CN103933553B - 一种用于治疗痤疮的含抗菌肽和细胞生长因子的纳米颗粒 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种含抗菌肽和细胞生长因子的纳米颗粒，其特征在于由用可生物降解的聚(D，L-乳酸-共-乙醇酸)制成的外壳及包裹在所述外壳中的包含抗菌肽和细胞生长因子的内核组成，其中所述抗菌肽占所述纳米颗粒总重的8-15重量％，所述细胞生长因子占所述纳米颗粒总重的1-4重量％。该纳米颗粒直径范围为80-150纳米，具有缓释功能。内含的抗菌肽可以杀死引起皮肤表面痤疮形成的痤疮丙酸杆菌，而细胞生长因子则有利于受损皮肤的修复再生。本发明所述的纳米颗粒，可直接作用于皮肤，能持续杀死痤疮丙酸杆菌及对受损皮肤进行修复，从而有效减少痤疮形成及因痤疮而造成的皮肤疤痕。

Description

一种用于治疗痤疮的含抗菌肽和细胞生长因子的纳米颗粒

技术领域

本发明涉及用于皮肤修复的产品，具体而言，本发明涉及一种用于治疗痤疮的含抗菌肽和细胞生长因子的纳米颗粒。

背景技术

痤疮俗称“青春痘”、“肺风粉刺”、“暗疮”等，是一种常见的毛囊、皮脂腺慢性炎症性疾病，通常好发于人面部、胸背部。在临床上以白头粉刺、黑头粉刺、炎性丘疹、结节、囊肿等为主要表现。

痤疮丙酸杆菌是引起人类痤疮形成的最主要细菌，属于典型革兰氏阳性厌氧菌，一般寄居在皮肤的毛囊及皮脂腺中，通过消耗皮脂中的甘油三酯来生长繁殖。这种细菌代谢产生的脂肪酸会刺激皮肤并促进皮脂腺过量分泌，从而使皮脂排泄不畅，最终导致炎症性丘疹、粉刺和脓包的产生。此外，痤疮丙酸杆菌还能分泌大量的蛋白酶、透明质酸和一些趋化因子，诱导皮肤细胞产生抗体及激活补体，进而引起毛囊炎症、皮肤破损以及形成疤痕。

痤疮的治疗方法有很多，其中抗生素治疗是一种常用的方法。尽管抗生素已被证实在降低皮肤炎症有效，但因其容易导致耐药性细菌产生的问题现时受到广泛质疑，尤其是在低剂量长期治疗上。此外，抗生素对减少皮肤过敏、损伤及疤痕形成作用不明显。

抗菌肽是一类可由昆虫、哺乳动物、植物甚至微生物体内诱导产生的小分子多肽。作为机体的防御因子，抗菌肽具有杀死多种细菌和真菌、抑制部分病毒和寄生性原虫以及选择性诱导肿瘤细胞发生凋亡的作用。与抗生素通过干扰代谢途径或抑制核酸合成的杀菌机制不同，抗菌肽是通过干扰病菌细胞膜的稳定性，使细胞内容物外泄的方式杀死细菌。这种独特的杀菌方式使病原微生物难以产生抗药性。此外，抗微生物肽还具有无残留毒性、不会产生抗原性等优点，使其在临床和日常应用上具有优越的应用前景。现时已有多种抗菌肽对痤疮丙酸杆菌有显著的抑杀作用，如果蝇来源的天蚕素(crecropin)系列以及一些人工合成的多肽。

创伤愈合在临床上经常遇到的难题，因此，如何缩短治疗时间、提高愈合质量是目前临床上亟待解决的课题。研究证实，细胞生长因子可通过促进细胞增殖和分化来修复各种皮肤损伤，改善伤口的愈合。与化学药物相比，细胞生长因子，如酸性成纤维细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、角质细胞生长因子、神经细胞生长因子等都能通过对前胶原基因表达的下行调节作用，抑制成纤维细胞分泌胶原的合成及沉积，从而防止瘢痕疙瘩的产生，尤其是在烧伤创面和慢性难愈性伤口治疗(如：褥疮、慢性感染的伤口，糖尿病、营养缺乏症、类固醇化病人的伤口，以及放射性伤口等)上，优势明显。

