WO2021201516A1 - 인슐린 수용체 특이적 압타머 및 이의 용도 - Google Patents

인슐린 수용체 특이적 압타머 및 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
WO2021201516A1
WO2021201516A1 PCT/KR2021/003795 KR2021003795W WO2021201516A1 WO 2021201516 A1 WO2021201516 A1 WO 2021201516A1 KR 2021003795 W KR2021003795 W KR 2021003795W WO 2021201516 A1 WO2021201516 A1 WO 2021201516A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
aptamer
insulin
insulin receptor
group
naphthyl group
Prior art date
Application number
PCT/KR2021/003795
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
윤나오
박만근
류성호
김윤동
이조운이
이정균
Original Assignee
주식회사 압타머사이언스
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 압타머사이언스 filed Critical 주식회사 압타머사이언스
Publication of WO2021201516A1 publication Critical patent/WO2021201516A1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/72—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/558—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using diffusion or migration of antigen or antibody
    • G01N33/561—Immunoelectrophoresis

Definitions

  • the present invention relates to an IR-specific aptamer that effectively enhances the sensitivity of an insulin receptor (IR) and enhances an IR signal in the presence of insulin.
  • IR insulin receptor
  • the present invention targets the Q272 residue in the cysteine rich (CR) domain of IR, which plays an important role in the modulation of IR, positive allosteric modulators for IR (Positive allosteric modulators, PAM) of the screening method.
  • Receptor tyrosine kinases are well-known cell membrane proteins that play key regulators of cell growth, proliferation, differentiation and metabolism.
  • Insulin receptor which is a type of RTK, promotes mitogen-activated protein kinase (MAPK)-related cell proliferation and phosphatidylinositol 3 kinase (PI3K)-related glucose metabolism in cells.
  • PI3K phosphatidylinositol 3 kinase
  • IR-mediated glucose uptake in adipose tissue and muscle is essential to maintain normal blood glucose levels. For this reason, IR has been widely used as a target for the treatment of diabetes (Diabetes, Diabetes mellitus, DM).
  • Diabetes is a type of metabolic disease and is associated with high blood sugar levels. About 90% of diabetic patients belong to type 2 diabetes (T2D). Most T2D is caused by insulin resistance. Insulin resistance significantly reduces the effectiveness of insulin, making it difficult to control blood sugar levels. In the early stages of diabetes (or prediabetes), the effects of insulin resistance can be overcome with more insulin secreted by pancreatic ⁇ cells. However, over time, high blood sugar levels are maintained due to ⁇ -cell dysfunction, ultimately requiring exogenous insulin to lower blood sugar levels in diabetic conditions.
  • T2D type 2 diabetes
  • Insulin and insulin analogues are the most commonly used antidiabetic drugs to lower blood sugar levels. In addition to the amount of insulin, insulin sensitivity is important for maintaining normal blood sugar levels. Insulin sensitivity indicates how sensitive a cell is to the effect of insulin, and improving it is one way to maximize the effect of insulin. Accordingly, a method for improving insulin sensitivity using positive allosteric modulators (PAM) is being studied.
  • PAM positive allosteric modulators
  • the allosteric modulator binds to a specific partial receptor of an orthosteric ligand, and regulates activation according to a change in the receptor structure. It can be classified according to the activating effect of the orthosteric ligand and the receptor activation capacity (De Smet, F., Christopoulos, A. and Carmeliet, P. (2014) Allosteric targeting of receptor tyrosine kinases. Nature biotechnology, 32, 1113). -1120.). Positive allosteric modulators (PAMs) increase the affinity and potency of orthosteric ligands. Conversely, negative allosteric modulators (NAMs) attenuate the affinity and potency of orthosteric ligands.
  • PAMs Positive allosteric modulators
  • NAMs negative allosteric modulators
  • Allosteric modulators have several potential advantages compared to ligands that bind to orthosteric sites, such as high specificity for receptor subtypes as drugs and reduced risk of drug overdose. Therefore, the study of allosteric modulators is important not only for the discovery of receptor activation mechanisms, but also for the discovery of new drug candidates.
  • the aptamer has high affinity and specificity for the target protein, similar to the antibody.
  • an aptamer interacts with the surface structure topology of a target protein.
  • the specificity of aptamers tends to be very sensitive to even small differences in target protein structure. Due to these properties, aptamers are ideally suited for the development of allosteric modulators required to recognize ligand-induced conformational changes of receptors. However, so far, there are only a few aptamers that act as agonists and activate the function of receptors.
  • IR-A43 which is a positive allosteric modulator (PAM) aptamer that specifically binds to an insulin receptor (IR).
  • PAM positive allosteric modulator
  • IR-A43 exhibited sensitizing properties and thus did not show activity in the absence of insulin, and effectively improved insulin sensitivity and enhanced IR signal in the presence of insulin.
  • the present inventors confirmed that the Q272 residue in the cysteine rich (CR) domain of IR is important for the modulation of IR, confirming that the Q272 residue may play an important role in the hotspot for IR sensitization did. Accordingly, IR-A43 can be used as a PAM for IR control.
  • One object of the present invention is to provide an insulin receptor (insulin receptor, IR) specific aptamer.
  • Another object of the present invention is to provide a screening method for positive allosteric modulators (PAM) for the insulin receptor.
  • PAM positive allosteric modulators
  • Another object of the present invention is to provide a cysteine-rich domain of an insulin receptor, which is a cysteine-rich domain of the insulin receptor, to which the aptamer of the present invention binds.
  • the insulin receptor (IR)-A43 aptamer of the present invention exhibits sensitizing properties and thus does not exhibit activity in the absence of insulin, and effectively improves insulin sensitivity and enhances the IR signal when present together with insulin.
  • the Q272 residue in the cysteine rich (CR) domain of IR is important for the regulation of IR, and it was confirmed that the Q272 residue may play an important role in the hotspot for IR sensitization, IR-A43 can be used as positive allosteric modulators (PAM) for the regulation of IR, and can increase IR sensitivity by targeting the Q272 residue.
  • PAM positive allosteric modulators
  • IR-A43F full sequence, 80mer
  • IR-A43 cleaved sequence, 31mer
  • 'N' represents Nap-dU(5-(N-1-naphthylmethylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine).
  • IR-A43F affinity and IGF1-R insulin-like growth factor 1 receptor were measured in the absence and presence of 100 nM insulin through a filter binding assay, respectively.
  • the dissociation constant (Kd) was determined based on a model in which one part was saturated.
  • FIG. 2 Human IR overexpressed Rat-1 cells (Rat-1 / hIR) FITC (fluorescein isothiocyanate) labeled insulin (FITC-insulin) (untreated (NT), 0.8 nM, 4 nM, 20 nM, 100 nM and After incubation at 500 nM), the binding affinity between IR and insulin or between IR and insulin and IR-A43 was confirmed through flow cytometry.
  • FITC fluorescein isothiocyanate labeled insulin
  • C Results of stimulation of cells cultured at 100 nM of FITC-IR-A43 with insulin 2 nM, 10 nM, and 50 nM at 4° C. for 1 hour.
  • Rat1/hIR cells were co-stimulated with insulin 10 nM and IR-A43 500 nM for 10 min, (A) site-specific phosphorylation of tyrosine residues of insulin receptors, (B) downstream insulins such as pIRS, pAKT, pSHC and pERK The result of confirming the phosphorylation of molecules involved in signaling. (C) The result of confirming phosphorylation of hIR (Y1150/1151) by co-stimulation of Rat1/hIR cells with 5 nM insulin and increasing IR-A43 concentration for 10 min.
  • Rat1/hIR cells were treated with low-dose insulin (2nM), high-dose insulin (50nM), or low-dose insulin (2nM) with IR-A43 to quantitatively evaluate the insulin-enhancing activity of IR-A43.
  • Results of stimulation with (250 nM). Bar graphs are expressed as mean ⁇ SE (SEM) (n 2 independent experiments).
  • Figure 4 Results of measuring glucose uptake after stimulation of fully differentiated 3T3-L1 adipocytes with 500 nM IR-A43, 20 nM insulin, or 20 nM insulin and 500 nM IR-A43 for 30 minutes. Data are presented as mean ⁇ SE (SEM). P-values were determined by one-way ANOVA followed by Tukey's multiple comparison test ( * p ⁇ 0.05, ** p ⁇ 0.01, *** p ⁇ 0.001 and ns, not significant).
  • FIG. 5 (A) Schematic representation of domain substitutions between hIR and mIR used to make a hybrid human IR (hIR) comprising a portion of the mouse IR (mIR). (B) Phosphorylation of a hybrid hIR comprising part 1, part 2, part 3, part 4, part 5, part 6 or part 7 of the mIR. (C) Phosphorylation of hybrid mIR comprising part 2 of hIR. (D) Phosphorylation of the hIR mutant (R271K/Q272P) in which residue R271 is substituted with K271 and residue Q272 is substituted with P272.
  • G Phosphorylation of the mIR mutant (P272Q) in which P272 is substituted with Q272.
  • Figure 6 Structural analysis results of the insulin-enhancing activity of IR-A43 based on the structure of the insulin receptor in the Protein Data Bank (PDB) database.
  • PDB Protein Data Bank
  • D Structural overlap of the L1-CR-L2 domains in the inactive and active forms.
  • One aspect of the present invention provides an insulin receptor (insulin receptor, IR) specific aptamer.
  • insulin receptor promotes mitogen-activated protein kinase (MAPK)-related cell proliferation and PI3K (phosphatidylinositol 3 kinase)-related glucose metabolism in cells.
  • MAPK mitogen-activated protein kinase
  • PI3K phosphatidylinositol 3 kinase
  • aptamer refers to a "Chemical Antibody” that has a short-length (20-80 bases) single-stranded property capable of binding to various types of target ligands from specific compounds to proteins with high specificity and affinity. means a nucleic acid molecule. Aptamers can be prepared in vitro through SELEX (Systematic evolution of ligands by exponential enrichment).
  • Aptamers are considered to be oligonucleic acid molecules having properties similar to those of antibodies in that they have high binding affinity and selectivity of nanomolar (nM) to femtomolar (fM) levels for a target protein.
  • aptamers compared with antibodies, aptamers have several advantages as follows: (1) aptamers prepared by chemical synthesis are easier to change than protein-based substances such as antibodies, and (2) SELEX process selectivity and affinity can be maximized, (3) high purity because it is made by chemical synthesis, (4) can be identified through instrumentation analysis, (5) stable to heat and can be stored for a long time at room temperature do.
  • SELEX Systematic evolution of ligands by exponential enrichment
  • a target substance As used herein, the term "SELEX (Systematic evolution of ligands by exponential enrichment)” is a method of selecting an aptamer that binds to a target substance.
  • an oligonucleotide library DNA or RNA
  • the DNA/RNA library not bound to the target is removed.
  • the nucleotides bound to the target After separating the nucleotides bound to the target, amplify them through a gene amplification method and repeat the above process several times to select an aptamer having high binding ability to the target.
  • an aptamer was prepared by modifying the general SELEX method as described above, and the specific method thereof is described below.
  • the aptamer selection process requires a process of securing a single-stranded nucleic acid pool from a library having about 10 14 to 10 15 different sequences, ie, diversity.
  • Various methods are used as a method for this, but in general, a method of amplifying only one strand using asymmetric PCR, biotin is attached to the end of one strand of a double-stranded nucleic acid, and then beads wrapped with streptavidin (streptavidin) The method of selectively separating only one strand using a bead is the most used.
  • a selection process of selecting an aptamer with high binding affinity is performed by binding the obtained library to a target molecule.
  • the target molecule is a protein
  • biotin labeled with the protein is usually pulled down using streptavidin beads.
  • the modified nucleic acid library not bound to the target protein is removed by washing with a buffer.
  • the plate after inducing the binding of the nucleic acid library to the target protein, it is washed with a buffer to remove nucleic acids that do not bind to the target protein.
  • a buffer to remove nucleic acids that do not bind to the target protein.
  • aptamers having affinity for the ligand usually, by repeating the selection-amplification process 5-15 times, an aptamer with high affinity can be obtained.
  • the amplified nucleic acid is cloned, the sequence is confirmed through sequence analysis from each clone, and the affinity and binding force with the target molecule are measured by synthesizing an aptamer.
  • the term “target molecule” refers to a substance detectable by the aptamer of the present invention. Specifically, the target molecule is present in the isolated sample and includes a protein, peptide, carbohydrate, polysaccharide, glycoprotein, hormone, receptor, antigen, antibody, virus, cofactor, drug, to which the capture aptamer can bind. It may be one or more selected from the group consisting of dyes, growth factors and controlled substances, but is not limited thereto. For the purposes of the present invention, the target molecule may be an insulin receptor, but is not limited thereto.
  • the aptamer of the present invention may include any one or more modifications selected from the following in one or more nucleotides constituting the polynucleotide sequence thereof.
  • the aptamer may include a nucleotide sequence of the following general formula (1).
  • Y in the general formula 1 is independently a pyrimidine-based base, and specifically may be C or T,
  • the 5' carbon in Y may be substituted with any one or more selected from the group consisting of a naphthyl group and a 2-naphthyl group, but is not limited thereto.
  • Y in Formula 1 may be substituted with a naphthyl group, and specifically may be substituted with Nap-dU (5-(N-1-naphthylmethylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine), but is not limited thereto.
  • the nucleotide sequence of Formula 1 may include a nucleotide sequence having 70% or more, 80% or more, 85% or more, or 90% or more homology thereto, but is not limited thereto.
  • the aptamer may include the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 22, but is not limited thereto.
  • the aptamer may include a nucleotide sequence of the following general formula (2).
  • Y in Formula 2 is independently a pyrimidine-based base, and may specifically be C or T,
  • the 5' carbon in Y may be substituted with any one or more selected from the group consisting of a naphthyl group and a 2-naphthyl group, but is not limited thereto.
  • Y in Formula 2 may be substituted with a naphthyl group, specifically, may be substituted with Nap-dU (5-(N-1-naphthylmethylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine), but is not limited thereto.
  • the nucleotide sequence of Formula 2 may include a nucleotide sequence having 70% or more, 80% or more, 85% or more, or 90% or more homology thereto, but is not limited thereto.
  • the aptamer may include a nucleotide sequence represented by the following general formula (3).
  • Y and W in the general formula 3 are independently a pyrimidine-based base, and specifically may be C or T,
  • 5' carbon in Y and W is substituted with any one or more selected from the group consisting of a naphthyl group and a 2-naphthyl group,
  • Any one or more of A, C, T and G in General Formula 3 may be one in which any one or more functional groups selected from the group consisting of a methoxy group and fluorine are introduced, but is not limited thereto.
  • Y in Formula 3 may be one substituted with a naphthyl group, specifically, one substituted with Nap-dU (5-(N-1-naphthylmethylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine), but is not limited thereto.
  • W in General Formula 3 may be substituted with a 2-naphthyl group, specifically, it may be substituted with 2-Nap-dU (5-(N-2-naphthylmethylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine), but is limited thereto doesn't happen
  • A, C, T and G of the general formula 3 may be a methoxy group or a fluorine introduced, but is not limited thereto.
