WO2021187745A1 - 중간엽 줄기세포 또는 중간엽 줄기세포에서 분비된 인슐린을 포함하는 샤르코-마리-투스병 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

중간엽 줄기세포 또는 중간엽 줄기세포에서 분비된 인슐린을 포함하는 샤르코-마리-투스병 예방 또는 치료용 약학적 조성물 Download PDF

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WO2021187745A1
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insulin
stem cells
mesenchymal stem
marie
charcot
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장종욱
전홍배
박상언
오신지
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사회복지법인 삼성생명공익재단
이엔셀 주식회사
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0668—Mesenchymal stem cells from other natural sources

Definitions

  • the present invention was made by the project specific number HI14C3484 under the support of the Ministry of Health and Welfare. Research on basic technology and next-generation technology", organized by Samsung Seoul Hospital, and the research period is from January 1, 2020 to December 31, 2020.
  • the present invention was made by the project specific number GFO3190121 under the support of the Samsung Seoul Hospital internal project. Development of customized diagnosis and treatment for Marie-Tooth disease", organized by Samsung Seoul Hospital, and the research period is from January 1, 2014 to December 31, 2020.
  • the present invention was made by the project specific number S2644635 under the support of the Small and Medium Business Technology Information Promotion Agency. "Development of next-generation rare muscle disease treatment using Enhanced Neo Cell", the lead institution is Encell Co., Ltd., and the research period is from 2018.08.01 to 2020.07.31.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating Charcot-Marie-Tooth disease, comprising mesenchymal stem cells or insulin secreted from mesenchymal stem cells.
  • Mesenchymal stem cells are cells of stromal origin, have the characteristics of self-renewal, and can be differentiated into bone, cartilage, adipose tissue, muscle, tendon, ligament, and nervous tissue. It is attracting attention as a cell suitable for therapy.
  • mesenchymal stem cells present in the bone marrow have a limited scope of application due to their limited differentiation and proliferative ability. It is usually accompanied by time, mental and physical pain.
  • mesenchymal stem cells present in the bone marrow have a limited scope of application due to their limited differentiation and proliferative ability. It is usually accompanied by time, mental and physical pain.
  • bone marrow transplantation there is a problem in that it is necessary to find a donor that does not show a graft-versus-host reaction because the antigen phenotype is matched through histocompatibility antigen comparison.
  • the umbilical cord can be obtained through a simple procedure during childbirth, and contains numerous hematopoietic stem cells and stem cells compared to its quantity. Recently, as it is known that there are a large amount of stem cells in the umbilical cord, placenta, umbilical cord blood, etc., research is being actively conducted. However, it has not yet been reported that mesenchymal stem cells isolated and cultured from the umbilical cord or factors secreted from mesenchymal stem cells inhibit muscle cell death.
  • IPN Inherited peripheral neuropathy
  • CMT Charcot-Marie-Tooth disease
  • HMSN hereditary motor and sensory neuropathy
  • HNPP hereditary neuropathy with liability to pressure palsy
  • HN hereditary motor neuropathy
  • HSAN hereditary sensory and autonomic neuropathy
  • Charcot-Marie-Tooth disease is an inherited neuromuscular disease associated with various gene mutations that cause axonal degeneration of peripheral nerves.
  • the main clinical features are muscle loss and loss of sensation in the distal center of the upper and lower extremities. It has been reported that the clinical course of the disease may vary not only between different subtypes but also within the same subtype, so close monitoring of patients is required.
  • Charcot-Marie-Tooth disease is the most common disease among IPN with a frequency of 1 in 2,500, and has clinical features such as muscle atrophy, weakness, foot deformity, and loss of sensation in the legs as the disease progresses. Symmetrical distal polyneuropathy.
  • therapeutics for genetic recessive diseases include gene therapy, enzyme replacement therapy, and cell transplantation, but these clinical approaches are the most common treatment methods for dominant diseases caused by gain-of-function of mutant proteins. cases are limited.
  • Various treatments have been proposed to prevent the harmful effects of these mutant proteins, but the basic treatment should be based on suppression or elimination of the expression of the mutant allele or protein.
  • the present inventors confirmed that insulin secreted from mesenchymal stem cells or mesenchymal stem cells has the effect of promoting the proliferation ability of Schwann cells, and completed the treatment for Charcot-Marie-Tooth disease with a mechanism of restoring myelination through this. .
  • an object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating Charcot-Marie-Tooth disease, comprising mesenchymal stem cells or insulin secreted from mesenchymal stem cells.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating Charcot-Marie-Tooth disease comprising insulin or a derivative thereof as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a stem cell therapeutic agent for treating Charcot-Marie-Tooth disease, comprising mesenchymal stem cells or insulin secreted from mesenchymal stem cells.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating Charcot-Marie-Tooth disease, comprising mesenchymal stem cells or insulin secreted from mesenchymal stem cells.
  • One example of the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating Charcot-Marie-Tooth disease, including mesenchymal stem cells.
  • meenchymal stem cells refers to pluripotent progenitor cells before differentiation into cells of specific organs, such as bone, cartilage, fat, tendon, nerve tissue, fibroblasts, and muscle cells.
  • the mesenchymal stem cells may have insulin-secreting ability.
  • the mesenchymal stem cells may include insulin.
  • insulin may be secreted from mesenchymal stem cells, but is not limited thereto.
  • the mesenchymal stem cells may be contained in the composition in an undifferentiated state.
  • the mesenchymal stem cells may be derived from humans or mammals other than humans, for example, may be derived from a human fetus.
  • mammals other than humans may be dogs, cats, monkeys, cattle, sheep, pigs, horses, rats, mice or guinea pigs, but is not limited thereto.
  • the mesenchymal stem cells are tonsils, umbilical cord, backpack, placenta, umbilical cord, umbilical cord blood, skin, peripheral blood, bone marrow, adipose tissue, muscle, liver, nerve tissue, periosteum, fetal membrane, synovial membrane, synovial fluid, amniotic membrane, meniscus It may be derived from the superior cartilage, anterior cruciate ligament, articular chondrocytes, baby teeth, perivascular cells, trabecular bone, subpatellar fat mass, spleen and thymus, etc., and may be derived from, for example, human tonsils or human umbilical cord. .
  • the method for isolating mesenchymal stem cells in the present invention is known in the art, for example, human tonsils, umbilical cord, backpack, placenta, umbilical cord, umbilical cord blood, skin, peripheral blood, bone marrow, adipose tissue, muscle, liver , nerve tissue, periosteum, fetal membrane, synovial membrane, synovial fluid, amniotic membrane, meniscus, anterior cruciate ligament, articular chondrocytes, dendritic cells, perivascular cells, arachnoid bone, subpatellar fat mass, spleen and thymus, etc.
  • the present invention is not limited thereto.
  • the isolated mesenchymal stem cells may be cultured if necessary.
  • the mesenchymal stem cells can be injected into a patient's body either alone or in a cultured state in an incubator, for example, Lindhoff et al. (1989, Arch. Neurol. 46: 615-31) or Douglas Conn.
  • an incubator for example, Lindhoff et al. (1989, Arch. Neurol. 46: 615-31) or Douglas Conn.
  • the clinical method published by Chiolka Douglas Kondziolka, Pittsburgh, 1998) may be used, but is not limited thereto.
  • the mesenchymal stem cells defined by the International Society for Cellular Therapy (ISCT) should grow attached to the bottom in culture conditions, be able to differentiate into osteoblasts, adipocytes or chondrocytes in vitro, and be capable of differentiating into osteoblasts, adipocytes or chondrocytes, and the cell surface.
  • ISCT International Society for Cellular Therapy
  • markers CD73, CD90, CD105, CD166 and CD44 should be expressed (positive markers), and CD34, CD45, CD19, CD11b, CD14 and HLA-DR should not be expressed (negative markers).
  • the formulation may include a conventional pharmaceutically acceptable carrier in addition to the mesenchymal stem cells, and in the case of an injection, a preservative, an analgesic agent, a solubilizer or stabilizer, and in the case of a topical formulation, a base, excipient, lubricant or preservatives and the like.
  • the pharmaceutical composition may further include a pharmaceutically acceptable carrier, and the carrier is commonly used in formulations, including lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia gum, Calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methylcellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and minerals It may include oil and the like, but is not limited thereto.
  • the carrier is commonly used in formulations, including lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia gum, Calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methylcellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and
  • the pharmaceutical composition may further include a lubricant, a wetting agent, a sweetener, a flavoring agent, an emulsifier, a suspending agent, a preservative, and the like in addition to the above components, but is not limited thereto.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is prepared in unit dosage form by formulating using a pharmaceutically acceptable carrier and/or excipient according to a method that can be easily carried out by a person of ordinary skill in the art to which the present invention pertains. or may be prepared by incorporation into a multi-dose container.
  • the formulation may be in the form of a solution, suspension or emulsion in an oil or aqueous medium, and may additionally contain a dispersing agent or a stabilizing agent.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered parenterally, and can be administered intravenously, subcutaneously, intraperitoneally or locally, and preferably can be administered directly to the site of the lesion.
  • composition for parenteral administration eg, injection
  • a pharmaceutically acceptable carrier for example, sterile purified water, a buffer of about pH 7, or physiological saline. It can be injected into a living body and, if necessary, may include conventional additives such as preservatives and stabilizers, but is not limited thereto.
  • the dosage form of the pharmaceutical composition according to the present invention may vary depending on the method of use, but warning agents (Plasters), granules (Granule), powders (Powders), syrups (Syrups), solutions (solutions), fluid extracts (FluidextractsI) , emulsions, suspensions, infusions, tablets, injections, capsules and pills, etc., but are not limited thereto.
  • Suitable formulations of the pharmaceutical compositions according to the invention depend on the route of administration chosen. Any of the known techniques, carriers and excipients may be used suitably and as understood in the art, for example, Remingston's Pharmaceutical Sciences described above.
  • the amount of mesenchymal stem cells injected in the present invention may be administered at 10 3 to 10 10 cells/time, preferably 10 3 to 10 9 cells/time, most preferably 5 x 10 4 cells/time. It may be administered in a circuit, but is not limited thereto.
  • Insulin injected in the present invention may be administered from 0.0001 ng to 500 mg/time, and preferably from 0.0001 mg to 200 mg/time, but is not limited thereto.
  • the dosage of the pharmaceutical composition in the present invention is variously prescribed according to factors such as formulation method, administration method, age, weight, sex, pathology, food, administration time, administration route, excretion rate, and response sensitivity of the patient. can be
  • prevention refers to any action that inhibits or delays the progression of Charcot-Marie-Tooth disease by administration of the pharmaceutical composition of the present invention.
  • treatment refers to any action in which Charcot-Marie-Tooth disease is improved or changed to a beneficial effect by administration of the composition of the present invention.