人体皮肤表面是是一个巨大的微生态系统，成分复杂。在人体皮肤直接使用抗菌肽或者细胞生长因子，很容易因与外界环境(如酸碱度、蛋白酶等)直接接触而导致快速失活，起不到抗菌和皮肤修复的作用。而反复使不但成本高，且容易出现皮肤过敏、色素沉淀及影响皮肤表面正常菌群微生态等。

近来的研究发现聚(D，L-乳酸-共-乙醇酸)(poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA)由两种单体——乳酸和羟基乙酸随机聚合而成，是一种可降解的功能高分子有机化合物，具有良好的生物相容性、无毒、良好的成囊和成膜的性能，被广泛应用于制药、医用工程材料和现代化工业领域。在美国，PLGA通过FDA认证，被正式作为药用辅料收录进美国药典。

本发明利用聚(D，L-乳酸-共-乙醇酸)制成外壳，在其中包裹包含抗菌肽和细胞生长因子的内核，并制成纳米级颗粒，用于痤疮治疗和受损皮肤的修复。研究发现，本发明制成的纳米颗粒，对皮肤没有刺激作用，能够很好地沉积在痤疮等皮肤损伤部位，随着外壳的生物降解，可以实现纳米颗粒内包裹的药物的缓慢释放，在临床应用时能减少给药次数以及对皮肤病变进行持续改善。

发明内容

本发明公开一种含抗菌肽和细胞生长因子的纳米颗粒，其特征在由用可生物降解的聚(D，L-乳酸-共-乙醇酸)制成的外壳和包裹在所述外壳中的包含抗菌肽和细胞生长因子的内核组成。其中，所述抗菌肽占所述纳米颗粒总重的8-15重量％，细胞生长因子占所述纳米颗粒总重的1-4重量％。优选地，所述抗菌肽占所述纳米颗粒总重的12.36重量％。所述细胞生长因子占所述纳米颗粒总重的3.1重量％。更优选地，所述纳米颗粒的内核是包含抗菌肽与细胞生长因子的组合物，并且在所述组合物中，所述抗菌肽与细胞生长因子的质量比率约为4∶1。最优选地，所述纳米颗粒的内核是基本上由质量比率约为4∶1的抗菌肽与细胞生长因子组成的组合物。

所述纳米颗粒的直径为80-150纳米，优选100纳米。本发明的纳米颗粒具有缓释功能，且能防止活性成分抗菌肽及细胞生长因子的快速失活。内含的抗菌肽可杀死皮肤表面的痤疮丙酸杆菌，而细胞生长因子则有利于受损皮肤的修复再生。

在一个优选的实施方案中，所述内核由抗菌肽和细胞生长因子组成。在进一步优选的实施方案中，在所述内核中，抗菌肽和细胞因子的质量比率约为4∶1。

本发明的上述目的通过如下技术方案予以实现：

1.一种含抗菌肽和细胞生长因子的纳米颗粒，其特征在于由用可生物降解的聚(D，L-乳酸-共-乙醇酸)制成的外壳和包裹在所述外壳中的包含抗菌肽和细胞生长因子的内核组成，其中所述抗菌肽占所述纳米颗粒总重的8-15重量％，细胞生长因子占所述纳米颗粒总重的1-4重量％。

2.根据第1项所述的纳米颗粒，其直径范围为80～150纳米。

3.根据第2项所述的纳米颗粒，所述纳米颗粒的直径为100纳米。

4.根据第1项所述的纳米颗粒，其中所述抗菌肽占所述纳米颗粒总重的12.36重量％。

5.根据第1项所述的纳米颗粒，其中所述细胞生长因子占所述纳米颗粒总重的3.1重量％。

6.根据第1项所述的纳米颗粒，其中所述内核是包含抗菌肽与细胞生长因子的组合物，并且在所述组合物中，所述抗菌肽与细胞生长因子的质量比率约为4∶1。

7.根据第1项所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒的内核是基本上由质量比率约为4∶1的抗菌肽与细胞生长因子组成的组合物。