  • the nucleotide sequence of Formula 3 may include a nucleotide sequence having 70% or more, 80% or more, 85% or more, or 90% or more homology thereto, but is not limited thereto.
  • the aptamer may include any one or more base sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3 to 10, but is not limited thereto.
  • the aptamer may include a nucleotide sequence of the following general formula (4).
  • Y and W of the general formula 4 are independently a pyrimidine-based base, and may specifically be C or T,
  • 5' carbon in Y and W is substituted with any one or more selected from the group consisting of a naphthyl group and a 2-naphthyl group,
  • Any one or more of A, C, T and G in General Formula 4 may be introduced with any one or more functional groups selected from the group consisting of a methoxy group and fluorine, but is not limited thereto.
  • Y in Formula 4 may be substituted with a naphthyl group, and specifically may be substituted with Nap-dU (5-(N-1-naphthylmethylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine), but is not limited thereto.
  • W in Formula 4 may be substituted with a 2-naphthyl group, specifically, it may be substituted with 2-Nap-dU (5-(N-2-naphthylmethylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine), but is limited thereto doesn't happen
  • A, C, T and G of the general formula 4 may be a methoxy group or a fluorine introduced, but is not limited thereto.
  • the nucleotide sequence of Formula 4 may include a nucleotide sequence having 70% or more, 80% or more, 85% or more, or 90% or more homology thereto, but is not limited thereto.
  • the aptamer may include any one or more base sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 11 to 19, but is not limited thereto.
  • the aptamer of the present invention may further include 1 to 30 polynucleotides at any one or more selected from the 5' end and the 3' end thereof.
  • the aptamer may include 30 to 150 nucleotides by further including the above-described polynucleotide at any one or more selected from the 5' end and the 3' end thereof.
  • affinity with the insulin receptor may be remarkably increased compared to the case where the aptamer is not modified.
  • the term 'homology' or 'identity' refers to a degree related to two given amino acid sequences or nucleotide sequences and may be expressed as a percentage.
  • the terms homology and identity can often be used interchangeably.
  • Sequence homology or identity of a conserved polynucleotide or polypeptide is determined by standard alignment algorithms, with default gap penalties established by the program used may be used.
  • Substantially, homologous or identical sequences generally have moderate or high stringency along at least about 50%, 60%, 70%, 80% or 90% of the entire or full-length sequence. It can hybridize under stringent conditions. Hybridization is also contemplated for polynucleotides containing degenerate codons instead of codons in the polynucleotides.
  • GAP program is defined as the total number of symbols in the shorter of two sequences divided by the number of similarly aligned symbols (ie, nucleotides or amino acids).
  • Default parameters for the GAP program are: (1) a binary comparison matrix (containing values of 1 for identity and 0 for non-identity) and Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation , pp. 353-358 (1979), Gribskov et al (1986) Nucl. Acids Res. 14: weighted comparison matrix of 6745 (or EDNAFULL (EMBOSS version of NCBI NUC4.4) substitution matrix); (2) a penalty of 3.0 for each gap and an additional 0.10 penalty for each symbol in each gap (or a gap opening penalty of 10, a gap extension penalty of 0.5); and (3) no penalty for end gaps.
  • the aptamer of the present invention may bind to a cysteine rich (CR) domain of an insulin receptor.
  • the cysteine rich domain may be an amino acid residue (SEQ ID NO: 24) corresponding to positions 234 to 281 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25 constituting the insulin receptor.
  • the binding site in the cysteine-rich domain of the aptamer may be an amino acid residue corresponding to position 272 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25 constituting the insulin receptor.
  • corresponding position refers to an amino acid residue at a position listed in a protein or polypeptide, or an amino acid residue similar to, identical to, or homologous to a residue listed in a protein or polypeptide.
  • corresponding region generally refers to a similar or corresponding position in a related protein or reference protein.
  • Specific numbering may be used for amino acid residue positions in proteins used in the present invention. For example, by aligning the polypeptide sequence of the protein of the present invention with the target protein to be compared, it is possible to renumber the position corresponding to the amino acid residue position of the protein of the present invention.
  • Another aspect of the present invention provides a screening method for positive allosteric modulators (PAM) for the insulin receptor.
  • PAM positive allosteric modulators
  • the term “positive allosteric modulators (PAM)” refers to an allosteric modulator that binds to a specific partial receptor of an orthosteric ligand and regulates activation according to a change in the receptor structure. modulator), and refers to an allosteric modulator that increases the affinity and efficacy of an orthosteric ligand.
  • the positive allosteric modulator may be used interchangeably with an allosteric enhancer.
  • Allosteric modulators exhibit intrinsic or antagonism at their target receptors, with or without orthosteric ligands present. Allosteric modulators have several potential advantages compared to ligands that bind to orthosteric sites, such as high specificity for receptor subtypes as drugs and reduced risk of drug overdose.
  • the test substance when the test substance binds to the cysteine-rich domain of the insulin receptor, and the insulin receptor contacted with the test substance has increased sensitivity of the insulin receptor or enhanced downstream signaling compared to the control, the test The method may further include selecting the substance as a candidate for a positive allosteric modulator for the insulin receptor.
  • test substance may be any one or more selected from the group consisting of aptamers, proteins, peptides and compounds, but is not limited thereto.
  • Another aspect of the present invention provides a cysteine-rich domain of an insulin receptor, wherein the domain is characterized by binding to the aptamer of the present invention.
  • the cysteine rich domain may be an amino acid residue (SEQ ID NO: 24) corresponding to positions 234 to 281 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25 constituting the insulin receptor.
  • the position in the cysteine-rich domain to which the aptamer of the present invention binds may be an amino acid residue corresponding to position 272 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25 constituting the insulin receptor.
  • Example 1 Identification of a sensitizing aptamer for insulin receptor (IR)
  • SELEX and aptamer synthesis were obtained from Aptamer Science Inc. (Pohang, Korea). Specifically, the DNA random library consisted of 20mers for each 5'- and 3'-terminal primer binding site and 40mers for random variable regions.
  • the sequence selected in SELEX is as follows: 5'-TATGAGTGACCGTCCGCCTG-N 40 -CAGCCACACCACCAGCCAAA-3' (80mer, N 40 is a random variable region).
  • thymine (dT) was replaced with Nap-dU (5-[N-(1-naphthylmethyl) carboxamide]-2'-deoxyuridine).
  • DNA libraries were incubated with His-tagged recombinant human IR extracellular domains. After incubation, the IR protein was purified with Dynabeads TALON (Invitrogen). The selected DNA was extracted and amplified by PCR to obtain an IR-sensitive aptamer IR-A43 (SEQ ID NO: 23) (FIG. 1A).
  • sequence optimization of IR-A43 was performed, and the sequences of the 5'- and 3'-ends were cut out one by one to select the truncated aptamer showing the same activity as compared to the full-length original aptamer.
  • the selected aptamer was modified to confirm that the variable region was a 41mer (FIG. 1A).
  • the sequence-optimized IR-A43 was composed of modified 31mer DNA and exhibited a binding affinity for IR at about 70 nM in the absence of insulin (Fig. 1B). However, in the presence of insulin, IR-A43 dramatically increased its binding affinity for IR, exhibiting a binding affinity for IR at about 2.85 nM.
  • IR has a high level of sequence homology with IGF1-R (insulin-like growth factor 1 receptor) and shares a downstream signaling pathway. Avidity was analyzed using IR, IGF1-R and IR-A43.
  • IR-A43 does not bind to IGF1-R, but specifically binds to IR ( FIG. 1B ).
  • FITC fluorescein isothiocyanate
  • Rat-1 cells Rat-1 cells
  • HeLa cells human IR overexpressed Rat-1 cells (Rat-1/hIR) and HeLa cells were cultured in DMEM (Dulbecco's modified Eagel's medium) medium containing 10% fetal bovine serum (FBS) at 37° C., 5% CO 2 It was cultured under humidified conditions containing The cultured cells were transferred to a 100 mm dish, cultured to 80-90% confluency, washed, and separated with 5 mM EDTA containing 1X PBS (phosphate buffered saline). After cell isolation, the cells were incubated with blocking buffer (1% bovine serum albumin (BSA) and 0.1% NaN 3 ) at 4° C. for 30 minutes.
  • blocking buffer 1% bovine serum albumin (BSA) and 0.1% NaN 3
  • Rat-1/hIR cells were cultured to 90% confluency, and then cultured in DMEM without FBS for 2 hours. Thereafter, incubated briefly at 37° C. with Krebs-Ringer HEPES buffer [120 mM NaCl, 1.2 mM MgSO 4 , 1.3 mM KH 2 PO 4 , 1.3 mM CaCl 2 , 5 mM KCl and 25 mM HEPES (pH 7.4)].
  • the aptamer was heated in Krebs-Ringer HEPES buffer at 95° C. for 5 min and cooled at room temperature for 30 min to construct a unique structure of the aptamer. After cooling the aptamer, insulin was added and co-treated with the aptamer. After insulin and aptamer treatment, all samples were incubated in a 37°C incubator.
  • IR-A43 effectively increases insulin binding to IR.
  • IR-A43 binds more preferentially to the structure activated by insulin than to the structure in which the receptor is inactive without insulin.
  • IR-A43 increased insulin binding in Rat-1/hIR cells using FITC-insulin ( FIG. 2D ).
  • FITC-insulin alone 100 nM
  • the peak of the fluorescence intensity shifted by 16.7%
  • Example 2 it was confirmed that IR-A43 increases insulin binding to IR. Based on this, it was expected that insulin binding to IR and IR downstream signaling pathways would increase. Therefore, to investigate the relationship between IR-A43 and IR signals, IR and IR downstream signaling pathways IRS (Insulin Receptor Substrate), AKT (Protein kinase B), SHC (Src Homology 2 Domain Containing Transforming Protein) and ERK ( Phosphorylation of Extracellular Signal-regulated Kinase) was confirmed.
  • IRS Insulin Receptor Substrate
  • AKT Protein kinase B
  • SHC Serc Homology 2 Domain Containing Transforming Protein
  • ERK Phosphorylation of Extracellular Signal-regulated Kinase
  • RIPA buffer 50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 0.1% sodium dodecyl sulphate (SDS), 0.5% sodium deoxycholate ( sodium deoxycholate), 1% Triton-X, 10% glycerol, 1mM EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), 1mM PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride), 2mM Na 3 VO 4 , 10mM ⁇ -glycerophosphate, 20 mM NaF and protease inhibitor cocktails].
  • IR-A43 could bind to the insulin receptor in the absence of insulin, but IR-A43 alone did not affect autophosphorylation of the insulin receptor expressed in Rat-1/hIR cells ( FIG. 3A ).
  • co-stimulation of the insulin receptor with insulin and IR-A43 amplified autophosphorylation.
  • phosphorylation of tyrosine residues was improved to a similar degree by IR-A43 without bias, and the phosphorylation level was different according to the concentration of IR-A43 (Fig. 3B).
  • Phosphorylation of downstream signaling proteins, like receptor autophosphorylation was amplified when insulin and IR-A43 were bound to the insulin receptor (Fig. 3C).
  • IR-A43 is a positive allosteric modulator (PAM) that amplifies the activity of insulin by stabilizing the binding of insulin to the receptor.
  • PAM positive allosteric modulator
  • glucose uptake was measured in fully differentiated 3T3-L1 cells, mouse-derived adipocytes.
  • Glucose uptake is a major function of IR in peripheral tissues. Insulin signaling, which increases the uptake of glucose from blood into cells, enables transport of glucose transporter type 4 (GLUT4) to the plasma membrane of skeletal muscle and adipocytes.
  • GLUT4 glucose transporter type 4
  • 3T3-L1 preadipocytes were cultured in DMEM medium with 10% bovine serum (BS).
  • BS bovine serum
  • cells were cultured in 10% BS condition on the first 2 days for growth, the culture medium was removed on the next 2 days and 10 containing 500 nM 3-isobutyl-1-methylxanthine (IMBX), 850 nM insulin and 1 uM dexamethasone.
  • IMBX 3-isobutyl-1-methylxanthine
  • 850 nM insulin 850 nM insulin
  • 1 uM dexamethasone 1 uM dexamethasone.
  • % FBS After 2 days the culture medium was removed and replaced with 10% FBS containing 850 nM insulin. After 2 days, the culture medium was removed and replaced with 10% FBS.
  • adipocytes were cultured without FBS for 3 hours, and adipocytes were cultured without glucose for 1 hour using Krebs-Ringer HEPES buffer, and then treated with aptamer and insulin for 15 minutes. Then, the cells were incubated with 2-deoxy-14C-glucose (14C-2-deoxy glucose) (0.1 uCi/ml) for 10 minutes and then with 25 mM D-glucose containing PBS. Washed 3 times. Cells were lysed with 1% SDS containing 0.5N NaOH, and glucose uptake was measured with a liquid scintillation counter.
  • 2-deoxy-14C-glucose 14C-2-deoxy glucose
  • the 3T3-L1 adipocytes used in the glucose uptake assay in this example are mouse-derived, whereas the Rat-1/hIR cells used in the Western blotting study are human-derived and express insulin receptors.
  • the amino acid sequences of human IR (hIR) and mouse IR (mIR) show high homology ( ⁇ 95.9%) but are not identical.
  • -A43 was specifically constructed for hIR. To confirm the species specificity of IR-A43, we transiently overexpressed hIR or mIR and observed receptor autophosphorylation in Chinese hamster ovary-K1 (CHO-K1) cells.
  • CHO-K1 cells were cultured in Ham's F-12K (F-12 nutrient mixture Ham Kaighn's modification medium) medium containing 10% FBS.
  • hIR or mIR were transfected and overexpressed into CHO-K1 cells using Lipofectamine 3000 transfection reagent (ThermoFisher, # L3000008) according to the manufacturer's instructions.
  • IR-A43 did not enhance insulin-induced autophosphorylation of mIR (Fig. 4B).
  • Example 5 Identification of hotspots for sensitization in human IR
  • IR-A43 the species specificity of IR-A43 is useful for identifying the binding site of IR-A43 and understanding the mechanism of its insulin potentiating activity.
  • domain (approximately 200-600 amino acids) substitutions were performed using Gibson Assembly Master Mix (NEB, # E2611L) according to the manufacturer's instructions.
  • Each construct was transfected into CHO-K1 cells using Lipofectamine 3000 transfection reagent (ThermoFisher, # L3000008) according to the manufacturer's instructions.
  • IR-A43 enhanced insulin-induced autophosphorylation of each hybrid hIR receptor except for the hybrid hIR containing Part 2 of the mIR ( FIG. 5B ).
  • a hybrid mIR including Part 2 of hIR was prepared and the activity of IR-A43 was evaluated.
  • IR-A43 is a hybrid It was confirmed that mIR improves the activity of insulin (FIG. 5C).
  • residue Q272 located in the cysteine rich (CR) domain of hIR is directly involved in the binding of IR-A43 to hIR, and that the region including Q272 is a hotspot for improving insulin activity by stabilizing insulin binding. .
  • Example 5 Structural change in the region containing the Q272 residue
  • IR-A43 when IR-A43 binds to residue Q272, it can serve as a 'wedge' stabilizing insulin binding by fixing the position of the L2 domain in the active form (Fig. 6H). This may explain the mutual positive cooperation that occurs when insulin and IR-A43 bind to the insulin receptor.
  • the IR-A43 aptamer of the present invention exhibits sensitizing properties and thus does not exhibit activity in the absence of insulin, and effectively improves insulin sensitivity and enhances IR signal in the presence of insulin.
  • the Q272 residue in the CR domain of IR is important for the regulation of IR, and it was confirmed that the Q272 residue can play an important role in the hotspot for IR sensitization, IR-A43 is positive for the regulation of IR. It can be used as an allosteric modulator and can increase IR sensitivity by targeting the Q272 residue.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Electrochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