  • Another embodiment of the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating Charcot-Marie-Tooth disease comprising insulin or a derivative thereof as an active ingredient.
  • Insulin in the present invention may be naturally produced and derived from mesenchymal stem cells, but is not limited thereto.
  • the insulin when naturally produced insulin, it includes, but is not limited to, insulin having a wild-type amino acid sequence of insulin usually associated with animals.
  • Naturally produced insulin in the present invention includes, but is not limited to, variants of naturally produced insulin.
  • Insulin in the present invention may include, without limitation, proteins, analogs, derivatives, and mutants thereof recombined by a method known in the art as long as they have biological activity to achieve the effect of preventing or treating Charcot-Marie-Tooth disease.
  • the mutation may be a mutation found in nature or an artificial mutation that has or does not have the effect of substituting, deleting or inserting one or more amino acids into a nucleic acid sequence encoding insulin.
  • the mutation may have a conservative amino acid substitution that does not affect insulin expression, and is 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, amino acid sequences with 99% or 100% identity.
  • insulin includes fragments, deletions, truncated polypeptides, etc., and may be fragments in which amino acid residues are removed from natural insulin. Such fragments, deletions, truncations, etc. do not substantially adversely affect the activity of the resulting polypeptide.
  • the activation domain of insulin can be derived by mapping the protein domain of insulin or through truncation from the C-terminus, N-terminus, or both C- and N-terminal ends, such truncated polypeptides may have virtually no negative effect on activity or may indicate an increase in activity.
  • recombinant when used in reference to a cell, typically indicates that the cell has been modified by the introduction of a foreign nucleic acid sequence or that the cell is derived from a cell so modified.
  • a recombinant cell may contain a gene that is not found in the same form in the native (non-recombinant) form of the cell, or the recombinant cell contains a native gene (found in the native form of the cell). However, these genes have been modified and reintroduced into the cell.
  • Recombinant cells may contain nucleic acids endogenous to the modified cell without removal of the nucleic acid from the cell, and such modifications include those obtained by gene substitution, site-specific mutagenesis, and related techniques known to those skilled in the art.
  • Recombinant DNA technology includes techniques for producing recombinant DNA in vitro and delivering such recombinant DNA into cells where it can be expressed or propagated to produce a recombinant polypeptide.
  • “Recombinant”, “recombining”, and “recombined” of a polynucleotide or nucleic acid generally refer to assembling or combining two or more nucleic acid or polynucleotide strands or fragments to produce a new polynucleotide or nucleic acid.
  • Recombinant polynucleotides or nucleic acids are sometimes referred to as chimeras.
  • a nucleic acid or polypeptide, when artificial or engineered, is a “recombinant” nucleic acid
  • Recombinant insulin may include any member derived from primates, humans, monkeys, rabbits, pigs, rodents, mice, rats, hamsters, gerbils, dogs, cats, and biologically active derivatives thereof, Mutant and variant forms of insulin with insulin are included as well as functional fragments and fusion proteins of insulin.
  • the term "derivative" may be obtained by substituting a part of the structure of insulin with other atomic groups, substituents, etc., or may include one or more insulins bonded or fused with other biological substances, and of proteins known in the art. It includes a protein improved by an improvement method.
  • one or more insulins combined with other biological substances are antibodies, antibody fragments, immunoglobulins, peptides, enzymes, growth factors, cytokines, transcription factors, toxins, antigenic peptides, hormones , transport proteins, motor function proteins, receptors, signaling proteins, storage proteins, membrane proteins, transmembrane proteins, internal proteins, external proteins, secretory proteins, viral proteins, glycoproteins,
  • the cleaved protein, protein complex, or chemically modified protein may be a fused insulin fusion protein.
  • Bio substances in the present invention include, without limitation, various small peptides, other proteins, and chemical means (eg, tags) useful for isolating or identifying bound polypeptides.
  • the biological material may be fused to the N-terminus and/or C-terminus of the insulin amino acid sequence, and may be prepared by a method known in the art.
  • some fusion domains capable of fusion with insulin are particularly useful for isolation of fusion proteins by affinity chromatography.
  • suitable matrices for affinity chromatography are used, for example glutathione-, amylase- and nickel- or cobalt-conjugated resins.
  • Many such matrices are available in "kit” form, such as the Pharmacia GST purification system and the QLAexpressTM system (Qiagen, Qiagen) useful with a (HIS6) fusion partner.
  • the fusion domain can be selected to facilitate detection of insulin.
  • detection domains include various fluorescent proteins (eg, GFP) as well as "epitope tags," which are generally short peptide sequences for which specific antibodies are available.
  • epitope tags for which specific monoclonal antibodies are readily available include the FLAG, influenza virus hemagglutinin (HA) and c-myc tags.
  • the fusion domain has a protease cleavage site that allows the appropriate protease to partially digest the fusion protein and thus liberate the recombinant protein therefrom, e.g., a protease cleavage site for factor Xa or thrombin. The free protein can then be isolated from the fusion domain by subsequent chromatographic separation.
  • the domain may include, for example, polyarginine-tag (Arg-tag), Strep-tag (Strep-tag), S-tag (S-tag), calmodulin-binding peptide, cellulose-binding domain (cellulose-binding domain), SBP-tag (SBPtag), chitin-binding domain (chitin-binding domain), glutathione S-transferase-tag, maltose-binding protein (maltose-binding domain) protein), NusA, TrxA, DsbA, protein A, protein G, and may further include human albumin.
  • Arg-tag polyarginine-tag
  • Strep-tag Strep-tag
  • S-tag S-tag
  • calmodulin-binding peptide cellulose-binding domain
  • SBP-tag SBP-tag
  • chitin-binding domain chitin-binding domain
  • glutathione S-transferase-tag maltose-binding protein (malto
  • insulin may be fused with a domain that stabilizes insulin in vivo ("stabilizer" domain).
  • stabilizing in the present invention is meant something that increases serum half-life, whether the increase is due to reduced destruction, reduced clearance by the kidneys or other pharmacokinetic effects.
  • Fusions with the Fc portion of immunoglobulins are known to confer desirable pharmacokinetic properties on a wide range of proteins. Likewise, fusion to human serum albumin may confer desirable properties. Other types of fusion domains that may be selected include multimerizing (eg, dimerizing, tetramerizing) domains and functional domains (which, if desired, confer additional biological functions). Fusions can be constructed such that the heterologous peptide is fused at the amino terminus of insulin and/or at the carboxy terminus of insulin.
  • the amino acid sequence of insulin may be a recombinant polypeptide comprising a fragment thereof, a natural polypeptide, or a synthetic polypeptide.
  • the polypeptide is multimeric.
  • the polypeptide is a dimer. It will be appreciated in the art that some amino acid sequences of the binding agents described herein may vary without significantly affecting the structure or function of the protein. Accordingly, the present invention further encompasses variants of insulin that exhibit substantial activity or comprise a region of a fragment thereof.
  • amino acid sequence variations include deletions, insertions, inversions, repetitions, and/or other types of substitutions.
  • Insulin in the present invention may be modified to contain additional chemical moieties that are not normally part of the polypeptide.
  • the derivatizing moiety may improve or otherwise modulate the solubility, biological half-life and/or absorption of the polypeptide. Moieties may also reduce or eliminate undesirable side effects of polypeptides and variants.
  • Insulin of the present invention may be present in further combination with a bioactive compound to enhance the therapeutic effect.
  • biologically active compound refers to a compound that modifies a disease when applied to a mammal having the disease.
  • a biologically active compound may contain antagonistic or agonistic properties, or it may be a proteinaceous bioactive compound or a non-proteinaceous bioactive compound.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be used alone or in combination with methods using surgery, radiation therapy, hormone therapy, chemotherapy, and biological response modifiers for the prevention and/or treatment of Charcot-Marie-Tooth disease,
  • the present invention is not limited thereto.
  • Another embodiment of the present invention relates to a stem cell therapeutic agent for treating Charcot-Marie-Tooth disease, including mesenchymal stem cells.
  • the mesenchymal stem cells may have insulin-secreting ability.
  • the mesenchymal stem cells may include insulin.
  • insulin may be secreted from mesenchymal stem cells, but is not limited thereto.
  • the mesenchymal stem cells may be contained in the cell therapy product in an undifferentiated state.
  • the mesenchymal stem cells may be derived from humans or mammals other than humans, for example, may be derived from a human fetus.
  • mammals other than humans may be dogs, cats, monkeys, cattle, sheep, pigs, horses, rats, mice or guinea pigs, but is not limited thereto.
  • the mesenchymal stem cells are tonsils, umbilical cord, backpack, placenta, umbilical cord, umbilical cord blood, skin, peripheral blood, bone marrow, adipose tissue, muscle, liver, nerve tissue, periosteum, fetal membrane, synovial membrane, synovial fluid, amniotic membrane, meniscus It may be derived from the superior cartilage, anterior cruciate ligament, articular chondrocytes, baby teeth, perivascular cells, trabecular bone, subpatellar fat mass, spleen and thymus, etc., and may be derived from, for example, human tonsils or human umbilical cord. .
  • the term "cell therapy” refers to proliferating or selecting living autologous, allogenic, or xenogenic cells in vitro, or using various methods to restore the function of cells and tissues. It refers to drugs used for the purpose of treatment, diagnosis, and prevention through a series of actions that change characteristics (Article 2 of the Product Authorization Review Notice for Biological Products, etc. announced by the KFDA (2008-78)).
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating Charcot-Marie-Tooth disease, comprising insulin secreted from mesenchymal stem cells or mesenchymal stem cells, wherein insulin secreted from mesenchymal stem cells or mesenchymal stem cells is Charcot-Marie-Tooth disease can be prevented or treated as a mechanism to restore myelination through the effect of promoting the proliferation ability of Schwann cells.
  • FIG. 1 is a graph showing the results of stem cell ability analysis by separating mesenchymal stem cells from tonsils according to an embodiment of the present invention.
  • 2A is a photograph confirming the ability to differentiate fat according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 2b is a graph of the result of confirming the fat differentiation ability according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 2c is a photograph confirming the osteoblast differentiation ability according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 2d is a graph of the result of confirming the osteoblast differentiation ability according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 2e is a photograph confirming the cartilage differentiation ability according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 3a is a photograph showing the results of screening for insulin by analyzing the secreted protein increased by co-culturing tonsil-derived mesenchymal stem cells with Schwann cells according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 3b is a graph comparing the insulin gene expression of mesenchymal stem cells by co-culturing tonsil-derived mesenchymal stem cells with Schwann cells according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 4a is a graph confirming that the proliferation capacity of Schwann cells increases when the Schwann cells are treated with insulin protein by concentration according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 4b is a graph confirming that the proliferation capacity of Schwann cells increases when the Schwann cells are treated with insulin protein by concentration according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 4c is a graph confirming that the proliferation capacity of Schwann cells increases when the Schwann cells are treated with insulin protein by concentration according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 4d is a photograph showing the result confirming that the proliferation ability of Schwann cells is activated through ERK and Akt pathways when 100 nM of insulin protein is treated in Schwann cells according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 5 is a graph showing the result confirming that insulin expression in umbilical cord-derived mesenchymal stem cells is increased when co-cultured with umbilical cord-derived mesenchymal stem cells with Schwann cells according to an embodiment of the present invention.
