WO2024005240A1 - 인슐린 수용체 결합 압타머 이량체 및 이의 용도 - Google Patents

인슐린 수용체 결합 압타머 이량체 및 이의 용도 Download PDF

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WO2024005240A1
WO2024005240A1 PCT/KR2022/009443 KR2022009443W WO2024005240A1 WO 2024005240 A1 WO2024005240 A1 WO 2024005240A1 KR 2022009443 W KR2022009443 W KR 2022009443W WO 2024005240 A1 WO2024005240 A1 WO 2024005240A1
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WO
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aptamer
sequence
seq
dimer
insulin receptor
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PCT/KR2022/009443
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English (en)
French (fr)
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류성호
오은주
윤나오
이지민
박만근
박성은
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포항공과대학교 산학협력단
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    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
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    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing

Definitions

  • the present invention relates to insulin receptor binding aptamer dimers and uses thereof.
  • Insulin receptor is a tyrosine kinase receptor and a transmembrane receptor activated by insulin, IGF-1, or IGF-2. It has a tetramer structure in which two ⁇ chains (719 residues) containing the insulin binding region and two ⁇ chains (620 residues) including the transmembrane region are connected by S-S bonds.
  • tyrosine kinase activity in the intracellular region of the ⁇ chain becomes active, and phosphorylation of receptor tyrosine residues occurs. This self-phosphorylation causes phosphorylation of other proteins.
  • Insulin binding to the insulin receptor (IR) initiates a signaling cascade that plays an essential role in glucose homeostasis.
  • a key step in overcoming diabetes is to understand ligand-dependent IR signaling and develop new pharmacological agents that modulate IR.
  • the molecular mechanism of IR activation by insulin binding has not been clearly elucidated.
  • IR a member of the receptor tyrosine kinase superfamily
  • IR is a glycoprotein consisting of two ⁇ and two ⁇ subunits ( ⁇ 2 ⁇ 2) covalently linked by disulfide bonds.
  • the extracellular domain of the IR also referred to as the ectodomain
  • TK cytoplasmic tyrosine kinase
  • the insulin-binding determinant is located entirely within the ectodomain, which consists of the leucine-rich repeat domains L1 and L2 of the ⁇ chain, an intervening cysteine-rich (CR) domain, and three fibronectin type III domains, Fn0, Fn1, and Fn2. Located.
  • insulin itself was the first peptide hormone to be structurally determined by There are two insulin binding sites on the IR, sites 1 and 2, with each site 1 on one monomer of the IR proximal to site 2' on a second monomer, and the binding of insulin to site 1 to site 2'. This suggests that subsequent binding to IR induces a conformational change in the IR ectodomain, thereby reducing the distance between the two intercellular TK domains, thereby facilitating autophosphorylation.
  • Insulin Today, various types of insulin derivatives are being developed and used to treat diabetes. Insulin is widely used to normally control blood sugar in diabetic patients because it is the most effective hypoglycemic agent. However, insulin administered at high concentrations for a long period of time activates cell division, increasing the incidence of cancer due to the growth of cancer cells and atherosclerosis due to the growth of vascular smooth muscle cells. It is known to worsen diabetes complications such as atherosclerosis. To solve this problem, artificial ligands using antibodies, peptides, etc. have been developed, but much technological development is still required due to low activity and unstable pharmacokinetics in vivo.
  • the present inventors prepared a novel insulin receptor-binding aptamer dimer, and thereby significantly increased the activity of the aptamer.
  • the phosphorylation of ERK which promotes cell division, was minimized while maintaining the same blood sugar-lowering effect as insulin.
  • the present invention was completed by developing a new dimer that minimizes the side effects of the drug.
  • the object of the present invention is to provide (1) a sequence that specifically binds to the extracellular domain of the insulin receptor including the base sequence of SEQ ID NO: 1; and a linker sequence having a complementary sequence to the linker sequence of the second aptamer linked thereto; (2) an extracellular domain of the insulin receptor comprising the base sequence of SEQ ID NO: 1 A sequence that specifically binds to; and a linker sequence having a complementary sequence to the linker sequence of the first aptamer linked thereto. It provides an aptamer dimer, comprising a second aptamer comprising a.
  • Another object of the present invention is to provide a first aptamer sequence that specifically binds to the extracellular domain of the insulin receptor including the base sequence of SEQ ID NO: 1; spacer sequence; And to provide an aptamer dimer consisting of a second aptamer sequence that specifically binds to the extracellular domain of the insulin receptor including the base sequence of SEQ ID NO: 1.
  • Another object of the present invention is to provide a use of the aptamer dimer.
  • the present invention provides (1) a sequence that specifically binds to the extracellular domain of the insulin receptor including the base sequence of SEQ ID NO: 1; and a linker sequence having a complementary sequence to the linker sequence of the second aptamer linked thereto; (2) an extracellular domain of the insulin receptor comprising the base sequence of SEQ ID NO: 1 A sequence that specifically binds to; and a linker sequence having a complementary sequence to the linker sequence of the first aptamer linked thereto. It provides an aptamer dimer, including a second aptamer comprising a.
  • the present invention provides a first aptamer sequence that specifically binds to the extracellular domain of the insulin receptor including the base sequence of SEQ ID NO: 1; spacer sequence; and a second aptamer sequence that specifically binds to the extracellular domain of the insulin receptor including the base sequence of SEQ ID NO: 1.
  • “Aptamer” is 15-40 single-stranded oligonucleotides that form a specific three-dimensional formation, has a stem loop structure, and has the property of specifically binding to a specific molecule. Aptamers are compounds that are easy to chemically synthesize, are easy to chemically modify, are heat stable, and have very high specificity for the target.
  • Aptamer sequences can be discovered using a method called SELEX (selective evolution of ligands by exponential enrichment), and hundreds of aptamer sequences have already been disclosed.
  • Aptamers are often compared to antibodies in that they specifically bind to targets, but they do not cause an immune response.
  • Aptamers are often compared to single antibodies due to their inherent high affinity (usually at the pM level) and the ability to bind to target molecules with specificity, and as they are especially called 'chemical antibodies', their potential as alternative antibodies is very high.
  • Aptamers have very high stability compared to antibodies. Protein or antibody drugs cannot be stored or transported at room temperature, but aptamers can and can maintain their function even after sterilization.
  • aptamer dimer refers to a structure comprising two aptamers linked by a suitable polymer moiety. According to the present invention, the aptamer dimer combines and/or combines two aptamers of one type, which exhibit the characteristic of specifically binding to the extracellular domain of the insulin receptor, through a linker having a complementary base sequence. It refers to a form in which two or more aptamers of one type that exhibit the characteristic of specifically binding to the extracellular domain of the insulin receptor are combined into a single-stranded aptamer through a spacer. This aptamer dimer functions as an agonist for the insulin receptor.
  • the first aptamer and the second aptamer are composed of the aptamer sequence and include the base sequence of SEQ ID NO: 1, and can specifically bind to the extracellular domain of the insulin receptor.
  • Constructing an aptamer dimer through a linker or spacer sequence can exhibit an equivalent or higher level of effect without restrictions on its form as long as the sequence of SEQ ID NO. 1 is constructed from the 5' direction to the 3' direction.
  • two aptamer regions of SEQ ID NO: 1 may be included in the dimer through complementary sequences.
  • the sequence structure due to the complementary sequence can be configured as shown in Figure 1.
  • the first aptamer and the second aptamer are connected through a spacer sequence, they may include two consecutive aptamer sequences of SEQ ID NO: 1 in the 5'-3' direction.
  • each first and second aptamer acts is not limited to the form or method in which they are connected by a linker or spacer.
  • the base sequence of SEQ ID NO: 1 specifically binds to the extracellular region of the insulin receptor, promotes phosphorylation of the insulin receptor, and acts as an aptamer that can bind with specific affinity to the insulin receptor, similar to insulin. You can.
  • the base sequence of SEQ ID NO: 1 is characterized in that it specifically binds to the insulin receptor, and may include a base modified by replacing the 5th position of deoxyribose uracil with a hydrophobic functional group.
  • bases used in the aptamer of the present invention other than the modified bases are selected from the group consisting of A, G, C, T, and deoxy forms thereof, and include modifications thereof. This is mentioned in detail.
  • position 5 of the base of the nucleotide included in the aptamer may be substituted with a hydrophobic functional group.
  • deoxyribose uracil modified by replacing the 5th position of the thymine base in the variable region with a hydrophobic functional group such as 5-[N-(1-naphthylmethyl)carboxamide]-2'-deoxyuridine (NapdU) or Contains 5-(N-benzylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine in the variable region.
  • it includes 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10, and preferably includes 5, 6, 7, 8, or 9.
  • the hydrophobic functional group may include a naphthyl group, benzyl group, pyrrolebenzyl group, isobutyl group, or tryptophan, and more preferably, the hydrophobic functional group is a naphthyl group or a benzyl group.
  • Deoxyribose uracil modified by substitution with a naphthyl group is shown in Formula 1 below, and deoxyribose uracil modified by substitution with a benzyl group is shown in Formula 2 below.
  • the base sequence of SEQ ID NO: 1 (IR-A62) is as follows:
  • SEQ ID NO: 1 CANNAGCAN GAGNCNAGAN CCGN
  • N is a modified base and may have either a naphthyl group or a benzyl group as a hydrophobic functional group, as referred to in Formula 1 or 2 above.
  • the N group may be deoxyribose uracil in which the 5th carbon position is substituted with a hydrophobic functional group. More specifically, naphthyl-uracil nucleotide (5-(N-1-naphthylmethylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine, Naphthyl-dU, NapdU) or benzyl-uracil nucleotide (5-(N-benzyl It may be any one or more selected from carboxyamide)-2'-deoxyuridine, Benzyl-dU, and BndU).
  • C, A, G can be modified or unmodified bases.
  • modified C introduces a methoxy group (2-O-Me, 2-O-Methoxy-DNA) at the second carbon position of the nucleotide;
  • modification may include the introduction of fluorine (2-F, 2-Fluorine-DNA) at the second carbon position of the nucleotide.
  • the modified G introduces a methoxy group (2-O-Me, 2-O-Methoxy-DNA) at the second carbon position of the nucleotide;
  • the modification may include the introduction of fluorine (2-F, 2-Fluorine-DNA) at the second carbon position of the nucleotide.
  • modified A introduces a methoxy group (2-O-Me, 2-O-Methoxy-DNA) at the second carbon position of the nucleotide;
  • the modification may include the introduction of fluorine (2-F, 2-Fluorine-DNA) at the second carbon position of the nucleotide.
  • the SEQ ID NO: 1 corresponds to sequences 22 to 46 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
  • SEQ ID NO: 2 TATGAGTGAC CGTCCGCCTG G CANNACGCA NGAGNCNAGA NCCGN CAGAC CNAAGGCNNC AGCCACACCA CCAGCCAAA
  • the base sequence of SEQ ID NO: 1 may form a stem-loop structure composed of internal nucleotides.
  • the stem-loop structure may form one or two stem-loop structures.
  • the base sequence of SEQ ID NO: 1 corresponds to a sequence essential for forming a stem-loop structure, and this sequence has the characteristic of specifically binding to the insulin receptor.
  • the first aptamer and the second aptamer essentially include the base sequence of SEQ ID NO: 1.
  • SEQ ID NO: 1 may include sequences 22 to 46 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 and may further include 25 to 79 consecutive nucleotide sequences. Specifically, contiguous 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, including base sequences 22 to 46 of SEQ ID NO: 2. There may be , 70, or 79 contiguous sequences.
  • including a sequence may mean including a sequence, may mean consisting essentially of these, or may mean consisting of these.
  • any base located in the middle or at both ends may be modified.
  • the modification includes PEG (polyethylene glycol), biotin, idT (inverted deoxythymidine), LNA (Locked Nucleic Acid), 2'-methoxy nucleoside, and 2'-amino at the 5' end, 3' end, middle or both ends. It may be modified by combining one or more types selected from the group consisting of nucleosides, 2'F-nucleosides, amine linkers, thiol linkers, and cholesterol.
  • 2'-methoxy nucleoside, 2'-amino nucleoside, or 2'F-nucleoside binds to the base contained in the aptamer and provides a modified base, thereby imparting nuclease resistance. do.
  • a modified base may be further included to ensure nuclease resistance and stability when administered in the human body.
  • Such modified bases may preferably be substitutions of 2'-OMe (methoxy) and/or 2'-F (fluorine) for any of the bases A, C, T, or G. That is, it has at least one modified base substitution of 2'-OMe (methoxy) or 2'-F (fluorine) for the base A, C, T or G of SEQ ID NO: 1 and/or SEQ ID NO: 2. It could be.
  • any embodiment according to the present invention may include variant constructs comprising any of the sequences mentioned above.
  • a sequence that specifically binds to the extracellular domain of the insulin receptor including any one base sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, preferably SEQ ID NO: 3 to 11; And a linker sequence having a complementary sequence to the linker sequence of the second aptamer linked thereto;
  • SEQ ID NO: 1, preferably any one selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 3 to 11 A sequence that specifically binds to the extracellular domain of the insulin receptor, including the base sequence of; And a linker sequence having a complementary sequence to the linker sequence of the first aptamer linked thereto; an aptamer dimer comprising a second aptamer including a.
  • the first aptamer that specifically binds to the extracellular domain of the insulin receptor comprising the base sequence of SEQ ID NO: 1, preferably any one base sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 3 to 11. order; spacer sequence; And a second aptamer sequence that specifically binds to the extracellular domain of the insulin receptor comprising any one base sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, preferably SEQ ID NO: 3 to 11. It provides a tamer dimer.
  • any modification to the base sequence of SEQ ID NO: 1 in order to improve the structure, stability in serum, or control renal clearance to increase binding force and specificity according to the present invention can be used in the present invention. included within the category.
  • the number of modified bases may be 4 to 60, preferably 6 to 50.
  • the receptor tyrosine residue is phosphorylated, and phosphorylation of the insulin receptor increases glucose absorption by controlling the movement of glucose transporter 4 (GLUT4) in fat cells and muscles through signal transduction. I order it.
  • the metabolic function of these insulin receptors is mainly regulated by the IRS-AKT pathway, and in the process of insulin signaling, Phosphoinositide 3-kinase (PI3K) plays an important role in the phosphorylation of Protein kinase B (AKT).
  • One aptamer containing only the base sequence of SEQ ID NO: 1 has the ability to bind to the insulin receptor, but it does not sufficiently mimic the function of insulin and is inferior to insulin in terms of effectiveness, so there is a problem that it must be administered in excessive amounts in the human body.
  • a dimer when a dimer is prepared based on the base sequence of SEQ ID NO. 1 and administered, it mimics the function of insulin almost identically and does not affect the ERK phosphorylation pathway, thereby preventing cancer cells that may occur due to the promotion of cell division. It was confirmed that excellent blood sugar control is possible without side effects such as increased cancer incidence due to the growth of vascular smooth muscle cells and worsening of diabetic complications such as atherosclerosis due to the growth of vascular smooth muscle cells.
  • the dimer linked by the complementary base sequence of the present invention has a short synthesis length, resulting in high purity and synthesis efficiency during large-scale synthesis, and the effect of reducing synthesis costs. There is.
  • the first aptamer according to the present invention is complementary to the linker sequence of the second aptamer linked to a sequence that specifically binds to the extracellular domain of the insulin receptor including the base sequence of SEQ ID NO: 1. It includes a linker sequence having a sequence.
