CN114014910B - 一种拟穴青蟹抗真菌多肽Spamptin72-91及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种拟穴青蟹抗真菌多肽Spamptin_72‑91及其应用，由20个氨基酸组成，分子式为C₁₀₅H₁₈₃N₃₅O₂₆S₁，分子量为2383.89道尔顿，其中含有5个带正电的氨基酸残基，根据氨基酸残基电荷预测该抗真菌多肽等电点为12.48，具有很好的水溶性，是一种带有正电荷的阳离子多肽，具有长度短、易合成、抗菌活性高且稳定等特点，在医药食品等领域具有很好应用前景。

Description

一种拟穴青蟹抗真菌多肽Spamptin72-91及其应用

技术领域

本发明属于海洋分子生物学技术领域，具体涉及一种拟穴青蟹抗真菌多肽Spamptin_72-91及其应用。

背景技术

真菌广泛分布在自然界中，种类繁多，生命力强，可以依靠孢子进行散播，日常生产生活中主要污染食品相关物质。当食物被霉菌污染后会发生颜色改变、粘稠变软、分解蛋白质产生硫化物和氨类物质、引起腐败变质，缩短食品的保质期并且影响品质。食品制作的过程中从原料生产、储存、加工、运输到使用的每个环节都很有可能发生真菌的污染。一些真菌还会随着生长的过程产生有毒或者致癌的次级代谢产物，日常生活中常见的产生毒素的真菌主要有曲霉属、青霉属和镰孢菌属主要产生的毒素包括黄曲霉素、赭曲霉毒素、展青霉素和伏马毒素。

另外一些真菌可以直接感染人或者动物造成相关疾病。临床发现真菌侵染呼吸道及粘膜造成一定刺激，出现鼻塞、干咳和哮喘。常见于居住环境中的烟曲霉被认为是空气传播的霉菌病原体，由它引起的曲霉病是免疫系统受损个体出现高发病率和造成死亡的主要原因之一。空气中真菌被吸入后也会造成过敏症状。因此，由真菌引起的疾病是一类重要的公共安全和卫生问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种拟穴青蟹抗真菌多肽Spamptin_72-91。

本发明的另一目的在于提供上述拟穴青蟹抗真菌多肽Spamptin_72-91的应用。

本发明的再一目的在于提供一种抗真菌组合物。

本发明的技术方案之一如下：

一种拟穴青蟹抗真菌多肽Spamptin_72-91，其分子式为C₁₀₅H₁₈₃N₃₅O₂₆S₁，其氨基酸序列如SEQ ID NO：01所示。

本发明的技术方案之二如下：

上述拟穴青蟹抗真菌多肽Spamptin_72-91在制备抗真菌组合物中的应用。

在本发明的一个优选实施方案中，所述抗真菌组合物对酵母真菌和丝状真菌具有抑制和杀灭作用。

进一步优选的，所述酵母真菌为新型隐球菌。

进一步优选的，所述丝状真菌为禾谷镰孢、尖孢镰孢、烟曲霉、赭曲霉、黑曲霉和腐皮镰孢。

本发明的技术方案之三如下：

一种抗真菌组合物，其有效成分包括如权利要求1所述的拟穴青蟹抗真菌多肽Spamptin_72-91。

在本发明的一个优选实施方案中，其有效成分为如权利要求1所述的拟穴青蟹抗真菌多肽Spamptin_72-91。

进一步优选的，其对酵母真菌和丝状真菌具有抑制和杀灭作用。

更进一步优选的，所述酵母真菌为新型隐球菌。

更进一步优选的，所述丝状真菌为禾谷镰孢、尖孢镰孢、烟曲霉、赭曲霉、黑曲霉和腐皮镰孢。

本发明的有益效果是：

1、本发明的拟穴青蟹抗真菌多肽Spamptin_72-91)由20个氨基酸组成，分子式为C₁₀₅H₁₈₃N₃₅O₂₆S₁，分子量为2383.89道尔顿，其中含有5个带正电的氨基酸残基，根据氨基酸残基电荷预测该抗真菌多肽等电点为12.48，具有很好的水溶性，是一种带有正电荷的阳离子多肽，具有长度短、易合成、抗菌活性高且稳定等特点，在医药食品等领域具有很好应用前景。

2、本发明的拟穴青蟹抗真菌多肽Spamptin_72-91对新型隐球菌、禾谷镰孢、尖孢镰孢、烟曲霉、赭曲霉、黑曲霉和腐皮镰孢具有良好的抗菌效果，且对拟穴青蟹血细胞和人肾上皮细胞HEK-293T无细胞毒性。