본 발명은 인슐린과 함께 존재시 인슐린 수용체(insulin receptor, IR)의 민감성을 효과적으로 향상시키고 IR 신호를 강화하는 IR 특이적 압타머에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 IR의 조절(modulation)에 중요한 역할을 하는 IR의 시스테인 풍부(cysteine rich, CR) 도메인 내 Q272 잔기를 타겟으로 한, IR에 대한 양성 알로스테릭 모듈레이터(Positive allosteric modulators, PAM)의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

Description

인슐린 수용체 특이적 압타머 및 이의 용도
본 발명은 인슐린과 함께 존재시 인슐린 수용체(insulin receptor, IR)의 민감성을 효과적으로 향상시키고 IR 신호를 강화하는 IR 특이적 압타머에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 IR의 조절(modulation)에 중요한 역할을 하는 IR의 시스테인 풍부(cysteine rich, CR) 도메인 내 Q272 잔기를 타겟으로 한, IR에 대한 양성 알로스테릭 모듈레이터(Positive allosteric modulators, PAM)의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
수용체 티로신 키나아제(Receptor tyrosine kinases, RTK)는 잘 알려진 세포막 단백질로써 세포 성장, 증식, 분화 및 대사의 주요 조절자 역할을 한다. 상기 RTK의 일종인 인슐린 수용체(insulin receptor, IR)는 세포에서 MAPK(mitogen-activated protein kinase) 관련 세포 증식과 PI3K(phosphatidylinositol 3 kinase) 관련 포도당 대사를 촉진한다. 지방 조직과 근육에서 IR 매개 포도당 흡수는 정상적인 혈당 수준을 유지하는 데 필수적이다. 이러한 이유로 IR은 당뇨병(Diabetes, Diabetes mellitus, DM) 치료의 표적으로 널리 사용되어왔다.
당뇨병은 대사성 질환의 일종이며 고혈당 수치와 관련이 있다. 약 90 %의 당뇨병 환자는 제 2 형 당뇨병(type 2 diabetes, T2D)에 속한다. 대부분 T2D는 인슐린 저항성에 의해 발생한다. 인슐린 저항성은 인슐린의 효과를 현저히 감소시켜 혈당 수치를 조절하기 어렵게 만든다. 당뇨병의 초기 단계 (또는 전당뇨)에서 인슐린 저항성의 영향은 췌장 β 세포에서 분비되는 더 많은 인슐린으로 극복할 수 있다. 그러나 시간이 지남에 따라 β 세포 기능 장애로 인해 높은 혈당 수치가 유지되어, 궁극적으로 당뇨병 상태에서는 혈당 수치를 낮추기 위해 외인성 인슐린이 필요하게 된다.
인슐린 및 인슐린 유사체는 혈당 수치를 낮추기 위해 가장 일반적으로 사용되는 항당뇨 약물이다. 인슐린의 양 외에도, 인슐린 감수성은 정상적인 혈당 수준을 유지하는 데 중요하다. 인슐린 감수성은 세포가 인슐린 효과에 얼마나 민감한지를 나타내며, 이를 개선하는 것은 인슐린 효과를 극대화하는 방법 중 하나이다. 이에, 양성 알로스테릭 모듈레이터(Positive allosteric modulators, PAM)를 사용하여 인슐린 감수성을 향상시키는 방법이 연구되고 있다.
알로스테릭 모듈레이터(Allosteric modulator)는 오르토스테릭(orthosteric) 리간드의 특정 부분 수용체와 결합하고, 수용체 구조 변화에 따른 활성화를 조절한다. 이는 오르토스테릭 리간드의 활성화 효과와 수용체 활성화 역량에 따라 분류할 수 있다(De Smet, F., Christopoulos, A. and Carmeliet, P. (2014) Allosteric targeting of receptor tyrosine kinases. Nature biotechnology, 32, 1113-1120.). 양성 알로스테릭 모듈레이터PAMs)는 오르토스테릭 리간드의 친화도와 효능을 증가시킨다. 반대로, 음성 알로스테릭 모듈레이터(negative allosteric modulator, NAM)는 오르토스테릭 리간드의 친화도와 효능을 약화시킨다. 일부 PAMs와 NAMs는 오르토스테릭 리간드의 존재 여부와 관계없이 그들의 표적 수용체에서 고유 작용 또는 길항 작용을 나타낸다. 알로스테릭 모듈레이터는 오르토스테릭 자리에 결합하는 리간드와 비교하여 약제로써 수용체 아형에 대한 높은 특이성 및 약물 과다 복용의 위험 감소와 같은 여러 잠재적인 이점이 있다. 따라서, 알로스테릭 모듈레이터 연구는 수용체 활성 메카니즘의 발견뿐만 아니라, 새로운 약 후보의 발견에 있어서도 중요하다.
한편, 압타머는 항체와 유사하게 표적 단백질에 대해 높은 친화성과 특이성을 가지고 있다. 그러나, 주로 단백질의 서열을 에피토프(epitope)로 인식하는 항체와 달리 압타머는 표적 단백질의 표면 구조 토폴로지(topology)와 상호 작용한다. 따라서, 압타머의 특이성은 표적 단백질 구조의 작은 차이에도 매우 민감한 경향이 있다. 이러한 특성으로 인해 압타머는 수용체의 리간드 유도 형태 변화를 인식하는 데 필요한 알로스테릭 모듈레이터 개발에 이상적으로 적합하다. 그러나 지금까지 작용제 역할을하고 수용체의 기능을 활성화하는 압타머는 극소수에 불과하다.
본 발명자들은 인슐린 수용체(insulin receptor, IR)에 특이적으로 결합하는 양성 알로스테릭 모듈레이터(Positive allosteric modulators, PAM) 압타머인 IR-A43를 제작하였다. 상기 IR-A43는 감작 특성을 나타내어 인슐린이 없을 때 활성을 나타내지 않으면서, 인슐린과 함께 존재시 인슐린 민감성을 효과적으로 향상시키고 IR 신호를 강화하였다. 또한, 본 발명자들은 IR의 시스테인 풍부(cysteine rich, CR) 도메인에서 Q272 잔기가 IR의 조절(modulation)에 중요함을 확인하였으며, Q272 잔기가 IR 민감화를 위한 핫스팟에서 중요한 역할을 할 수 있음을 확인하였다. 이에 따라, IR-A43은 IR의 조절을 위한 PAM으로 사용할 수 있다.
본 발명의 하나의 목적은 인슐린 수용체(insulin receptor, IR) 특이적 압타머를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 인슐린 수용체에 대한 양성 알로스테릭 모듈레이터(Positive allosteric modulators, PAM)의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 인슐린 수용체의 시스테인 풍부 도메인으로써, 본 발명의 압타머가 결합하는 것으로 특정되는 것인, 인슐린 수용체의 시스테인 풍부 도메인을 제공하는 것이다.
본 발명의 인슐린 수용체(insulin receptor, IR)-A43 압타머는 감작 특성을 나타내어 인슐린이 없을 때에는 활성을 나타내지 않으면서, 인슐린과 함께 존재시 인슐린 민감성을 효과적으로 향상시키고 IR 신호를 강화함을 확인하였다. 또한, IR의 시스테인 풍부(cysteine rich, CR) 도메인에서 Q272 잔기가 IR의 조절에 중요함을 확인하였으며, Q272 잔기가 IR 민감화를 위한 핫스팟에서 중요한 역할을 할 수 있음을 확인하였는 바, IR-A43은 IR의 조절을 위한 양성 알로스테릭 모듈레이터(Positive allosteric modulators, PAM)로 사용할 수 있으며, Q272 잔기를 타겟으로 IR 민감성을 증가시킬 수 있다.
도 1 (A) 인슐린 수용체(insulin receptor, IR)에 대한 IR-A43F(전체 서열, 80mer)와 IR-A43(절단 서열, 31mer)의 친화도 비교 결과. 'N'은 Nap-dU(5-(N-1-naphthylmethylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine)를 나타낸다. (B) IR에 대한 IR-A43F의 친화도와 IGF1-R(insulin-like growth factor 1 receptor) 수용체는 인슐린 100nM 부재, 존재 조건에서 각각 필터 결합 에세이를 통하여 측정하였다. 해리정수(Kd)는 한 부분이 포화된 모델을 기준으로 결정하였다.
도 2 (A) 인간 IR이 과발현된 Rat-1 세포(Rat-1/hIR)를 FITC(fluorescein isothiocyanate) 표지 인슐린(FITC-인슐린) (무처리(NT), 0.8nM, 4nM, 20nM, 100nM 및 500nM)에서 배양한 후 유세포 분석을 통해 IR과 인슐린, 또는 IR과 인슐린 및 IR-A43간의 결합 친화도를 확인한 결과. (B) Rat-1/hIR 세포를 무처리(NT), IR-A43 500nM, FITC-인슐린 20nM, FITC-인슐린 20nM 및 IR-A43 500nM, FITC-인슐린 100nM, FITC-인슐린 100nM 및 IR-A43 500nM으로 4℃에서 1시간 동안 자극한 결과. (C) FITC-IR-A43 100 nM에서 배양된 세포를 인슐린 2nM, 10nM, 50nM으로 4℃에서 1시간 동안 자극한 결과. (D) FITC-인슐린 100nM에서 배양된 세포를 IR-A43 2nM, 10nM, 50nM에서 4℃에서 1시간 동안 자극한 결과.
도 3 Rat1/hIR 세포를 인슐린 10nM 및 IR-A43 500nM으로 10 분 동안 공동 자극하고, (A) 인슐린 수용체의 티로신 잔기의 부위 특이적 인산화, (B) pIRS, pAKT, pSHC 및 pERK와 같은 하류 인슐린 신호에 관여하는 분자의 인산화를 확인한 결과. (C) Rat1/hIR 세포를 5nM 인슐린 및 10분 동안 증가하는 IR-A43 농도로 공동 자극하여, hIR(Y1150/1151)의 인산화를 확인한 결과. (D), (E) IR-A43의 인슐린 강화 활성을 정량적으로 평가하기 위해 Rat1/hIR 세포를 저농도의 인슐린(2nM), 고농도의 인슐린(50nM) 또는 낮은 농도의 인슐린(2nM)과 IR-A43(250nM)으로 자극한 결과. 막대 그래프는 평균 ± SE (SEM)로 표시되었다(n = 2 회의 독립적인 실험).
도 4 (A) 완전히 분화된 3T3-L1 지방 세포를 500nM IR-A43, 20nM 인슐린 또는 20nM 인슐린과 500nM IR-A43으로 30 분 동안 자극한 후 포도당 흡수량을 측정한 결과. 데이터는 평균 ± SE (SEM)로 표시되었다. P-값은 일원 분산 분석에 이어 Tukey의 다중 비교 테스트에 의해 결정되었다(* p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001 및 ns, 유의미하지 않음). (B) 인간 또는 마우스 인슐린 수용체를 리포펙타민(Lipofectamin) 3000 시약을 사용하여 차이니즈 햄스터 난소-K1(Chinese hamster ovary - K1, CHO-K1) 세포로 형질 감염시키고, 72 시간 후 세포를 IR-A43 5nM, 인슐린 250nM 또는 인슐린 5nM과 IR-A43 250nM으로 자극한 결과.
도 5 (A) 마우스 IR(mIR)의 일부를 포함하는 하이브리드 인간 IR(hIR)을 만드는 데 사용되는 hIR과 mIR 간 도메인 치환을 나타낸 개략도. (B) mIR의 part 1, part 2, part 3, part 4, part 5, part 6 또는 part 7을 포함하는 하이브리드 hIR의 인산화. (C) hIR의 part 2를 포함하는 하이브리드 mIR의 인산화. (D) 잔기 R271이 K271로 치환되고 잔기 Q272가 P272로 치환된 hIR 돌연변이체(R271K/Q272P)의 인산화. (E) (위) H264 잔기가 F264로 치환되고 K267 잔기가 R267로 치환된 hIR 돌연변이체(H264F/K267R)의 인산화. (아래) hIR의 L300 잔기가 M300으로 치환된 hIR 돌연변이체(L300M)의 인산화. 세포는 인슐린 5nM 또는 인슐린 5nM 및 IR-A43 250nM으로 10 분 동안 자극하였다. (F) R271이 K271(R271K)로 치환되거나 잔기 Q272가 P272(Q272P)로 치환된 hIR 돌연변이체의 인산화. (G) P272가 Q272로 치환된 mIR 돌연변이체(P272Q)의 인산화. (H) (G)에 제시된 데이터의 인슐린 수용체 인산화의 상대적 배 변화. 데이터는 평균 ± SE (SEM)로 표시되었다(n = 2 회의 독립적인 실험). P- 값은 일원 분산 분석에 이어 Tukey의 다중 비교 테스트에 의해 결정되었다(* p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001 및 ns, 유의미하지 않음). 세포는 인슐린 5nM 또는 인슐린 5nM 및 IR-A43 250nM으로 10 분 동안 자극하였다.
도 6 PDB(Protein Data Bank) 데이터베이스의 인슐린 수용체 구조를 기반으로 한 IR-A43의 인슐린 강화 활성에 대한 구조적 분석 결과. (A) 인슐린 수용체의 엑토(ecto) 도메인의 비활성 형태(PDB ID : 4ZXB)와 활성 형태(PDB ID : 6HN4, 6HN5) 간의 비교. (B) 비활성 형태(PDB ID : 4ZXB) 및 (C) 활성 형태(PDB ID : 6HN5)의 L1-CR-L2 도메인에서 잔기 Q272의 위치. (D) 비활성 형태 및 활성 형태의 L1-CR-L2 도메인의 구조적 중첩. (E) 비활성 입체 형태와 (F) 인슐린 수용체의 활성 입체 형태 사이의 잔기 Q272에 가까운 영역의 입체 형태 변화에 대한 상세도. (G) 인슐린 수용체에서 인슐린과 IR-A43의 상호 양성 협력에 대한 구조 모델.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
본 발명의 하나의 양태는 인슐린 수용체(insulin receptor, IR) 특이적 압타머를 제공한다.
