、弧菌和酵母真菌从斜面上冲下，调整菌悬液浓度。用MH液体培养基稀释细菌；用YPD液体培养基稀释酵母真菌；补充1.5％NaCl的TSB培养基稀释弧菌，使得菌体的最终浓度为5×10⁵CFU/mL。用10mM磷酸钠缓冲液(pH＝7.4)将霉菌孢子从斜面上冲下，用马铃薯葡萄糖液体培养基和磷酸钠缓冲液混合液稀释孢子，利用血球计数板在光学显微镜下对孢子计数，调整孢子浓度，使得霉菌孢子最终浓度为5×10⁴个/mL。

(3)将已合成的Boleopectin粉末分别用灭菌ddH₂O水溶解，经过0.22μm滤膜过滤后，倍比稀释蛋白浓度至3μM、6μM、12μM、24μM、48μM、96μM，192μM，置于冰上备用。

(4)在96孔细胞培养板上，每种待测菌设置空白对照组、阴性对照组和待测实验组，每组设置三个平行：

a空白对照组：50μL待测蛋白样品和50μL培养基

b阴性对照组：50μL无菌ddH₂0水和50μL菌悬液

c待测实验组：50μL待测蛋白样品和50μL菌悬液

(5)将96孔细胞培养板置于28℃培养箱中，培养1-2d，观察待测实验组中MIC结果；将待测实验组吹打混匀后，吸取适量的菌液滴于相应固体培养基平板上，于适宜温度倒置培养1-2d，观察MBC结果。

大弹涂鱼抗菌肽Boleopectin的MIC、MBC观察结果如表2所示：

表2大弹涂鱼抗菌肽Boleopectin的抗菌活性

注：MIC：最小抑菌浓度(μM)，用a-b表示。a：肉眼可见菌体生长的最高蛋白浓度；b：肉眼未见菌体生长的最低蛋白浓度

MBC：最小杀菌浓度(μM)，用a-b表示。a：平板可见菌落生长的最高蛋白浓度；b：平板未见菌落生长的最低蛋白浓度。

实施例3大弹涂鱼抗菌多肽Boleopectin杀菌动力学曲线

本实施例选取金黄色葡萄球菌和鲍曼不动杆菌作为待测菌，对大弹涂鱼抗菌多肽Boleopectin的杀菌动力学进行测定。

具体方法如实施例2中所述的抗菌活性测定类似。调整Boleopectin至1倍MBC(金黄色葡萄球菌：6μM终浓度；鲍曼不动杆菌：6μM终浓度)。在与待测菌共孵后10min、20min、30min、40min、50min、60min、70min、80min、90min、100min、110min、120min、150min、180min，将96孔细胞培养板取空白对照组、阴性对照组、待测实验组混匀，吸取6μL铜绿假单胞菌菌悬液稀释至600μL DPBS中，混匀后吸取40μL涂布至营养肉汤平板上，37℃倒置培养1-2d，记录待测菌菌单克隆数量，计算杀菌指数。

杀菌指数是指经过一定时间共孵后，待测实验组的克隆数与阴性对照组克隆数的比值，用百分比表示(参见图1)。

如图1所示，Boleopectin在低至6μM终浓度下可以将金黄色葡萄球菌和鲍曼不动杆菌快速杀灭，30min即可将活菌量降低到95％以下。

实施例4大弹涂鱼抗菌肽Boleopectin在不同温度条件下抗菌活性及热稳定性

本实施例选取鲍曼不动杆菌作为待测菌，对大弹涂鱼抗菌肽Boleopectin的抗菌活性热稳定性进行测定。

具体方法如实施例2中所述的抗菌活性测定类似。调整Boleopectin终浓度至1倍MBC(鲍曼不动杆菌：6μM)。(1)将Boleopectin溶液在0℃、4℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃、121℃处理30min后，置于冰上降温10min后与待测菌共孵(对照等体积无菌ddH₂O共孵)4h后涂板，37℃恒温培养箱培养10h后计数(参见图2A)；(2)在100℃沸水中水浴5min、10min、20min、30min、60min、120min、240min后置于冰上备用。将Boleopectin或者无菌ddH₂0分别与待测菌共同孵育在4h后涂板37℃恒温培养箱培养10h后计数(参见图2B)。如图2所示，Boleopectin在不同温度条件或在100℃持续热处理后仍能保持其抗菌活性。