  • the second aptamer is a linker sequence having a complementary sequence to the linker sequence of the first aptamer linked to a sequence that specifically binds to the extracellular domain of the insulin receptor including the base sequence of SEQ ID NO: 1; Includes.
  • the first aptamer may preferably be any one selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, and 42.
  • the second aptamer may preferably be any one selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, and 43.
  • the aptamer dimer is preferably SEQ ID NO: 28 and 29, SEQ ID NO: 30 and 31, SEQ ID NO: 32 and 33, SEQ ID NO: 34 and 35, SEQ ID NO: 36 and 37, SEQ ID NO: 38 and 39, sequence It may include any one of the first aptamer and the second aptamer selected from the group consisting of Nos. 40 and 41 and SEQ ID Nos. 42 and 43.
  • the formation of a dimer is achieved by combining two aptamers through complementary nucleic acid sequences to form a dimer and/or by combining two aptamers through a spacer sequence to form a single form. Implements a strand shape.
  • Linker sequence refers to a chemical moiety that connects two molecules or moieties.
  • the linker sequence of the present invention corresponds to a nucleic acid linker and is connected to the first aptamer and the second aptamer to form a double bond through complementary base sequences to form a dimer.
  • FIG. 1 An example of this dimer form is shown in Figure 1.
  • the first aptamer and the second aptamer may be connected in a dimer form through the combination of complementary linker sequences.
  • the first aptamer and the second aptamer containing the sequence of SEQ ID NO: 1, which specifically binds to the extracellular domain of the insulin receptor through a linker having such a complementary sequence may have the same active site sequence. and may have different sequences. That is, the sequences that specifically bind to the extracellular domain of the insulin receptor in the two aptamers may be the same or different.
  • the linker sequence of the linker having the above complementary sequence is, for example, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60 sequences. It may preferably have 5 to 30 base sequences, 10 to 30 base sequences, approximately 15 to 25 base sequences, and more preferably about 20 base sequences.
  • the linker sequence may further include modified bases to ensure nuclease resistance and stability when administered in the human body.
  • modified bases may preferably be substitutions of 2'-OMe (methoxy) and/or 2'-F (fluorine) for any of the bases of A, C, T, or G, and may be used as L-form DNA Or it may be LNA (Locked DNA). That is, the base sequence of the linker sequence may have at least one modified base substitution of 2'-OMe (methoxy) or 2'-F (fluorine) for the bases A, C, T or G,
  • the linker sequence can be in the form of L-form DNA or LNA (Locked DNA).
  • the linker sequence of the present invention may preferably consist of any one sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 12 to 27.
  • a spacer sequence may be additionally included to provide an appropriate space between this linker sequence and the sequence of SEQ ID NO: 1 that binds to the insulin receptor.
  • the sequence for providing space between the linker forming this complementary bond and the insulin receptor is preferably polyT, and the number of linkers is approximately 0, 1, 2, 3, 4, 5, and 6. and the insulin receptor.
  • the first aptamer may further include a spacer sequence between a sequence that specifically binds to the extracellular domain of the insulin receptor including the base sequence of SEQ ID NO: 1 and the linker sequence.
  • the second aptamer may further include a spacer sequence between a sequence that specifically binds to the extracellular domain of the insulin receptor including the base sequence of SEQ ID NO: 1 and the linker sequence.
  • the spacer sequence can be used as a binding agent to create a single strand by combining two types of aptamers and/or two or more of one type of aptamer.
  • the present invention includes a first aptamer sequence that specifically binds to the extracellular domain of the insulin receptor including the base sequence of SEQ ID NO: 1; spacer sequence; and a second aptamer sequence that specifically binds to the extracellular domain of the insulin receptor including the base sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the aptamer dimer of the present invention includes a first aptamer sequence that specifically binds to the extracellular domain of the insulin receptor including the base sequence of SEQ ID NO: 1; spacer sequence; And it may be composed of a second aptamer sequence that specifically binds to the extracellular domain of the insulin receptor including the base sequence of SEQ ID NO: 1.
  • spacer sequences are preferably poly A fragment, poly T fragment, poly G fragment, poly C fragment, phosphoramidite fragment, random oligonucleotide sequence that does not interfere with the aptamer sequence, and ethylene glycol fragment.
  • the length of may vary as known to those skilled in the art. Preferably 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, It may be a poly T fragment sequence of 26, 27, 28, 29, or 30.
  • the spacer sequence may further include modified bases to ensure nuclease resistance and stability when administered in the human body.
  • modified bases may preferably be substitutions of 2'-OMe (methoxy) and/or 2'-F (fluorine) for any of the bases of A, C, T, or G, and may be used as L-form DNA Or it may be LNA (Locked DNA). That is, the base sequence of the linker sequence may have at least one modified base substitution of 2'-OMe (methoxy) or 2'-F (fluorine) for the bases A, C, T or G,
  • the linker sequence can be in the form of L-form DNA or LNA (Locked DNA).
  • the spacer sequence of the present invention may preferably consist of any one sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 46 to 60.
  • the present invention provides (1) a sequence that specifically binds to the extracellular domain of the insulin receptor including the base sequence of SEQ ID NO: 1; and a linker sequence having a complementary sequence to the linker sequence of the second aptamer linked thereto; (2) an extracellular domain of the insulin receptor comprising the base sequence of SEQ ID NO: 1 A sequence that specifically binds to; and a linker sequence having a complementary sequence to the linker sequence of the first aptamer linked thereto. It provides an aptamer dimer, including a second aptamer comprising a.
  • a first aptamer sequence that specifically binds to the extracellular domain of the insulin receptor including the base sequence of SEQ ID NO: 1; spacer sequence; and a second aptamer sequence that specifically binds to the extracellular domain of the insulin receptor including the base sequence of SEQ ID NO: 1.
  • such aptamer dimer may preferably be any one selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 61 to 76.
  • the aptamer dimer according to the present invention has the effect of mimicking the action of insulin more than the monomer form. Specifically, the effect of activating the insulin receptor is large, and this action is similar to the action level of insulin.
  • the pAKT level can be adjusted to be high without increasing the pERK level, thereby producing a therapeutic effect while minimizing the side effects that occur during long-term insulin therapy.
  • the aptamer dimer according to the present invention exhibits an excellent phosphorylation effect on Y960, Y1146, Y1150, Y1151, Y1316, and Y1322 of the insulin receptor, and this action is very similar to the action of insulin. .
  • the aptamer dimer according to the present invention exhibits an excellent phosphorylation effect on Y896 of the insulin receptor substrate compared to the aptamer monomer, and this action is very similar to insulin.
  • the aptamer dimer according to the present invention exhibits superior phosphorylation effect on AKT (for example, S473) compared to the aptamer monomer, and this action is very similar to insulin.
  • the aptamer dimer according to the present invention does not exhibit a phosphorylation effect on ERK compared to the aptamer monomer. Accordingly, side effects caused by ERK activity that occur during long-term insulin therapy can be minimized.
  • the aptamer dimer according to the present invention increases glucose absorption compared to the aptamer monomer, and this action is very similar to insulin.
  • the present invention provides (1) a sequence that specifically binds to the extracellular domain of the insulin receptor including the base sequence of SEQ ID NO: 1; and a linker sequence having a complementary sequence to the linker sequence of the second aptamer linked thereto; (2) an extracellular domain of the insulin receptor comprising the base sequence of SEQ ID NO: 1 A sequence that specifically binds to; and a linker sequence having a complementary sequence to the linker sequence of the first aptamer linked thereto. It provides a pharmaceutical composition comprising an aptamer dimer, including a second aptamer comprising a linker sequence.
  • the present invention provides a first aptamer sequence that specifically binds to the extracellular domain of the insulin receptor including the base sequence of SEQ ID NO: 1; spacer sequence; and a second aptamer sequence that specifically binds to the extracellular domain of the insulin receptor including the base sequence of SEQ ID NO: 1. It provides a pharmaceutical composition comprising an aptamer dimer.
  • the present invention provides (1) a sequence that specifically binds to the extracellular domain of the insulin receptor including the base sequence of SEQ ID NO: 1; and a linker sequence having a complementary sequence to the linker sequence of the second aptamer linked thereto; (2) an extracellular domain of the insulin receptor comprising the base sequence of SEQ ID NO: 1 A sequence that specifically binds to; And a linker sequence having a complementary sequence to the linker sequence of the first aptamer linked thereto; an aptamer dimer comprising a second aptamer including a; and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the present invention provides a first aptamer sequence that specifically binds to the extracellular domain of the insulin receptor including the base sequence of SEQ ID NO: 1; spacer sequence; and an aptamer dimer consisting of a second aptamer sequence that specifically binds to the extracellular domain of the insulin receptor including the base sequence of SEQ ID NO: 1; and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the present invention provides (1) a sequence that specifically binds to the extracellular domain of the insulin receptor including the base sequence of SEQ ID NO: 1; and a linker sequence having a complementary sequence to the linker sequence of the second aptamer linked thereto; (2) an extracellular domain of the insulin receptor comprising the base sequence of SEQ ID NO: 1 A sequence that specifically binds to; and a linker sequence having a complementary sequence to the linker sequence of the first aptamer linked thereto. It provides a pharmaceutical composition for preventing or treating metabolic diseases, including an aptamer dimer, including a second aptamer comprising a linker sequence.
  • the present invention provides a first aptamer sequence that specifically binds to the extracellular domain of the insulin receptor including the base sequence of SEQ ID NO: 1; spacer sequence; And providing a pharmaceutical composition for preventing or treating metabolic diseases comprising an aptamer dimer consisting of a second aptamer sequence that specifically binds to the extracellular domain of the insulin receptor including the base sequence of SEQ ID NO: 1. do.
  • a sequence that specifically binds to the extracellular domain of the insulin receptor including the base sequence of SEQ ID NO: 1; and a linker sequence having a complementary sequence to the linker sequence of the second aptamer linked thereto; (2) an extracellular domain of the insulin receptor comprising the base sequence of SEQ ID NO: 1 A sequence that specifically binds to; and a linker sequence having a complementary sequence to the linker sequence of the first aptamer linked thereto. It relates to a method for preventing or treating metabolic diseases including an aptamer dimer, including a second aptamer comprising a linker sequence.
  • the present invention provides a first aptamer sequence that specifically binds to the extracellular domain of the insulin receptor including the base sequence of SEQ ID NO: 1; spacer sequence; and a method for preventing or treating metabolic diseases comprising an aptamer dimer consisting of a second aptamer sequence that specifically binds to the extracellular domain of the insulin receptor containing the base sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the present invention provides (1) a sequence that specifically binds to the extracellular domain of the insulin receptor including the base sequence of SEQ ID NO: 1 for use in the prevention or treatment of metabolic diseases; and a linker sequence having a complementary sequence to the linker sequence of the second aptamer linked thereto; (2) an extracellular domain of the insulin receptor comprising the base sequence of SEQ ID NO: 1 A sequence that specifically binds to; and a linker sequence having a complementary sequence to the linker sequence of the first aptamer linked thereto. It provides an aptamer dimer, including a second aptamer comprising a.
  • the present invention provides a first aptamer sequence that specifically binds to the extracellular domain of the insulin receptor including the base sequence of SEQ ID NO: 1 for use in the prevention or treatment of metabolic diseases; spacer sequence; and a second aptamer sequence that specifically binds to the extracellular domain of the insulin receptor including the base sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the present invention relates to the manufacture of a drug for the treatment of metabolic diseases using (1) a sequence that specifically binds to the extracellular domain of the insulin receptor including the base sequence of SEQ ID NO: 1; and a linker sequence having a complementary sequence to the linker sequence of the second aptamer linked thereto; (2) an extracellular domain of the insulin receptor comprising the base sequence of SEQ ID NO: 1 A sequence that specifically binds to; and a linker sequence having a complementary sequence to the linker sequence of the first aptamer linked thereto. It provides a use of an aptamer dimer, including a second aptamer comprising a.
  • the present invention provides a first aptamer sequence that specifically binds to the extracellular domain of the insulin receptor containing the base sequence of SEQ ID NO: 1 in the manufacture of a drug for the treatment of metabolic diseases; spacer sequence; and a second aptamer sequence that specifically binds to the extracellular domain of the insulin receptor including the base sequence of SEQ ID NO: 1.
  • Metabolic diseases include, for example, diabetes mellitus (T1D and/or T2DM, such as prediabetes), idiopathic type 1 diabetes (T1D (type 1b)), latent autoimmune diabetes in adults (LADA), and early-onset type 2 diabetes (T2DM).
  • T1D and/or T2DM such as prediabetes
  • T1D type 1b
  • LADA latent autoimmune diabetes in adults
  • T2DM early-onset type 2 diabetes
  • EOD young-onset atypical diabetes
  • MODY adult-onset diabetes in young people
  • malnutrition-related diabetes gestational diabetes, hyperglycemia, insulin resistance, hepatic insulin resistance, impaired glucose tolerance, diabetic neuropathy, diabetic Nephropathy, kidney disease (e.g., acute kidney failure, tubular dysfunction, pro-inflammatory changes to the proximal tubules), diabetic retinopathy, adipocyte dysfunction, visceral fat accumulation, sleep apnea, obesity (e.g., hypothalamic obesity and -genetic obesity) and related comorbidities (e.g., osteoarthritis and urinary incontinence), eating disorders (e.g., binge eating syndrome, bulimia nervosa, and syndromic obesity, such as Prader-Willi syndrome and Bardet-Biddle) (Bardet-Biedl) syndrome), weight gain due to the use of other medications (e.g., from the use of steroids and anti
  • the aptamer dimer according to the present invention is capable of absorbing glucose at the level of insulin.
  • the insulin receptor-binding aptamer dimer according to the present invention can perform glucose uptake as an agonist for the insulin receptor, and does not exhibit cell division or other side effects that may occur due to insulin, and can control the level of insulin. there is. Therefore, the insulin receptor-binding aptamer dimer according to the present invention can be usefully used to control blood sugar without affecting the increase in cancer incidence due to the growth of cancer cells and atherosclerosis due to the growth of vascular smooth muscle cells.
  • the aptamer dimer of the present invention may increase cellular glucose uptake, but may have a low lipolysis inhibition effect. Preferably, it is characterized by increasing glucose absorption and having a lower lipolysis inhibition effect compared to insulin. Inhibition of lipolysis is a representative role of insulin, and when insulin is administered through this activity, it is known to control blood sugar but induce weight gain.
  • the aptamer dimer according to the present invention can effectively increase glucose absorption even with a low lipolysis inhibition effect, and more preferably, can be usefully used to control blood sugar without affecting weight gain due to lipolysis inhibition. Accordingly, the aptamer dimer according to the present invention can be usefully used in the treatment, improvement, and prevention of metabolic diseases.
  • pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to treat a disease with a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level is determined by the patient's sexually transmitted disease, age, type and severity of the disease, and drug. activity, sensitivity to the drug, time of administration, route of administration and excretion rate, duration of treatment, factors including concurrently used drugs, and other factors well known in the medical field.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, and may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents. Additionally, the pharmaceutical composition of the present invention can be administered singly or multiple times. Considering all of the above factors, it is important to administer an amount that can achieve maximum effect with the minimum amount without side effects, and can be easily determined by a person skilled in the art.
  • subject of the present invention includes animals or humans whose symptoms can be improved by administration of the pharmaceutical composition according to the present invention.
  • insulin dysfunction can be effectively prevented and treated.