본 발명에서 용어, "인슐린 수용체(insulin receptor, IR)”는 세포에서 MAPK(mitogen-activated protein kinase) 관련 세포 증식과 PI3K(phosphatidylinositol 3 kinase) 관련 포도당 대사를 촉진한다. 지방 조직과 근육에서 인슐린 수용체 매개 포도당 흡수는 정상적인 혈당 수준을 유지하는 데 필수적이다. 이러한 이유로 인슐린 수용체는 당뇨병(Diabetes, Diabetes mellitus, DM) 치료의 표적으로 널리 사용되어왔다. 본 발명에 있어서, 상기 인슐린 수용체는 포유류, 구체적으로는 마우스 또는 인간에서 유래하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "압타머"는 "Chemical Antibody"로서 특정 화합물부터 단백질까지 다양한 종류의 표적 리간드에 높은 특이도와 친화도로 결합할 수 있는 특성을 가지는 짧은 길이 (20~80개 염기)의 단일 가닥 핵산 분자를 의미한다. 압타머는 SELEX (Systematic evolution of ligands by exponential enrichment)를 통해 생체 외 (In Vitro)에서 제조할 수 있다.
압타머는 표적 단백질에 대해 나노몰 (nM) 내지 펨토몰 (fM)수준의 높은 결합력과 선택성을 지니고 있다는 점에서 항체와 유사한 특성을 가지는 올리고 핵산 분자로 여겨진다. 한편, 항체와 비교할 때 압타머는 다음과 같은 여러 가지 장점을 가지고 있다: (1) 화학 합성법으로 제조되는 압타머는 항체와 같은 단백질 기반의 물질보다 목적하는 화학적 변이가 용이하며, (2) SELEX 과정을 통해 선택성과 친화도를 극대화할 수 있으며, (3) 화학적 합성으로 만들어지므로 순도가 높고, (4) 기기 분석을 통해 만들어진 물질을 동정할 수 있으며, (5) 열에 안정하여 실온에서 장기간 보존이 가능하다.
본 발명에서 용어, "SELEX (Systematic evolution of ligands by exponential enrichment)"는 표적 물질과 결합하는 압타머를 선별하는 방법이다. 일반적으로 공지된 방법의 경우, 표적 단백질을 무작위적인 염기서열을 가진 올리고 뉴클레오티드 라이브러리 (DNA 또는 RNA)와 함께 일정 온도에서 반응시킨 후에, 표적과 결합하지 않은 DNA/RNA 라이브러리는 제거한다. 표적과 결합한 뉴클레오티드를 분리한 후 유전자 증폭 방법을 통해 증폭시켜 위 과정을 여러 차례 반복하여 표적에 높은 결합력을 가지는 압타머를 선별해낸다.
본 발명의 경우, 상기와 같은 일반적인 SELEX 방법을 변형하여 압타머를 제조하였으며, 그에 관한 구체적인 방법에 대해서는 하기에 기재되어 있다.
압타머 선별 과정에는 일반적으로 1014 내지 1015개 정도의 서로 다른 서열, 즉 다양성을 가지는 라이브러리로부터 단일 가닥 핵산 풀 (pool)을 확보하는 과정이 필요하다. 이를 위한 방법으로 여러 가지 방법이 이용되고 있으나 일반적으로 비대칭 PCR을 사용하여 한쪽 가닥만을 증폭시키는 방법, 이중 가닥 핵산의 한 가닥 끝 부분에 비오틴 (biotin)을 붙인 후 스트렙타비딘 (streptavidin)으로 감싼 비드 (bead)를 이용하여 한 가닥만을 선택적으로 분리하는 방법이 가장 많이 이용되고 있다.
이후, 확보한 라이브러리를 표적 분자에 결합시켜 결합력이 높은 압타머를 골라내는 선택 과정을 진행한다. 표적 분자가 단백질인 경우에는 보통 단백질에 표지된 비오틴을 스트렙타비딘 비드를 이용해 풀 다운 (Pull down)한다. 표적 단백질과 변형 핵산 라이브러리의 결합을 유도한 후 버퍼로 씻어내어 표적 단백질에 결합하지 않은 변형 핵산 라이브러리들을 제거한다.
플레이트 (Plate)의 경우에도 마찬가지로 핵산 라이브러리와 표적 단백질의 결합을 유도한 후 버퍼로 씻어내어 표적 단백질에 결합하지 않는 핵산들을 제거한다. 이러한 방법들을 사용하여 리간드에 대해 친화도를 가지는 압타머들을 얻을 수 있다. 보통 5-15 회의 선별-증폭 과정을 반복하면 높은 친화도를 가지는 압타머를 얻을 수 있다. 선별 과정이 종료되면 증폭한 핵산을 클로닝한 후 개개의 클론으로부터 서열 분석을 통해 그 서열을 확인하고, 압타머를 합성하여 표적 분자와의 친화도 및 결합력을 측정한다.
본 발명에서 용어, "표적 분자"는 본 발명의 압타머로 검출할 수 있는 물질을 의미한다. 구체적으로, 상기 표적 분자는 분리된 시료 내에 존재하는 것으로 포획 압타머가 결합할 수 있는 단백질, 펩티드, 탄수화물, 다당류, 당단백질, 호르몬, 수용체, 항원, 항체, 바이러스, 보조인자 (cofactor), 약물, 염료, 성장인자 및 규제 물질 (controlled substance)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 목적상, 상기 표적 분자는 인슐린 수용체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 압타머는 이의 폴리뉴클레오티드 서열을 이루는 하나 이상의 뉴클레오티드에 하기 중 선택되는 어느 하나 이상의 변형(modification)을 포함할 수 있다.
구체적으로, 상기 압타머는 하기의 일반식 1의 염기서열을 포함할 수 있다.
[일반식 1]
GCCYGYAYCCGCAGYAYCGGCAYYCAGCGAC (서열번호 1);
여기서 상기 일반식 1의 Y는 독립적으로 피리미딘계 염기이고, 구체적으로 C 또는 T일 수 있고,
상기 Y 내 5' 탄소는 나프틸기 및 2-나프틸기로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상으로 치환된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 일반식 1의 Y는 나프틸기로 치환된 것일 수 있고, 구체적으로 Nap-dU(5-(N-1-naphthylmethylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine)로 치환된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 일반식 1의 염기서열은 이와 상동성이 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상 또는 90% 이상인 염기서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 압타머는 서열번호 22의 염기서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 압타머는 하기의 일반식 2의 염기서열을 포함할 수 있다.
GACYGYAYCCGCGGYAYCGGCAYYCAGCCAC (서열번호 2);
여기서 상기 일반식 2의 Y는 독립적으로 피리미딘계 염기이고, 구체적으로 C 또는 T일 수 있고,
상기 Y 내 5' 탄소는 나프틸기 및 2-나프틸기로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상으로 치환된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 일반식 2의 Y는 나프틸기로 치환된 것일 수 있고, 구체적으로 Nap-dU(5-(N-1-naphthylmethylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine)로 치환된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 일반식 2의 염기서열은 이와 상동성이 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상 또는 90% 이상인 염기서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 압타머는 하기의 일반식 3의 염기서열을 포함할 수 있다.
[일반식 3]
GACWGWAWCCGCGGYAWCGGCAYYCAGCCAC (서열번호 20);
여기서 상기 일반식 3의 Y 및 W는 독립적으로 피리미딘계 염기이고, 구체적으로 C 또는 T일 수 있고,
상기 Y 및 W 내 5' 탄소는 나프틸기 및 2-나프틸기로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상으로 치환되고,
상기 일반식 3 내 어느 하나 이상의 A, C, T 및 G는 메톡시기 및 불소로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 작용기가 도입된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 일반식 3의 Y는 나프틸기로 치환된 것일 수 있고, 구체적으로 Nap-dU(5-(N-1-naphthylmethylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine)로 치환된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 일반식 3의 W는 2-나프틸기로 치환된 것일 수 있고, 구체적으로 2-Nap-dU(5-(N-2-naphthylmethylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine)로 치환된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 Nap-dU 및 2-Nap-dU의 화학식은 하기 화학식 1과 같다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2021003795-appb-I000001
상기 일반식 3의 A, C, T 및 G는 메톡시기 또는 불소가 도입된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 일반식 3의 염기서열은 이와 상동성이 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상 또는 90% 이상인 염기서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 압타머는 서열번호 3 내지 서열번호 10으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 염기서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 압타머는 하기의 일반식 4의 염기서열을 포함할 수 있다.
[일반식 4]
GACWGWAWCCGCGGYAWCGGCAYYCAGCCAC (서열번호 21);
여기서 상기 일반식 4의 Y 및 W는 독립적으로 피리미딘계 염기이고, 구체적으로 C 또는 T일 수 있고,
상기 Y 및 W 내 5' 탄소는 나프틸기 및 2-나프틸기로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상으로 치환되고,
상기 일반식 4 내 어느 하나 이상의 A, C, T 및 G는 메톡시기 및 불소로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 작용기가 도입된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 일반식 4의 Y는 나프틸기로 치환된 것일 수 있고, 구체적으로 Nap-dU(5-(N-1-naphthylmethylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine)로 치환된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 일반식 4의 W는 2-나프틸기로 치환된 것일 수 있고, 구체적으로 2-Nap-dU(5-(N-2-naphthylmethylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine)로 치환된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 일반식 4의 A, C, T 및 G는 메톡시기 또는 불소가 도입된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 일반식 4의 염기서열은 이와 상동성이 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상 또는 90% 이상인 염기서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 압타머는 서열번호 11 내지 서열번호 19로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 염기서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 압타머는 이의 5' 말단 및 3' 말단 중 선택되는 어느 하나 이상에 1 내지 30 개의 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
상기 압타머는 이의 5' 말단 및 3' 말단 중 선택되는 어느 하나 이상에 전술한 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하여, 30 내지 150 개의 뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있다.
상기와 같이 압타머를 이루는 어느 하나 이상의 염기가 치환되거나 작용기가 도입되어 변형됨으로써, 변형되지 않은 경우와 비교하여 인슐린 수용체와의 친화력(affinity)이 현저하게 높아질 수 있다.
본 발명에서 용어, '상동성 (homology)' 또는 '동일성 (identity)'은 두 개의 주어진 아미노산 서열 또는 염기서열과 관련된 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 용어 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.
보존된 (conserved) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나 (homologous) 또는 동일한 (identical) 서열은 일반적으로 서열 전체 또는 전체-길이의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%를 따라 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 하이브리드할 수 있다. 하이브리드화는 폴리뉴클레오티드에서 코돈 대신 축퇴 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오티드 또한 고려된다.
