KR20210117771A

KR20210117771A - 중간엽 줄기세포 또는 중간엽 줄기세포에서 분비된 인슐린을 포함하는 샤르코-마리-투스병 예방 또는 치료용 약학적 조성물

Info

Publication number: KR20210117771A
Application number: KR1020200034461A
Authority: KR
Inventors: 장종욱; 전홍배; 박상언; 오신지
Original assignee: 사회복지법인 삼성생명공익재단; 이엔셀 주식회사
Priority date: 2020-03-20
Filing date: 2020-03-20
Publication date: 2021-09-29
Also published as: EP4122476A1; EP4122476A4; KR20220062456A; WO2021187745A1; AU2021239708A1; US20230081894A1

Abstract

본 발명은 중간엽 줄기세포 또는 중간엽 줄기세포에서 분비된 인슐린을 포함하는 샤르코-마리-투스병 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

Description

중간엽 줄기세포 또는 중간엽 줄기세포에서 분비된 인슐린을 포함하는 샤르코-마리-투스병 예방 또는 치료용 약학적 조성물 {Pharmaceutical composition for preventing or treating Charcot-Marie-Tooth disease comprising insulin secreted from mesenchymal stem cells or mesenchymal stem cells}

중간엽 줄기세포 (mesenchymal stem cell)는 스트로마 기원의 세포로 자기 재생 (self-renewal)의 특징을 가지고 있으며 골, 연골, 지방조직, 근육, 건, 인대, 신경조직 등으로 분화할 수 있어 세포 치료요법에 적합한 세포로 주목 받고 있다.

현재 중간엽 줄기세포를 얻을 수 있는 가장 대표적 기원 조직으로 골수 (bone marrow)를 들 수 있다. 그러나, 골수에 존재하는 간엽 줄기세포는 제한적인 분화능과 증식능력으로 인해 그 응용범위가 한정적일 수밖에 없으며, 골수로부터 유래하는 한계로 인해 여러 단계의 시술이 필요하고, 시술 과정이 복잡하여 채취 대상자에게 시간적, 정신적 및 육체적 고통을 수반하는 것이 보통이다. 또한, 골수 이식을 위해서는 조직적합항원 비교를 통해 항원 표현형이 일치하여 이식편대 숙주반응을 보이지 않는 공여자를 찾아야 한다는 문제점이 있다.

탯줄은 골수와는 달리 분만과정에서 간단한 시술을 통해 얻을 수 있으며, 그 양에 비해 수많은 조혈모세포 및 줄기세포를 포함하고 있다. 최근에는, 탯줄, 태반, 제대혈 등에 많은 양의 줄기세포가 있는 것으로 알려지면서 연구가 활발히 이루어지고 있다. 그러나, 아직까지 탯줄로부터 분리·배양한 중간엽 줄기세포 또는 중간엽 줄기세포에서 분비되는 인자가 근육세포 사멸을 억제한다고 보고된 바는 없다.

유전성 말초신경병증 (Inherited peripheral neuropathy; IPN)은 유전적으로 그리고 임상적으로 유전성 운동 및 감각 신경병증 (hereditary motor and sensory neuropathy; HMSN)이라고도 불리는 샤르코-마리-투스병 (Charcot-Marie-Tooth disease; CMT), 압박마비유전신경병 (hereditary neuropathy with liability to pressure palsy; HNPP), 유전운동신경병 (hereditary motor neuropathy; HMN) 및 유전성감각 자율신경병증 (hereditary sensory and autonomic neuropathy; HSAN)을 포함하는 질환이다.

샤르코-마리-투스병은 말초신경의 축삭 변성을 일으키는 다양한 유전자 돌연변이와 관련된 유전성 신경근 질환이다. 주된 임상양상은 상지 및 하지 원위부 중심의 근육 소실과 감각 상실이다. 여러 가지 아형들 사이뿐 아니라 동일한 아형 내에서도 질병의 임상 경과가 다양하게 나타날 수 있음이 보고된 바 있어, 환자에 대한 면밀한 모니터링이 필요하다.