  • administration means introducing a predetermined substance into a human or animal by any appropriate method, and the route of administration of the therapeutic composition according to the present invention is through any general route as long as it can reach the target tissue. It may be administered orally or parenterally. Additionally, the therapeutic composition according to the present invention can be administered by any device that can move the active ingredient to target cells.
  • the preferred dosage of the pharmaceutical composition according to the present invention varies depending on the patient's condition and weight, degree of disease, drug form, administration route and period, but can be appropriately selected by a person skilled in the art.
  • the pharmaceutical composition may be formulated in various oral or parenteral dosage forms.
  • it can be in any dosage form for oral administration, such as tablets, pills, hard/soft capsules, solutions, suspensions, emulsifiers, syrups, granules, and elixirs.
  • These formulations for oral administration may contain, in addition to the above active ingredients, diluents such as lactose, dextrose, sucrose, mannitol, sorbitol, cellulose and/or glycine, silica, and talc, depending on the typical composition of each formulation. , stearic acid and its magnesium or calcium salts, and/or lubricants such as polyethylene glycol.
  • the dosage form for oral administration when it is a tablet, it may contain a binder such as magnesium aluminum silicate, starch paste, gelatin, tragacanth, methylcellulose, sodium carboxymethylcellulose, and/or polyvinylpyrrolidine. Depending on the condition, it may also contain a disintegrant such as starch, agar, alginic acid or its sodium salt, a boiling mixture and/or an absorbent, a colorant, a flavoring agent, or a sweetener.
  • a binder such as magnesium aluminum silicate, starch paste, gelatin, tragacanth, methylcellulose, sodium carboxymethylcellulose, and/or polyvinylpyrrolidine.
  • a disintegrant such as starch, agar, alginic acid or its sodium salt, a boiling mixture and/or an absorbent, a colorant, a flavoring agent, or a sweetener.
  • examples include solutions, gels, cleansing compositions, tablets for insertion, suppository forms, topical administration such as creams, ointments, dressing solutions, sprays, and other coating agents, solution forms, suspension forms, etc.
  • It may be a liquid formulation such as an emulsion type, and may be a sterilized aqueous solution, non-aqueous solvent, suspension, emulsion, freeze-dried formulation, suppository, cream, ointment, jelly, foam, detergent or insert, preferably a liquid or gel formulation.
  • cleansing compositions, and external skin preparations such as tablets for insertion may be included.
  • the formulation can be prepared by adding solubilizers, emulsifiers, buffers for pH adjustment, etc. to sterilized water.
  • the non-aqueous solvent or suspension may include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, and injectable ester such as ethyl oleate.
  • aptamers are prepared in colloidal drug delivery systems (e.g. liposomes, albumin microspheres, microemulsions, nano-particles and nanocapsules) or macroemulsions, for example by coacervation techniques or interfacial polymerization.
  • colloidal drug delivery systems e.g. liposomes, albumin microspheres, microemulsions, nano-particles and nanocapsules
  • macroemulsions for example by coacervation techniques or interfacial polymerization.
  • microcapsules such as hydroxymethylcellulose or gelatin-microcapsules and poly-(methylmethacrylate) microcapsules, respectively. These techniques are known in the art.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention can be administered in a pharmaceutically effective amount.
  • “Pharmaceutically effective amount” means an amount sufficient to prevent or treat a disease with a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment.
  • the effective dose level can be variously selected by a person skilled in the art depending on factors such as formulation method, patient's condition and weight, patient's gender, age, degree of disease, drug form, administration route and period, excretion rate, reaction sensitivity, etc. there is.
  • the effective amount may vary depending on the route of processing, the use of excipients and the possibility of use with other agents, as will be appreciated by those skilled in the art.
  • the composition of the present invention is generally administered to adults at 0.0001 to 100 mg/kg per day, preferably 0.001 to 100 mg/kg per kg of body weight per day.
  • the above dosage does not limit the scope of the present invention in any way.
  • the pharmaceutical composition may be formulated in a parenteral administration form, in which case it is administered by parenteral administration methods such as subcutaneous injection, intravenous injection, intramuscular injection, or intrathoracic injection.
  • parenteral administration methods such as subcutaneous injection, intravenous injection, intramuscular injection, or intrathoracic injection.
  • the active ingredient i.e., a derivative of formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof
  • the active ingredient is mixed in water with a stabilizer or buffer to prepare a solution or suspension. and such solutions or suspensions can be prepared in unit dosage form in ampoules or vials.
  • the pharmaceutical composition may be sterilized or may further contain auxiliaries such as preservatives, stabilizers, wetting agents or emulsification accelerators, salts and/or buffers for adjusting osmotic pressure, and may further contain other therapeutically useful substances.
  • auxiliaries such as preservatives, stabilizers, wetting agents or emulsification accelerators, salts and/or buffers for adjusting osmotic pressure, and may further contain other therapeutically useful substances.
  • the subject of administration of the pharmaceutical composition of the present invention may be a mammal, including humans, and preferably may be a rodent or a human.
  • the insulin receptor-binding aptamer dimer according to the present invention has a greater effect of activating the insulin receptor compared to the aptamer monomer, and exhibits different phosphorylation characteristics for the insulin receptor (increased phosphorylation sites), and in particular pAKT without increasing the pERK level.
  • phosphorylation characteristics for the insulin receptor increased phosphorylation sites
  • pAKT in particular pAKT without increasing the pERK level.
  • Figure 1 shows the binding structure form of the aptamer dimer (IR-A62) by the complementary sequence according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 2 shows phosphorylation of insulin receptor (Y960, Y1146, Y1150, Y1151, Y1316, Y1322), insulin receptor substrate (Y896), AKT (S473), and ERK according to processing of aptamer dimer according to an embodiment of the present invention. Shows the results of confirming the change.
  • Figure 3A shows the results of confirming the formation of a 6-20bp dimer depending on the linker length by native PAGE
  • Figure 3B shows the results of insulin receptor (Y1150, Y1150) following processing of the aptamer dimer according to an embodiment of the present invention. /Y1151), AKT (S473, T308), and ERK (T202/Y204).
  • Figure 4 shows the results of confirming changes in phosphorylation of insulin receptors (Y1150, Y1150/Y1151) and AKT (S473) according to treatment with aptamer dimer at different concentrations according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 5 shows the results of confirming changes in glucose uptake of the insulin receptor according to treatment with different concentrations of aptamer dimer according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 6 shows the results confirming the increase in the phosphorylation level of Y1150 by treating the aptamer dimer at different concentrations according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 7 shows the results of confirming the increase in the phosphorylation level (pY) of the insulin receptor by treating the aptamer dimer at different concentrations according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 8 shows the results confirming the increase in the phosphorylation level of AKT by treating the aptamer dimer at different concentrations according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 9 shows the results confirming the increase in the phosphorylation level of ERK (T202/Y204) by treating the aptamer dimer according to one embodiment of the present invention at different concentrations.
  • Figure 10 shows the results confirming the increase in the phosphorylation level of ERK by treating the aptamer dimer with the linker sequence modified (2'-OMe modified) according to an embodiment of the present invention at different concentrations (Ins: insulin, A62-M : IR-A62, A62LD1 (2'OMe): SEQ ID NO: 19, A62LD2 (2'OMe): SEQ ID NO: 20, A62-D (2'OMe): Self-assembly (dimer) of SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20) .
  • Figure 11 shows the results of confirming the decomposition rate in serum of the aptamer dimer according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 12 shows the results of confirming changes in phosphorylation of insulin receptors (Y1150/Y1151 cs, Y1150/Y1151 pAb) and AKT (S473) depending on the length of the linker of the aptamer dimer according to an embodiment of the present invention.
  • Aptamer was synthesized by requesting Aptamer Science, Inc. (Pohang, Korea). Specifically, the aptamer used in the experiment was synthesized using the method below. The aptamer was synthesized using the Solid Phase Oligo Synthesis method using Bioautomation's Mermade 12 synthesizer, a stationary phase synthesizer exclusively for nucleic acids. It was synthesized using solid phase b-cyanoethyl phosphoramidite chemistry using an oligonucleotide synthesizer (Bioautomation, Mermade12), and after synthesis, CPG (200nmole synthesis column, 1000A (MM1-1000-)) was synthesized in cleavage solution [t-butylamine:methanol.
  • Solid Phase Oligo Synthesis method using Bioautomation's Mermade 12 synthesizer, a stationary phase synthesizer exclusively for nucleic acids. It was synthesized using solid phase b-cyanoethyl phosphoramidite chemistry using
  • insulin Sigma-Aldrich (St. Louis, MI, USA), Ins), the IR-A62 aptamer (Ori), and two synthesized aptamers were used. Experiments were performed using mixed (LD1+LD2) and single (LD1 or LD2).
  • Antibodies used in Western blot are as follows.
  • Millipore Anti-phospho-insulin receptor (Y1146), anti-phospho-insulin receptor (Y1150) and anti-phospho-tyrosine (4G10) antibodies.
  • Invitrogen (Carlsbad, CA, USA): Anti-phospho-insulin receptor (Y1322), anti-phospho-insulin receptor (Y1316), anti-phospho-insulin receptor (Y1150/Y1151) and anti-phospho-insulin receptor (Y960). Antibodies.
  • Invitrogen Goat anti-rabbit IgG and anti-mouse IgG secondary antibodies conjugated to DyLight 800.
  • TTBS buffer (20mM Tris, 150mM NaCl, 0.1% Tween 20) for 10 min each, incubated with secondary antibodies for 1 h at room temperature, and the membrane was washed three times in TTBS buffer for 10 min each. After further washing, the intensity of specific bands was analyzed using a LI-COR Odyssey infrared imaging system.
  • the length of the complementary sequence was optimized and the single strand (monomer) was confirmed.
  • the dimer was constructed with linker sequences of 6 bp, 8 bp, 10 bp, 12 bp, 14 bp, 16 bp, 18 bp, and 20 bp.
  • the linker sequence used random repeating A, C, T, and G sequences.
  • Linker sequence information for optimizing the length of the complementary sequence is shown in Table 3 below.
  • IR-A62 monomer (A62) of the modified SEQ ID NO: 7 was added to the table above.
  • An aptamer for preparing IR-A62 dimer was designed by connecting the linker of 3, and is shown in Table 4 below.
  • the IR-A62 dimer (IR-A62-D(D1+D2) (6 bp to 20 bp) bp)) treatment
  • the IR-A62 aptamer dimer linked by 6 bp or 8 bp showed a similar level of Y1150 phosphorylation as the IR-A62 aptamer monomer.
  • the IR-A62 aptamer dimer (10 bp to 20 bp) linked with a length of 10 bp or more showed a higher Y1150 phosphorylation level compared to the IR-A62 aptamer monomer.
  • IR-A62 aptamer dimers with a junction length of 6 bp or 8 bp were not formed, and only IR-A62 aptamer dimers with a length of 10 bp or longer were formed. It was confirmed that it was done.
  • Example 2 Similar to Example 2, the hIR-L6 cell line was treated with IR-A62 aptamer monomer (IR-A62-M) or dimer (IR-A62-D (12 bp)) at different concentrations, and then treated as in Example 2 above. Similarly, Western blot was performed to evaluate protein phosphorylation.
  • IR-A62-M IR-A62 aptamer monomer
  • IR-A62-D dimer
  • IR-A62 aptamer monomer A62-M
  • IR-A62 aptamer dimer (12bp) After treating hIR-L6 cells with IR-A62 aptamer monomer (A62-M) and IR-A62 aptamer dimer (12bp) at different concentrations (20, 100, 500nM), After measuring the intracellular level of pIR through Western blotting, IR-A62 aptamer dimer (12 bp) showed higher Y1150 phosphorylation level and pAKT level compared to IR-A62 aptamer monomer (at 500 nM of IR-A62 aptamer monomer). Results appear similar to those for 100 nM IR-A62 aptamer dimer (12 bp).
  • C14-2DG C14 2- Deoxy-D-glucose
  • the glucose uptake effect by 100nM of the IR-A62 aptamer dimer (12bp) was shown to be at the same level as the glucose uptake effect by 500nM of the IR-A62 aptamer monomer, and the IR-A62 pressure
  • the glucose uptake effect by 500nM of the tamer dimer (12bp) showed a higher result than that, and the IR-A62 aptamer dimer (12bp) showed a higher glucose uptake effect than the IR-A62 aptamer monomer.
  • Rat-1/IR cell line was treated with IR-A62 aptamer monomer (IR-A62-M) or dimer (IR-A62-D (20 bp)) at various concentrations, and then insulin receptor The phosphorylation level of Y1150 residue and the overall phosphorylation level were confirmed through Western blot.
  • the IR-A62 aptamer dimer ((IR-A62-D (20 bp)) according to the present invention has a significantly higher Y1150 residue compared to the monomeric aptamer (IR-A62-M). It showed a specific phosphorylation effect. Also, as shown in Figure 7, in terms of overall phosphorylation, the IR-A62 aptamer dimer ((IR-A62-D (20 bp)) according to the present invention is similar to the monomer (IR-A62- It showed excellent phosphorylation efficacy compared to M).
  • the IR-A62 aptamer dimer ((IR-A62-D(20 bp)) according to the present invention exhibits a better insulin receptor phosphorylation effect.
  • Rat-1/IR cell line was treated with IR-A62 aptamer monomer (IR-A62-M) or dimer (IR-A62-D (20 bp)) at various concentrations, and then AKT and The phosphorylation level of ERK was confirmed through Western blot.
  • the level of pAKT was confirmed to be significantly increased by treatment with IR-A62 aptamer dimer.
  • the IR-A62 aptamer dimer can solve the possibility of increased cancer incidence and atherosclerosis, which are concerns about side effects that occur during long-term insulin therapy. Excellent effectiveness is recognized in this regard.
  • Rat-1/IR cell line After treating the Rat-1/IR cell line with insulin, IR-A62, and IR-A62 aptamer dimer (2'-OMe) of SEQ ID NO. 45 and/or SEQ ID NO. 46, the intracellular level of pIR was measured by Western blotting. It was measured through.
  • the IR-A62 aptamer dimer (A62-D(2'OMe); A62-LD1+LD2) in which the 2'-OMe modification is introduced into the connection site has Y1150 and Y1150 of the insulin receptor. It showed an excellent effect on the phosphorylation of /Y1151 and AKT and had a similar effect to that of insulin.
  • IR-A62 (A62-M)
  • A62-LD1 or A62-LD2 a linker sequence bound to it
  • phosphorylation of Y1150, Y1150/Y1151 and AKT are not achieved or only at very low levels. It worked.
  • the dimer form of the aptamer according to the present invention was stably maintained in the blood for more than a certain period of time. Looking at this graphically, it was confirmed that the retention time in the blood was significantly longer than that of the dimer form of Aptamager monomer.
  • Example 10 similarly to Example 2, in order to confirm the phosphorylation level of pY1150/1151 (10C3) and the length of the appropriate complementary sequence, the IR-A62 monomer (A62) of the modified SEQ ID NO: 7 was added to the table above.
  • An aptamer for preparing IR-A62 dimer was designed by connecting the spacer of 5, and is shown in Table 6 below. From the results of Example 10 above, the 2'-OMe modification showed an excellent effect comparable to insulin on the phosphorylation of Y1150, Y1150/Y1151 and AKT of the insulin receptor, and as stability in serum was confirmed, in this design, the spacer The 2'-OMe modification was introduced.