임의의 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는 예를 들어, Pearson et al (1988)[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444에서와 같은 디폴트 파라미터를 이용하여 "FASTA" 프로그램과 같은 공지의 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또는, EMBOSS 패키지의 니들만 프로그램 (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)(버전 5.0.0 또는 이후 버전)에서 수행되는 바와 같은, 니들만-운치 (Needleman-Wunsch) 알고리즘 (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)이 사용되어 결정될 수 있다 (GCG 프로그램 패키지 (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994, 및 [CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073을 포함한다). 예를 들어, 국립 생물공학 정보 데이터베이스 센터의 BLAST, 또는 ClustalW를 이용하여 상동성, 유사성 또는 동일성을 결정할 수 있다.
폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 상동성, 유사성 또는 동일성은 예를 들어, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482에 공지된 대로, 예를 들면, Needleman et al. (1970), J Mol Biol. 48:443과 같은 GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정될 수 있다. 요약하면, GAP 프로그램은 두 서열 중 더 짧은 것에서의 기호의 전체 수로, 유사한 배열된 기호 (즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산)의 수를 나눈 값으로 정의한다. GAP 프로그램을 위한 디폴트 파라미터는 (1) 이진법 비교 매트릭스 (동일성을 위해 1 그리고 비-동일성을 위해 0의 값을 함유함) 및 Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)에 의해 개시된 대로, Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745의 가중된 비교 매트릭스 (또는 EDNAFULL(NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스); (2) 각 갭을 위한 3.0의 페널티 및 각 갭에서 각 기호를 위한 추가의 0.10 페널티 (또는 갭 개방 패널티 10, 갭 연장 패널티 0.5); 및 (3) 말단 갭을 위한 무 페널티를 포함할 수 있다.
또한, 임의의 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는 정의된 엄격한 조건하에서 써던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내이고, 당업자에게 잘 알려진 방법 (예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York)으로 결정될 수 있다.
본 발명의 압타머는 인슐린 수용체의 시스테인 풍부(cysteine rich, CR) 도메인에 결합하는 것일 수 있다.
상기 시스테인 풍부 도메인은 인슐린 수용체를 이루는 서열번호 25의 아미노산 서열에서 234 내지 281번째 위치에 상응하는 아미노산 잔기(서열번호 24)일 수 있다.
구체적으로, 상기 압타머의 시스테인 풍부 도메인 내 결합 위치는 인슐린 수용체를 이루는 서열번호 25의 아미노산 서열에서 272번째 위치에 상응하는 아미노산 잔기일 수 있다.
본 발명에서 용어, “상응하는 위치(corresponding position)"는, 단백질 또는 폴리펩티드에서 열거되는 위치의 아미노산 잔기이거나, 또는 단백질 또는 폴리펩티드에서 열거되는 잔기와 유사하거나 동일하거나 상동한 아미노산 잔기를 지칭한다. 본 발명에 사용된 "상응 영역"은 일반적으로 관련 단백질 또는 레퍼런스 단백질에서의 유사하거나 대응되는 위치를 지칭한다.
본 발명에 사용되는 단백질 내의 아미노산 잔기 위치에 특정 넘버링이 사용될 수 있다. 예를 들면, 비교하고자 하는 대상 단백질과 본 발명의 단백질의 폴리펩티드 서열을 정렬함으로써, 본 발명의 단백질의 아미노산 잔기 위치에 상응하는 위치에 대해 재넘버링 하는 것이 가능하다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 인슐린 수용체에 대한 양성 알로스테릭 모듈레이터(Positive allosteric modulators, PAM)의 스크리닝 방법을 제공한다.
여기에서 사용되는 용어는 전술한 바와 같다.
본 발명에서 용어, “양성 알로스테릭 모듈레이터(Positive allosteric modulators, PAM)”는 오르토스테릭(orthosteric) 리간드의 특정 부분 수용체와 결합하고, 수용체 구조 변화에 따른 활성화를 조절하는 알로스테릭 모듈레이터(Allosteric modulator)의 일종으로, 오르토스테릭 리간드의 친화도와 효능을 증가시키는 알로스테릭 모듈레이터를 의미한다. 상기 양성 알로스테릭 모듈레이터는 알로스테릭 인핸서(Allosteric enhancer)와 혼용될 수 있다.
일부 알로스테릭 모듈레이터는 오르토스테릭 리간드의 존재 여부와 관계없이 그들의 표적 수용체에서 고유 작용 또는 길항 작용을 나타낸다. 알로스테릭 모듈레이터는 오르토스테릭 자리에 결합하는 리간드와 비교하여 약제로써 수용체 아형에 대한 높은 특이성 및 약물 과다 복용의 위험 감소와 같은 여러 잠재적인 이점이 있다.
구체적으로, 상기 방법은
a) 인슐린 수용체와 시험물질을 접촉시키는 단계; b) 상기 시험물질이 인슐린 수용체에 결합하는 위치를 확인하는 단계; 및 c) 상기 시험물질과 접촉한 상기 인슐린 수용체 및 상기 시험물질과 접촉하지 않은 대조군에서 상기 인슐린 수용체의 민감성 또는 하류 신호 전달 수준을 확인하는 단계;를 포함할 수 있다.
또한, 상기 방법은 상기 시험물질이 인슐린 수용체의 시스테인 풍부 도메인에 결합하고, 상기 시험물질과 접촉한 상기 인슐린 수용체가 상기 대조군에 비해 인슐린 수용체의 민감성이 증가되거나 하류 신호 전달이 강화된 경우, 상기 시험물질을 인슐린 수용체에 대한 양성 알로스테릭 모듈레이터 후보물질로 선별하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 시험물질은 압타머, 단백질, 펩타이드 및 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 인슐린 수용체의 시스테인 풍부 도메인으로써, 상기 도메인은 본 발명의 압타머가 결합하는 것으로 특정되는 것인, 인슐린 수용체의 시스테인 풍부 도메인을 제공한다.
여기에서 사용되는 용어는 전술한 바와 같다.
상기 시스테인 풍부 도메인은 인슐린 수용체를 이루는 서열번호 25의 아미노산 서열에서 234 내지 281번째 위치에 상응하는 아미노산 잔기(서열번호 24)일 수 있다.
구체적으로, 상기 본 발명의 압타머가 결합하는 시스테인 풍부 도메인 내 위치는 인슐린 수용체를 이루는 서열번호 25의 아미노산 서열에서 272번째 위치에 상응하는 아미노산 잔기일 수 있다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 인슐린 수용체(insulin receptor, IR)에 대한 감작 압타머 식별
IR에 대한 민감성 압타머를 확보하기 위해 재조합 인간 IR 세포외도메인(H28-K944)을 사용하여 SELEX(Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment)를 수행하였다.
SELEX 및 압타머 합성은 Aptamer Science Inc. (한국 포항)에서 수행하였다. 구체적으로, DNA 랜덤 라이브러리는 각 5'- 및 3'- 말단의 프라이머 결합 부위를 위한 20mer와 무작위 가변 영역을 위한 40mer로 구성되었다. SELEX에서 선택된 서열은 다음과 같다: 5'-TATGAGTGACCGTCCGCCTG-N40-CAGCCACACCACCAGCCAAA-3' (80mer, N40은 랜덤 가변 영역).
압타머의 결합 특이성을 개선하기 위해 티민(dT)을 Nap-dU(5-[N-(1-naphthylmethyl) carboxamide]-2'-deoxyuridine)로 대체하였다. DNA 라이브러리는 His tag이 붙은 재조합 인간 IR 세포외도메인과 함께 배양하였다. 배양 후, IR 단백질을 Dynabeads TALON(Invitrogen)으로 정제하였다. 선별된 DNA를 추출하고 PCR로 증폭시켜, IR 민감성 압타머 IR-A43(서열번호 23)을 수득하였다(도 1A).
다음으로, IR-A43의 시퀀스 최적화를 수행하였으며, 5'- 및 3'- 말단의 서열을 하나씩 잘라내어 전체 길이의 원래 압타머와 비교하여 동일한 활성을 나타내는 절단된 압타머를 선별하였다. 선별된 압타머는 변형되어 가변 영역이 41mer임을 확인하였다(도 1A).
그 결과, 서열 최적화된 IR-A43은 변형된 31mer DNA로 구성되며 인슐린이 없을 때 IR에 대해 약 70nM에서 결합 친화성을 나타내었다(도 1B). 그러나 인슐린이 존재하면 IR-A43은 IR에 대한 결합 친화도가 극적으로 증가하여, IR에 대해 약 2.85nM에서 결합 친화성을 나타내었다.
IR은 IGF1-R(insulin-like growth factor 1 receptor)와 높은 수준의 서열 상동성을 가지며 하류 신호 경로를 공유하는 바, IR-A43이 IGF1-R이 아닌 IR에 특이적으로 결합하는지 확인하기 위해 IR, IGF1-R 및 IR-A43을 사용하여 결합력을 분석하였다.
그 결과, IR-A43은 IGF1-R에 결합하지 않고, IR에 특이적으로 결합함을 확인하였다(도 1B).
실시예 2: 인슐린과 IR-A43의 IR에 대한 협력적 결합
IR-A43이 IR에 대한 인슐린 결합을 증가시키는지 확인하기 위해, 인간 IR이 과발현된 Rat-1 세포(Rat-1/hIR)에서 FITC(fluorescein isothiocyanate) 표지 인슐린(FITC-인슐린)의 결합을 측정하였다.
구체적으로, 인간 IR이 과발현된 Rat-1 세포(Rat-1/hIR)와 HeLa 세포를 10% FBS(fetal bovine serum)가 포함된 DMEM(Dulbecco's modified Eagel's medium) 배지에서 37℃, 5% CO2를 포함하는 가습 조건에서 배양하였다. 배양된 세포를 100mm 접시에 옮겨 80~90% 컨플루언시(confluency)가 되도록 배양하고 세포를 세척 후 1X PBS(phosphate buffered saline)가 포함된 5 mM EDTA로 분리하였다. 세포 분리 후, 세포를 차단 완충액(1% BSA(bovine serum albumin) 및 0.1% NaN3)으로 4℃에서 30 분 동안 배양하였다.
세포를 FITC-인슐린과 함께 4℃에서 1 시간 동안 배양하였다. 세포 배양 후, 세포를 차가운 PBS로 2 회 세척하였다. 4% 파라포름알데히드로 4℃에서 1 시간 동안 샘플을 고정하고 유세포 분석(BD FACS Canto II 및 BD LSR Foretessa 5 Laser)하였다.
그 결과, FITC-인슐린과 IR 결합이 FITC-인슐린 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인하였다(도 2A). 미처리 세포(음성 대조군)에서는 약 1.1%의 피크 이동이 발생한 반면, 인슐린 500nM 처리 세포에서는 약 97.1% 피크 이동이 발생하였다.
이를 통해, FITC-인슐린이 Rat-1/hIR에서 잘 기능하는 것을 확인하였다.
다음으로, IR에 대한 인슐린 결합에서 IR-A43의 효과를 확인하기 위해 인슐린만 처리된 세포와 인슐린 및 IR-A43 공동 처리된 세포의 피크 이동을 비교하였다.
구체적으로, Rat-1/hIR 세포를 90% 컨플루언시가 되도록 배양한 후, FBS 없이 DMEM에서 2 시간 동안 배양하였다. 이후 Krebs-Ringer HEPES 버퍼[120mM NaCl, 1.2mM MgSO4, 1.3mM KH2PO4, 1.3mM CaCl2, 5mM KCl 및 25mM HEPES (pH 7.4)]로 37℃에서 잠시 배양하였다. 세포 실험 전에 압타머를 Krebs-Ringer HEPES 완충액에서 95℃에서 5 분 동안 가열하고 실온에서 30 분 동안 냉각하여 압타머의 독특한 구조를 제작하였다. 압타머 냉각 후 인슐린을 첨가하고 압타머와 공동 처리하였다. 인슐린 및 압타머 처리 후 모든 샘플은 37℃ 배양기에서 배양하였다.
그 결과, 인슐린 20nM 및 100nM 처리된 세포에서 약 1.12% 및 7.91% 피크 이동이 관찰되었다(도 2B). 그러나 IR이 있는 경우 각 인슐린 20nM 및 100nM에서 약 8.5% 및 82.8% 피크 이동이 관찰되었다.
이를 통해, IR-A43은 IR에 대한 인슐린 결합을 효과적으로 증가시킴을 알 수 있다.
다음으로, 인슐린이 IR에 대한 IR-A43 결합에 영향을 미치는지 여부를 테스트하기 위해 FITC 표지 IR-A43(FITC-IR-A43)이 IR에 효과적으로 결합하는지를 확인하였다.
그 결과, 인슐린은 농도-의존 방법에 있어서 FITC-IR-A43의 IR 결합을 더욱 증가시켰다(도 2C). FITC-IR-A43 단독(100nM)의 경우 형광 강도의 최고점이 20.9% 이동하였고, 50mM 인슐린과 공동 처리한 경우 최고점이 74.1% 이동하였다.
이를 통해, IR-A43는 수용체가 인슐린이 없는 비활성된 구조보다는 인슐린에 의하여 활성화된 구조에 있어서 더 선호적으로 결합함을 알 수 있다.
또한, FITC-인슐린을 사용한 Rat-1/hIR 세포에서 IR-A43은 인슐린 결합을 증가시켰다(도 2D). FITC-인슐린 단독(100nM)의 경우 형광 강도의 최고점이 16.7% 이동하였고, 250nM IR-A43을 공동처리한 경우 최고점이 66.6% 이동하였다.