8.根据第1项所述的纳米颗粒，其中所述内核中的抗菌肽为能够杀死痤疮丙酸杆菌的多肽，其选自天蚕素(crecropin，SEQ ID Nos.1-3)和SEQID Nos.9-11所示的人工合成多肽(ILWKRK、ILPWKWLWWLWKKKR、KWKLFRRIGAVLRVL)中的一种或多种。

9.根据第8项所述的纳米颗粒，其中所述内核中的抗菌肽为SEQ IDNo.10(ILPWKWLWWLWKKKR)。

10.根据第1项所述的纳米颗粒，其中所述内核中的细胞生长因子是选自人源酸性成纤维细胞生长因子(SEQ ID No.4)、人源碱性成纤维细胞生长因子(SEQ ID No.5)、人源表皮生长因子(SEQ ID No.6)、人源角质细胞生长因子(SEQ ID No.7)或人源神经细胞生长因子(SEQ ID No.8)中的任一种。

11.根据第10项所述的纳米颗粒，其中所述内核中的细胞生长因子是人源碱性成纤维细胞生长因子(SEQ ID No.5)。

12.根据第1项所述的纳米颗粒，其中在所述内核中，所述抗菌肽为SEQ ID No.10(ILPWKWLWWLWKKKR)，并且所述细胞生长因子是人源碱性成纤维细胞生长因子(SEQ ID No.5)。

13.一种制备权利要求1的含抗菌肽和细胞生长因子的纳米颗粒的方法，该方法包括以下步骤：

1).称取2737毫克聚(D，L-乳酸-共-乙醇酸)溶解于100毫升乙酸乙酯中，振荡成澄清溶液；

2).称取40毫克抗菌肽固体和10毫克细胞生长因子固体；

3).取10毫升步骤1)中所述溶液中加入200微升Tween-100溶液，超声混匀；

4).将步骤2)中称取好的抗菌肽和细胞生长因子溶于步骤3)中所述溶液中，搅拌混匀；

5).将步骤4)中制备的溶液用蠕动泵以雾化方式加入到含聚乙烯醇4-88的水溶液中，室温搅拌过夜；

6).收集步骤5)中所述的溶液，高速离心并收集沉淀，弃去上清液；

7).用去离子水重悬步骤6)收集的沉淀，然后冻干，得到含抗菌肽和细胞生长因子的纳米颗粒。

其中，天蚕素(crecropin)主要包括一些果蝇来源的多肽，例如，SEQID Nos.1-3的多肽。在本发明具体的实施方案中，SEQ ID Nos.1-3的多肽可以由吉尔生化(上海)有限公司化学合成，纯度大于98％。人源的细胞因子SEQ ID Nos.5-8可商购获得，例如，购自Peprotech，U.S.A.等。

更具体地，除了化学合成或商业购买途径之外，用于制成本发明所述的内核抗菌肽或者细胞生长因子可以通过基因工程技术表达、分离纯化得到(参见Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)。

优选地，本发明还公开一种含抗菌肽和细胞生长因子的纳米颗粒的制备方法，该方法包括以下步骤：

1).称取2737毫克聚(D，L-乳酸-共-乙醇酸)溶解于100毫升乙酸乙酯中，振荡成澄清溶液；

2).称取40毫克抗菌肽固体和10毫克细胞生长因子固体；

3).取10毫升步骤1)中所述溶液中加入200微升Tween-100溶液，超声混匀；

4).将步骤2)中称取好的抗菌肽和细胞生长因子溶于步骤3)中所述溶液中，搅拌混匀；

5).将步骤4)中制备的溶液用蠕动泵以雾化方式加入到含聚乙烯醇4-88的水溶液中，室温搅拌过夜；

6).收集步骤5)中所述的溶液，高速离心并收集沉淀，弃去上清液；

7).用去离子水重悬步骤6)收集的沉淀，然后冻干，得到含抗菌肽和细胞生长因子的纳米颗粒。

聚(D，L-乳酸-共-乙醇酸)易溶于乙酸乙酯溶液，然后在2％聚乙烯醇4-88溶液中发生聚合，自发形成中空囊泡状纳米颗粒(见图2的电镜图片)，并在形成囊泡过程中包裹水溶液药物。