  • 6A is a graph confirming that Rotarod behavioral ability increases when insulin protein is administered to mice with Charcot-Marie-Tooth disease according to an embodiment of the present invention.
  • 6B is a graph confirming that the GripStrength behavioral ability increases when insulin protein is administered to mice with Charcot-Marie-Tooth disease according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 7 is a graph confirming that PMP22 gene expression is reduced when insulin protein is administered to mice with Charcot-Marie-Tooth disease according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 8A is a photograph confirming that the myelination of the nervous tissue is increased when insulin protein is administered to mice with Charcot-Marie-Tooth disease according to an embodiment of the present invention.
  • 8B is a graph confirming that the myelination of nervous tissue is increased when insulin protein is administered to mice with Charcot-Marie-Tooth disease according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 8c is a graph confirming that the thickness of myelination of the nervous tissue increases according to the concentration of insulin protein in mice with Charcot-Marie-Tooth disease according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 8d is a photograph confirming that myelination of nerve tissue is increased when insulin protein is administered to mice with Charcot-Marie-Tooth disease according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 8e is a graph confirming that myelination of nerve tissue is increased when insulin protein is administered to mice with Charcot-Marie-Tooth disease according to an embodiment of the present invention.
  • 8f is a photograph confirming that the myelination of the nervous tissue is increased when insulin protein is administered to mice with Charcot-Marie-Tooth disease according to an embodiment of the present invention.
  • 8g is a graph confirming that the myelination of the nervous tissue is increased when insulin protein is administered to mice with Charcot-Marie-Tooth disease according to an embodiment of the present invention.
  • 9A is a photograph confirming that calf muscle tissue formation is increased when insulin protein is administered to mice with Charcot-Marie-Tooth disease according to an embodiment of the present invention.
  • 9B is a graph confirming that calf muscle tissue formation is increased when insulin protein is administered to mice with Charcot-Marie-Tooth disease according to an embodiment of the present invention.
  • 9c is a photograph confirming that calf muscle tissue formation is increased when insulin protein is administered to mice with Charcot-Marie-tooth disease according to an embodiment of the present invention.
  • 9D is a graph confirming that calf muscle tissue formation is increased when insulin protein is administered to mice with Charcot-Marie-Tooth disease according to an embodiment of the present invention.
  • 9E is a graph confirming that calf muscle tissue formation is increased when insulin protein is administered to mice with Charcot-Marie-Tooth disease according to an embodiment of the present invention.
  • a pharmaceutical composition for preventing or treating Charcot-Marie-Tooth disease comprising mesenchymal stem cells.
  • the cells obtained by culturing tonsil-derived mesenchymal stem cells in ⁇ -MEM containing FBS at 37° C., saturated humidity and 5% CO 2 were obtained at 80% confluence.
  • the obtained cells were analyzed for the expression pattern of mesenchymal stem cell-specific cell surface markers (CD90, CD105, CD73, CD166 and CD44) according to the requirements of ISCT (International Society for Cellular Therapy), and mesenchymal stem cells for purity analysis
  • Cells expressing negative markers (CD34, CD45, CD19, CD11b, CD14 and HLA-DR) were analyzed by flow cytometry. The results are shown in FIG. 1 .
  • tonsil-derived mesenchymal stem cells expressed more than 95% of mesenchymal stem cell-specific cell surface markers, and did not express negative markers of mesenchymal stem cells. Cells were confirmed.
  • Example 2 Confirmation of the differentiation ability of tonsil-derived mesenchymal stem cells into adipocytes, osteoblasts or chondrocytes
  • tonsil-derived mesenchymal stem cells After culturing tonsil-derived mesenchymal stem cells, they were each differentiated using a differentiation medium that differentiates them into typical mesenchymal cells, such as adipocytes, osteoblasts, or chondrocytes.
  • a differentiation medium that differentiates them into typical mesenchymal cells, such as adipocytes, osteoblasts, or chondrocytes.
  • the cells obtained by culturing tonsil-derived mesenchymal stem cells in ⁇ -MEM containing FBS at 37° C., saturated humidity and 5% CO 2 were obtained at 80% confluence. After culturing for 10 to 30 days in a differentiation medium for differentiating the obtained cells into osteoblasts, chondrocytes or adipocytes, it was confirmed whether the cells were differentiated or not.
  • StemPro Adipogenesis Differentiation Kit was used for adipocyte differentiation
  • StemPro Osteogenesis Differentiation Kit was used for osteoblast differentiation
  • BMP-6, TGF ⁇ 3, ITS, dexamethasone, ascorbic acid, L-proline were used in DMEM medium for chondrocyte differentiation.
  • a medium containing sodium pyruvate was used.
  • Adipocytes were stained with oil-red O, osteoblasts were stained with Alizarin red S, and chondrocytes were stained with Safranin-O, and the results are shown in FIGS. 2a to 2d.
  • RNA was reacted at 65° C. for 5 minutes, 23° C. for 10 minutes, 55° C. for 10 minutes, and 80° C. for 10 minutes using SuperScript IV Reverse Transcriptase Kit (Invitrogen).
  • tonsil-derived mesenchymal stem cells were differentiated into mesenchymal cells, such as adipocytes, osteoblasts, or chondrocytes, under a suitable differentiation medium.
  • Antibody arrays were performed to find secreted substances that promote the proliferation of Schwann cells during co-culture of Schwann cells and tonsil-derived mesenchymal stem cells. Specifically, for protein analysis, experiments were conducted using RayBio Biotin Label-based Human Antibody Array (#AAH-BLG-1-4, RayBiotech, Inc., GA, USA), and Axon GenePix 4000B scanner (Molecular Devices, CA) , USA) and analyzed using GenePix Pro 6.0 (Molecular Devices, CA, USA). The results are shown in Fig. 3a and Table 3, and insulin was screened with a substance likely to induce the proliferation of Schwann cells through a literature search, etc., and the results are shown in Figs. 3a and Table 3.
  • Example 2 insulin expression was confirmed in mesenchymal stem cells co-cultured using an insulin primer in the same manner as for gene expression analysis through qRT-PCR, and the results are shown in FIG. 3B and Table 4.
  • the degree of cell proliferation was measured using a CCK-8 (Dojindo) test method to measure the absorbance at 450 nM in a spectrophotometer.
  • ATP was measured using CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (Promega Corporation), and finally 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU), which is bound during DNA synthesis of cells, was confirmed.
  • This test method was analyzed using Cell Proliferation ELISA, BrdU (colorimetric) (Roche).
  • the cells were obtained 24 hours later, the pellet was put in RIPA buffer, the cells were disrupted by a sonicator, and the supernatant was centrifuged at 13,000 rpm at 4°C for 15 minutes. After protein quantitation, 30 ug of protein was loaded on an SDS-PAGE gel. After that, the gel loaded in PVDF was transferred and blocked with 5% skim milk for 1 hour, and then P-ERK1/2, ERK1/2, P-AKT, AKT, and ⁇ -actin antibodies were applied at 4°C for 24 hours. pasted After the HRP-attached secondary antibody reaction and washing process, the band of the protein was confirmed using the ECL solution, and the results are shown in FIG. 4D .
  • Example 2 insulin expression was measured in mesenchymal stem cells co-cultured with Schwann cells using an insulin primer in umbilical cord-derived mesenchymal stem cells in the same manner as gene expression analysis through qRT-PCR, and the results are shown in FIG. 5 and Table 8.
  • Insulin 12 U/kg concentration was intravenously administered to 5-week-old Charcot-Marie-Tooth disease mice, and 2 weeks later, the results of confirming the increase in behavioral ability through the Rotarod experiment as in Example 5 are shown in FIGS. 6A and 9 .
  • Insulin 12 U/kg concentration was intravenously administered to 5-week-old Charcot-Marie-tooth disease mice, and 2 weeks later, the results of confirming the increase in behavioral ability through the Grip Strength experiment as in Example 5 are shown in Figures 6b and 10. .
  • Insulin 12 U/kg concentration was intravenously administered to 5-week-old Charcot-Marie-Tooth disease mice, and sciatic nerve tissue was collected 2 weeks later, and the same as in the gene expression analysis through qRT-PCR in Example 2
  • the expression of PMP22 was confirmed in mouse nervous tissue with the PMP22 primer, and the results are shown in FIGS. 7 and 11 .
  • Insulin 12 U/kg concentration was intravenously administered to 5-week-old Charcot-Marie-Tooth disease mice, and sciatic nerve tissue was collected 2 weeks later, and the same method as in Example 7 for tissue structure analysis with a transmission electron microscope. The observed results are shown in FIGS. 8A to 8C and Tables 12 and 13.
  • a concentration of 12 U/kg of insulin was intravenously administered to a 5-week-old Charcot-Marie-Tooth disease mouse, and the sciatic nerve tissue was collected two weeks later, and the results observed with a confocal microscope in Example 7 It is shown in Figure 8d and Table 14.
  • Insulin 12 U/kg concentration was intravenously administered to 5-week-old Charcot-Marie-Tooth disease mice, sciatic nerve tissue was collected one month later, and protein expression using western blotting in Example 3
  • the MPZ expression level was confirmed using the MPZ antibody in the same manner as in the analysis, and the results are shown in FIGS. 8f, 8g and Table 15.
  • Insulin 12 U/kg concentration was intravenously administered to 5-week-old Charcot-Marie-Tooth disease mice, and after 2 weeks, gastrocnemius muscle tissue was collected and the same method as for protein expression analysis using a fluorescent antibody in Example 7 By measuring the increase in muscle formation using the Dystrophin antibody, the results are shown in FIGS. 9a, 9b and Table 16.
  • a concentration of 12 U/kg of insulin was intravenously administered to a 5-week-old Charcot-Marie-Tooth disease mouse, and 2 weeks later, the calf muscle tissue was photographed using an MRI device, and the results are shown in FIG. 9c .
  • the cross-sectional area of the main muscle was measured and the volume of the muscle tissue was shown in FIGS. 9D and 17 and in FIGS. 9E and 18 .
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating Charcot-Marie-Tooth disease, comprising mesenchymal stem cells or insulin secreted from mesenchymal stem cells.