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Abstract

본 발명은 인슐린 수용체 결합 압타머 이량체 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 인슐린 수용체 결합 압타머 이량체는 압타머 단량체 대비 인슐린 수용체를 활성화시키는 효과가 크고 인슐린 수용체에 대한 상이한 인산화 특성(인산화가 일어나는 site가 늘어남)을 나타내며 특히 pERK 레벨을 상승시키지 않으면서 pAKT 레벨은 높게 조절하여 장기간 인슐린 요법시 발생하는 부작용을 최소화하면서 glucose uptake 효능을 증진시켜 치료 효과를 나타내어 당뇨 등의 질환 치료에 우수한 효과를 나타낸다.

Description

인슐린 수용체 결합 압타머 이량체 및 이의 용도
본 발명은 인슐린 수용체 결합 압타머 이량체 및 이의 용도에 관한 것이다.
인슐린 수용체(IR, Insulin receptor)는 티로신 카이네이즈 수용체로서, 인슐린, IGF-1 또는 IGF-2에 의해 활성화되는 막관통 수용체(transmembrane receptor)이다. 인슐린 결합부를 포함하는 α사슬(719잔기) 2개와 막 관통부를 포함하는 β사슬(620잔기) 2개가 S-S결합으로 연결된 4합체 구조로 되어 있다. 인슐린이 수용체와 결합하면, β사슬의 세포내 영역에 있는 티로신 키나아제 활성이 활발해지고, 수용체 티로신 잔기의 인산화가 일어난다. 이러한 자기 인산화가 다른 단백질의 인산화를 일으킨다.
인슐린 수용체 (IR)에 대한 인슐린 결합은 글루코스 항상성에 있어 필수적인 역할을 수행하는 신호 전달 캐스케이드를 개시한다. 당뇨병을 이겨내기 위한 핵심적 단계는 리간드-의존성 IR 신호전달을 이해하여, IR을 조절하는 새로운 약리학적 작용제를 개발하는 것이다. 그러나 수십년에 걸친 광범위한 노력에도 불구하고, 인슐린의 결합에 의한 IR 활성화의 분자 메카니즘은 명확하게 밝혀지지 않았다.
수용체 티로신 키나제 슈퍼패밀리의 구성원인 IR은 디설파이드 결합에 의해 공유 연결된 2개의 α 및 2개의 β 서브유닛 (α2β2)으로 이루어진 당단백질이다. IR의 세포외 도메인 (또한 엑토도메인으로 지칭됨)은 2개의 α 서브유닛과, 2개의 β 서브유닛의 N-말단 절편을 포함하는 반면, 막횡단 도메인 및 세포질 티로신 키나제 (TK) 도메인은 β 서브유닛의 C-말단 절편을 포함한다. 인슐린-결합 결정기는 α 쇄의 류신-풍부 반복부 도메인 L1 및 L2, 개재 시스테인-풍부 (CR) 도메인, 및 3종의 피브로넥틴 제III형 도메인, 즉 Fn0, Fn1, 및 Fn2로 이루어진 엑토도메인 내에 전부 위치한다.
인슐린 자체는 X선 결정학에 의해 구조적으로 밝혀진 첫 번째 펩티드 호르몬이고, 지난 50년 동안 광범위한 구조적 연구의 대상이었으나, 인슐린에 의한 IR 활성화의 분자 메카니즘은 아직 밝혀지지 않았다. IR 상의 2개의 인슐린 결합 부위인 부위 1 및 2가 존재하는데, IR의 1 개의 단량체 상의 각각의 부위 1은 제2 단량체 상의 부위 2'에 근접하고, 부위 1에 대한 인슐린의 결합은 부위 2'에 대한 후속 결합을 유도하여 IR 엑토도메인의 입체형태적 변화를 일으키고, 이에 따라 2개의 세포간 TK 도메인 사이의 거리가 감소하여 자가인산화가 용이해진다는 것을 시사한다.
오늘날 다양한 종류의 인슐린 유도체들이 당뇨병 치료를 위해 개발되어 사용되고 있다. 인슐린은 가장 효과적인 혈당강하제이기 때문에 당뇨병 환자의 혈당을 정상적으로 조절하기 위해 널리 사용되지만, 장기간 고농도로 투여되는 인슐린은 세포 분열을 활성화시킴으로써 암세포의 성장에 의한 암발생률 증가와 혈관 평활근 세포의 성장에 의한 죽상동맥경화(Atherosclerosis)와 같은 당뇨합병증을 악화시키는 것으로 알려져 있다. 이를 해결하기 위해서 항체, 펩타이드 등을 사용한 인공적인 리간드들이 개발되었지만 낮은 활성과 생체 내에서 불안정한 약물동태성(Pharmacokinetics) 등으로 인해 여전히 많은 기술 개발이 요구된다.
한편, 압타머는 기능적으로 저해성 압타머에 초점을 두어 연구개발이 많이 이루어진바 있다. 그러나, 최근들어 압타머-단백질 결합이 단백질의 적절한 구조 변화를 유도시킬 수 있다면 단백질 기능의 활성화가 가능해질 것이라 여겨지고 이에 따라 이에 대한 연구개발이 활발하게 진행되고 있다. 다만, 압타머 특성상 인체 내에서 분해가 다소 빠르게 일어날 수 있고 이에 따라 투여되는 양이 많아야 하는 등의 일부 인체 내 투여 상의 부족한 점이 존재하여, 이에 대한 개선이 필요하다.
이러한 배경하에, 본 발명자들은 신규의 인슐린 수용체 결합 압타머 이량체를 제조하고, 이를 통하여 압타머의 활성을 크게 증가시켰다. 또한, 인슐린과 같은 혈당강하효과는 최대한 비슷하게 유지하면서, 세포분열을 촉진시키는 ERK에 대한 인산화를 최소화하였다. 그 결과, 약물의 부작용을 최소화하는 신규 이량체를 개발함으로써, 본 발명을 완성하였다.
이에 본 발명의 목적은 (1) 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 인슐린 수용체의 세포 외 영역(Extracellular domain)에 특이적으로 결합하는 서열; 및 이에 연결된 제2압타머의 링커 서열에 대하여 상보적 서열을 가지는 링커 서열;을 포함하는 제1 압타머, (2) 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 인슐린 수용체의 세포 외 영역(Extracellular domain)에 특이적으로 결합하는 서열; 및 이에 연결된 제1압타머의 링커 서열에 대하여 상보적 서열을 가지는 링커 서열;을 포함하는 제2 압타머를 포함하는, 압타머 이량체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 인슐린 수용체의 세포 외 영역(Extracellular domain)에 특이적으로 결합하는 제1압타머 서열; 스페이서(spacer) 서열; 및 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 인슐린 수용체의 세포 외 영역(Extracellular domain)에 특이적으로 결합하는 제2압타머 서열로 이루어진 압타머 이량체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 압타머 이량체의 용도를 제공하는 것이다.
상기 목적을 수행하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 (1) 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 인슐린 수용체의 세포 외 영역(Extracellular domain)에 특이적으로 결합하는 서열; 및 이에 연결된 제2압타머의 링커 서열에 대하여 상보적 서열을 가지는 링커 서열;을 포함하는 제1 압타머, (2) 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 인슐린 수용체의 세포 외 영역(Extracellular domain)에 특이적으로 결합하는 서열; 및 이에 연결된 제1압타머의 링커 서열에 대하여 상보적 서열을 가지는 링커 서열;을 포함하는 제2 압타머를 포함하는, 압타머 이량체를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 인슐린 수용체의 세포 외 영역(Extracellular domain)에 특이적으로 결합하는 제1압타머 서열; 스페이서(spacer) 서열; 및 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 인슐린 수용체의 세포 외 영역(Extracellular domain)에 특이적으로 결합하는 제2압타머 서열로 이루어진 압타머 이량체를 제공한다.
"압타머(aptamer)"란, 특이적 3차원 형성을 형성하는 15-40개의 단일가닥 올리고뉴클레오티드로서, 스템 루프(stem loop) 구조를 가지며, 특정 분자에 특이적으로 결합하는 성질이 있다. 압타머는 화학적으로 합성이 용이하며, 화학적 변형이 쉽고 열에 안정적이면서 타겟에 대한 특이도가 매우 높은 화합물이다.
압타머의 서열은 SELEX(selective evolution of ligands by exponential enrichment)란 방법으로 발굴할 수 있으며, 이미 수백 종의 압타머 서열이 공개되어 있다. 압타머는 특이적으로 타겟과 결합한다는 점에서 흔히 항체와 비교되기도 하지만, 면역반응이 없다. 저분자 유기물, 펩타이드, 막 단백질까지 다양한 표적분자에 결합할 수 있는 많은 압타머들이 계속 해서 발굴되어 왔다. 압타머는 고유의 높은 친화성(보통 pM 수준)과 특이성으로 표적분자에 결합할 수 있다는 특성 때문에 자주 단일 항체와 비교가 되고, 특별히 'chemical antibody'라 불리는 만큼 대체항체로서의 가능성도 매우 높다. 압타머는 항체에 비해 안정성이 매우 높다. 단백질이나 항체 의약품의 경우 실온에서 보관이나 운반이 불가능하지만 압타머는 가능하고, 심지어 멸균 후에도 기능을 유지할 수 있다.
본 발명의 용어 "압타머 이량체"란 적합한 중합체 모이어티에 의해 연결된 2개의 압타머를 포함하는 구조를 의미한다. 본 발명에 따르면, 압타머 이량체는 인슐린 수용체의 세포 외 영역(Extracellular domain)에 특이적으로 결합하는 특성을 나타내는 1종의 압타머 2개를 상보적 염기서열을 가지는 링커를 통하여 결합 및/또는 인슐린 수용체의 세포 외 영역(Extracellular domain)에 특이적으로 결합하는 특성을 나타내는 1종의 압타머 2개 이상을 스페이서(spacer)를 통하여 단일가닥의 압타머로 결합한 형태를 의미한다. 이러한 압타머 이량체는 인슐린 수용체에 대한 작용제로서의 기능을 한다.
본 발명에 있어서, 제1압타머 및 제2압타머는 압타머 서열의 구성으로 서열번호 1의 염기서열을 포함하고, 인슐린 수용체의 세포 외 영역(Extracellular domain)에 특이적으로 결합할 수 있다.
링커 또는 스페이서 서열을 통한 압타머 이량체의 구성은 5' 방향에서 3' 방향으로 서열번호 1의 서열이 구성되는 경우라면 이의 형태에 제한 사항 없이 동등 수준 이상의 효과를 나타낼 수 있다.
구체적으로, 링커를 통하여 압타머 이량체를 구성하는 경우 상보적 서열을 통하여 2개의 서열번호 1의 압타머 영역이 이량체 내에 포함될 수 있다. 이러할 경우, 상보적 서열로 인한 서열 구조를 예시적으로 나타낸 도 1과 같이 구성할 수 있다. 또한, 스페이서 서열을 통해 제1압타머 및 제2압타머를 이어서 연결하는 경우, 5'-3'방향으로 2개의 연속되는 서열번호 1의 압타머 서열을 포함하는 것일 수 있다.
즉, 각각의 제1압타머 및 제2압타머가 작용하는 방식은 링커 또는 스페이서에 의해 연결되는 형태 또는 방식에 국한되지 않는다.
상기 서열번호 1의 염기서열은 인슐린 수용체의 세포 외 영역에 특이적으로 결합하고, 인슐린 수용체의 인산화를 촉진하며, 인슐린과 유사하게 인슐린 수용체에 대해 특이적인 친화도를 가지고 결합할 수 있는 압타머로 작용할 수 있다.
상기 서열번호 1의 염기서열은 인슐린 수용체에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하고, 데옥시리보스 우라실의 5번 위치가 소수성 작용기로 치환되어 변형된 염기를 포함할 수 있다.
상기 변형된 염기 이외의 본 발명의 압타머에 사용되는 염기는 특별한 언급이 없는 한, A, G, C, T, 및 이들의 deoxy 형태의 염기들로 이루어진 군에서 선택된 것이며, 이의 변형의 포함에 대해서는 이를 구체적 기재로 언급한다.
상기 압타머의 결합력과 특이성을 높이기 위하여, 상기 압타머에 포함된 뉴클레오타이드의 염기의 5번 위치가 소수성 작용기로 치환된 것일 수 있다. 예를 들면 가변영역의 티민(Thymine)염기의 5번 위치가 소수성 작용기로 치환되어 변형된 데옥시리보스 우라실, 예컨대 5-[N-(1-naphthylmethyl)carboxamide]-2’-deoxyuridine (NapdU) 또는 5-(N-벤질카복시아미드)-2'-데옥시우리딘을 가변영역에 포함한다. 예를 들어, 이에 한정되는 것은 아니나, 1, 2, 3, 4, 5, 6 7, 8, 9, 10개를 포함하며, 바람직하게 5, 6, 7, 8, 또는 9개를 포함한다. 상기 소수성 작용기는 나프틸기, 벤질기, 피롤벤질기, 이소부틸기, 또는 트립토판을 포함할 수 있고, 더욱 바람직하게는 상기 소수성 작용기는 나프틸기 또는 벤질기이다. 상기 나프틸기로 치환되어 변형된 데옥시리보스 우라실을 아래 화학식 1에, 벤질기로 치환되어 변형된 데옥시리보스 우라실을 아래 화학식 2에 표시하였다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2022009443-appb-I000001
[화학식 2]
Figure PCTKR2022009443-appb-I000002
본 발명에 있어서, 서열번호 1의 염기서열(IR-A62)은 아래와 같다:
서열번호 1:　CANNACGCAN GAGNCNAGAN CCGN
상기 서열에 있어서, N은 변형된 염기로, 상기 화학식 1 또는 2로 언급된 바와 같이 소수성 작용기를 나프틸기 또는 벤질기 중 어느 하나를 가질 수 있다.
구체적으로, N기는 5번째 탄소 위치가 소수성 작용기로 치환된 데옥시리보스 우라실일 수 있다. 보다 구체적으로, 나프틸-우라실 뉴클레오티드 (5-(N-1-나프틸메틸카복시아미드)-2'-데옥시우리딘, Naphthyl-dU, NapdU) 또는 벤질-우라실 뉴클레오티드 (5-(N-벤질카복시아미드)-2'-데옥시우리딘, Benzyl-dU, BndU) 중 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
상기 언급된, C, A, G는 변형되거나 비변형된 염기일 수 있다.
예를 들어, 변형된 C는 뉴클레오티드의 2번째 탄소 위치에 메톡시기(2-O-Me, 2-O-Methoxy-DNA) 도입; 또는 뉴클레오티드의 2번째 탄소 위치에 불소(2-F, 2-Fluorine-DNA)가 도입의 변형을 포함할 수 있다.
구체적으로, 변형된 G는 뉴클레오티드의 2번째 탄소 위치에 메톡시기(2-O-Me, 2-O-Methoxy-DNA) 도입; 또는 뉴클레오티드의 2번째 탄소 위치에 불소(2-F, 2-Fluorine-DNA)가 도입의 변형을 포함할 수 있다.
구체적으로, 변형된 A는 뉴클레오티드의 2번째 탄소 위치에 메톡시기(2-O-Me, 2-O-Methoxy-DNA) 도입; 또는 뉴클레오티드의 2번째 탄소 위치에 불소(2-F, 2-Fluorine-DNA)가 도입의 변형을 포함할 수 있다.
상기 서열번호 1은 서열번호 2의 염기서열에 있어서 22 내지 46번째 서열에 해당한다.