在这个纳米颗粒制备过程中(详见实施例1)，其制备溶液含有少量的水、乙酸乙酯，吐温-100等杂质。本发明人将溶液放于离心管中，14℃，60000xg，离心1小时，收集纳米颗粒并弃去上清液。加入100毫升灭菌去离子水，重悬纳米颗粒，然后，以14℃，60000xg，离心1小时的方法，洗涤颗粒2次，以去除吐温-100、聚乙烯醇4-88以及大部分水和乙酸乙酯。

由于乙酸乙酯具挥发性、而固体水分在冻干过程中也可以通过升华方式去除，因此，本发明人利用冻干的方法，除去剩余杂质。从这一角度上，也可以说，本发明的纳米颗粒的内核是基本上由抗菌肽和细胞生长因子组成的组合物，并且在所述组合物中，所述抗菌肽与细胞生长因子的质量比率约为4∶1。因此，成品纳米颗粒只含有聚(D，L-乳酸-共-乙醇酸)形成的囊泡和由抗菌肽与细胞生长因子组成的内核(正常情况下，冻干品会含有0.5-3％的水分)。

本领域技术人员应该理解，上述制备方法中各成分的用量并不限于所示的量，本领域技术人员可以进行适当的调整，例如，成比例的增加或减少用量，这些变化均包含在本发明的范围之内。

本发明制备的含抗菌肽和细胞生长因子的纳米颗粒还可以用于制备祛痘化妆品制剂方：通过将上述的纳米颗粒与本领域技术人员熟知的药物载体或赋形剂组合，按照祛痘化妆品领域的常规方法制成适于外用的霜剂、乳化剂或者水剂等剂型。

附图说明

图1.为本发明所述的纳米颗粒的结构示意图；

图2.为本发明所述的纳米颗粒的电镜示意图；

图3.为本申请所述纳米颗粒促成纤维细胞增殖的示意图(*表示P＜0.05；***表示P＜0.001)；

图4.为本申请所述纳米颗粒抑制痤疮杆菌生长的示意图。

序列表说明

SEQ ID No.1：黑腹果蝇天蚕素A氨基酸序列(N端-C端，共63个氨基酸，参见AAF57025；可由吉尔生化(上海)有限公司化学合成，纯度大于98％)；

SEQ ID No.2：黑腹果蝇天蚕素B氨基酸序列(N端-C端，共63个氨基酸，参见AAF57027；可由吉尔生化(上海)有限公司化学合成，纯度大于98％)；

SEQ ID No.3：黑腹果蝇天蚕素C氨基酸序列(N端-C端，共63个氨基酸，参见AAF57028；可由吉尔生化(上海)有限公司化学合成，纯度大于98％)；

SEQ ID No.4：人源酸性成纤维细胞生长因子(N端-C端，共154个氨基酸，参见AAB29057；可购自Peprotech，U.S.A.，货号：100-17A)；

SEQ IDNo.5：人源碱性成纤维细胞生长因子(N端-C端，共155个氨基酸，参见AAA52448，可购自Peprotech，U.S.A.，货号：100-18B)；

SEQ ID No.6：人源表皮生长因子(N端-C端，共53个氨基酸，参见AAS83395；可购自Peprotech，U.S.A.，货号：AF-100-15)

SEQ ID No.7：人源角质细胞生长因子(N端-C端，共194个氨基酸，参见AAB21431；可购自Peprotech，U.S.A.，货号：AF-100-19)；

SEQ ID No.8：人源神经细胞生长因子(N端-C端，共168个氨基酸，参见AAA35961；可购自Peprotech，U.S.A.，货号：AF-450-01)；