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Abstract

본 발명은 중간엽 줄기세포 또는 중간엽 줄기세포에서 분비된 인슐린을 포함하는 샤르코-마리-투스병 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

Description

중간엽 줄기세포 또는 중간엽 줄기세포에서 분비된 인슐린을 포함하는 샤르코-마리-투스병 예방 또는 치료용 약학적 조성물
본 발명은 보건복지부의 지원 하에서 과제고유번호 HI14C3484에 의해 이루어진 것으로서, 상기 과제의 연구관리전문기관은 보건산업진흥원, 연구사업명은 "연구중심병원육성R＆D", 연구과제명은 "줄기세포 재생치료제의 GMP 기반 기술 및 차세대 기술 연구", 주관기관은 삼성서울병원, 연구기간은 2020.01.01 ~ 2020.12.31이다.
또한, 본 발명은 삼성서울병원 내부과제의 지원 하에서 과제고유번호 GFO3190121에 의해 이루어진 것으로서, 상기 과제의 연구관리전문기관은 삼성서울병원, 연구사업명은 "20*20 PROJECT", 연구과제명은 "샤르코-마리-투스병의 맞춤형 진단 및 치료법 개발", 주관기관은 삼성서울병원, 연구기간은 2014.01.01 ~ 2020.12.31이다.
또한, 본 발명은 중소기업기술정보진흥원의 지원 하에서 과제고유번호 S2644635에 의해 이루어진 것으로서, 상기 과제의 연구관리전문기관은 (사)한국엔젤투자협회, 연구사업명은 "기술창업투자연계", 연구과제명은 "효능증진 신 줄기세포(Enhanced Neo Cell)를 활용한 차세대 희귀 근육질환 치료제 개발", 주관기관은 이엔셀 주식회사, 연구기간은 2018.08.01 ~ 2020.07.31이다.
본 특허출원은 2020년 03월 20일에 대한민국 특허청에 제출된 대한민국 특허출원 제10-2020-0034461호에 대하여 우선권을 주장하며, 상기 특허출원의 개시 사항은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명은 중간엽 줄기세포 또는 중간엽 줄기세포에서 분비된 인슐린을 포함하는 샤르코-마리-투스병 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
중간엽 줄기세포 (mesenchymal stem cell)는 스트로마 기원의 세포로 자기 재생 (self-renewal)의 특징을 가지고 있으며 골, 연골, 지방조직, 근육, 건, 인대, 신경조직 등으로 분화할 수 있어 세포 치료요법에 적합한 세포로 주목받고 있다.
현재 중간엽 줄기세포를 얻을 수 있는 가장 대표적 기원 조직으로 골수 (bone marrow)를 들 수 있다. 그러나, 골수에 존재하는 간엽 줄기세포는 제한적인 분화능과 증식능력으로 인해 그 응용범위가 한정적일 수밖에 없으며, 골수로부터 유래하는 한계로 인해 여러 단계의 시술이 필요하고, 시술 과정이 복잡하여 채취 대상자에게 시간적, 정신적 및 육체적 고통을 수반하는 것이 보통이다. 또한, 골수 이식을 위해서는 조직적합항원 비교를 통해 항원 표현형이 일치하여 이식편대숙주반응을 보이지 않는 공여자를 찾아야 한다는 문제점이 있다.
탯줄은 골수와는 달리 분만과정에서 간단한 시술을 통해 얻을 수 있으며, 그 양에 비해 수많은 조혈모세포 및 줄기세포를 포함하고 있다. 최근에는, 탯줄, 태반, 제대혈 등에 많은 양의 줄기세포가 있는 것으로 알려지면서 연구가 활발히 이루어지고 있다. 그러나, 아직까지 탯줄로부터 분리·배양한 중간엽 줄기세포 또는 중간엽 줄기세포에서 분비되는 인자가 근육세포 사멸을 억제한다고 보고된 바는 없다.
유전성 말초신경병증 (Inherited peripheral neuropathy; IPN)은 유전적으로 그리고 임상적으로 유전성 운동 및 감각 신경병증 (hereditary motor and sensory neuropathy; HMSN)이라고도 불리는 샤르코-마리-투스병 (Charcot-Marie-Tooth disease; CMT), 압박마비유전신경병 (hereditary neuropathy with liability to pressure palsy; HNPP), 유전운동신경병 (hereditary motor neuropathy; HMN) 및 유전성감각 자율신경병증 (hereditary sensory and autonomic neuropathy; HSAN)을 포함하는 질환이다.
샤르코-마리-투스병은 말초신경의 축삭 변성을 일으키는 다양한 유전자 돌연변이와 관련된 유전성 신경근 질환이다. 주된 임상양상은 상지 및 하지 원위부 중심의 근육 소실과 감각 상실이다. 여러 가지 아형들 사이뿐 아니라 동일한 아형 내에서도 질병의 임상 경과가 다양하게 나타날 수 있음이 보고된 바 있어, 환자에 대한 면밀한 모니터링이 필요하다.
또한, 샤르코-마리-투스병은 2,500명당 1명의 빈도로 IPN 중에서 가장 흔히 발생하는 질환으로서, 병이 진행함에 따라 근육의 위축, 쇠약, 발의 기형, 및 다리의 감각 상실과 같은 임상적 특징을 갖는 대칭성 원위부 다발신경병증이다.
샤르코-마리-투스병의 발병 원인으로 80개 이상의 다양한 원인 유전자가 분리되었으며, 이중 가장 주요한 원인 유전자는 PMP22 (peripheral myelin protein 22), MPZ (myelin protein zero), GJB1 (gap junction protein beta 1) 및 MFN2 (mitofusin 2)으로서 이들 유전자가 CMT 발병의 약 90%를 차지한다. 이러한 유전자들은 상염색체 우성 또는 X염색체 우성 방식으로 유전되어 질병을 유발한다. CMT의 95% 이상은 우성유전이며, 극소수만 상염색체 열성 또는 X염색체 열성 방식으로 유전된다. 또한, 상염색체 우성의 대부분이 PMP22 유전자의 중복에 의해 유발되나, 50% 이상은 40개 이상의 유전자의 점돌연변이 (point mutation)에 의해 유발된다.
임상적으로 유전적 열성질환을 위한 치료법은 유전자 치료, 효소 보충요법, 및 세포 이식 등이 있으나, 이러한 임상적 접근은 돌연변이 단백질의 기능 획득 변이 (gain-of-function)에 의해 유발되는 우성질환의 경우에는 제한적이다. 이러한 돌연변이 단백질의 해로운 영향을 막기 위해 다양한 치료법이 제안되고 있으나, 기본적인 치료법은 돌연변이 대립유전자 또는 단백질의 발현억제 또는 제거를 기반으로 해야 한다.
본 발명자들은 중간엽 줄기세포 또는 중간엽 줄기세포에서 분비된 인슐린이 슈반세포의 증식능을 촉진하는 효과가 있음을 확인하였고, 이를 통한 수초형성을 회복시키는 기전으로 샤르코-마리-투스병 치료제를 완성하였다.
이에 본 발명의 목적은 중간엽 줄기세포 또는 중간엽 줄기세포에서 분비된 인슐린를 포함하는 샤르코-마리-투스병 예방 또는 치료용 약학적 조성물 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 인슐린 또는 이의 유도체를 유효성분으로 포함하는 샤르코-마리-투스병 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 중간엽 줄기세포 또는 중간엽 줄기세포에서 분비된 인슐린를 포함하는 샤르코-마리-투스병 치료용 줄기세포 치료제를 제공하는 것이다.
본 발명은 중간엽 줄기세포 또는 중간엽 줄기세포에서 분비된 인슐린을 포함하는 샤르코-마리-투스병 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일 예는 중간엽 줄기세포를 포함하는 샤르코-마리-투스병 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 용어 "중간엽 줄기세포"는 뼈, 연골, 지방, 힘줄, 신경 조직, 섬유아세포 및 근육 세포 등 구체적인 장기의 세포로 분화되기 전의 만능 전구 세포를 말한다.
본 발명에 있어서 중간엽 줄기세포는 인슐린 분비능을 갖는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 중간엽 줄기세포는 인슐린을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 인슐린은 중간엽 줄기세포로부터 분비된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 중간엽 줄기세포는 분화되지 않은 상태로 조성물 중에 함유된 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 중간엽 줄기세포는 인간 또는 인간을 제외한 포유 동물로부터 유래한 것일 수 있으며, 예를 들어, 인간의 태아로부터 유래된 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 인간을 제외한 포유동물은 개, 고양이, 원숭이, 소, 양, 돼지, 말, 랫트, 마우스 또는 기니피그 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 중간엽 줄기세포는 편도, 탯줄, 배낭, 태반, 제대, 제대혈, 피부, 말초혈액, 골수, 지방 조직, 근육, 간, 신경 조직, 골막, 태아막, 활액막, 활액, 양막, 반월상연골, 전십자 인대, 관절 연골세포, 유치, 혈관주위세포, 지주골, 슬개골하 지방괴, 비장 및 흉선 등에서 유래할 수 있으며, 예를 들어, 인간의 편도 또는 인간 탯줄에서 유래한 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 중간엽 줄기세포의 분리방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 인간의 편도, 탯줄, 배낭, 태반, 제대, 제대혈, 피부, 말초혈액, 골수, 지방 조직, 근육, 간, 신경 조직, 골막, 태아막, 활액막, 활액, 양막, 반월상연골, 전십자 인대, 관절 연골세포, 유치, 혈관주위세포, 지주골, 슬개골하 지방괴, 비장 및 흉선 등으로부터 분리되고 정제될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 분리된 중간엽 줄기세포는 필요에 따라 배양할 수도 있다.
본 발명에 있어서 중간엽 줄기세포는 세포 단독 혹은 배양기에서 배양된 상태로 환자의 생체 내로 주입될 수 있는데, 예를 들어, 린드발 등 (1989, Arch. Neurol. 46: 615-31) 또는 더글라스 콘치올카 (Douglas Kondziolka, Pittsburgh,1998)가 발표한 임상방법을 이용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
국제 줄기세포 위원회 (International Society for Cellular Therapy, ISCT)에서 정한 중간엽 줄기세포는 배양조건에서 바닥에 부착되어 자라야 하고, 시험관 내에서 조골세포, 지방세포 또는 연골세포로 분화할 수 있어야 하고, 세포 표면 마커로서 CD73, CD90, CD105, CD166 및 CD44을 발현 (Positive marker)해야 하고, CD34, CD45, CD19, CD11b, CD14 및 HLA-DR은 발현하지 않아야 (negative marker) 한다.