또한, 샤르코-마리-투스병은 2,500명당 1명의 빈도로 IPN 중에서 가장 흔히 발생하는 질환으로서, 병이 진행함에 따라 근육의 위축, 쇠약, 발의 기형, 및 다리의 감각 상실과 같은 임상적 특징을 갖는 대칭성 원위부 다발신경병증이다.

샤르코-마리-투스병의 발병 원인으로 80개 이상의 다양한 원인 유전자가 분리되었으며, 이중 가장 주요한 원인 유전자는 PMP22 (peripheral myelin protein 22), MPZ (myelin protein zero), GJB1 (gap junction protein beta 1) 및 MFN2 (mitofusin 2)으로서 이들 유전자가 CMT 발병의 약 90%를 차지한다. 이러한 유전자들은 상염색체 우성 또는 X염색체 우성 방식으로 유전되어 질병을 유발한다. CMT의 95% 이상은 우성유전이며, 극소수만 상염색체 열성 또는 X염색체 열성 방식으로 유전된다. 또한, 상염색체 우성의 대부분이 PMP22 유전자의 중복에 의해 유발되나, 50% 이상은 40개 이상의 유전자의 점돌연변이 (point mutation)에 의해 유발된다.

임상적으로 유전적 열성질환을 위한 치료법은 유전자 치료, 효소 보충요법, 및 세포 이식 등이 있으나, 이러한 임상적 접근은 돌연변이 단백질의 기능획득 변이 (gain-of-function)에 의해 유발되는 우성질환의 경우에는 제한적이다. 이러한 돌연변이 단백질의 해로운 영향을 막기 위해 다양한 치료법이 제안되고 있으나, 기본적인 치료법은 돌연변이 대립유전자 또는 단백질의 발현억제 또는 제거를 기반으로 해야 한다.

본 발명자들은 중간엽 줄기세포 또는 중간엽 줄기세포에서 분비된 인슐린이 슈반세포의 증식능을 촉진하는 효과가 있음을 확인하였고, 이를 통한 수초형성을 회복시키는 기전으로 샤르코-마리-투스병 치료제를 완성하였다.

이에 본 발명의 목적은 중간엽 줄기세포 또는 중간엽 줄기세포에서 분비된 인슐린를 포함하는 샤르코-마리-투스병 예방 또는 치료용 약학적 조성물 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 인슐린 또는 이의 유도체를 유효성분으로 포함하는 샤르코-마리-투스병 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 중간엽 줄기세포 또는 중간엽 줄기세포에서 분비된 인슐린를 포함하는 샤르코-마리-투스병 치료용 줄기세포 치료제를 제공하는 것이다.

이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.

본 발명의 일 예는 중간엽 줄기세포를 포함하는 샤르코-마리-투스병 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 용어 "중간엽 줄기세포"는 뼈, 연골, 지방, 힘줄, 신경 조직, 섬유아세포 및 근육 세포 등 구체적인 장기의 세포로 분화되기 전의 만능 전구 세포를 말한다.

본 발명에 있어서 중간엽 줄기세포는 인슐린 분비능을 갖는 것일 수 있다.

본 발명에 있어서 중간엽 줄기세포는 인슐린을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명에 있어서 인슐린은 중간엽 줄기세포로부터 분비된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 중간엽 줄기세포는 분화되지 않은 상태로 조성물 중에 함유된 것일 수 있다.

본 발명에 있어서 중간엽 줄기세포는 인간 또는 인간을 제외한 포유동물로부터 유래한 것일 수 있으며, 예를 들어, 인간의 태아로부터 유래된 것일 수 있다.

본 발명에 있어서 인간을 제외한 포유동물은 개, 고양이, 원숭이, 소, 양, 돼지, 말, 랫트, 마우스 또는 기니피그 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 중간엽 줄기세포는 편도, 탯줄, 배낭, 태반, 제대, 제대혈, 피부, 말초혈액, 골수, 지방 조직, 근육, 간, 신경 조직, 골막, 태아막, 활액막, 활액, 양막, 반월상연골, 전십자 인대, 관절 연골세포, 유치, 혈관주위세포, 지주골, 슬개골하 지방괴, 비장 및 흉선 등에서 유래할 수 있으며, 예를 들어, 인간의 편도 또는 인간 탯줄에서 유래한 것일 수 있다.