서열번호 2:　TATGAGTGAC CGTCCGCCTG G CANNACGCA NGAGNCNAGA NCCGN CAGAC CNAAGGCNNC　AGCCACACCA CCAGCCAAA
상기 서열번호 1의 염기서열은 내부의 뉴클레오타이드로 구성된 스템-루프 구조를 형성할 수 있다. 상기 스템-루프 구조는 1 또는 2개의 스템-루프 구조를 형성할 수 있다. 이러한 서열번호 1의 염기서열은 스템-루프 구조를 형성하는데 필수적인 서열에 해당하며, 이러한 서열은 인슐린 수용체에 특이적으로 결합하는 특징을 가진다.
이에 따라, 본 발명에서 제1압타머 및 제2압타머는 서열번호 1의 염기서열을 필수적으로 포함한다. 보다 구체적으로, 서열번호 1은 서열번호 2의 염기서열에 있어서 22 내지 46번째 서열을 포함하면서 연속되는 25개 내지 79개의 염기서열을 더 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로, 서열번호 2의 염기서열 22 내지 46번째 서열을 포함하면서 연속되는 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 60개, 70개, 또는 79개의 연속된 서열일 수 있다.
본원 발명에서 서열을 포함하는 것은 서열을 포함하는 것을 의미할 수 있고, 이들로 필수적으로 이루어진 것을 의미할 수도 있으며, 이들로 이루어지는 것을 의미할 수 있다.
또한, 상기 서열번호 1 및/또는 서열번호 2의 N의 위치 이외의 임의의 염기 서열에서, 혈청 내 안정성을 증진시키거나 신장 클리어런스(renal clearance)를 조절하기 위하여, 5' 말단, 3' 말단, 중간 또는 양 말단에 위치한 염기를 적어도 하나 이상 변형시킬 수 있다. 상기 변형은 5' 말단, 3' 말단, 중간 또는 양 말단에 PEG(polyethylene glycol), 비오틴, idT(inverted deoxythymidine), LNA(Locked Nucleic Acid), 2'-메톡시 뉴클레오사이드, 2'-아미노 뉴클레오사이드, 2'F-뉴클레오사이드, 아민 링커, 티올 링커, 및 콜레스테롤 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 결합되어 변형된 것일 수 있다. 2'-메톡시 뉴클레오사이드, 2'-아미노 뉴클레오사이드 또는 2'F-뉴클레오사이드는 압타머에 포함된 염기에 결합하여 변형된 염기를 제공함으로써 뉴클레이즈 저항성(nuclease resistance)을 부여한다.
바람직하게, 뉴클라아제 저항성을 확보하고 인체 내 투여 시 안정성을 위하여 변형된 염기를 더 포함할 수 있다. 이러한 변형된 염기는 바람직하게, 임의의 A, C, T, 또는 G의 염기에 대하여 2’-OMe(메톡시) 및/또는 2’-F(플루오르)의 치환일 수 있다. 즉, 상기 서열번호 1 및/또는 서열번호 2의 A, C, T 또는 G의 염기에 대하여 적어도 하나 이상의 2’-OMe(메톡시) 또는 2’-F(플루오르)의 변형된 염기 치환을 가지는 것일 수 있다.
한편, 상기한 염기의 변형에 대한 이해를 돕기 위하여, 서열번호 1의 염기서열을 중심으로 하는 임의의 변이 서열의 일예시를 아래 서열번호 3 내지 11에 나열하였으나, 이러한 서열은 본 발명의 일 예시적 서열에 불과할 뿐 이에 한정되는 것은 아니다.
[표 1]
Figure PCTKR2022009443-appb-I000003
밑줄의 굵은 표시 N: 화학식 2 소수성 작용기(벤질카르복시아미드)굵은 기울임 표시 N: 화학식 1 소수성 작용기( 나프틸메틸카르복시아미드 )
밑줄친 A, G, C: 2‘ 위치에서 플루오로(2’-F)로 염기 개질
기울임 표시 A, G, C: 2‘ 위치에서 메톡시(2’-Ome)로 염기 개질
이에 따라, 본원 발명에 따른 임의의 실시예는 위 언급된 임의의 서열을 포함하는 변이 구성을 포함할 수 있다.
예를 들어, (1) 서열번호 1, 바람직하게 서열번호 3 내지 11로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 염기서열을 포함하는 인슐린 수용체의 세포 외 영역(Extracellular domain)에 특이적으로 결합하는 서열; 및 이에 연결된 제2압타머의 링커 서열에 대하여 상보적 서열을 가지는 링커 서열;을 포함하는 제1 압타머, (2) 서열번호 1, 바람직하게 서열번호 3 내지 11로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 염기서열을 포함하는 인슐린 수용체의 세포 외 영역(Extracellular domain)에 특이적으로 결합하는 서열; 및 이에 연결된 제1압타머의 링커 서열에 대하여 상보적 서열을 가지는 링커 서열;을 포함하는 제2 압타머를 포함하는, 압타머 이량체를 일 수 있다.
또한, 서열번호 1의 염기서열, 바람직하게 서열번호 3 내지 11로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 염기서열을 포함하는 인슐린 수용체의 세포 외 영역(Extracellular domain)에 특이적으로 결합하는 제1압타머 서열; 스페이서(spacer) 서열; 및 서열번호 1, 바람직하게 서열번호 3 내지 11로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 염기서열을 포함하는 인슐린 수용체의 세포 외 영역(Extracellular domain)에 특이적으로 결합하는 제2압타머 서열로 이루어진 압타머 이량체를 제공하는 것이다.
위 언급된 바와 같이, 본 발명에 따른 결합력과 특이성을 높이기 위한 구조, 혈청 내 안정성을 증진시키거나 신장 클리어런스(renal clearance)를 조절하기 위한 서열번호 1의 염기서열에 대한 임의의 변형이 본 발명의 범주 내에 포함된다.
상기 변형된 염기의 개수는 4 내지 60개, 바람직하게는 6 내지 50개일 수 있다.
본 발명에 따른 압타머 이량체가 인슐린 수용체와 결합하면, 수용체 티로신 잔기가 인산화되고, 인슐린 수용체의 인산화는 신호전달을 통해 지방세포와 근육에서 glucose transporter 4 (GLUT4)의 이동을 조절하여 포도당 흡수를 증가시킨다. 이러한 인슐린 수용체에 의한 대사기능은 주로 IRS-AKT 경로에 의해 조절되며, 또한 인슐린 신호전달 과정에서 Phosphoinositide 3-kinase (PI3K)는 Protein kinase B (AKT)의 인산화에 중요한 역할을 한다.
서열번호 1 염기서열을 단독으로만 포함하는 하나의 압타머는 인슐린 수용체와 결합능이 존재하나 인슐린의 기능을 충분히 Mimic하지 못하고 효과 측면에서도 인슐린에 비해 떨어지기 때문에 인체 내에 과량투여되어야 하는 문제가 존재한다.
이에, 본 발명에서는 서열번호 1의 염기서열을 중심으로 하여 이량체를 제조하고 이를 투여하는 경우 인슐린의 기능을 거의 동일하게 mimic하면서 ERK인산화 경로에 영향을 미치지 않아 세포 분열 촉진으로 인하여 발생할 수 있는 암세포의 성장에 의한 암발생률 증가와 혈관 평활근 세포의 성장에 의한 죽상동맥경화와 같은 당뇨병합증 악화 등의 부작용 없이 우수한 혈당의 조절이 가능함을 확인하였다.
특히, 이량체의 구조로 적합한 형태를 가지기 위해서 상보적 염기서열을 통한 링커 서열을 통하여 이를 연결함으로써 우수한 작용을 나타낼 수 있다. 구체적으로, 핵산물질로만 이루어진 이량체 혹은 단일가닥 이량체에 비해 본 발명의 상보적 염기서열로 연결된 이량체는 합성길이가 짧아 대용량 합성 시 결과물의 순도 및 합성효율이 높고, 합성비용을 절감하는 효과가 있다.
이에 따라, 본 발명에 따른 제1압타머는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 인슐린 수용체의 세포 외 영역(Extracellular domain)에 특이적으로 결합하는 서열에 연결된 제2압타머의 링커 서열에 대하여 상보적 서열을 가지는 링커 서열;을 포함한다. 제2압타머는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 인슐린 수용체의 세포 외 영역(Extracellular domain)에 특이적으로 결합하는 서열에 연결된 제1압타머의 링커 서열에 대하여 상보적 서열을 가지는 링커 서열;을 포함한다.
본 발명에 있어서, 제1압타머는 바람직하게는 서열번호 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40 및 42로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명에 있어서, 제2압타머는 바람직하게는 서열번호 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41 및 43 로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명에 있어서, 압타머 이량체는 바람직하게는 서열번호 28 및 29, 서열번호 30 및 31, 서열번호 32 및 33, 서열번호 34 및 35, 서열번호 36 및 37, 서열번호 38 및 39, 서열번호 40 및 41 및 서열번호 42 및 43 로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제1압타머 및 제2압타머를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 이량체의 형성은 상보적 핵산 서열을 통하여 2개의 압타머를 결합시킨 형태를 구현하여 이량체 형태를 구현 및/또는 스페이서 서열을 통하여 2개의 압타머를 결합시킨 형태를 구현하여 단일 가닥 형태를 구현한다.
"링커 서열"은 2개의 분자 또는 모이어티를 연결하는 화학적 모이어티를 지칭한다. 본 발명의 링커 서열은 핵산 링커에 해당하며, 제1압타머와 제2압타머에 연결되어 서로의 상보적으로 작용하는 염기 서열을 통하여 이중 결합을 형성하여 이량체를 구성한다.
이러한 이량체 형태의 일예시를 도 1에 나타내었다. 도 1에서 확인할 수 있는 바와 같이, 상보적인 링커 서열의 결합을 통하여 제1압타머 및 제2압타머가 연결된 이량체 형태를 가질 수 있다.
이러한 상보적 서열을 가지는 링커를 통해서 인슐린 수용체의 세포 외 영역(Extracellular domain)에 특이적으로 결합하는 서열번호 1의 서열을 포함하는 제1압타머 및 제2압타머는 서로 동일한 활성 부위 서열을 가질 수도 있고 상이한 서열을 가질 수도 있다. 즉, 2개의 압타머에 있어서 인슐린 수용체의 세포 외 영역(Extracellular domain)에 특이적으로 결합하는 서열은 서로 동일하거나 상이할 수 있다.
위 상보적 서열을 가지는 링커의 링커 서열은 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60 개의 서열일 수 있으며, 바람직하게, 5 내지 30 개, 10개 내지 30개, 대략 15 내지 25개의 염기 서열, 보다 바람직하게 약 20여개의 염기 서열을 가질 수 있다.
링커 서열은 뉴클라아제 저항성을 확보하고 인체 내 투여 시 안정성을 위하여 변형된 염기를 더 포함할 수 있다. 이러한 변형된 염기는 바람직하게, 임의의 A, C, T, 또는 G의 염기에 대하여 2’-OMe(메톡시) 및/또는 2’-F(플루오르)의 치환일 수 있으며, L-form DNA 또는 LNA (Locked DNA)일 수 있다. 즉, 상기 링커 서열의 염기서열은 A, C, T 또는 G의 염기에 대하여 적어도 하나 이상의 2’-OMe(메톡시) 또는 2’-F(플루오르)의 변형된 염기 치환을 가지는 것일 수 있으며, 링커 서열의 L-form DNA 또는 LNA (Locked DNA)의 형태를 이용할 수 있다.
본 발명의 링커 서열은 바람직하게는 서열번호 12 내지 27로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 서열로 이루어진 것일 수 있다.
또한 필요에 따라 이러한 링커 서열과 인슐린 수용체에 결합하는 서열번호 1의 서열 사이에 적절 공간을 제공하기 위한 스페이서 서열을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 상보적 결합을 형성하는 링커와 인슐린 수용체 사이에 공간을 제공하기 위한 서열은 폴리T가 바람직하며, 대략 0개, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 수준으로 링커와 인슐린 수용체 사이에 포함될 수 있다.
따라서, 제1압타머는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 인슐린 수용체의 세포 외 영역(Extracellular domain)에 특이적으로 결합하는 서열과 상기 링커 서열 사이에 스페이서 서열을 추가로 포함할 수 있다. 제2압타머는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 인슐린 수용체의 세포 외 영역(Extracellular domain)에 특이적으로 결합하는 서열과 상기 링커 서열 사이에 스페이서 서열을 추가로 포함할 수 있다.
또한 본 발명에서 스페이서 서열은 2종의 압타머 및/또는 1종의 압타머 2개 이상을 결합하여 단일가닥을 생성하기 위한 결합제로써 이용될 수 있다.
즉, 본원 발명은 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 인슐린 수용체의 세포 외 영역(Extracellular domain)에 특이적으로 결합하는 제1압타머 서열; 스페이서(spacer) 서열; 및 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 인슐린 수용체의 세포 외 영역(Extracellular domain)에 특이적으로 결합하는 제2압타머 서열로 이루어진 압타머 이량체를 제공한다.
구체적으로, 본 발명의 압타머 이량체는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 인슐린 수용체의 세포 외 영역(Extracellular domain)에 특이적으로 결합하는 제1압타머 서열; 스페이서(spacer) 서열; 및 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 인슐린 수용체의 세포 외 영역(Extracellular domain)에 특이적으로 결합하는 제2압타머 서열로 이루어진 것일 수 있다.
이러한 스페이서 서열은 폴리 A 단편, 폴리 T 단편, 폴리 G 단편, 폴리 C 단편, 포스포라미디트(Phosphoramidite) 단편, 압타머 서열에 간섭이 없는 랜덤 올리고뉴클레오티드 서열, ethylene glycol 단편 가 바람직하며, 이 단편의 길이는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 바와 같이 달라질 수 있다. 바람직하게 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30개의 폴리 T단편 서열일 수 있다.
스페이서 서열은 뉴클라아제 저항성을 확보하고 인체 내 투여 시 안정성을 위하여 변형된 염기를 더 포함할 수 있다. 이러한 변형된 염기는 바람직하게, 임의의 A, C, T, 또는 G의 염기에 대하여 2’-OMe(메톡시) 및/또는 2’-F(플루오르)의 치환일 수 있으며, L-form DNA 또는 LNA (Locked DNA)일 수 있다. 즉, 상기 링커 서열의 염기서열은 A, C, T 또는 G의 염기에 대하여 적어도 하나 이상의 2’-OMe(메톡시) 또는 2’-F(플루오르)의 변형된 염기 치환을 가지는 것일 수 있으며, 링커 서열의 L-form DNA 또는 LNA (Locked DNA)의 형태를 이용할 수 있다.
본 발명의 스페이서 서열은 바람직하게는 서열번호 46 내지 60으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 서열로 이루어진 것일 수 있다.
이에 본 발명은 (1) 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 인슐린 수용체의 세포 외 영역(Extracellular domain)에 특이적으로 결합하는 서열; 및 이에 연결된 제2압타머의 링커 서열에 대하여 상보적 서열을 가지는 링커 서열;을 포함하는 제1 압타머, (2) 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 인슐린 수용체의 세포 외 영역(Extracellular domain)에 특이적으로 결합하는 서열; 및 이에 연결된 제1압타머의 링커 서열에 대하여 상보적 서열을 가지는 링커 서열;을 포함하는 제2 압타머를 포함하는, 압타머 이량체를 제공한다.