상기 제제에는 상기 중간엽 줄기세포 외에 약학적으로 허용 가능한 통상의 담체를 포함할 수 있고, 주사제의 경우 보존제, 무통화제, 가용화제 또는 안정화제, 국소투여용 제제의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제 또는 보존제 등을 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 더 포함할 수 있으며, 상기 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태일 수 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 비경구로 투여할 수 있고, 정맥 내, 피하, 복강 내 투여 또는 국소 적용이 가능하며, 바람직하게는 병변이 발생한 부위에 직접 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물의 비경구 투여용 조성물 (예를 들어, 주사제)은 약학적으로 허용 가능한 담체, 예를 들어, 멸균 정제수, 약 pH 7의 완충액, 또는 생리식염수 중에 분산 및/또는 용해시켜 생체 내에 주입될 수 있으며, 필요할 경우, 보존제, 안정화제 등과 같은 통상의 첨가제를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 약학적 조성물의 제형은 사용방법에 따라 달라질 수 있으나, 경고제 (Plasters), 과립제 (Granule), 산제 (Powders), 시럽제 (Syrups), 액제 (solutions), 유동엑스제 (FluidextractsI), 유제 (Emulsions), 현탁제 (Suspensions), 침제 (Infusions), 정제 (Tablets), 주사제 (Injections), 캅셀제 (Capsules) 및 환제 (Pills)등으로 제조할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 약학적 조성물의 적합한 제형은 선택된 투여 루트에 따라 좌우된다. 공지 기술들, 담체 및 부형제들 중의 어느 것이라도 적합하게, 그리고 당해 분야, 예를 들어, 앞서 설명한 Remingston's Pharmaceutical Sciences에서 이해되는 바와 같이 사용될 수 있다.
본 발명에서 주입되는 중간엽 줄기세포의 양은 103 내지 1010 cells/회로 투여될 수 있으며, 바람직하게는 103 내지 109 cells/회로 투여될 수 있으며, 가장 바람직하게는 5 x 104 cells/회로 투여될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 주입되는 인슐린은 0.0001 ng 내지 500 mg/회로 투여될 수 있으며, 바람직하게는 0.0001 mg 내지 200 mg/회로 투여될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 약학적 조성물의 투여 용량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "예방"은 본 발명의 약학적 조성물의 투여로 샤르코-마리-투스병을 억제시키거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "치료"는 본 발명의 조성물의 투여로 샤르코-마리-투스병이 호전 또는 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 다른 일 예는 인슐린 또는 이의 유도체를 유효성분으로 포함하는 샤르코-마리-투스병 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서 인슐린은 자연적으로 생성되고 중간엽 줄기세포로부터 유래된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 인슐린이 자연적으로 생성된 인슐린인 경우 보통 동물과 연관된 인슐린의 야생형 아미노산 서열을 갖는 인슐린을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 자연적으로 생성된 인슐린은 자연적으로 생성된 인슐린의 변이체를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 인슐린은 샤르코-마리-투스병 예방 또는 치료 효과를 달성하는 생물활성을 가진 한 당 분야의 알려진 방법으로 재조합된 단백질, 이들의 유사체, 유도체, 돌연변이체들을 제한 없이 포함할 수 있다.
본 발명에서 돌연변이는 자연계에서 발견되는 돌연변이 또는 인슐린을 코딩하는 핵산 서열에 하나 이상의 아미노산을 치환, 결실 또는 삽입한 효과를 갖거나 갖지 않는 인공적 돌연변이일 수 있다.
본 발명에 있어서 돌연변이는 인슐린 발현에 영향을 주지 않는 보존적 아미노산 치환을 가질 수 있으며, 자연계의 인슐린의 아미노산 서열과 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서 인슐린은 단편, 결실, 절두 등에 의한 폴리펩티드 변이체로 이루어진 것을 포함하며, 자연계의 인슐린으로부터 아미노산 잔기가 제거된 단편일 수 있다. 이러한 단편, 결실, 절두 등은 생성된 폴리펩티드의 활성에 사실상 부정적 영향을 주지 않는다. 구체적 양태에서, 인슐린의 단백질 도메인의 맵핑에 의해 또는 C-말단, N-말단, 또는 C-말단과 N-말단 단부 둘다로부터의 절두를 통해 인슐린의 활성화 도메인을 도출해 낼 수 있으며, 이러한 절두된 폴리펩티드는 활성에 사실상 부정적 영향을 주지 않거나 활성의 증가를 나타낼 수 있다.
본 발명에 있어서 "재조합"은 세포와 관련하여 사용될 때, 전형적으로 세포가 외래 핵산 서열의 도입에 의해 변형되었거나 세포가 그렇게 변형된 세포로부터 유래됨을 나타낸다. 예를 들어, 재조합 세포는 천연 (native; 비-재조합) 형태의 세포 내에서는 동일한 형태로 발견되지 않는 유전자를 포함할 수 있거나, 또는 재조합 세포는 (천연 형태의 세포에서 발견되는) 천연 유전자를 포함할 수 있지만, 그러나 이러한 유전자는 변형되어 세포 내로 재도입된 것이다. 재조합 세포는 세포로부터의 핵산의 제거 없이, 변형된 세포에 내재하는 핵산을 포함할 수 있으며 그러한 변형은 유전자 치환, 부위-특이적 돌연변이 및 당업자에게 공지된 관련 기술에 의해 얻어지는 것들을 포함한다. 재조합 DNA 기술은, 시험관 내에서 재조합 DNA를 생산하고, 그러한 재조합 DNA를 발현 또는 전파될 수 있는 세포 내로 전달하여 재조합 폴리펩티드를 생산하는 기술을 포함한다. 폴리뉴클레오티드 또는 핵산의 "재조합", "재조합하는", 및 "재조합된"은 일반적으로, 둘 이상의 핵산 또는 폴리뉴클레오티드 가닥들 또는 단편들을 조립 또는 조합하여 새로운 폴리뉴클레오티드 또는 핵산을 생성하는 것을 지칭한다. 재조합 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 때때로 키메라로 지칭된다. 핵산 또는 폴리펩티드는, 인공적이거나 또는 엔지니어링된 경우에, "재조합" 핵산 또는 폴리펩티드이다.
재조합 인슐린은 영장류, 인간, 원숭이, 토끼, 돼지, 설치류, 마우스, 랫트, 햄스터, 게르빌루스쥐, 개, 고양이로부터 유래된 임의의 멤버, 및 그의 생물학적 활성 유도체를 포함하는 것일 수 있으며, 활성을 갖는 돌연변이 및 변이형 인슐린이 인슐린의 기능적 단편 및 융합 단백질과 마찬가지로 포함된다.
본 발명에 있어서 "유도체"란 인슐린의 구조 일부를 다른 원자단, 치환기 등으로 치환하여 얻어지는 것 또는 다른 생물학적 물질과 결합 또는 융합된 하나 이상의 인슐린을 포함하는 것일 수 있으며, 당업계에 공지되어 있는 단백질의 개량 방법에 의해 개량된 단백질을 포함한다.
본 발명에 있어서 다른 생물학적 물질과 결합된 하나 이상의 인슐린은 항체, 항체의 절편, 면역 글로불린, 펩타이드, 효소, 성장인자 (growth factor), 사이토카인 (cytokine), 전사인자, 독소, 항원성 펩티드, 호르몬, 운반 단백질, 운동 기능 단백질, 수용체, 신호 (signaling) 단백질, 저장 단백질, 막 단백질, 막횡단 (transmembrane) 단백질, 내부 (internal) 단백질, 외부 (external) 단백질, 분비 단백질, 바이러스 단백질, 당 단백질, 절단된 단백질, 단백질 복합체, 또는 화학적으로 개질된 단백질 등이 융합된 인슐린 융합 단백질일 수 있다.
본 발명에 있어서 생물학적 물질은 결합된 폴리펩티드를 분리 또는 확인하는 데 유용한 다양한 작은 펩티드, 다른 단백질, 화학적 수단 (예를 들어, tag)을 제한 없이 포함한다.
본 발명에 있어서 생물학적 물질은 인슐린 아미노산 서열의 N 말단 및/또는 C 말단에 융합될 수 있으며, 당 업계에 공지된 방법에 의해서 제조될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 인슐린과 융합될 수 있는 일부 융합 도메인은 친화성 크로마토그래피에 의한 융합 단백질의 단리에 특히 유용하다. 친화도 정제의 목적상, 친화성 크로마토그래피를 위한 적절한 매트릭스, 예를 들어, 글루타티온-, 아밀라제- 및 니켈- 또는 코발트-접합 수지가 사용된다. 다수의 그러한 매트릭스는 파마시아 지에스티 (Pharmacia GST) 정제 시스템 및 (HIS6) 융합 파트너와 유용한 큐엘에이익스프레스 (QLAexpress)TM 시스템 (카이아진, Qiagen)과 같이 "키트" 형태로 이용 가능하다.
또 다른 예로서, 융합 도메인은 인슐린의 검출을 촉진하도록 선택될 수 있다. 그러한 검출 도메인의 예는 특정 항체가 이용 가능한 일반적으로 길이가 짧은 펩티드 서열인 "에피토프 태그"뿐만 아니라 다양한 형광 단백질 (예를 들어, GFP)도 포함한다. 특정 모노클로날 항체가 쉽사리 이용가능한 주지의 에피토프 태그는 FLAG, 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 (HA) 및 c-myc 태그를 포함한다. 일부 경우에 있어서, 융합 도메인은 적절한 프로테아제로 하여금 융합 단백질을 부분적으로 소화하도록 해주고 그리하여 그로부터 재조합 단백질을 유리시키게 해주는 프로테아제 절단 부위, 예를 들어, 인자 Xa 또는 트롬빈에 대한 프로테아제 절단 부위를 갖는다. 이어서 유리된 단백질은 후속 크로마토그래피 분리에 의하여 융합 도메인으로부터 단리시킬 수 있다.
또한, 상기 도메인은 예컨대 폴리아르기닌-태그 (Arg-tag), Strep-태그 (Strep-tag), S-태그 (S-tag), 칼모듈린-결합 펩티드 (calmodulin-binding peptide), 셀룰로오스-결합 도메인 (cellulose-binding domain), SBP-태그 (SBPtag), 키틴-결합 도메인 (chitin-binding domain), 글루타티온 S-트랜스퍼라제-태그 (glutathione S-transferase-tag), 말토오스-결합 단백질 (maltose-binding protein), NusA, TrxA, DsbA, protein A, protein G, 인간 알부민 (human albumin) 등을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예이 있어서, 인슐린은 생체 내에서 인슐린을 안정화시키는 도메인 ("스태빌라이저" 도메인)과 융합될 수 있다.
본 발명에 있어서 "안정화시키는"이란 혈청 반감기 증가가 감소된 파괴, 신장에 의한 감소된 클리어런스 또는 다른 약동학적 효과 때문인지 여부에 관계 없이 혈청 반감기를 증가시키는 무언가를 의미한다.