이를 통해, IR-A43과 인슐린이 IR에 결합 시 상호 긍정적 협력함(mutual positive cooperativity)을 알 수 있다.
실시예 3: IR-A43의 인간 IR 및 IR 하류 신호 조절
상기 실시예 2에서 IR-A43이 IR에 대한 인슐린 결합을 증가시키는 것을 확인한 바, 이를 토대로 IR 및 IR 하류 신호 전달 경로에 인슐린 결합이 증가할 것으로 예상하였다. 이에, IR-A43과 IR 신호 사이의 관계를 조사하기 위해 IR 및 IR 하류 신호 전달 경로인 IRS(Insulin Receptor Substrate), AKT(Protein kinase B), SHC(Src Homology 2 Domain Containing Transforming Protein) 및 ERK(Extracellular Signal-regulated Kinase)의 인산화를 확인하였다.
구체적으로, Rat-1/hIR 세포에 압타머와 인슐린을 처리한 후, RIPA 완충액[50mM Tris-HCl (pH 7.4), 150mM NaCl, 0.1% sodium dodecyl sulphate (SDS), 0.5% 나트륨 데옥시콜레이트(sodium deoxycholate), 1% 트리톤(Triton)-X, 10% 글리세롤(glycerol), 1mM EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid), 1mM PMSF(phenylmethylsulfonyl fluoride), 2mM Na3VO4, 10mM β-글리세로인산(glycerophosphate), 20mM NaF 및 프로테아제 억제제 칵테일(protease inhibitor cocktails)]에 용해시켰다. 세포 용해물을 초음파 처리하고 4℃에서 15 분 동안 14,000 rpm에서 원심 분리하였다. 다음으로, 100ul의 상층액을 수확하고 25ul의 5X 샘플 버퍼(50mM Tris-HCl, 0.1% 브로모페놀 블루(bromophenol blue), 12.5% β-머캅토에탄올(mercaptoethanol), 12.5% SDS, 25% 글리세롤)와 혼합하였다. 단백질을 SDS 폴리아크릴 아미드 겔 전기 영동(SDS-PAGE)에서 분리하여 니트로 셀룰로오스 막으로 옮겼다. 각 단백질을 1 차 항체와 함께 4℃에서 밤새 배양하였다. 이후, LI-COR Odyssey 적외선 이미징 시스템 (Odyssey, LI-COR) 또는 향상된 화학 발광(ECL 시스템, Thermo Scientific)에 의해 시각화하였다.
그 결과, IR-A43은 인슐린이 없을 때 인슐린 수용체에 결합할 수 있지만 IR-A43 단독으로는 Rat-1/hIR 세포에서 발현되는 인슐린 수용체의 자가 인산화에 영향을 미치지 않았다(도 3A). 그러나 인슐린 수용체와 인슐린 및 IR-A43의 공동 자극은 자가 인산화를 증폭시켰다. 또한, 티로신 잔기의 인산화는 편향없이 IR-A43에 의해 유사한 정도로 향상되었으며, 인산화 수준은 IR-A43의 농도에 따라 차이가 있었다(도 3B). 하류 신호 전달 단백질의 인산화는 수용체 자가 인산화와 마찬가지로 인슐린과 IR-A43이 인슐린 수용체에 결합될 때 증폭되었다(도 3C).
다음으로, IR-A43의 인슐린 강화 활성을 추가로 평가하기 위해 IR-A43에 의해 강화된 저농도 인슐린의 효과와 고농도 인슐린 단독의 효과를 비교하였다. Rat-1/hIR 세포를 2 nM 인슐린 및 250 nM IR-A43으로 공동 처리했을 때, 인슐린 수용체 및 하류 신호 분자의 인산화 수준은 인슐린 50nM 단독으로 생성된 인산화 수준과 유사하였다(도 3D-E).
인슐린과 IR-A43 사이의 상호 양성 협력성(mutual positive cooperativity)은 IR-A43이 인슐린 결합 부위와 다른 부위에 결합함을 나타내었다. 이에, IR-A43은 인슐린 결합의 수용체에 대한 결합을 안정화시켜 인슐린의 활성을 증폭시키는 양성 알로스테릭 모듈레이터(Positive allosteric modulators, PAM)임을 알 수 있다.
실시예 4: IR-A43의 마우스 IR 조절
in vivo에서 IR-A43가 마우스 IR을 조절하는지의 여부를 확인하기 위해 마우스 유래 지방 세포인 완전히 분화된 3T3-L1 세포에서 포도당 흡수를 측정하였다. 포도당 흡수는 말초세포조직에서 IR의 주요 기능이다. 포도당을 혈액으로부터 세포로 흡수를 증가시키는 인슐린 신호는 GLUT4(Glucose Transporter Type 4)을 골격근, 지방세포의 원형질막으로 이동 가능하게 한다.
포도당 흡수를 측정하기 위해 완전히 분화된 지방 세포를 사용하였다. 먼저, 3T3-L1 지방전구세포는 10% BS(bovine serum)과 함께 DMEM 배지에서 배양하였다. 성장을 위해 처음 2 일에 세포를 10% BS 조건에서 배양하고, 다음 2 일에 배양 배지를 제거하고 500nM IMBX(3-isobutyl-1-methylxanthine), 850nM 인슐린 및 1uM 덱사메타손(dexamethasone)을 함유하는 10% FBS로 교체하였다. 2 일 후 배양 배지를 제거하고 850nM 인슐린을 함유하는 10% FBS로 교체하였다. 2 일 후 배양 배지를 제거하고 10% FBS로 교체하였다.
이후, 지방 세포를 3 시간 동안 FBS 없이 배양하고, Krebs-Ringer HEPES 완충액을 사용하여 지방 세포를 1 시간 동안 포도당 없이 배양한 후, 15 분 동안 압타머와 인슐린을 병용 처리하였다. 그 다음, 2-데옥시-14C-글루코스(2-deoxy-14C-glucose, 14C-2-deoxy glucose) (0.1 uCi/ml)로 세포를 10 분 동안 배양하고 PBS가 포함된 25mM D-글루코스로 3 회 세척하였다. 세포를 0.5N NaOH가 포함된 1% SDS로 용해하고, 포도당 흡수량을 액체 섬광 계수기로 측정하였다.
그 결과, 500nM IR-A43은 20nM 인슐린에 의해 유도된 포도당 섭취에 영향을 미치지 않았다(도 4A). 250nM IR-A43이 Rat-1/hIR 세포에서 2nM 인슐린의 활성을 ~ 25 배 증가시켰다는 점을 감안하면 이 결과는 예상치 못한 결과였다(도 3D).
그러나, 본 실시예에서 포도당 흡수 분석에 사용된 3T3-L1 지방 세포는 마우스에서 유래한 반면 웨스턴 블롯팅 연구에 사용된 Rat-1/hIR 세포는 인간 유래로써 인슐린 수용체를 발현한다. 인간 IR(hIR) 및 마우스 IR(mIR)의 아미노산 서열은 높은 상동성을 나타내지만(~95.9%) 동일하지는 않은 바, IR-A43 결합 부위의 아미노산 서열이 mIR에 존재하지 않을 수 있다고 가정하여 IR-A43을 hIR에 특이 적으로 제작하였다. IR-A43의 종 특이성을 확인하기 위해 차이니즈 햄스터 난소-K1(Chinese hamster ovary - K1, CHO-K1) 세포에서 일시적으로 hIR 또는 mIR을 과발현하고 수용체 자가 인산화를 관찰하였다.
구체적으로, CHO-K1 세포를 10 % FBS가 포함된 Ham's F-12K(F-12 nutrient mixture Ham Kaighn's modification medium) 배지에서 배양하였다. hIR 또는 mIR을 제조업체의 지침에 따라 Lipofectamine 3000 형질 감염 시약(ThermoFisher, # L3000008)을 사용하여 CHO-K1 세포로 형질 감염시키고 과발현하였다.
그 결과, 예상한 바와 같이 IR-A43은 mIR의 인슐린 유도 자가 인산화를 향상시키지 않았다(도 4B).
실시예 5: 인간 IR 내 감작을 위한 핫스팟 확인
구조적 관점에서, IR-A43의 종 특이성은 IR-A43의 결합 부위를 확인하고 인슐린 강화 활성의 메커니즘을 이해하는 데 유용하다. hIR 및 mIR의 엑토 도메인(ectodomain)에 일치하지 않는 35 개의 아미노산이 존재하는 바, 이의 아미노산 서열을 도메인(예를 들면, L1, L2, CR)에 따라 7 개 부분으로 나누었다(표 1). 각 7 개의 도메인은 3차원(3D) 거리에 따라 분류되었다.
이후, 각각 mIR의 한 부분을 포함하는 7 개의 하이브리드 hIR을 제작하였다(도 5A).
구체적으로, 제조업체의 지침에 따라 Gibson 어셈블리 마스터 믹스(NEB, # E2611L)를 사용하여 도메인(약 200~600 개 아미노산) 치환을 수행하였다. 각 구조물은 제조업체의 지침에 따라 Lipofectamine 3000 형질 감염 시약(ThermoFisher, # L3000008)을 사용하여 CHO-K1 세포로 형질 감염시켰다.
Residue
Number 		Human Mouse Domain Part
158 I V CR Part 1
210 S K
218 Q E
236 R Q
264 H F Part 2
267 K R
271 R K
272 Q P
300 L M
313 H Q L2 Part 3
314 L I
367 Y F
386 R H
477 Y F FnIII-1 Part 4
538 L Q
547 N S
631 F Y FnIII-2a
+
ID-α		 Part 5
665 E D
676 E D
680 G S
726 G E ID-β Part 6
727 D E
733 V A
734 A T
735 V T
736 P L
738 V L
739 A P
740 A D
744 T V
748 S I
753 P Q
790 T S FnIII-2b
+
FnIII-3		 Part 7
792 E D
886 I V
그 결과, IR-A43은 mIR의 Part 2를 포함하는 하이브리드 hIR을 제외하고 각 하이브리드 hIR 수용체의 인슐린 유도 자가 인산화를 강화하였다(도 5B).
hIR의 Part 2의 아미노산 서열이 IR-A43의 활성에 중요하다는 것을 확인하기 위해, hIR의 Part 2를 포함하는 하이브리드 mIR을 제작하고 이에 대해 IR-A43의 활성을 평가한 결과, IR-A43이 하이브리드 mIR에서 인슐린의 활성을 향상시킴을 확인하였다(도 5C).
이를 통해, hIR의 Part 2(H264, K267, R271, Q272 및 L300)에 위치한 5 개 잔기 중 적어도 하나가 IR-A43 결합에 직접 관여함을 알 수 있다.
이에, 어떤 잔기가 IR-A43 결합과 직접적으로 연관되어 있는지 확인하기 위해, mIR(H264F/K267R, R271K/Q272P 및 L300M)의 부분 2의 잔기를 포함하는 3 개의 hIR 돌연변이를 제작하고 이에 대해 IR-A43의 활성을 평가한 결과, hIR-R271K/Q272P 돌연변이에서만 인슐린 강화 활성이 감소함을 확인하였다(도 5D-E).
R271K 및 Q272P 돌연변이의 효과를 평가한 결과, Q272P 돌연변이가 hIR에서 IR-A43의 인슐린 강화 활성을 현저하게 감소시켰음을 확인하였다(도 5F).
또한, mIR의 잔기 P272가 hIR의 잔기 Q272로 대체된 mIR 돌연변이체(P272Q)에서 IR-A43의 활성을 평가한 결과, IR-A43의 인슐린 강화 활성이 회복되었다(도 5G, H).
이에, hIR의 시스테인 풍부(cysteine rich, CR) 도메인에 위치한 잔기 Q272가 IR-A43의 hIR에 대한 결합에 직접 관여하고 Q272를 포함하는 영역이 인슐린 결합을 안정화시켜 인슐린 활성을 향상시키는 핫스팟임을 확인하였다.
실시예 5: Q272 잔기가 포함된 영역의 구조적 변화
IR-A43이 인슐린의 활성을 향상시키는 메커니즘을 이해하려면 잔기 Q272를 포함하는 영역의 구조적 변화를 이해하는 것이 필요하다. 인슐린 수용체의 비활성 엑토 도메인의 구조는 X-ray 결정학에 의해 밝혀졌으며, 각 α-β 단량체가 대칭 반전된 'V'모양으로 이량체화됨을 입증하였다(Croll, T.I., et al. Structure (London, England : 1993), 2016, 24, 469-476.; McKern, N.M., et al. Nature, 2006, 443, 218-221.). 활성(인슐린 결합)화된 엑토 도메인 구조는 단일 입자 극저온 전자 현미경으로 분석한 결과에서는 생리적 인슐린 농도에서 하나의 인슐린 분자가 인슐린 수용체에 결합하여 L1 도메인을 반대 모노머의 Fn3-1 도메인으로 이동하여 수용체를 비대칭 역'L' 모양으로 유도하는 것을 확인하였다(도 6A) (Weis, F., et al. Nature communications, 2018, 9, 4420.). 잔기 Q272를 포함하는 CR 도메인은 L1 도메인과 L2 도메인 사이에 위치하였다(도 6B, C). L1-CR-L2 도메인의 비활성 및 활성 구조의 중첩은 L1-CR 도메인이 수용체에 대한 인슐린 결합시 실질적인 형태 변화를 겪지 않음을 나타내었다(도 6D). 인슐린 결합 후 L2와 CR 도메인(~P303-P307) 사이의 경계는 경첩처럼 작용하여 L1과 L2 도메인을 서로 가깝게 만들었다 (도 6D). 비활성 형태에서 잔기 Q272는 L2 도메인(H313, L315 및 E316)의 일부에 매우 가깝게 위치하였다(도 6E). 그러나 인슐린에 의해 유도된 입체 형태 변화는 L2 도메인의 전위로 이어져 구조 외부에 Q272 잔기를 노출하였다(도 6G). 따라서, 인슐린-매개된 잔기 Q272의 노출은 IR-A43이 인슐린이 없는 비활성 형태보다 수용체의 활성 형태에 더 유리하게 결합하게 함을 알 수 있다. 또한, IR-A43이 잔기 Q272에 결합될 때, 활성 형태에서 L2 도메인의 위치를 고정함으로써 인슐린 결합을 안정화시키는 '쐐기' 역할을 할 수 있음을 알 수 있다(도 6H). 이는 인슐린과 IR-A43이 인슐린 수용체에 결합할 때 발생하는 상호 긍정적 협력성을 설명할 수 있다.
상기 실시예의 결과로부터, 본 발명의 IR-A43 압타머는 감작 특성을 나타내어 인슐린이 없을 때에는 활성을 나타내지 않으면서, 인슐린과 함께 존재시 인슐린 민감성을 효과적으로 향상시키고 IR 신호를 강화함을 확인하였다. 또한, IR의 CR 도메인에서 Q272 잔기가 IR의 조절에 중요함을 확인하였으며, Q272 잔기가 IR 민감화를 위한 핫스팟에서 중요한 역할을 할 수 있음을 확인하였는 바, IR-A43은 IR의 조절을 위한 양성 알로스테릭 모듈레이터로 사용할 수 있으며, Q272 잔기를 타겟으로 IR 민감성을 증가시킬 수 있다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (32)