SEQ IDNo.9：ILWKRK(人工合成的抗菌肽)；

SEQ IDNo.10：ILPWKWLWWLWKKKR(人工合成的抗菌肽)；

SEQ ID No.11：KWKLFRRIGAVLRVL(人工合成的抗菌肽)。

具体实施方式：

以下通过实施例来进一步阐明本发明。但是应该理解，所述实施例只是举例说明的目的，并不意欲限制本发明的范围和精神。

需要说明的是，本领域技术人员应该理解，下述实施例中所用的试剂、酶类等除特别说明外，均为可从试剂公司商购的分析纯级别的试剂或酶类。

实施例1.含抗菌肽和细胞生长因子的纳米颗粒的制备

称取2737毫克的聚(D，L-乳酸-共-乙醇酸)(poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA，lactide∶glycolide(50∶50)，购自Sigma，U.S.A.，货号P2191)并溶于100毫升乙酸乙酯中(购自Sigma，U.S.A.，货号437549，)，并命名为EA溶液。取10毫升EA溶液，加入200微升吐温80(Tween-80，购自Sigma，U.S.A.，货号T2575)，振荡混匀，并命名为SBE溶液。

分别称取40毫克抗菌肽ILPWKWLWWLWKKKR(SEQ ID No.10，序列为从氨基端(N端)到羧基端(C端)的氨基酸顺序，由吉尔生化(上海)有限公司化学合成，纯度大于98％)和10毫克人源碱性成纤维细胞生长因子(序列为SEQ ID No.5，购自Peprotech，U.S.A.，货号：100-18B)，加入到上述的SBE溶液中，水浴超声(型号：VCX500，Sonics，U.S.A.)至溶液变澄清后，再全部转移到剩余的EA溶液中，涡旋振荡30秒混匀并静置2分钟。

制备20毫升2％聚乙烯醇4-88溶液(购自Merck，Germany，货号141350)，然后，用蠕动泵(Millipore，U.S.A.，型号：xx8200230)及超声波破碎仪(Sonics，U.S.A.，型号：VCX500)将含有抗菌肽和细胞生长因子的EA溶液以雾化方式均匀加入2％的聚乙烯醇4-88溶液中，(流速：1毫升/分钟，超声能量：133瓦)，搅拌混匀后，再加入30毫升去离子水，室温搅拌12-14小时。

将溶液至于离心管(Corning，U.S.A.，货号：430828)中，14℃，60000xg，离心1小时，收集纳米颗粒并弃去上清液。加入100毫升灭菌去离子水，重悬纳米颗粒，然后，以14℃，60000xg，离心1小时的方法，洗涤颗粒2次，以去除吐温-100、聚乙烯醇4-88以及大部分水和乙酸乙酯。最后，用40毫升灭菌去离子水重悬纳米颗粒，并置于冻干机中，-50℃真空冻干18-24小时，即得到含抗菌肽和细胞生长因子的纳米颗粒，其外壳由聚(D，L-乳酸-共-乙醇酸)形成。通过电镜检测，其颗粒直径在87纳米左右。

实施例2.细胞增殖活性的测定

采用噻唑蓝(3-(4，5-Dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT，购自sigma，U.S.A.，货号：M2128)染色法测定纳米颗粒中细胞生长因子对NIH/3T3成纤维细胞(购自美国典型培养物保藏中心ATCC，目录号：CRL-1658)的促增殖活性。用含10％胎牛血清的F-12K(Ham′s)培养基(购自Panreac AppliChem，Germany，货号：A1297)培养NIH-3T3成纤维细胞至对数生长期，然后用0.25％(w/v)的胰蛋白酶(购自Life Technologies，U.S.A.，货号：R-001-100)溶液消化并计数，按每孔7000个细胞加入到96孔细胞培养板(Corning，U.S.A.，货号：3300)中，于37℃，5％二氧化碳环境中培养24小时后，换入含2％血清的新鲜培养基继续培养16小时。用培养基对实施例1中制备的纳米颗粒样品按倍比方法进行系列稀释，使其作用终浓度为0.05毫克/毫升(低剂量)、0.1毫克/毫升(中剂量)以及0.33毫克/毫升(高剂量)，然后加入到细胞培养板中(100微升/孔)培养48小时。以30纳克/毫升的碱性成纤维细胞生长因子以及3毫克/毫升的不含细胞生长因子及抗菌肽的纳米颗粒分别作为阳性和阴性对照。培养结束后，加入20微升MTT(5毫克/毫升)溶液，继续培养4小时。弃上清，加入二甲基亚砜(DMSO，购自Sigma，U.S.A.，货号：D8418)100微升，室温放置30分钟后，用酶联免疫比色仪(Bio-tek，U.S.A.，型号：ELX800)测定其吸光度，测定波长为570nm，对照波长为630nm。结果显示，终浓度为0.1毫克/毫升的实施例1制备的纳米颗粒即具有显著的促成纤维细胞增殖能力(图3)。