附图说明

图1至5为本发明实施例1中拟穴青蟹抗真菌多肽Spamptin_72-91抑制霉菌孢子萌发实验图。其中，图1为腐皮镰孢菌，图2为黑曲霉，图3为尖孢镰孢菌，图4为烟曲霉，图5 为赭曲霉。上述各图中Spamptin_72-91的具体量为：A：对照，B：0.5μM，C：1.5μM，D：3μM， E：6μM，F：12μM，G：24μM，H：48μM。

图6为本发明实施例1中拟穴青蟹抗真菌多肽Spamptin_72-91与黑曲霉和尖孢镰孢菌作用后扫描电镜观察图。其中，A：黑曲霉，B：黑曲霉+6μM Spamptin_72-91，C：黑曲霉+12μMSpamptin_72-91，D：尖孢镰孢，E：尖孢镰孢+3μM Spamptin_72-91，F：尖孢镰孢+6μMSpamptin_72-91。

图7为为本发明实施例1中MTS-PMS法检测拟穴青蟹抗真菌多肽Spamptin_72-91细胞毒性实验图。其中，A为拟穴青蟹血细胞(Hemocytes)，B为人肾上皮细胞HEK-293T 细胞，横坐标为Spamptin_72-91蛋白浓度(μM)，纵坐标为细胞增殖率(％)。

具体实施方式

以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。

实施例1

本实施例的一种拟穴青蟹新型抗真菌多肽Spamptin_72-91的氨基酸序列为SEQ IDNO： 01：Arg ThrAla Val Ser Leu Pro Arg Arg Pro Gln Phe Val Ile Lys Gln Met IleArg Ser。

本实施例委托吉尔生化(上海)有限公司以固相合成方法合成获得纯度达95％以上的拟穴青蟹抗真菌多肽Spamptin_72-91，并提供多肽分子量、HPLC等检测信息，相关理化参数如下表1所示。

表1抗真菌多肽Spamptin_72-91理化参数

由表1可知本实施例的拟穴青蟹抗真菌多肽Spamptin_72-91分子量小、稳定性较好，具有很强的水溶性，是一种带有正电荷的阳离子多肽。

一、最小抑菌浓度(MIC：Minimum Inhibition Concentration)和最小杀菌浓度(MBC： Minimum Bactericidal Concentration)的测定

1、涉及到的菌株有：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas Aeruginosa)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、禾谷镰孢(Fusarium graminearum)、尖孢镰孢(Fusarium oxysporum)、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)、赭曲霉(Aspergillus ochraceus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、腐皮镰孢(Fusarium solani)。菌株均购自中国科学院微生物研究所菌种保藏中心，由本实验室保种贮藏。

2、具体方法如下：

(1)将保种菌株划线于MH平板，于37℃或者28℃条件下倒置培养过夜；

(2)挑取单克隆于MH液体培养基中，37℃或者28℃，200rpm培养至对数期；

(3)5000g，2min收集细菌，用10mM磷酸钠缓冲液(pH＝7.4)将细菌重悬，最后用MH液体培养基稀释细菌，使得菌体的最终浓度为5×10⁴cfu/mL；

(4)将已合成的Spamptin_72-91粉末溶于无菌Milli-Q水，倍比稀释蛋白浓度至1μM、3μM、6μM、12μM、24μM、48μM、96μM；

(5)在96孔聚丙烯无菌培养板上，每种待测菌设置空白对照组、阴性对照组和待测实验组，每组设置三个平行：

a空白对照组：50μL待测蛋白样品和50μL培养基

b阴性对照组：50μL无菌Milli-Q水和50μL菌悬液

c待测实验组：50μL待测蛋白样品和50μL菌悬液

将96孔培养板置于37℃培养箱中，培养18-24h，观察待测实验组中MIC结果；将待测实验组吹打混匀后，吸取适量的菌液涂布于MH平板上，于37℃倒置培养过夜，观察 MBC结果。

3、拟穴青蟹抗真菌多肽Spamptin_72-91MIC和MBC观察结果如下表2所示。

表2拟穴青蟹抗真菌多肽Spamptin_72-91的抗菌活性

注：MIC：最小抑菌浓度(μM)，用a-b表示；a：肉眼可见菌体生长的最高蛋白浓度；b：肉眼未见菌体生长的最低蛋白浓度；MBC：最小杀菌浓度(μM)，杀死99.9％细菌浓度。