  1. 하기의 일반식 1의 염기서열을 포함하는, 인슐린 수용체(insulin receptor) 특이적 압타머:
    [일반식 1]
    GCCYGYAYCCGCAGYAYCGGCAYYCAGCGAC (서열번호 1);
    여기서 상기 일반식 1의 Y는 독립적으로 C 또는 T이고,
    상기 Y 내 5' 탄소는 나프틸기 및 2-나프틸기로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상으로 치환된 것인, 압타머.
  2. 제1항에 있어서, 상기 Y는 나프틸기로 치환된 것인, 압타머.
  3. 제2항에 있어서, 상기 나프틸기는 Nap-dU(5-(N-1-naphthylmethylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine)인 것인, 압타머.
  4. 제1항에 있어서, 상기 일반식 1의 염기서열은 이와 상동성이 90% 이상인 염기서열을 포함하는 것인, 압타머.
  5. 제1항에 있어서, 상기 압타머는 서열번호 22의 염기서열을 포함하는 것인, 압타머.
  6. 하기의 일반식 2의 염기서열을 포함하는, 인슐린 수용체 특이적 압타머:
    [일반식 2]
    GACYGYAYCCGCGGYAYCGGCAYYCAGCCAC (서열번호 2);
    여기서 상기 일반식 2의 Y는 독립적으로 C 또는 T이고,
    상기 Y 내 5' 탄소는 나프틸기 및 2-나프틸기로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상으로 치환된 것인, 압타머.
  7. 제6항에 있어서, 상기 Y는 나프틸기로 치환된 것인, 압타머.
  8. 제7항에 있어서, 상기 나프틸기는 Nap-dU(5-(N-1-naphthylmethylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine)인 것인, 압타머.
  9. 제6항에 있어서, 상기 일반식 2의 염기서열은 이와 상동성이 90% 이상인 염기서열을 포함하는 것인, 압타머.
  10. 하기의 일반식 3의 염기서열을 포함하는, 인슐린 수용체 특이적 압타머:
    [일반식 3]
    GACWGWAWCCGCGGYAWCGGCAYYCAGCCAC (서열번호 20);
    여기서 상기 일반식 3의 Y 및 W는 독립적으로 C 또는 T이고,
    상기 Y 및 W 내 5' 탄소는 나프틸기 및 2-나프틸기로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상으로 치환되고,
    상기 일반식 3 내 어느 하나 이상의 A, C, T 및 G는 메톡시기 및 불소로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 작용기가 도입된 것인, 압타머.
  11. 제10항에 있어서, 상기 Y는 나프틸기로 치환된 것인, 압타머.
  12. 제11항에 있어서, 상기 나프틸기는 Nap-dU(5-(N-1-naphthylmethylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine)인 것인, 압타머.
  13. 제10항에 있어서, 상기 W는 2-나프틸기로 치환된 것인, 압타머.
  14. 제13항에 있어서, 상기 나프틸기는 2-Nap-dU(5-(N-2-naphthylmethylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine)인 것인, 압타머.
  15. 제10항에 있어서, 상기 A, C, T 및 G는 메톡시기 또는 불소가 도입된 것인, 압타머.
  16. 제10항에 있어서, 상기 일반식 3의 염기서열은 이와 상동성이 90% 이상인 염기서열을 포함하는 것인, 압타머.
  17. 제10항에 있어서, 상기 압타머는 서열번호 3 내지 서열번호 10으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 염기서열을 포함하는 것인, 압타머.
  18. 하기의 일반식 4의 염기서열을 포함하는, 인슐린 수용체 특이적 압타머:
    [일반식 4]
    GACWGWAWCCGCGGYAWCGGCAYYCAGCCAC (서열번호 21);
    여기서 상기 일반식 4의 Y 및 W는 독립적으로 C 또는 T이고,
    상기 Y 및 W 내 5' 탄소는 나프틸기 및 2-나프틸기로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상으로 치환되고,
    상기 일반식 4 내 어느 하나 이상의 A, C, T 및 G는 메톡시기 및 불소로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 작용기가 도입된 것인, 압타머.
  19. 제18항에 있어서, 상기 Y는 나프틸기로 치환된 것인, 압타머.
  20. 제19항에 있어서, 상기 나프틸기는 Nap-dU(5-(N-1-naphthylmethylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine)인 것인, 압타머.
  21. 제18항에 있어서, 상기 W는 2-나프틸기로 치환된 것인, 압타머.
  22. 제21항에 있어서, 상기 나프틸기는 2-Nap-dU(5-(N-2-naphthylmethylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine)인 것인, 압타머.
  23. 제18항에 있어서, 상기 A, C, T 및 G는 메톡시기 또는 불소가 도입된 것인, 압타머.
  24. 제18항에 있어서, 상기 일반식 4의 염기서열은 이와 상동성이 90% 이상인 염기서열을 포함하는 것인, 압타머.
  25. 제18항에 있어서, 상기 압타머는 서열번호 11 내지 서열번호 19로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 염기서열을 포함하는 것인, 압타머.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 압타머는 인슐린 존재 하에서, 인슐린 수용체에 결합하여 이의 민감성을 증가시키는 것인, 압타머.
  27. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 압타머는 인슐린 수용체의 시스테인 풍부(cysteine rich) 도메인에 결합하는 것인, 압타머.
  28. 제27항에 있어서, 상기 압타머의 시스테인 풍부 도메인 내 결합 위치는 인슐린 수용체를 이루는 서열번호 25의 아미노산 서열에서 272번째 위치에 상응하는 아미노산 잔기인 것인, 압타머.
  29. a) 인슐린 수용체와 시험물질을 접촉시키는 단계;
    b) 상기 시험물질이 인슐린 수용체에 결합하는 위치를 확인하는 단계; 및
    c) 상기 시험물질과 접촉한 상기 인슐린 수용체 및 상기 시험물질과 접촉하지 않은 대조군에서 상기 인슐린 수용체의 민감성 또는 하류 신호 전달 수준을 확인하는 단계;를 포함하는, 인슐린 수용체에 대한 양성 알로스테릭 모듈레이터(Positive allosteric modulators)의 스크리닝 방법으로써,
    상기 시험물질이 인슐린 수용체의 시스테인 풍부 도메인에 결합하고,
    상기 시험물질과 접촉한 상기 인슐린 수용체가 상기 대조군에 비해 인슐린 수용체의 민감성이 증가되거나 하류 신호 전달이 강화된 경우,
    상기 시험물질을 인슐린 수용체에 대한 양성 알로스테릭 모듈레이터 후보물질로 선별하는 단계를 포함하는,
    인슐린 수용체에 대한 양성 알로스테릭 모듈레이터의 스크리닝 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 시험물질의 도메인 내 결합 위치는 인슐린 수용체를 이루는 서열번호 25의 아미노산 서열에서 272번째 위치에 상응하는 아미노산 잔기인 것인, 방법.
  31. 제29항에 있어서, 상기 시험물질은 압타머, 단백질, 펩타이드 및 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 방법.
  32. 인슐린 수용체의 시스테인 풍부 도메인으로써,
    상기 도메인은 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항의 압타머가 결합하는 것으로 특정되는 것인, 인슐린 수용체의 시스테인 풍부 도메인.
PCT/KR2021/003795 2020-03-30 2021-03-26 인슐린 수용체 특이적 압타머 및 이의 용도 WO2021201516A1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202063001762P 2020-03-30 2020-03-30
US63/001,762 2020-03-30