이뮤노글로불린의 Fc 부분과의 융합은 광범위의 단백질에 바람직한 약동학적 특성을 부여하는 것으로 알려져 있다. 마찬가지로, 인간 혈청 알부민에의 융합은 바람직한 특성을 부여할 수 있다. 선택될 수 있는 융합 도메인의 다른 유형은 다량체화 (예를 들어, 이량체화, 사량체화) 도메인 및 (소망에 따라, 추가의 생물학적 기능을 부여하는) 기능적 도메인을 포함한다. 융합체는 이종 펩티드가 인슐린의 아미노 말단에서 및/또는 인슐린의 카르복시 말단에서 융합되도록 구축될 수 있다.
발명의 일 구체적인 양태에 있어서, 인슐린의 아미노산 서열은 그의 단편을 포함하는 재조합 폴리펩티드, 천연 폴리펩티드, 또는 합성 폴리펩티드일 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 다량체이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 이량체이다. 본원에 기재된 결합제의 일부 아미노산 서열은 단백질의 구조 또는 기능에 대해 유의한 영향을 미치지 않으면서 달라질 수 있다는 것이 관련 기술분야에서 인지될 것이다. 따라서, 본 발명은 실질적 활성을 나타내거나, 그의 단편의 영역을 포함하는 인슐린의 변이를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 아미노산 서열 변이는 결실, 삽입, 반전, 반복 및/또는 다른 유형의 치환을 포함한다.
본 발명에 있어서 인슐린은 통상적으로 폴리펩티드의 일부가 아닌 추가의 화학적 모이어티 (moiety)를 함유하도록 변형될 수 있다. 유도체화 모이어티는 폴리펩티드의 용해도, 생물학적 반감기 및/또는 흡수를 개선시키거나 또는 달리 조절할 수 있다. 모이어티는 또한 폴리펩티드 및 변이체의 바람직하지 않은 부작용을 감소시키거나 또는 제거할 수 있다. 화학적 모이어티에 대한 개관은 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22st Edition, 2012, Pharmaceutical Press, London]에서 찾아볼 수 있다.
본 발명의 인슐린은 치료 효과의 증진을 위하여 생물활성 화합물과 추가로 결합되어 존재할 수 있다.
본 발명에 있어서 용어 "생물활성 화합물"은 상기 질병을 갖는 포유류에 적용되었을 때 질병을 변형하는 화합물을 말한다. 생물 활성 화합물은 길항 (antagonistic) 또는 작용물질 (agonistic) 특성들을 포함할 수 있고, 또는 단백질성 생물활성 화합물 또는 비-단백질성 생물활성 화합물일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 샤르코-마리-투스병 예방 및/또는 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 일예는 중간엽 줄기세포를 포함하는 샤르코-마리-투스병 치료용 줄기세포 치료제에 관한 것이다.
본 발명에 있어서 중간엽 줄기세포는 인슐린 분비능을 갖는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 중간엽 줄기세포는 인슐린을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 인슐린은 중간엽 줄기세포로부터 분비된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 중간엽 줄기세포는 분화되지 않은 상태로 세포치료제 중에 함유된 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 중간엽 줄기세포는 인간 또는 인간을 제외한 포유동물로부터 유래한 것일 수 있으며, 예를 들어, 인간의 태아로부터 유래된 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 인간을 제외한 포유동물은 개, 고양이, 원숭이, 소, 양, 돼지, 말, 랫트, 마우스 또는 기니피그 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 중간엽 줄기세포는 편도, 탯줄, 배낭, 태반, 제대, 제대혈, 피부, 말초혈액, 골수, 지방 조직, 근육, 간, 신경 조직, 골막, 태아막, 활액막, 활액, 양막, 반월상연골, 전십자 인대, 관절 연골세포, 유치, 혈관주위세포, 지주골, 슬개골하 지방괴, 비장 및 흉선 등에서 유래할 수 있으며, 예를 들어, 인간의 편도 또는 인간 탯줄에서 유래한 것일 수 있다.
본 발명에서 용어 "세포 치료제"는 세포와 조직의 기능을 복원하기 위하여 살아있는 자가 (autologous), 동종 (allogenic), 혹은 이종 (xenogenic)의 세포를 체외에서 증식, 선별하거나 여러 가지 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 일련의 행위를 통하여 치료, 진단, 예방의 목적으로 사용하는 의약품 (KFDA가 고시한 생물학적 제재 등의 품목허가 심사고시(2008-78호) 제2조)를 의미한다.
본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.
본 발명은 중간엽 줄기세포 또는 중간엽 줄기세포에서 분비된 인슐린을 포함하는 샤르코-마리-투스병 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 중간엽 줄기세포 또는 중간엽 줄기세포에서 분비된 인슐린이 슈반세포의 증식능을 촉진하는 효과를 통해 통한 수초형성을 회복시키는 기전으로 샤르코-마리-투스병을 예방 또는 치료할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 편도 (Tonsil)에서 중간엽 줄기세포를 분리하여 줄기세포능 분석 진행 결과를 보여주는 그래프이다.
도 2a는 본 발명의 일 실시예에 따라 지방 분화능력을 확인한 사진이다.
도 2b는 본 발명의 일 실시예에 따라 지방 분화능력을 확인한 결과 그래프이다.
도 2c는 본 발명의 일 실시예에 따라 조골 분화능력을 확인한 사진이다.
도 2d는 본 발명의 일 실시예에 따라 조골 분화능력을 확인한 결과 그래프이다.
도 2e는 본 발명의 일 실시예에 따라 연골 분화능력을 확인한 사진이다.
도 3a는 본 발명의 일 실시예에 따라 편도 유래 중간엽 줄기세포를 슈반세포와 공동배양하여 증가되는 분비 단백질을 분석하여 인슐린을 스크리닝한 결과를 보여주는 사진이다.
도 3b는 본 발명의 일 실시예에 따라 편도 유래 중간엽 줄기세포를 슈반세포와 공동배양하여 중간엽 줄기세포의 인슐린 유전자 발현을 비교한 결과 그래프이다.
도 4a는 본 발명의 일 실시예에 따라 슈반세포에 인슐린 단백질을 농도별로 처리하였을 때 슈반세포의 증식능이 증가하는 것을 확인한 그래프이다.
도 4b는 본 발명의 일 실시예에 따라 슈반세포에 인슐린 단백질을 농도별로 처리하였을 때 슈반세포의 증식능이 증가하는 것을 확인한 그래프이다.
도 4c는 본 발명의 일 실시예에 따라 슈반세포에 인슐린 단백질을 농도별로 처리하였을 때 슈반세포의 증식능이 증가하는 것을 확인한 그래프이다.
도 4d는 본 발명의 일 실시예에 따라 인슐린 단백질 100nM을 슈반세포에 처리하였을 때, ERK, Akt 경로를 통해 슈반세포의 증식능이 활성화되는 것을 확인한 결과를 보여주는 사진이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예 따라 탯줄 유래 중간엽 줄기세포를 슈반세포와 공동 배양하였을 때 탯줄 유래 중간엽 줄기세포에서 인슐린 발현이 증가되는 것을 확인한 결과 그래프이다.
도 6a는 본 발명의 일 실시예에 따라 인슐린 단백질을 샤르코-마리-투스 질환 마우스에 투여했을 때 Rotarod 행동 능력이 증가하는 것을 확인한 그래프이다.
도 6b는 본 발명의 일 실시예에 따라 인슐린 단백질을 샤르코-마리-투스 질환 마우스에 투여했을 때 GripStrength 행동 능력이 증가하는 것을 확인한 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 인슐린 단백질을 샤르코-마리-투스 질환 마우스에 투여했을 때 PMP22 유전자 발현이 감소되는 것을 확인한 그래프이다.
도 8a는 본 발명의 일 실시예에 따라 인슐린 단백질을 샤르코-마리-투스 질환 마우스에 투여했을 때 신경조직의 수초형성이 증가되는 것을 확인한 사진이다.
도 8b는 본 발명의 일 실시예에 따라 인슐린 단백질을 샤르코-마리-투스 질환 마우스에 투여했을 때 신경조직의 수초형성이 증가되는 것을 확인한 그래프이다.
도 8c는 본 발명의 일 실시예에 따라 인슐린 단백질을 샤르코-마리-투스 질환 마우스에 농도별로 신경조직의 수초형성의 두께가 증가되는 것을 확인한 그래프이다.
도 8d는 본 발명의 일 실시예에 따라 인슐린 단백질을 샤르코-마리-투스 질환 마우스에 투여했을 때 신경조직의 수초형성이 증가되는 것을 확인한 사진이다.
도 8e는 본 발명의 일 실시예에 따라 인슐린 단백질을 샤르코-마리-투스 질환 마우스에 투여했을 때 신경조직의 수초형성이 증가되는 것을 확인한 그래프이다.
도 8f는 본 발명의 일 실시예에 따라 인슐린 단백질을 샤르코-마리-투스 질환 마우스에 투여했을 때 신경조직의 수초형성이 증가되는 것을 확인한 사진이다.
도 8g는 본 발명의 일 실시예에 따라 인슐린 단백질을 샤르코-마리-투스 질환 마우스에 농도별로 투여했을 때 신경조직의 수초형성이 증가되는 것을 확인한 그래프이다.
도 9a는 본 발명의 일 실시예에 따라 인슐린 단백질을 샤르코-마리-투스 질환 마우스에 투여했을 때 종아리 근육조직 형성이 증가되는 것을 확인한 사진이다.
도 9b는 본 발명의 일 실시예에 따라 인슐린 단백질을 샤르코-마리-투스 질환 마우스에 투여했을 때 종아리 근육조직 형성이 증가되는 것을 확인한 그래프이다.
도 9c는 본 발명의 일 실시예에 따라 인슐린 단백질을 샤르코-마리-투스 질환 마우스에 투여했을 때 종아리 근육조직 형성이 증가되는 것을 확인한 사진이다.
도 9d는 본 발명의 일 실시예에 따라 인슐린 단백질을 샤르코-마리-투스 질환 마우스에 투여했을 때 종아리 근육조직 형성이 증가되는 것을 확인한 그래프이다.
도 9e는 본 발명의 일 실시예에 따라 인슐린 단백질을 샤르코-마리-투스 질환 마우스에 투여했을 때 종아리 근육조직 형성이 증가되는 것을 확인한 그래프이다.
중간엽 줄기세포를 포함하는 샤르코-마리-투스병 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 편도 유래 중간엽 줄기세포의 줄기세포능 분석
편도 유래 중간엽 줄기세포의 줄기세포능을 확인하기 위해 세포표면 마커 분석을 실시하였다.