二、拟穴青蟹抗真菌多肽Spamptin_72-91作用后霉菌孢子萌发的光学显微镜观察

选取腐皮镰孢、黑曲霉、尖孢镰孢、烟曲霉、赭曲霉、作为待测菌，观察拟穴青蟹抗真菌多肽Spamptin_72-91对各霉菌孢子萌发的影响。

具体方法同上述抗菌活性测定类似。调整Spamptin_72-91蛋白浓度为1μM、3μM、6μM、12μM、24μM、48μM、96μM，置于冰上备用；调整各霉菌孢子最终浓度为5×10⁴个/mL。将等体积各浓度Spamptin_72-91与各霉菌孢子于96孔细胞培养板混匀，置于28℃培养箱中，静置培养24h，在光学显微镜下观察霉菌孢子萌发情况。如图1至图5所示，当Spamptin_72-91终浓度为6μM时能有效抑制腐皮镰孢和黑曲霉孢子萌发；终浓度为3μM的Spamptin_72-91能有效抑制尖孢镰孢孢子萌发；终浓度为12μM的Spamptin_72-91能有效抑制烟曲霉和赭曲霉孢子萌发。如图6所示，正常情况下黑曲霉孢子近圆形，表面完整，经终浓度3-6μM Spamptin_72-91处理后黑曲霉孢子出现皱缩，并且出现破裂内容物流出；未处理的尖孢镰孢孢子呈现规则平滑的外形，经终浓度1.5-3μM Spamptin_72-91处理后，表面出现皱缩破损，孢子形态发生明显变化，内容物外流。

三、细胞毒性测定

选取拟穴青蟹血细胞(Hemocytes)和人肾上皮细胞(HEK-293T)，对拟穴青蟹抗真菌多肽Spamptin_72-91细胞毒性进行测定，具体方法如下：

(1)收集生长状态良好的拟穴青蟹血细胞(Hemocytes)和人肾上皮细胞(HEK-293T)，调整细胞浓度为10³-10⁴个/mL，将细胞均匀吹散，在96孔细胞培养板中每孔加入100μL 细胞悬液，置于26℃和37℃，0.5％CO₂条件下静置培养，50％以上细胞贴壁。

(2)小心吸出培养基，加入含有不同浓度(0μM、3μM、6μM、12μM、24μM、48μM、 96μM、192μM)Spamptin_72-91的相应培养基，置于26℃和37℃，0.5％CO₂条件下静置培养24h。

(3)加入20μL MTS-PMS溶液后避光孵育3h后，使用酶标仪测得OD₄₉₂值，评价Spamptin_72-91的细胞毒性。

3、结果如图7所示：在96μM浓度条件下，拟穴青蟹抗真菌多肽Spamptin_72-91与拟穴青蟹血细胞(图7-A)、HEK-293T细胞(图7-B)共孵24h后，与对照组相比实验组细胞存活率均在95％以上，说明拟穴青蟹抗真菌多肽Spamptin_72-91无细胞毒性。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

序列表

<110> 厦门大学

<120> 一种拟穴青蟹抗真菌多肽Spamptin72-91及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> PRT

<213> Scylla paramamosain

<400> 1

Arg Thr Ala Val Ser Leu Pro Arg Arg Pro Gln Phe Val Ile Lys Gln

1 5 10 15

Met Ile Arg Ser

20

Claims (10)

1.一种拟穴青蟹抗真菌多肽Spamptin_72-91，其特征在于：其分子式为C₁₀₅H₁₈₃N₃₅O₂₆S₁，其氨基酸序列如SEQ ID NO：01所示。

2.权利要求1所述的拟穴青蟹抗真菌多肽Spamptin_72-91在制备抗真菌组合物中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述抗真菌组合物对酵母真菌和丝状真菌具有抑制和杀灭作用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述酵母真菌为新型隐球菌。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述丝状真菌为尖孢镰孢、烟曲霉、赭曲霉、黑曲霉和腐皮镰孢。

6.一种抗真菌组合物，其特征在于：其有效成分包括如权利要求1所述的拟穴青蟹抗真菌多肽Spamptin_72-91。

7.如权利要求6所述的一种抗真菌组合物，其特征在于：其有效成分为如权利要求1所述的拟穴青蟹抗真菌多肽Spamptin_72-91。

8.如权利要求7所述的一种抗真菌组合物，其特征在于：其对酵母真菌和丝状真菌具有抑制和杀灭作用。

9.如权利要求8所述的一种抗真菌组合物，其特征在于：所述酵母真菌为新型隐球菌。

10.如权利要求8所述的一种抗真菌组合物，其特征在于：所述丝状真菌为尖孢镰孢、烟曲霉、赭曲霉、黑曲霉和腐皮镰孢。

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