实施例5大弹涂鱼抗菌多肽Boleopectin作用后霉菌孢子萌发的光学显微镜观察

本实施例选取尖孢镰孢、黄曲霉、腐皮镰孢霉作为待测菌，观察大弹涂鱼抗菌肽Boleopectin对各霉菌孢子萌发的影响。

具体方法如实施例2中所述的抗菌活性测定类似。调整Boleopectin蛋白浓度为6μM、12μM、24μM、48μM、96μM、192μM，置于冰上备用；调整各霉菌孢子最终浓度为5×10⁴个/mL。将等体积各浓度Boleopectin与各霉菌孢子于96孔细胞培养板混匀，置于28℃培养箱中，静置培养24h，在光学显微镜下观察霉菌孢子萌发情况，如图3-5所示，光学显微镜下观察孢子萌发，Boleopectin分别在24μM、48μM、12μM终浓度下对尖孢镰孢、黄曲霉、腐皮镰孢的孢子萌发有显著的抑制作用。

实施例6大弹涂鱼抗菌多肽Boleopectin与细菌、真菌孢子作用后的扫描电镜观察

本实施例本实施例选取鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、黄曲霉、尖孢镰孢作为待测菌株，扫描电镜样品的制备按以下步骤进行：

(1)如实施例2所述制备鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌悬液(OD600＝0.4)，制备黄曲霉和尖孢镰孢孢子悬液(5×10⁶个/mL)，冰上放置备用。

(2)用灭菌纯水溶解合成肽Boleopectin，并调整蛋白浓度为12μM、24μM、96μM、192μM，冰上放置备用。

(3)悬液和蛋白等体积混合后在适宜温度孵育适宜时间(根据MIC及杀菌动力学标准)。

(4)加入等体积戊二醛固定液，4℃固定2h后，6000g离心5min。

(5)去尽上清，1mL PBS重悬沉淀，6000g离心10min，重复该步骤。

(6)加入10μLPBS，制备较高浓度菌悬液。

(7)将高浓度菌悬液滴加在载玻片上，置于冰上，静置30min后，用滤纸吸去多余液体。

(8)PBS浸泡15min后，30％-50％-70％-80％-90％-95％-100％-100％(v/v)乙醇逐级脱水，每级脱水15min。

(9)临界点干燥法干燥样品。

(10)喷金后用扫描电子显微镜观察及拍照。(参见图6和图7)

如图6、图7所示，对照组细菌形态正常，结构完整，表面光滑；抗菌肽处理后的细菌，形态发生明显变化，膜表面出现褶皱、孔洞甚至破裂，从而造成内容物外泄。

实施例7大弹涂鱼抗菌多肽Boleopectin细胞毒性测定

本实施例选取人肾上皮细胞(293T)和斑马鱼胚胎细胞(ZF4)，对大弹涂鱼抗菌肽Boleopectin细胞毒性进行测定。

(1)收集生长状态良好人肾上皮细胞和斑马鱼胚胎细胞，调整细胞浓度为1×10⁵个/mL，将细胞均匀吹散，在96孔细胞培养板中每孔加入100μL细胞悬液，置于适宜温度培养箱培养至80％以上细胞贴壁。

(2)小心吸出培养基，加入含有不同浓度(0μM、6μM、12μM、24μM、48μM、96μM)Boleopectin的培养基，置于适宜温度培养箱培养24h。

(3)加入20μL MTS-PMS溶液后避光孵育2h后，使用酶标仪测得OD₄₉₂值，评价

Boleopectin的细胞毒性。

结果如图8所示，仅在高浓度48-96μM的Boleopectin对人肾上皮细胞和斑马鱼胚胎细胞具有一定的毒性作用，在有效抗菌浓度(低于24μM)时无细胞毒性。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

Claims

1.一种大弹涂鱼抗菌多肽Boleopectin，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO.01所示。

2.权利要求1所述的大弹涂鱼抗菌多肽Boleopectin在制备抗细菌组合物中的应用。

3.一种抗细菌组合物，其特征在于：其有效成分包括权利要求1所述的大弹涂鱼抗菌多肽Boleopectin。

4.如权利要求3所述的一种抗细菌组合物，其特征在于：其对金黄色葡萄球菌、屎肠球菌、粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、大肠埃希氏菌和铜绿假单胞菌具有抑制和杀灭作用。

5.权利要求1所述的大弹涂鱼抗菌多肽Boleopectin在制备抗真菌组合物中的应用。

6.一种抗真菌组合物，其特征在于：其有效成分包括权利要求1所述的大弹涂鱼抗菌多肽Boleopectin。

7.如权利要求6所述的一种抗真菌组合物，其特征在于：其对新型隐球菌、尖孢镰孢、黄曲霉和腐皮镰孢具有抑制和杀灭作用。

8.权利要求1所述的大弹涂鱼抗菌多肽Boleopectin在制备水产饲料添加剂中的应用。

9.一种水产饲料添加剂，其特征在于：其有效成分包括权利要求1所述的大弹涂鱼抗菌多肽Boleopectin。