또한, 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 인슐린 수용체의 세포 외 영역(Extracellular domain)에 특이적으로 결합하는 제1압타머 서열; 스페이서(spacer) 서열; 및 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 인슐린 수용체의 세포 외 영역(Extracellular domain)에 특이적으로 결합하는 제2압타머 서열로 이루어진 압타머 이량체를 제공한다.
본 발명에 있어서, 이러한 압타머 이량체는 바람직하게는 서열번호 61 내지 76으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.
본 발명에 의한 압타머 이량체는 단량체 형태와 대비하여 인슐린의 작용을 더 mimic할 수 있는 효과를 나타낸다. 구체적으로, 인슐린 수용체를 활성화시키는 효과가 크고, 이러한 작용은 인슐린의 작용 수준과 유사하다. 또한, pERK 레벨을 상승시키지 않으면서 pAKT 레벨은 높게 조절하여 장기간 인슐린 요법시 발생하는 부작용을 최소화하면서 치료 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명의 일실시양태에 따르면, 본 발명에 따른 압타머 이량체는 인슐린 수용체의 Y960, Y1146, Y1150, Y1151, Y1316, Y1322에 대한 우수한 인산화 효과를 나타내며, 이러한 작용은 인슐린의 작용과 매우 유사하다.
본 발명의 일실시양태에 따르면, 본 발명에 따른 압타머 이량체는 압타머 단량체 대비 인슐린 수용체 기질의 Y896에 대한 우수한 인산화 효과를 나타내며, 이러한 작용은 인슐린과 매우 유사하다.
본 발명의 일실시양태에 따르면, 본 발명에 따른 압타머 이량체는 압타머 단량체 대비 AKT(일 예시로 S473)에 대한 우수한 인산화 효능을 나타내며, 이러한 작용은 인슐린과 매우 유사하다.
본 발명의 일실양태에 따르면, 본 발명에 따른 압타머 이량체는 압타머 단량체 대비 ERK에 대하여 인산화 작용을 나타내지 않는다. 이에 따라, 장기간 인슐린 요법시 발생하는, 즉 ERK 활성에 따른 부작용을 최소화할 수 있다.
본 발명의 일실양태에 따르면, 본 발명에 따른 압타머 이량체는 압타머 단량체 대비 포도당 흡수를 증가시키며, 이러한 작용은 인슐린과 매우 유사하다.
또한, 이량체 형성으로 인한 우수한 혈청 내 안정성을 통하여, 압타머가 가질 수 있는 인체 내 반감기 문제를 최소화하여 치료제로의 이용 가능성을 최대화하였다.
상기 목적을 수행하기 위한 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 (1) 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 인슐린 수용체의 세포 외 영역(Extracellular domain)에 특이적으로 결합하는 서열; 및 이에 연결된 제2압타머의 링커 서열에 대하여 상보적 서열을 가지는 링커 서열;을 포함하는 제1 압타머, (2) 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 인슐린 수용체의 세포 외 영역(Extracellular domain)에 특이적으로 결합하는 서열; 및 이에 연결된 제1압타머의 링커 서열에 대하여 상보적 서열을 가지는 링커 서열;을 포함하는 제2 압타머를 포함하는, 압타머 이량체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 인슐린 수용체의 세포 외 영역(Extracellular domain)에 특이적으로 결합하는 제1압타머 서열; 스페이서(spacer) 서열; 및 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 인슐린 수용체의 세포 외 영역(Extracellular domain)에 특이적으로 결합하는 제2압타머 서열로 이루어진 압타머 이량체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
상기 목적을 수행하기 위한 다른 하나의 양태로서 본 발명은 (1) 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 인슐린 수용체의 세포 외 영역(Extracellular domain)에 특이적으로 결합하는 서열; 및 이에 연결된 제2압타머의 링커 서열에 대하여 상보적 서열을 가지는 링커 서열;을 포함하는 제1 압타머, (2) 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 인슐린 수용체의 세포 외 영역(Extracellular domain)에 특이적으로 결합하는 서열; 및 이에 연결된 제1압타머의 링커 서열에 대하여 상보적 서열을 가지는 링커 서열;을 포함하는 제2 압타머를 포함하는, 압타머 이량체; 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 인슐린 수용체의 세포 외 영역(Extracellular domain)에 특이적으로 결합하는 제1압타머 서열; 스페이서(spacer) 서열; 및 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 인슐린 수용체의 세포 외 영역(Extracellular domain)에 특이적으로 결합하는 제2압타머 서열로 이루어진 압타머 이량체; 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
상기 목적을 수행하기 위한 다른 하나의 양태로서 본 발명은 (1) 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 인슐린 수용체의 세포 외 영역(Extracellular domain)에 특이적으로 결합하는 서열; 및 이에 연결된 제2압타머의 링커 서열에 대하여 상보적 서열을 가지는 링커 서열;을 포함하는 제1 압타머, (2) 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 인슐린 수용체의 세포 외 영역(Extracellular domain)에 특이적으로 결합하는 서열; 및 이에 연결된 제1압타머의 링커 서열에 대하여 상보적 서열을 가지는 링커 서열;을 포함하는 제2 압타머를 포함하는, 압타머 이량체를 포함하는 대사성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 인슐린 수용체의 세포 외 영역(Extracellular domain)에 특이적으로 결합하는 제1압타머 서열; 스페이서(spacer) 서열; 및 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 인슐린 수용체의 세포 외 영역(Extracellular domain)에 특이적으로 결합하는 제2압타머 서열로 이루어진 압타머 이량체를 포함하는 대사성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, (1) 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 인슐린 수용체의 세포 외 영역(Extracellular domain)에 특이적으로 결합하는 서열; 및 이에 연결된 제2압타머의 링커 서열에 대하여 상보적 서열을 가지는 링커 서열;을 포함하는 제1 압타머, (2) 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 인슐린 수용체의 세포 외 영역(Extracellular domain)에 특이적으로 결합하는 서열; 및 이에 연결된 제1압타머의 링커 서열에 대하여 상보적 서열을 가지는 링커 서열;을 포함하는 제2 압타머를 포함하는, 압타머 이량체를 포함하는 대사성 질환에 대한 예방 또는 치료방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 인슐린 수용체의 세포 외 영역(Extracellular domain)에 특이적으로 결합하는 제1압타머 서열; 스페이서(spacer) 서열; 및 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 인슐린 수용체의 세포 외 영역(Extracellular domain)에 특이적으로 결합하는 제2압타머 서열로 이루어진 압타머 이량체를 포함하는 대사성 질환에 대한 예방 또는 치료방법에 관한 것이다.
본 발명은 대사성 질환의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 (1) 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 인슐린 수용체의 세포 외 영역(Extracellular domain)에 특이적으로 결합하는 서열; 및 이에 연결된 제2압타머의 링커 서열에 대하여 상보적 서열을 가지는 링커 서열;을 포함하는 제1 압타머, (2) 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 인슐린 수용체의 세포 외 영역(Extracellular domain)에 특이적으로 결합하는 서열; 및 이에 연결된 제1압타머의 링커 서열에 대하여 상보적 서열을 가지는 링커 서열;을 포함하는 제2 압타머를 포함하는, 압타머 이량체를 제공한다.
또한, 본 발명은 대사성 질환의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 인슐린 수용체의 세포 외 영역(Extracellular domain)에 특이적으로 결합하는 제1압타머 서열; 스페이서(spacer) 서열; 및 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 인슐린 수용체의 세포 외 영역(Extracellular domain)에 특이적으로 결합하는 제2압타머 서열로 이루어진 압타머 이량체를 제공한다.
본 발명은 대사성 질환의 치료를 위한 약제의 제조에 있어서 (1) 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 인슐린 수용체의 세포 외 영역(Extracellular domain)에 특이적으로 결합하는 서열; 및 이에 연결된 제2압타머의 링커 서열에 대하여 상보적 서열을 가지는 링커 서열;을 포함하는 제1 압타머, (2) 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 인슐린 수용체의 세포 외 영역(Extracellular domain)에 특이적으로 결합하는 서열; 및 이에 연결된 제1압타머의 링커 서열에 대하여 상보적 서열을 가지는 링커 서열;을 포함하는 제2 압타머를 포함하는, 압타머 이량체의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 대사성 질환의 치료를 위한 약제의 제조에 있어서 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 인슐린 수용체의 세포 외 영역(Extracellular domain)에 특이적으로 결합하는 제1압타머 서열; 스페이서(spacer) 서열; 및 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 인슐린 수용체의 세포 외 영역(Extracellular domain)에 특이적으로 결합하는 제2압타머 서열로 이루어진 압타머 이량체의 용도를 제공한다.
대사성 질환은, 예를 들면 당뇨병(T1D 및/또는 T2DM, 예컨대 전당뇨병), 특발성 1형 당뇨병(T1D(유형 1b)), 성인에서 잠복성 자가면역 당뇨병(LADA), 조기 발병 2형 당뇨병(T2DM(EOD)), 연소자 발병 비정형 당뇨병(YOAD), 연소자의 성인 발병 당뇨병(MODY), 영양실조-관련된 당뇨병, 임신성 당뇨병, 고혈당증, 인슐린 내성, 간 인슐린 내성, 내당능 장애, 당뇨병성 신경병증, 당뇨병성 신증, 신장 질환(예컨대, 급성 신장 장애, 관형 기능장애, 근위 세뇨관에 대한 전염증 변화), 당뇨병성 망막증, 지방세포 기능장애, 내장 지방 축적, 수면 무호흡증, 비만(예컨대, 시상하부성 비만 및 단일-유전자성 비만) 및 관련 동반질환(예컨대, 골관절염 및 요실금), 섭식 장애(예컨대, 폭식 증후군, 신경성 식욕 항진증, 및 증후군성 비만, 예컨대 프레더-윌리(Prader-Willi) 증후군 및 바르데-비들(Bardet-Biedl) 증후군), 다른 약제의 사용으로 인한 체중 증가(예컨대, 스테로이드 및 항정신병약의 사용으로부터), 과도한 당 섭취욕, 이상지질혈증(고지혈증, 고중성지질혈증, 총 콜레스테롤 증가, 고LDL 콜레스테롤, 및 저 HDL 콜레스테롤 포함), 비알코올성 지방간질환(NAFLD)(관련 질환, 예컨대 지방증, 비알코올성 지방간염(NASH), 섬유증, 간경변, 및 간세포 암종 포함)일 수 있다.
본 발명에 따른 압타머 이량체는 인슐린 수준으로 포도당을 흡수할 수 있다.
본 발명에 따른 인슐린 수용체 결합 압타머 이량체는 인슐린 수용체에 대해 작용제로서 포도당 흡수(glucose uptake)을 수행할 수 있으며, 세포 분열이나 기타 인슐린에 의해 발생 가능한 부작용 등을 나타내지 않으며 인슐린의 수준을 조절할 수 있다. 따라서 본 발명에 따른 인슐린 수용체 결합 압타머 이량체는 암세포의 성장에 의한 암발생률 증가와 혈관 평활근 세포의 성장에 의한 죽상동맥경화에 영향을 미치지 않으면서 혈당 조절을 하는데 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 압타머 이량체는 세포의 포도당 흡수를 증가시키면서도, 지방 분해 억제 효과가 낮을 수 있다. 바람직하게는 포도당 흡수를 증가시키면서도 인슐린에 비하여 지방 분해 억제 효과가 낮은 것을 특징으로 한다. 지방분해 억제 활성은 인슐린의 대표적인 역할이며 이를 통해 인슐린을 투여하는 경우, 혈당은 조절되나 체중 증가를 유도하는 것으로 알려져 있다. 본 발명에 따른 압타머 이량체는 낮은 지방분해 억제 효과에도 포도당 흡수를 효과적으로 증가시킬 수 있으며, 더욱 바람직하게는 지방분해 억제에 의한 체중 증가에 영향을 미치지 않고 혈당 조절을 하는데 유용하게 사용될 수 있다. 이에 따라, 본 발명에 따른 압타머 이량체는 대사성 질환의 치료, 개선 및 예방에 유용하게 이용될 수 있다.
본 발명에서 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 성병, 연령, 질병의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 또한 본 발명의 약학적 조성물은 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 용어 "대상체"는 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 증상이 호전될 수 있는 동물 또는 인간을 포함한다. 본 발명에 따른 치료용 조성물을 개체에게 투여함으로써, 인슐린 기능 장애를 효과적으로 예방 및 치료할 수 있다.
본 발명의 용어 "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 인간 또는 동물에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명에 따른 치료용 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 치료용 조성물은 유효성분이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여 경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
상기 약학 조성물은 다양한 경구 투여 형태 또는 비경구 투여 형태로 제형화될 수 있다. 예를 들어, 정제, 환제, 경/연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제, 엘릭서제(elixirs) 등의 임의의 경구 투여용 제형으로 될 수 있다. 이러한 경구 투여용 제형은 각 제형의 통상적인 구성에 따라 상기 유효 성분 외에, 예를 들어, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신 등의 희석제나, 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜 등의 활택제 등의 제약상 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다.
또한, 상기 경구 투여용 제형이 정제인 경우, 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘 등의 결합제를 포함할 수 있고, 경우에 따라, 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제나, 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제 또는 감미제 등을 포함할 수도 있다.
비경구용으로 제공하는 경우, 일 예로 액제, 겔(gel)제, 세정 조성물, 삽입용 정제, 좌제 형태, 크림, 연고, 드레싱 용액, 분무제, 기타 도포제등의 국소 투여제, 용액형, 현탁형, 유제형 등의 액상제형일 수 있으며, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제, 크림, 연고, 젤리, 거품, 세척제 또는 삽입물, 바람직하게는 액제, 겔 (gel)제, 세정 조성물, 삽입용 정제 등의 피부 외용제가 포함될 수 있다. 상기 제형은 일 예로 멸균수에 용해보조제, 유화제, pH 조절을 위한 완충제 등을 첨가하여 제조할 수 있다. 상기 비수성용제 또는 현탁용제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜 (polyethylene glycol), 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
필요에 따라, 압타머는 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들면, 리포솜, 알부민 마이크로구체, 마이크로에멀젼, 나노-입자 및 나노캡슐) 또는 마크로에멀젼 내의, 예를 들어 코아세르베이션 기술 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 각각 내에 포획될 수 있다. 이러한 기술은 관련 기술분야에 공지되어 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물의 투여는 약제학적으로 유효한 양을 투여할 수 있다. "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 예방 또는 치료하기에 충분한 양을 의미한다. 유효 용량 수준은 제제화 방법, 환자의 상태 및 체중, 환자의 성별, 연령, 질환의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간, 배설 속도, 반응 감응성 등과 같은 요인들에 따라 당업자에 의해 다양하게 선택될 수 있다. 유효량은 당업자에게 인식되어 있듯이 처리의 경로, 부형제의 사용 및 다른 약제와 함께 사용할 수 있는 가능성에 따라 변할 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 경구 투여제의 경우 일반적으로 성인에게 1일에 체중 1 kg당 본 발명의 조성물을 1일 0.0001 내지 100 ㎎/㎏으로, 바람직하게는 0.001 내지 100 ㎎/㎏으로 투여할 수 있으나, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
그리고, 상기 약학 조성물은 비경구 투여 형태로 제형화될 수도 있는데, 이러한 경우 피하주사, 정맥주사, 근육 내 주사 또는 흉부 내 주사 등의 비경구 투여 방법에 의해 투여된다. 이 때, 상기 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위하여, 상기 약학 조성물은 유효 성분, 즉, 화학식 I의 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합되어 용액 또는 현탁액으로 제조되고, 이러한 용액 또는 현탁액이 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제조될 수 있다.