实施例3.抑菌活性的测定

称取适量的实施例1制备的纳米颗粒，用水溶解，制备成终浓度为1毫克/毫升、2毫克/毫升以及6毫克/毫升的工作溶液。取100毫升细菌液体培养基(蛋白胨10克/升，酵母提取物5克/升，氯化钠10克/升，pH7.0)高温灭菌后，冷却至45℃，加入100微升(约3x10⁵个克隆)过夜培养的痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes，购自美国典型培养物保藏中心ATCC，货号：ATCC-11827)，轻轻摇匀后接种到6孔板中(500微升/孔)。然后，每孔加入500微升纳米颗粒工作液，混匀，37℃恒温培养24小时，每2小时取样，酶联免疫比色仪(Bio-tek，U.S.A.，型号：ELX800)测量密度值(测量波长600nm)。以100微克/毫升的合成抗菌肽ILPWKWLWWLWKKKR以及3毫克/毫升的不含细胞生长因子及抗菌肽的纳米颗粒分别作为阳性和阴性对照。结果显示，终浓度为1毫克/毫升的实施例1制备的纳米颗粒能完全抑制痤疮杆菌的生长，与阳性组没有显著差异(图4)。

应该理解，尽管参考其示例性的实施方案，已经对本发明进行具体地显示和描述，但是本领域的普通技术人员应该理解，在不背离由后附的权利要求所定义的本发明的精神和范围的条件下，可以在其中进行各种形式和细节的变化，可以进行各种实施方案的任意组合。

等同实施方案：本发明可以体现为其他具体的但不偏离其精神或基本特征的形式，因此认为前述实施方案是在所有方面说明而不是限制本文所描述的发明。因此，本发明的范围包括在权利说明书等同目的和范围内的所有修改和组合。

Claims (8)

1.一种含抗菌肽和细胞生长因子的纳米颗粒，其特征在于由用可生物降解的聚(D，L-乳酸-共-乙醇酸)制成的外壳和包裹在所述外壳中的包含抗菌肽和细胞生长因子的内核组成，其中所述抗菌肽如SEQ ID No.10所示，并且占所述纳米颗粒总重的8-15重量％，所述细胞生长因子占所述纳米颗粒总重的1-4重量％。

2.根据权利要求1所述的纳米颗粒，其特征在于：所述纳米颗粒的直径范围为80-150纳米。

3.根据权利要求2所述的纳米颗粒，所述纳米颗粒的直径为100纳米。

4.根据权利要求1所述的纳米颗粒，其中所述抗菌肽占所述纳米颗粒总重的12.36重量％。

5.根据权利要求1所述的纳米颗粒，其中所述细胞生长因子占所述纳米颗粒总重的3.1重量％。

6.根据权利要求1所述的纳米颗粒，其中所述内核是包含抗菌肽与细胞生长因子的组合物，并且在所述组合物中，所述抗菌肽与细胞生长因子的质量比率为4∶1。

7.根据权利要求1所述的纳米颗粒，其特征在于：所述内核中的细胞生长因子是选自人源酸性成纤维细胞生长因子、人源碱性成纤维细胞生长因子、人源表皮生长因子或人源角质细胞生长因子中的任一种。

8.根据权利要求7所述的纳米颗粒，其中所述内核中的细胞生长因子是人源碱性成纤维细胞生长因子。