구체적으로, 편도 유래 중간엽 줄기세포를 37℃, 포화된 습도 및 5% CO2에서 FBS를 함유한 α-MEM에서 배양하여 얻은 세포를 80% 컨플루언스 (confluence)에서 수득하였다. 수득한 세포를 ISCT (International Society for Cellular Therapy)의 요건에 따라 중간엽 줄기세포 특이 세포표면 마커 (CD90, CD105, CD73, CD166 및 CD44)의 발현 양상을 분석하였고, 순도 분석을 위해 중간엽 줄기세포의 negative 마커 (CD34, CD45, CD19, CD11b, CD14 및 HLA-DR)을 발현하는 세포를 유세포분석기로 분석하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에서 확인할 수 있듯이, 편도 유래 중간엽 줄기세포는 95% 이상의 중간엽 줄기세포 특이 세포표면 마커를 발현하였고, 중간엽 줄기세포의 negative 마커는 발현하지 않는 것을 확인할 수 있었으며, 이를 통해 중간엽 줄기세포임을 확인하였다.
실시예 2. 편도 유래 중간엽 줄기세포의 지방세포, 조골세포 또는 연골세포 분화 능력 확인
편도 유래 중간엽 줄기세포를 배양 후 대표적인 중간엽세포인 지방세포 (adipocyte), 조골세포 (osteoblast) 또는 연골세포 (chondrocyte)로 분화시키는 분화배지를 이용하여 각각 분화시켰다.
구체적으로, 편도 유래 중간엽 줄기세포를 37℃, 포화된 습도 및 5% CO2에서 FBS를 함유한 α-MEM에서 배양하여 얻은 세포를 80% 컨플루언스 (confluence)에서 수득하였다. 수득한 세포를 조골세포 (osteoblast), 연골세포 (chondrocyte) 또는 지방세포 (adipocyte)로 분화시키는 분화배지로 10 내지 30일 동안 배양 후 각 세포로 분화 여부를 확인하였다.
지방세포 분화를 위해 StemPro Adipogenesis Differentiation Kit을 사용하였고, 조골세포 분화를 위해 StemPro Osteogenesis Differentiation Kit을 사용하였고, 연골 세포 분화를 위해 DMEM 배지에 BMP-6, TGFβ3, ITS, dexamethasone, ascorbic acid, L-proline, sodium pyruvate를 포함한 배지를 사용하였다.
지방세포는 oil-red O로 염색하였고, 조골 세포는 Alizarin red S로, 연골세포는 Safranin-O로 염색하였고, 그 결과를 도 2a 내지 도 2d에 나타내었다.
또한, 지방세포, 연골세포로 분화시킨 세포들에서 각각의 분화된 세포들에서 관찰될 수 있는 특이 유전자들이 발현되는지를 qRT-PCR 분석을 이용하여 확인하였다. 분화시키지 않는 세포와 분화시킨 세포를 수득하여 펠렛에서 TRIZOL로 전체 RNA를 추출하였다. TRIZOL 1 ml에서 펠렛을 완전히 풀어준 뒤 클로로포름을 0.2 ml 넣어 15초간 흔들어 준 다음, 실온에서 3분간 두었다. 그 다음, 13,000 rpm으로 4℃에서 15분간 원심분리하면, 페놀-클로로포름 하층, 중간층, 무색의 수용액 상층으로 분리가 되는데, 이 중에서 무색의 수용액 상층만 따로 모아서 새로운 튜브로 이동시켰다. 상기 튜브에 0.5ml의 아이소프로필 알코올 (isopropyl alcohol)을 넣은 후 강하게 혼합한 다음 실온에서 5분간 방치한 후, 다시 13,000 rpm으로, 4℃에서, 10분간 원심분리하여 상층액은 버리고 펠렛에 75% 에탄올을 첨가하여 다시 강하게 혼합한 후, 원심분리하였다. 상층액은 버리고 RNA 펠렛은 5~10분간 건조시켜 RNase-free water에 녹였다.
cDNA 합성은 SuperScript IV Reverse Transcriptase Kit(Invitrogen)을 사용하여 전체 RNA 1 ug을 65℃ 5분, 23℃ 10분, 55℃ 10분, 80℃ 10분 반응시켰다.
합성된 cDNA 1 ug을 PPARG (지방세포), RUNX2 (연골세포)의 프라이머로 qRT-PCR 진행하였을 때 각각 분화된 세포에서 분화되지 않은 세포에 비해 60%, 13%정도 분화유전자 발현이 증가된 것을 확인하였다.
편도 유래 중간엽 줄기세포는 중간엽 세포인 지방세포, 조골세포 또는 연골세포로 적합한 분화배지 하에서 분화되는 것을 확인할 수 있었다.
PPARG
Control 1
Aipocyte 64.5
RUNX2
Control 1
Osteocyte 12.9
도 2a 내지 도 2d에서 확인할 수 있듯이, 지방, 조골 및 연골 분화 능력을 확인하였으며, 중간엽 줄기세포임을 확인하였다.
실시예 3. 인슐린 스크리닝 및 인슐린 유잔자 발현량 측정
3-1. 분비 단백질 분석
슈반세포와 편도 유래 중간엽 줄기세포의 공동배양 시 슈반세포의 증식을 촉진하는 분비 물질을 찾기 위하여 항체 어레이를 진행하였다. 구체적으로 단백질 분석을 위해 RayBio Biotin Label-based Human Antibody Array (#AAH-BLG-1-4, RayBiotech, Inc., GA, USA)를 이용하여 실험을 진행하였으며, Axon GenePix 4000B scanner (Molecular Devices, CA, USA)로 슬라이드를 스캔하고 GenePix Pro 6.0 (Molecular Devices, CA, USA)를 이용하여 분석하였다. 그 결과를 도 3a 및 표 3에 나타내었으며, 문헌 검색 등을 통하여 슈반세포의 증식을 유도할 가능성이 있는 물질로 인슐린을 스크리닝 하여, 그 결과를 도 3a 및 표 3에 나타내었다.
Antibody name Genbank Fold change
TMEFF1 / Tomoregulin-1 NM_003692 2.03
Insulin NM_000207 1.82
IL-22 NM_020525 1.26
PF4 NM_002619 1.11
EDA-A2 NM_001399 1.10
CXCR4 (fusin) NM_003467 1.06
sFRP-4 NM_003014 1.05
CCR7 NM_001838 1.05
3-2. 인슐린 유전자 발현량 측정
실시예 2에서 qRT-PCR을 통해 유전자 발현 분석과 동일한 방법으로 인슐린 프라이머를 사용해 공동배양한 중간엽 줄기세포에서 인슐린 발현을 확인하여, 그 결과를 도 3b 및 표 4에 나타내었다.
Human insulin
Tonsil-MSC 1
Tonsil-MSC + S16 2.0
도 3b 및 표 4에서 확인할 수 있듯이, 편도 유래 중간엽 줄기세포와 슈반세포와 공동배양하여 편도 유래 중간엽 줄기세포의 인슐린 유전자 발현의 비교분석 결과, 슈반세포와 공동배양한 편도 유래 중간엽 줄기세포에서 인슐린 유전자 발현이 증가한 것을 확인하였다.
실시예 3. 슈반세포 증식능 증가 확인
배양된 슈반세포에 인슐린을 0, 1, 10, 50, 100, 200, 500 또는 1000 nM을 처리한 후 세포의 증식정도를 CCK-8 (Dojindo) 실험법을 사용하여 분광광도계에서 450nM 흡광도를 측정하였다. 또한 CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (Promega Corporation)을 사용하여 ATP를 측정하였고, 마지막으로 세포의 DNA 합성시에 결합되는 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) 확인하였다. 이 실험법은 Cell Proliferation ELISA, BrdU (colorimetric) (Roche)를 사용하여 분석하였다. BrdU를 세포에 첨가하고 24시간 동안 반응시킨 후 세포를 고정하고 DNA를 변성시킨 다음, Anti-BrdU 항체를 처리하고, HRP가 연결된 2차 항체를 사용하여 TMB 기질과 반응시키고, 분광광도계에서 370 nM 흡광도를 측정하여, 그 결과를 도 4a 내지 4c에 나타내었다.
배양된 슈반세포에 100 nM의 인슐린 단백질을 처리한 후 24시간 후에 세포를 수득한 후 펠렛에 RIPA 버퍼에 넣어 초음파 분쇄기로 세포를 깬 다음, 13,000 rpm으로 4℃에서 15분간 원심분리하여, 상층액만을 위하여 단백질 정량 후 30ug의 단백질을 SDS-PAGE 젤에 로딩하였다. 그 후 PVDF에 로딩된 젤을 트랜스퍼 한 후 5% skim milk로 1시간 동안 블로킹한 다음, P-ERK1/2, ERK1/2, P-AKT, AKT, β-actin 항체를 4℃에서 24시간동안 붙였다. HRP가 부착된 2차 항체 반응과 세척과정을 거친 후 ECL 용약을 이용하여 단백질의 밴드를 확인하여, 그 결과를 도 4d에 나타내었다.
CCK-8 0 nM 1 nM 10 nM 50 nM 100 nM 200 nM 500 nM 1000 nM
1 1.03 1.09 1.16 1.18 1.19 1.21 1.21
ATP 0 nM 1 nM 10 nM 50 nM 100 nM 200 nM 500 nM 1000 nM
1 1.08 1.13 1.20 1.23 1.18 1.22 1.06
BrdU 0 nM 1 nM 10 nM 50 nM 100 nM 200 nM 500 nM 1000 nM
1 1.13 1.32 1.39 1.51 1.50 1.36 1.44
도 4a 내지 도 4c에서 확인할 수 있듯이, 슈반세포에 인슐린 단백질을 농도별로 처리하였을 때 슈반세포의 증식능이 증가하는 것을 확인하였으며, 인슐린 단백질 100 nM을 슈반세포에 처리하였을 때, 슈반세포의 증식능 증가시키는 최적의 농도 임을 확인하였음.
또한, 도 4d에서 확인할 수 있듯이, 인슐린 단백질 100 nM을 슈반세포에 처리하였을 때, ERK, Akt 경로를 통해 슈반세포의 증식능이 활성화되는 것을 확인하였다.
실시예 4. 탯줄 유래 중간엽 줄기세포의 인슐린 발현 확인
실시예 2에서 qRT-PCR을 통해 유전자발현양 분석과 동일한 방법으로 탯줄 유래 중간엽 줄기세포에서 인슐린 프라이머를 사용해 슈반세포와 공동배양한 중간엽 줄기세포에서 인슐린 발현을 측정하여, 그 결과를 도 5 및 표 8에 나타내었다.
Human insulin
WK-MSC 1
WJ-MSC + S16 2.34
도 5 및 표 8에서 확인할 수 있듯이, 편도 유래 중간엽 줄기세포뿐만 아니라 탯줄 (Wharton's Jelly) 유래 중간엽 줄기세포 에서도 슈반세포와 공동배양 하였을 때, 인슐린 발현이 증가되는 것을 확인하였다.