또한, 상기 약학 조성물은 멸균되거나, 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 보조제를 더 포함할 수도 있고, 기타 치료적으로 유용한 물질을 더 포함할 수도 있으며, 혼합, 과립화 또는 코팅의 통상적인 방법에 따라 제제화될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 투여 대상은 인간을 포함하는 포유류일 수 있으며, 바람직하게는 설치류, 또는 인간일 수 있다.
본 발명에 따른 인슐린 수용체 결합 압타머 이량체는 압타머 단량체 대비 인슐린 수용체를 활성화시키는 효과가 크고 인슐린 수용체에 대한 상이한 인산화 특성(인산화가 일어나는 site가 늘어남)을 나타내며 특히 pERK 레벨을 상승시키지 않으면서 pAKT 레벨은 높게 조절하여 장기간 인슐린 요법시 발생하는 부작용을 최소화하면서 glucose uptake 효능을 증진시켜 치료 효과를 나타내어 당뇨 등의 질환 치료에 우수한 효과를 나타낸다.
도 1은 본 발명의 일실시양태에 따른 압타머 이량체(IR-A62)의 상보적 서열에 의한 결합 구조 형태를 나타내는 것이다.
도 2는 본 발명의 일실시양태에 따른 압타머 이량체의 처리에 따른 인슐린 수용체(Y960, Y1146, Y1150, Y1151, Y1316, Y1322), 인슐린 수용체 기질(Y896), AKT(S473) 및 ERK의 인산화 변화를 확인한 결과를 나타낸다.
도 3의 A는 링커 길이별 6~20bp 이량체 형성을 native PAGE로 확인한 결과를 나타내며, 도 3의 B는 본 발명의 일실시양태에 따른 압타머 이량체의 처리에 따른 인슐린 수용체(Y1150, Y1150/Y1151), AKT(S473, T308) 및 ERK(T202/Y204)의 인산화 변화를 확인한 결과를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 일실시양태에 따른 압타머 이량체의 농도별 처리에 따른 인슐린 수용체(Y1150, Y1150/Y1151) 및 AKT(S473)의 인산화 변화를 확인한 결과를 나타낸다.
도 5는 본 발명의 일실시양태에 따른 압타머 이량체의 농도별 처리에 따른 인슐린 수용체의 글루코스 흡수(glucose uptake) 변화를 확인한 결과를 나타낸다.
도 6은 본 발명의 일실시양태에 따른 압타머 이량체를 농도 별로 처리하여 Y1150의 인산화 수준 증가를 확인한 결과를 나타낸다.
도 7은 본 발명의 일실시양태에 따른 압타머 이량체를 농도 별로 처리하여 인슐린 수용체의 인산화 수준 증가(pY)를 확인한 결과를 나타낸다.
도 8은 본 발명의 일실시양태에 따른 압타머 이량체를 농도 별로 처리하여 AKT의 인산화 수준 증가를 확인한 결과를 나타낸다.
도 9는 본 발명의 일실시양태에 따른 압타머 이량체를 농도 별로 처리하여 ERK(T202/Y204)의 인산화 수준 증가를 확인한 결과를 나타낸다.
도 10은 본 발명의 일실시양태에 따른 링커 서열이 개질(2‘-OMe 개질)된 압타머 이량체를 농도 별로 처리하여 ERK의 인산화 수준 증가를 확인한 결과를 나타낸다(Ins : 인슐린, A62-M: IR-A62, A62LD1(2’OMe): 서열번호 19, A62LD2(2’OMe): 서열번호 20, A62-D(2’OMe): 서열번호 19 및 서열번호 20의 자가조립(다이머)).
도 11은 본 발명의 일실시양태에 따른 압타머 이량체의 혈청내 분해 속도를 확인한 결과를 나타낸다.
도 12는 본 발명의 일실시양태에 따른 압타머 이량체의 링커의 길이에 따른 인슐린 수용체(Y1150/Y1151 cs, Y1150/Y1151 pAb) 및 AKT(S473)의 인산화 변화를 확인한 결과를 나타낸다.
본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 제시한다. 하기의 실시예, 제조예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 인슐린 수용체 결합 압타머 이량체의 합성
Aptamer를 Aptamer Science, Inc.(Pohang, Korea)에 의뢰하여 합성하였다. 구체적으로, 아래와 같은 방법을 이용하여 실험에 사용되는 압타머를 합성하였다. 압타머는 핵산전용 고정상 합성기인 Bioautomation사의 Mermade 12 합성기를 사용하여 Solid Phase Oligo Synthesis 방법으로 합성하였다. 올리고뉴클레오타이드 합성기(Bioautomation, Mermade12)를 이용하여 solide phase b-cyanoethyl phosphoramidite chemistry로 합성하였으며, 합성 후 CPG(200nmole synthesis column, 1000A(MM1-1000-))를 클리비지(cleavage) 용액[t-butylamine:methanol:water(1:1:2 부피비)]에 넣고 70℃에서 5시간 동안 클리비지/디프로텍션(deprotection) 후 진공 건조를 시킨 다음, HPLC(GE, AKTA basic)를 이용하여 분리/정제하였다. 사용한 컬럼은 RP-C18 컬럼 (Waters, Xbridge OST C18 10x50mm)이고 UV 254 nm/290nm, flow rate: 5ml/min, 온도: 65℃의 조건으로 0.1M TEAB/Acetonitrile Buffer를 이용하였다. 이들 압타머들은 모두 LC-ESI MS spectrometer(Waters HPLC systems(Waters) + Qtrap2000(ABI))로 0.02% 오차범위 내에서 정확한 분자량을 측정하였으며 HPLC를 이용한 순도측정에서 80-90%를 얻을 수 있었다.
IR-A62 기반의 서열 정보는 아래 표 2에 나타내었다.
[표 2]
Figure PCTKR2022009443-appb-I000004
굵은 기울임 표시 N: 화학식 1 소수성 작용기( 나프틸메틸카르복시아미드 )
밑줄친 A, G, C: 2‘ 위치에서 플루오로 (2’-F)로 염기 개질
기울임 표시 A, G, C: 2‘ 위치에서 메톡시(2’-Ome)로 염기 개질
<실시예 2> 인슐린 수용체에 대한 티로신 잔기의 특이적 인산화 확인
인슐린 수용체에 대한 티로신 잔기의 특이적 인산화를 확인하기 위하여, 인슐린(Sigma-Aldrich(St. Louis, MI, USA), Ins), 상기 IR-A62 압타머(Ori), 합성한 2종의 압타머를 혼합(LD1+LD2) 및 단독(LD1 또는 LD2)을 이용하여 실험을 수행하였다.
인슐린 수용체가 과발현된 Rat-1 섬유세포(Rat-1/hIR)에서 인슐린 수용체 및 신호전달 단백질의 인산화를 확인하였다.
인슐린 수용체(IR)의 Y960, Y1146, Y1150, Y1151, Y1316, Y1322의 티로신 잔기의 특이적 인산화, 인슐린 수용체 기질(Insulin receptor substrate, IRS, Y896)의 특이적 인산화, AKT 및 ERK의 인산화를 확인하였다.
웨스턴 블랏에 사용된 항체들은 다음과 같다.
Millipore: Anti-phospho-insulin receptor (Y1146), anti-phospho-insulin receptor (Y1150) 및 anti-phospho-tyrosine (4G10) 항체.
Invitrogen (Carlsbad, CA, USA): Anti-phospho-insulin receptor (Y1322), anti-phospho-insulin receptor (Y1316), anti-phospho-insulin receptor (Y1150/Y1151) 및 anti-phospho-insulin receptor (Y960) 항체.
Cell Signalling Technology (Danvers, MA, USA): Anti-phospho-ERK1/2 (T202/Y204), anti-phospho-AKT (T308) and anti-phospho-AKT (S473) 항체.
Invitrogen: DyLight 800에 컨쥬게이트된 Goat anti-rabbit IgG 및 anti-mouse IgG secondary 항체.
단백질의 인산화를 평가하기 위해 웨스턴 블랏을 수행하였다. 구체적으로, 세포를 12-웰 플레이트에 접종하고, Serum starvation을 위하여, 인슐린 또는 압타머로 자극 전 세포를 FBS가 없는 배지에서 3시간 동안 인큐베이션하였다. 그리고 나서, 압타머와 인슐린을 Krebs-Ringer HEPES 완충액(25mM HEPES(pH 7.4), 120mM NaCl, 5mM KCl, 1.2mM MgSO4, 1.3mM CaCl2 및 1.3mM KH2PO4)에서 준비하였다. 3차 구조를 재구성하기 위해, 압타머 샘플을 95°C에서 5분 동안 가열한 다음 실온으로 천천히 냉각하였다. 인슐린(20 nM) 또는 압타머(100nM)로 자극한 후, 세포를 cold PBS로 3회 세척한 다음 lysis buffer에 용해시켰다. 그리고 나서, 세포 용해물을 초음파 처리하고 4°C에서 15분 동안 20,000 x g에서 원심분리하고 상층액을 5x Laemmli 샘플 완충액과 혼합하였다. 95°C에서 10분 동안 가열한 후, 단백질을 Bis-Tris 젤에서 분리하고 니트로셀룰로오스 막으로 옮기고, 막을 블로킹 버퍼(PBS, 5% 무지방 분유 및 0.1% NaN3)에서 실온에서 30분 동안 인큐베이션한 다음 4°C에서 밤새 표시된 항체로 처리하였다. 마지막으로, 막을 각각 10분 동안 TTBS 완충액(20mM Tris, 150mM NaCl, 0.1% Tween 20)에서 3회 세척하고 2차 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 각각 10분 동안 TTBS 완충액으로 막을 3회 더 세척한 후, LI-COR Odyssey 적외선 이미징 시스템을 사용하여 특정 밴드의 강도를 분석하였다.
그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, IR-A62 단량체(A62) 또는 이에 링커 서열을 포함하는 압타머(A62-LD1) 또는 상보적 링커를 포함하는 서열(A62-LD2)과 대비하였을 때, 이량체(A62-LD1+LD2)의 처리는 Y1150에 대한 인산화 수준이 크게 증가하였음을 확인하였다. 또한, 인슐린 수용체의 Y960, Y1146, Y1150/10151, Y1316, Y1322 위치에서의 인산화 효과 및 인슐린 수용체 기질의 Y896에서의 인산화 효과가 또한 함께 발생하는 것을 확인하였다. 이러한 다른 티로신 잔기에서의 인산화 증가는 인슐린에서 발현되는 인산화와 동등한 특성을 나타내는 것이었다. 또한, IR-A62 단량체와 대비할 때 IR-A62 이량체는 AKT 인산화 효과가 IR-A62 monomer에 비해 매우 높게 나타나는 반면, ERK에 대해서는 발현 변화를 크게 나타내지 않았다.
<실시예 3> 인슐린 수용체 결합 압타머 이량체 최적화
다이머 형태를 가질 수 있는 IR-A62 단량체(A62)의 최적화를 위하여, 상보적 서열의 길이에 대한 최적화 및 단일 가닥(단량체)에 대한 확인하였다.
다이머를 구성할 수 있는 상보적 서열의 길이의 최적화를 위하여 링커 서열을 6 bp, 8 bp, 10 bp, 12 bp, 14 bp, 16 bp, 18 bp 및 20 bp의 길이로 하여 다이머를 구성하였다. 링커 서열은 반복되는 임의의 A, C, T, G 서열을 사용하였다.
상보적 서열의 길이 최적화를 위한 링커 서열 정보는 아래 표 3에 나타내었다.
[표 3]
Figure PCTKR2022009443-appb-I000005
그리고 나서, 실시예 2에서와 유사하게 pY1150/1151 (10C3)의 인산화 수준을 확인하여 적합한 상보적 서열의 길이를 확인하고자, 상기한 개질된 서열번호 7의 IR-A62 단량체(A62)에 상기 표 3의 링커를 연결하여 IR-A62 이량체 제조를 위한 압타머를 설계하고, 하기 표 4에 나타내었다.
[표 4]
Figure PCTKR2022009443-appb-I000006
앞서는 실시예 2와 유사하게, 단백질의 인산화를 평가하기 위해 웨스턴 블랏을 수행하였다.
상기 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3의 A에서 확인할 수 있는 바와 같이, 링커 길이별 6~20bp의 이량체가 형성되었음을 확인하였다.
또한, 도 3의 B에서 확인할 수 있는 바와 같이, IR-A62 단량체(IR-A62-M)와 대비하였을 때, IR-A62 이량체(IR-A62-D(D1+D2)(6 bp 내지 20 bp))의 처리는, 6 bp 또는 8 bp로 연결된 IR-A62 압타머 이량체의 경우에는 IR-A62 압타머 단량체와 유사한 수준의 Y1150 인산화 레벨을 보였다. 반면, 10bp 이상의 길이로 연결된 IR-A62 압타머 이량체 (10 bp 내지 20 bp)는 IR-A62 압타머 단량체 대비 높은 Y1150 인산화 레벨을 보였다.
또한, IR-A62 압타머 이량체의 native gel 분석 결과에서 연결부위 길이가 6 bp 또는 8 bp인 IR-A62 압타머 이량체는 형성되지 않았고, 10bp 이상 길이인 IR-A62 압타머 이량체만 형성되었음을 확인하였다.
이러한 결과는 IR-A62 압타머 이량체 (6 bp 또는 8 bp)는 연결부위가 짧아 이량체를 형성하지 못하고 단량체로 존재하기 때문에 Y1150 인산화 레벨 상승효과가 없으며, IR-A62 압타머 이량체 (10 bp 내지 20 bp)는 이량체를 형성하여 Y1150 인산화 레벨 상승효과가 나타난 것으로 판단된다.
<실시예 4> 인슐린 수용체에 대한 티로신 잔기의 특이적 인산화 확인
실시예 2에서와 유사하게 hIR-L6 세포주에 IR-A62 압타머 단량체(IR-A62-M) 또는 이량체(IR-A62-D(12 bp))를 농도별로 처리한 후, 앞서는 실시예 2와 유사하게, 단백질의 인산화를 평가하기 위해 웨스턴 블랏을 수행하였다.
그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에서 확인할 수 있는 바와 같이, hIR-L6 cell에 IR-A62 압타머 단량체(A62-M) 및 IR-A62 압타머 이량체 (12bp)를 농도별로 (20, 100, 500nM) 처리한 후, pIR의 intracellular level을 Western blotting을 통해 측정한 후, IR-A62 압타머 이량체 (12bp)는 IR-A62 압타머 단량체에 비해 높은 Y1150 인산화 레벨 및 pAKT 레벨을 보였다 (IR-A62 압타머 단량체 500nM의 결과가 IR-A62 압타머 이량체 (12bp) 100nM 결과와 유사하게 나타남).
< 실시예 5> 인슐린 수용체에 대한 클루코스 흡수(glucose uptake) 변화 확인
hIR-L6 cell에 IR-A62 압타머 단량체(IR-A62-M) 및 IR-A62 압타머 이량체 (12bp)를 농도별로 (20, 100, 500nM) 처리한 후, C14-2DG (C14 2-Deoxy-D-glucose)를 처리하여 glucose uptake를 액체섬광계수기 (liquid scintillation counter)로 측정하였다.
그 결과를 5에 나타내었다.