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2021201516A1 true WO2021201516A1 (ko) 2021-10-07

Family

ID=77927376

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2021/003795 WO2021201516A1 (ko) 2020-03-30 2021-03-26 인슐린 수용체 특이적 압타머 및 이의 용도

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2021201516A1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024005240A1 (ko) * 2022-06-30 2024-01-04 포항공과대학교 산학협력단 인슐린 수용체 결합 압타머 이량체 및 이의 용도

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100076060A1 (en) * 2005-09-15 2010-03-25 Duke University Aptamers as agonists
KR20170013178A (ko) * 2015-07-27 2017-02-06 주식회사 포스코 인슐린 수용체 압타머 및 이를 포함하는 약학적 조성물
KR20180007918A (ko) * 2016-07-14 2018-01-24 충북대학교 산학협력단 인슐린 수용체에 특이적으로 결합하는 dna 앱타머 및 이의 용도
WO2019216458A1 (ko) * 2018-05-10 2019-11-14 주식회사 압타머사이언스 인슐린 수용체 압타머 및 이를 포함하는 당뇨병 치료용 약학적 조성물

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100076060A1 (en) * 2005-09-15 2010-03-25 Duke University Aptamers as agonists
KR20170013178A (ko) * 2015-07-27 2017-02-06 주식회사 포스코 인슐린 수용체 압타머 및 이를 포함하는 약학적 조성물
KR20180007918A (ko) * 2016-07-14 2018-01-24 충북대학교 산학협력단 인슐린 수용체에 특이적으로 결합하는 dna 앱타머 및 이의 용도
WO2019216458A1 (ko) * 2018-05-10 2019-11-14 주식회사 압타머사이언스 인슐린 수용체 압타머 및 이를 포함하는 당뇨병 치료용 약학적 조성물

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MARGHERITA IABONI, ET AL.: "Targeting Insulin Receptor with a Novel Internalizing Aptamer", MOLECULAR THERAPY-NUCLEIC ACIDS, CELL PRESS, US, vol. 5, no. 9, 20 September 2016 (2016-09-20), US, pages e365, XP055650740, ISSN: 2162-2531, DOI: 10.1038/mtna.2016.73 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024005240A1 (ko) * 2022-06-30 2024-01-04 포항공과대학교 산학협력단 인슐린 수용체 결합 압타머 이량체 및 이의 용도

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2016111546A2 (ko) 혈액 응고인자 viii 유전자를 타겟으로 하는 엔도뉴클레아제 및 이를 포함하는 혈우병 치료용 조성물
Kim et al. Agouti regulation of intracellular calcium: role of melanocortin receptors
WO2012128580A1 (en) Water-soluble polypeptides comprised of repeat modules, method for preparing the same and method for a target-specific polypeptide and analysis of biological activity thereof
Pezet et al. The last proline of Box 1 is essential for association with JAK2 and functional activation of the prolactin receptor
WO2018124642A9 (ko) 치수줄기세포의 상아 모전구세포로의 분화용 조성물 및 상아모전구세포 표면에 특이적으로 결합하는 IgG 또는 IgM 타입 단일 클론 항체
WO2021201516A1 (ko) 인슐린 수용체 특이적 압타머 및 이의 용도
WO2016036172A1 (ko) 단백질 키나제 억제제에 대한 감수성 예측용 바이오 마커 및 이의 용도
Durzyńska et al. Human Eb peptide: not just a by-product of pre-pro-IGF1b processing?
WO2014178653A1 (ko) 지방세포 분화 과정에서 인간 작은 류신 지퍼 단백질의 용도
WO2019216675A1 (ko) 조절 t 세포 표면 항원의 에피토프 및 이에 특이적으로 결합하는 항체
WO2010137770A1 (ko) 신규한 ｇｐｃｒ 단백질 및 이의 용도
WO2013176503A1 (ko) 타우 단백질 매개 신경 퇴행성 질환 치료제
WO2018203613A1 (ko) 톨-유사 수용체(tlr) 억제를 위한 펩타이드 및 이를 포함하는 약학적 조성물
WO2022154288A1 (ko) 단백질 키나아제 a의 촉매 서브 유닛 알파에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 및 이를 활용한 암 진단 용도
WO2022131889A1 (ko) Taci 단백질의 용도
WO2021187745A1 (ko) 중간엽 줄기세포 또는 중간엽 줄기세포에서 분비된 인슐린을 포함하는 샤르코-마리-투스병 예방 또는 치료용 약학적 조성물
WO2022015113A1 (ko) Ptk7에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도
WO2011090283A2 (ko) Ｓｈ３ｒｆ２ 발현 또는 활성 억제제를 함유하는 암의 예방 또는 치료용 조성물
WO2020071641A1 (ko) Tsp1 단백질 억제제를 유효성분으로 함유하는 파브리 병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
WO2023177246A1 (ko) Egfrviii 특이적 압타머 및 이의 용도
WO2019190066A1 (ko) Oct4 기능 저해용 펩티드를 포함하는 줄기세포성 억제용 조성물
WO2017164486A1 (ko) Tesk1 억제제를 포함하는 항암제 내성 억제용 조성물 및 tesk1 억제제의 스크리닝 방법
WO2013022262A2 (ko) 인간 리지스틴 수용체 및 그 용도
WO2016159695A1 (ko) Ssu72를 유효성분으로 포함하는 자가면역질환의 예방 또는 치료용 조성물
WO2023167528A1 (ko) 인슐린 수용체 특이적 압타머 및 이의 이용

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 21780493

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 21780493

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

32PN Ep: public notification in the ep bulletin as address of the adressee cannot be established

Free format text: NOTING OF LOSS OF RIGHTS PURSUANT TO RULE 112(1) EPC

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 21780493

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1