실시예 5. 질환 동물 모델에서 인슐린의 행동 능력 증가 확인
인슐린 12 U/kg의 농도를 5주령 된 샤르코-마리-투스 질환 마우스에 정맥 투여하고 2주 뒤에 실시예 5와 같이 Rotarod 실험을 통한 행동 능력 증가를 확인한 결과를 도 6a 및 표 9에 나타내었다.
Rotarod WT sham insulin
112.3 27.8 67.9
인슐린 12 U/kg의 농도를 5주령 된 샤르코-마리-투스 질환 마우스에 정맥 투여하고 2주 뒤에 실시예 5와 같이 Grip Strength 실험을 통한 행동 능력 증가를 확인한 결과를 도 6b 및 표 10에 나타내었다.
GripStrength WT sham insulin
8.9 6.2 7.7
도 6a, 도 6b 및 표 10에서 확인할 수 있듯이, 질환 마우스에 인슐린을 처리하였을 때 마우스의 행동 능력이 증가하였다.
실시예 6. 질환 동물 모델에서 인슐린의 PMP22 유전자 발현량 감소 확인
인슐린 12 U/kg의 농도를 5주령 된 샤르코-마리-투스 질환 마우스에 정맥 투여하고 2주 뒤에 좌골신경 (sciatic nerve) 조직을 채취한 뒤 실시예 2에서 qRT-PCR을 통해 유전자 발현 분석과 동일한 방법으로 PMP22 프라이머로 마우스 신경조직에서 PMP22 발현을 확인하여, 그 결과를 도 7 및 표 11에 나타내었다.
PMP22 WT sham insulin
1 1305.36 986.69
도 7 및 표 11에서 확인할 수 있듯이, 인슐린을 샤르코-마리-투스 질환 마우스에 투여했을 때, PMP22 발현량이 감소하였다.
실시예 7. 질환 동물 모델에서 인슐린의 신경조직의 수초형성 증가 확인
인슐린 12 U/kg의 농도를 5주령 된 샤르코-마리-투스 질환 마우스에 정맥 투여하고 2주 뒤에 좌골신경 (sciatic nerve) 조직을 채취한 뒤 실시예 7에서 투과전자현미경으로 조직 구조 분석과 동일한 방법으로 관찰한 결과를 도 8a 내지 도 8c 및 표 12, 13에 나타내었다.
Myelination WT sham insulin
100 13.59 82.99
Thickness WT sham insulin
3.32 0.67 2.53
인슐린 12 U/kg의 농도를 5주령 된 샤르코-마리-투스 질환 마우스에 정맥 투여하고 이주 뒤에 좌골신경 (sciatic nerve) 조직을 채취한 뒤 실시예 7에서 공초점 (confocal) 현미경으로 관찰한 결과를 도 8d 및 표 14에 나타내었다.
MPZ WT sham insulin
1 0.20 0.69
인슐린 12 U/kg의 농도를 5주령 된 샤르코-마리-투스 질환 마우스에 정맥 투여하고 한 달 뒤에 좌골신경 (sciatic nerve) 조직을 채취한 뒤 실시예 3에서 웨스턴 블랏 (western blotting)을 이용한 단백질 발현 분석과 동일한 방법으로 MPZ 항체를 이용해 MPZ 발현양을 확인하여, 그 결과를 도 8f, 8g 및 표 15에 나타내었다.
MPZ WT sham insulin
100 3.84 44.12
도 8a 내지 도 8g에서 확인할 수 있듯이, 인슐린을 샤르코-마리-투스 질환 마우스에 투여했을 때, 수초 형성이 증가하였다.
실시예 8. 질환 동물 모델에서 인슐린 근육조직의 근육형성 증가 확인
인슐린 12 U/kg의 농도를 5주령 된 샤르코-마리-투스 질환 마우스에 정맥 투여하고 2주 뒤에 종아리 근육 (gastrocnemius muscle) 조직을 채취한 뒤 실시예 7에서 형광 항체를 이용한 단백질 발현 분석과 동일한 방법으로 Dystrophin 항체를 이용해 근육 형성 증가를 측정하여, 그 결과를 도 9a, 9b 및 표 16에서 나타내었다.
Dystrophin WT sham insulin
1 0.27 0.94
인슐린 12 U/kg의 농도를 5주령 된 샤르코-마리-투스 질환 마우스에 정맥 투여하고 2주 뒤에 MRI 장비로 종아리 근육 (gastrocnemius muscle)조직을 촬영하여 그 결과를 도 9c에 나타내었다. 그리고, 근육 주직의 단면적을 측정하여 도 9d 및 표 17에, 근육 조직의 볼륨을 도 9e 및 표 18에서 나타내었다.
CSA WT Sham insulin
Left Right Left Right Left Right
0.328 0.331 0.302 0.290 0.343 0.323
Volume WT sham insulin
Left Right Left Right Left Right
2.754 2.782 2.533 2.438 2.879 2.712
도 9a 내지 도 9e에서 확인할 수 있듯이, 인슐린을 샤르코-마리-투스 질환 마우스에 투여했을 때, 근육 형성이 증가하였다.
본 발명은 중간엽 줄기세포 또는 중간엽 줄기세포에서 분비된 인슐린을 포함하는 샤르코-마리-투스병 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

Claims (11)

  1. 중간엽 줄기세포를 포함하는 샤르코-마리-투스병 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 인슐린 분비능을 갖는 것인, 샤르코-마리-투스병 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 인슐린을 포함하는 것인, 샤르코-마리-투스병 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 인간 편도 또는 인간 탯줄 유래인 것인, 샤르코-마리-투스병 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  5. 인슐린 또는 이의 유도체를 유효성분으로 포함하는 샤르코-마리-투스병 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 인슐린은 중간엽 줄기세포에서 분비된 인슐린인 것인, 샤르코-마리-투스병 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  7. 제5항에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 인간 편도 또는 인간 탯줄 유래인 것인, 샤르코-마리-투스병 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  8. 중간엽 줄기세포를 포함하는 샤르코-마리-투스병 치료용 줄기세포 치료제.
  9. 제8항에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 인슐린 분비능을 갖는 것인, 샤르코-마리-투스병 치료용 줄기세포 치료제.
  10. 제8항에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 인슐린을 포함하는 것인, 샤르코-마리-투스병 치료용 줄기세포 치료제.
  11. 제8항에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 인간 편도 또는 인간 탯줄 유래인 것인, 샤르코-마리-투스병 치료용 줄기세포 치료제.
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20230110194A (ko) * 2022-01-13 2023-07-21 주식회사 툴젠 슈반 세포 특이적 프로모터

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100298763B1 (ko) * 1992-06-12 2001-10-24 세파론, 인코포레이티드 말초신경병의예방및치료
US20090214487A1 (en) * 2006-01-12 2009-08-27 Timothy Varney Use of mesenchymal stem cells for treating genetic diseases and disorders
KR20160022758A (ko) * 2014-08-19 2016-03-02 이화여자대학교 산학협력단 편도 유래 중간엽 줄기세포로부터 인슐린 분비 세포의 분화 방법
KR20160085571A (ko) * 2015-01-08 2016-07-18 이화여자대학교 산학협력단 편도 유래 중간엽 줄기세포로부터 근육 세포의 분화방법
KR20190112668A (ko) * 2018-03-26 2019-10-07 이화여자대학교 산학협력단 편도 유래 중간엽 줄기세포로부터 운동신경세포의 분화방법
KR20200034461A (ko) 2018-09-21 2020-03-31 주식회사 포스코 롤 측정장치 및 이를 이용한 롤 측정방법

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100298763B1 (ko) * 1992-06-12 2001-10-24 세파론, 인코포레이티드 말초신경병의예방및치료
US20090214487A1 (en) * 2006-01-12 2009-08-27 Timothy Varney Use of mesenchymal stem cells for treating genetic diseases and disorders
KR20160022758A (ko) * 2014-08-19 2016-03-02 이화여자대학교 산학협력단 편도 유래 중간엽 줄기세포로부터 인슐린 분비 세포의 분화 방법
KR20160085571A (ko) * 2015-01-08 2016-07-18 이화여자대학교 산학협력단 편도 유래 중간엽 줄기세포로부터 근육 세포의 분화방법
KR20190112668A (ko) * 2018-03-26 2019-10-07 이화여자대학교 산학협력단 편도 유래 중간엽 줄기세포로부터 운동신경세포의 분화방법
KR20200034461A (ko) 2018-09-21 2020-03-31 주식회사 포스코 롤 측정장치 및 이를 이용한 롤 측정방법

Non-Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Remington: The Science and Practice of Pharmacy", PHARMACEUTICAL PRESS
ENCELLS CO., LTD: "Development of Next-Generation Medicines for Rare Muscular Disease using Enhanced Neo Cell", TECHNOLOGY-BASED STARTUPS AND INVESTMENTS LINKAGE, 1 August 2018 (2018-08-01)
LEAL, A. ; ICHIM, T.E. ; MARLEAU, A.M. ; LARA, F. ; KAUSHAL, S. ; RIORDAN, N.H.: "Immune effects of mesenchymal stem cells: Implications for Charcot-Marie-Tooth disease", CELLULAR IMMUNOLOGY, ACADEMIC PRESS, SAN DIEGO, CA., US, vol. 253, no. 1-2, 1 January 2008 (2008-01-01), US, pages 11 - 15, XP025410601, ISSN: 0008-8749, DOI: 10.1016/j.cellimm.2008.06.003 *
LINDVALL ET AL., ARCH. NEUROL., vol. 46, 1989, pages 615 - 31
PARK S., CHOI Y, JUNG N, KIM J, S JUNG: "Restoration of neuromuscular function in charcot-marie-tooth (CMT)1a disease by human tonsil-derived MSC (T-MSC)", CYTOTHERAPY, vol. 19, no. 5, 1 May 2017 (2017-05-01), XP055851749 *
PARK SAEYOUNG, JUNG NAMHEE, MYUNG SEOHA, CHOI YOONYOUNG, CHUNG KI, CHOI BYUNG-OK, JUNG SUNG-CHUL: "Differentiation of Human Tonsil-Derived Mesenchymal Stem Cells into Schwann-Like Cells Improves Neuromuscular Function in a Mouse Model of Charcot-Marie-Tooth Disease Type 1A", INTERNATIONAL JOURNAL OF MOLECULAR SCIENCES, vol. 19, no. 8, 14 August 2018 (2018-08-14), pages 2393, XP055851751, DOI: 10.3390/ijms19082393 *
SAMSUNG SEOUL HOSPITAL, RESEARCH-DRIVEN HOSPITAL FOSTERING R&D, 1 January 2020 (2020-01-01)
SAMSUNG SEOUL HOSPITAL: "Development of Customized Diagnosis and Treatment Methods for Charcot-Marie-Tooth Disease", 1 January 2014
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