도 5에서 확인할 수 있는 바와 같이, IR-A62 압타머 이량체 (12bp) 100nM에 의한 glucose uptake 효과가 IR-A62 압타머 단량체 500nM에 의한 glucose uptake 효과와 동일한 수준으로 나타났으며, IR-A62 압타머 이량체 (12bp) 500nM에 의한 glucose uptake 효과는 그보다 더 상승한 결과를 보여 IR-A62 압타머 이량체 (12bp)는 IR-A62 압타머 단량체에 비해 높은 glucose uptake 효과를 보였다.
< 실시예 6> 인슐린 수용체에 대한 티로신 잔기 (Y1150 및 전체), AKT 및 pERK 인산화 수준 변화 확인
실시예 2에서와 유사하게 Rat-1/IR 세포주에 IR-A62 압타머 단량체(IR-A62-M) 또는 이량체(IR-A62-D(20 bp))를 농도별로 처리한 후, 인슐린 수용체의 Y1150 잔기의 인산화 수준 및 전체 인산화 수준을 웨스턴 블랏을 통해 확인하였다.
상기 결과를 도 6 및 도 7에 나타내었다.
도 6에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 IR-A62 압타머 이량체((IR-A62-D(20 bp))는 단량체 압타머(IR-A62-M)와 대비하여 현저히 높은 Y1150 잔기 특이적 인산화 효과를 나타내었다. 또한 도 7에 나타낸 바와 같이, 전체 인산화 측면에서도 본 발명에 따른 IR-A62 압타머 이량체((IR-A62-D(20 bp))는 단량체(IR-A62-M)와 대비하여 우수한 인산화 효능을 나타내었다.
이를 통해서 본 발명에 따른 IR-A62 압타머 이량체((IR-A62-D(20 bp))가 보다 우수한 인슐린 수용체 인산화 효과를 나타내는 것을 확인하였다.
<실시예 7> AKT 및 ERK에 대한 인산화 수준 변화 확인
실시예 2에서와 유사하게 Rat-1/IR 세포주에 IR-A62 압타머 단량체(IR-A62-M) 또는 이량체(IR-A62-D(20 bp))를 농도별로 처리한 후, AKT 및 ERK의 인산화 수준을 웨스턴 블랏을 통해 확인하였다.
그 결과를 도 8 및 도 9에 나타내었다.
도 8에서 확인할 수 있는 바와 같이, pAKT의 수준은 IR-A62 압타머 이량체 처리에 의해 현저히 증가하는 것을 확인하였다.
반면, 도 9에서 확인할 수 있는 바와 같이, ERK의 인산화 수준은 단량체와 이량체 사이에 큰 차이를 나타내지 않았다.
즉. ERK의 인산화 수준을 상승시키지 않으면서 AKT 수준을 증진시킴을 고려할 때, IR-A62 압타머 이량체는 장기간의 인슐린 요법 시 발생하는 부작용으로 염려되는 암발생률 증가 및 죽상동맥경화 발생 가능성을 해결할 수 있다는 점에서 우수한 효과가 인정된다.
< 실시예 8> IR-A62 압타머 이량체의 연결부위 서열에 2’- OMe 변형의 도입에 의한 효과 개선 확인
상기 서열번호 42 또는 서열번호 43의 서열에 대하여, 링커 역할을 하는 연결 부위(서열번호 26 및 27의 링커 서열)에 대해 뉴클라아제 저항성을 제공할 수 있는 2’-OMe(메톡시) 치환을 수행하였다.
이를 서열번호 44 및 서열번호 45에 나타내었다. 이러한 2’-OMe(메톡시)가 추가된 변이 서열은 3’-inverted dT (3’-idT) 로 라벨링해두었다.
Rat-1/IR cell line에 인슐린, IR-A62, 서열번호 45 및/또는 서열번호 46의 IR-A62 압타머 이량체 (2’-OMe)를 처리한 후, pIR의 intracellular level을 Western blotting을 통해 측정하였다.
[표 5]
Figure PCTKR2022009443-appb-I000007
그 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10에서 확인할 수 있는 바와 같이, 2’-OMe 변형이 연결 부위에 도입된 IR-A62 압타머 이량체(A62-D(2'OMe); A62-LD1+LD2)는 인슐린 수용체의 Y1150, Y1150/Y1151와 AKT의 인산화에 우수한 효과를 나타내었고 인슐린과 유사한 수준의 효과를 나타내었다. 반면, IR-A62(A62-M), 또는 이에 링커 서열이 결합된 서열(A62-LD1 또는 A62-LD2)의 경우 Y1150, Y1150/Y1151의 인산화 및 AKT의 인산화를 이루지 못하거나 매우 낮은 수준으로만 작용하였다.
<실시예 9> IR-A62 압타머 이량체의 반감기 개선 확인
IR-A62 단량체(링커 없음) 및 IR-A62 이량체(2'-OMe 변형)에 대하여 혈청 내 안정성 분석 실험을 수행하였다. 구체적으로, 위 표 5의 압타머들을 각각 37℃에서 최대 48시간 동안 90% 마우스 혈청과 함께 배양하고, 시점 별로 압타머의 분해를 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 사용하여 분석하였다.
그 결과를 도 11의 (a) 및 (b)에 나타내었다.
도 11의 (a)에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 다이머 형태의 압타머는 혈중에서 일정 시간 이상 안정하게 유지되는 결과를 나타내었다. 이를 그래프로 살펴보면, 다이머 형태를 가지는 압타마거 단량체 형태보다 혈중에서의 유지 시간이 상당히 길게 나타는 것을 확인하였다.
상기 결과로부터 본 발명에 따른 압타머 이량체의 안정성 또한 크게 증가된 것을 확인하였다.
<실시예 10> 신규 형태의 IR-A62 압타머 이량체 제작 및 효과 확인
한편, 기존 IR-A62 압타머 이량체 합성방식과 다르게 단일 가닥으로 IR-A62 압타머 이량체를 합성고자 하였다. 이에, 두 개의 IR-A62 압타머 서열 사이의 거리를 더 짧고 세밀하게 조절하고자, 스페이스 서열에 대한 적절 길이를 확인하고자 하였다.
스페이서 서열 정보는 아래 표 6에 나타내었다.
[표 6]
Figure PCTKR2022009443-appb-I000008
그리고 나서, 실시예 2에서와 유사하게 pY1150/1151 (10C3)의 인산화 수준을 확인하여 적합한 상보적 서열의 길이를 확인하고자, 상기한 개질된 서열번호 7의 IR-A62 단량체(A62)에 상기 표 5의 스페이서를 연결하여 IR-A62 이량체 제조를 위한 압타머를 설계하고, 하기 표 6에 나타내었다. 상기한 실시예 10의 결과로부터 2’-OMe 변형이 인슐린 수용체의 Y1150, Y1150/Y1151와 AKT의 인산화에 인슐린에 견줄 만한 우수한 효과를 나타내었고, 혈청 내 안정성을 확인함에 따라, 본 설계에서는 스페이서의 2'-OMe 변형을 도입하였다.
[표 7]
Figure PCTKR2022009443-appb-I000009
음영 표시: 2’- OMe치환
앞서는 실시예 2와 유사하게, 단백질의 인산화를 평가하기 위해 웨스턴 블랏을 수행하였다.
상기 결과를 도 12에 나타내었다.
도 12에서 확인할 수 있는 바와 같이, A62 단량체(A62-M)와 대비하였을 때, 표 7의 A62 이량체의 처리는, Poly T로 연결된 IR-A62 압타머 이량체의 경우 연결부위 서열이 4T 내지 15T 사이에서 IR-A62 압타머 단량체 대비 Y1150 인산화 레벨 상승효과가 나타났다.
한편, 짧은 PEG linker로 연결된 IR-A62 압타머 이량체의 경우에는 연결부위 서열이 H1 내지 H6 사이에서 IR-A62 압타머 단량체 대비 Y1150 인산화 레벨 상승효과가 나타났다.

Claims (20)

  1. (1) 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 인슐린 수용체의 세포 외 영역(Extracellular domain)에 특이적으로 결합하는 서열; 및 이에 연결된 제2압타머의 링커 서열에 대하여 상보적 서열을 가지는 링커 서열;을 포함하는 제1 압타머,
    (2) 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 인슐린 수용체의 세포 외 영역(Extracellular domain)에 특이적으로 결합하는 서열; 및 이에 연결된 제1압타머의 링커 서열에 대하여 상보적 서열을 가지는 링커 서열;을 포함하는 제2 압타머를 포함하는, 압타머 이량체
    여기서, 서열번호 1은 CANNACGCAN GAGNCNAGAN CCGN 이며,
    상기 N은 5-(N-1-나프틸메틸카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 또는 5-(N-벤질카복시아미드)-2'-데옥시우리딘이며,
    상기 C, A 또는 G는 변형되거나 비변형된 염기이며,
    변형된 C는 뉴클레오티드의 2번째 탄소 위치에 메톡시기(2-O-Me, 2-O-Methoxy-DNA) 도입; 또는 뉴클레오티드의 2번째 탄소 위치에 불소(2-F, 2-Fluorine-DNA)가 도입의 변형이며,
    변형된 G는 뉴클레오티드의 2번째 탄소 위치에 메톡시기(2-O-Me, 2-O-Methoxy-DNA) 도입; 또는 뉴클레오티드의 2번째 탄소 위치에 불소(2-F, 2-Fluorine-DNA)가 도입의 변형이며, 및
    변형된 A는 뉴클레오티드의 2번째 탄소 위치에 메톡시기(2-O-Me, 2-O-Methoxy-DNA) 도입; 또는 뉴클레오티드의 2번째 탄소 위치에 불소(2-F, 2-Fluorine-DNA)가 도입의 변형임.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제1압타머 및 제2압타머에서 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 인슐린 수용체의 세포 외 영역(Extracellular domain)에 특이적으로 결합하는 서열은, 서열번호 2의 염기서열에 있어서 22 내지 46번째 서열을 포함하면서 연속되는 25개 내지 79개의 염기서열을 포함하는 것인 압타머 이량체.
  3. 제2항에 있어서, 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 인슐린 수용체의 세포 외 영역(Extracellular domain)에 특이적으로 결합하는 서열은 서열번호 3 내지 11로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 압타머 이량체.
  4. 제1항에 있어서, 상기 압타머 이량체는 제2압타머의 링커 서열에 대하여 상보적 서열을 가지는 링커 서열과 제1압타머의 링커 서열에 대하여 상보적 서열을 가지는 링커 서열이 상보적 결합을 통해 이량체를 형성하는 것인 압타머 이량체.
  5. 제1항에 있어서, 상기 링커 서열은 5 내지 30개의 염기 서열을 가지는 것인 압타머 이량체.
  6. 제5항에 있어서, 상기 링커 서열은 A, C, T 또는 G의 염기에 대하여 적어도 하나 이상의 2’-OMe(메톡시) 또는 2’-F(플루오르)의 변형된 염기 치환을 가지거나 L-form DNA 또는 LNA (Locked DNA)인 압타머 이량체.
  7. 제5항에 있어서, 상기 링커 서열은 서열번호 12 내지 27로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 서열인 압타머 이량체.
  8. 제1항에 있어서, 상기 제1압타머는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 인슐린 수용체의 세포 외 영역(Extracellular domain)에 특이적으로 결합하는 서열과 링커 서열 사이에 스페이서 서열를 추가로 포함하는 것인, 압타머 이량체.
  9. 제8항에 있어서, 상기 스페이서 서열은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 폴리 T 단편인, 압타머 이량체.
  10. 제1항에 있어서, 상기 제1압타머는 서열번호 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40 및 42로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 압타머 이량체.
  11. 제1항에 있어서, 상기 제2압타머는 서열번호 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41 및 43로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 압타머 이량체.
  12. 제1항에 있어서, 상기 압타머 이량체는 서열번호 28 및 29, 서열번호 30 및 31, 서열번호 32 및 33, 서열번호 34 및 35, 서열번호 36 및 37, 서열번호 38 및 39, 서열번호 40 및 41, 및 서열번호 42 및 43 로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제1압타머 및 제2압타머를 포함하는 것인, 압타머 이량체.
  13. 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 인슐린 수용체의 세포 외 영역(Extracellular domain)에 특이적으로 결합하는 제1압타머 서열; 스페이서(spacer) 서열; 및 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 인슐린 수용체의 세포 외 영역(Extracellular domain)에 특이적으로 결합하는 제2압타머 서열로 이루어진 압타머 이량체,
    여기서, 서열번호 1은 CANNACGCAN GAGNCNAGAN CCGNC 이며,
    상기 N은 5-(N-1-나프틸메틸카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 또는 5-(N-벤질카복시아미드)-2'-데옥시우리딘이며,
    상기 C, A 또는 G는 변형되거나 비변형된 염기이며,
    변형된 C는 뉴클레오티드의 2번째 탄소 위치에 메톡시기(2-O-Me, 2-O-Methoxy-DNA) 도입; 또는 뉴클레오티드의 2번째 탄소 위치에 불소(2-F, 2-Fluorine-DNA)가 도입의 변형이며,
    변형된 G는 뉴클레오티드의 2번째 탄소 위치에 메톡시기(2-O-Me, 2-O-Methoxy-DNA) 도입; 또는 뉴클레오티드의 2번째 탄소 위치에 불소(2-F, 2-Fluorine-DNA)가 도입의 변형이며, 및
    변형된 A는 뉴클레오티드의 2번째 탄소 위치에 메톡시기(2-O-Me, 2-O-Methoxy-DNA) 도입; 또는 뉴클레오티드의 2번째 탄소 위치에 불소(2-F, 2-Fluorine-DNA)가 도입의 변형임.
  14. 제13항에 있어서, 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 인슐린 수용체의 세포 외 영역(Extracellular domain)에 특이적으로 결합하는 서열은 서열번호 3 내지 11로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 압타머 이량체.
  15. 제14항에 있어서, 상기 스페이서 서열은, 폴리 A 단편, 폴리 T 단편, 폴리 G 단편, 폴리 C 단편, 포스포라미디트(Phosphoramidite) 단편, 또는 ethylene glycol 단편인, 압타머 이량체.
  16. 제15항에 있어서, 상기 스페이서 서열은 서열번호 46 내지 60로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인, 압타머 이량체.
  17. 제13항에 있어서, 상기 압타머 이량체는 서열번호 61 내지 76로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인, 압타머 이량체.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 압타머 이량체를 포함하는 대사성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 상기 대사성 질환은 당뇨병, 특발성 1형 당뇨병, 성인에서 잠복성 자가면역 당뇨병, 조기 발병 2형 당뇨병, 연소자 발병 비정형 당뇨병, 연소자의 성인 발병 당뇨병, 영양실조-관련된 당뇨병, 임신성 당뇨병, 고혈당증, 인슐린 내성, 간 인슐린 내성, 내당능 장애, 당뇨병성 신경병증, 당뇨병성 신증, 신장 질환, 당뇨병성 망막증, 지방세포 기능장애, 내장 지방 축적, 수면 무호흡증, 비만, 다른 약제의 사용으로 인한 체중 증가, 과도한 당 섭취욕, 이상지질혈증, 및 비알코올성 지방간질환(NAFLD)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 대사성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  20. 제18항에 있어서, 상기 대사성 질환은 당뇨병, 특발성 1형 당뇨병, 성인에서 잠복성 자가면역 당뇨병, 조기 발병 2형 당뇨병, 연소자 발병 비정형 당뇨병, 연소자의 성인 발병 당뇨병, 영양실조-관련된 당뇨병 및 임신성 당뇨병로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 대사성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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