본 발명에 있어서 중간엽 줄기세포의 분리방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 인간의 편도, 탯줄, 배낭, 태반, 제대, 제대혈, 피부, 말초혈액, 골수, 지방 조직, 근육, 간, 신경 조직, 골막, 태아막, 활액막, 활액, 양막, 반월상연골, 전십자 인대, 관절 연골세포, 유치, 혈관주위세포, 지주골, 슬개골하 지방괴, 비장 및 흉선 등으로부터 분리되고 정제될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 분리된 중간엽 줄기세포는 필요에 따라 배양할 수도 있다.

본 발명에 있어서 중간엽 줄기세포는 세포 단독 혹은 배양기에서 배양된 상태로 환자의 생체 내로 주입될 수 있는데, 예를 들어, 린드발 등 (1989, Arch. Neurol. 46: 615-31) 또는 더글라스 콘치올카 (Douglas Kondziolka, Pittsburgh,1998)가 발표한 임상방법을 이용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

국제 줄기세포 위원회 (International Society for Cellular Therapy, ISCT)에서 정한 중간엽 줄기세포는 배양조건에서 바닥에 부착되어 자라야 하고, 시험관 내에서 조골세포, 지방세포 또는 연골세포로 분화할 수 있어야 하고, 세포 표면 마커로서 CD73, CD90, CD105, CD166 및 CD44을 발현 (Positive marker)해야 하고, CD34, CD45, CD19, CD11b, CD14 및 HLA-DR은 발현하지 않아야 (negative marker) 한다.

상기 제제에는 상기 중간엽 줄기세포 외에 약학적으로 허용 가능한 통상의 담체를 포함할 수 있고, 주사제의 경우 보존제, 무통화제, 가용화제 또는 안정화제, 국소투여용 제제의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제 또는 보존제 등을 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 더 포함할 수 있으며, 상기 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태일 수 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 비경구로 투여할 수 있고, 정맥 내, 피하, 복강 내 투여 또는 국소 적용이 가능하며, 바람직하게는 병변이 발생한 부위에 직접 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물의 비경구 투여용 조성물 (예를 들어, 주사제)은 약학적으로 허용 가능한 담체, 예를 들어, 멸균 정제수, 약 pH 7의 완충액, 또는 생리식염수 중에 분산 및/또는 용해시켜 생체 내에 주입될 수 있으며, 필요할 경우, 보존제, 안정화제 등과 같은 통상의 첨가제를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 약학적 조성물의 제형은 사용방법에 따라 달라질 수 있으나, 경고제 (Plasters), 과립제 (Granule), 산제 (Powders), 시럽제 (Syrups), 액제 (solutions), 유동엑스제 (FluidextractsI), 유제 (Emulsions), 현탁제 (Suspensions), 침제 (Infusions), 정제 (Tablets), 주사제 (Injections), 캅셀제 (Capsules) 및 환제 (Pills)등으로 제조할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 약학적 조성물의 적합한 제형은 선택된 투여 루트에 따라 좌우된다. 공지 기술들, 담체 및 부형제들 중의 어느 것이라도 적합하게, 그리고 당해 분야, 예를 들어, 앞서 설명한 Remingston's Pharmaceutical Sciences에서 이해되는 바와 같이 사용될 수 있다.

본 발명에서 주입되는 중간엽 줄기세포의 양은 10⁴ 내지 10¹⁰ cells/회로 투여될 수 있으며, 바람직하게는 10⁵ 내지 10⁹ cells/회로 투여될 수 있으며, 가장 바람직하게는 5 x 10⁷ cells/회로 투여될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 주입되는 인슐린은 0.0001 ng 내지 500 mg/회로 투여될 수 있으며, 바람직하게는 0.0001 mg 내지 200 mg/회로 투여될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 약학적 조성물의 투여 용량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "예방"은 본 발명의 약학적 조성물의 투여로 샤르코-마리-투스병을 억제시키거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "치료"는 본 발명의 조성물의 투여로 샤르코-마리-투스병이 호전 또는 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 다른 일 예는 인슐린 또는 이의 유도체를 유효성분으로 포함하는 샤르코-마리-투스병 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서 인슐린은 자연적으로 생성되고 중간엽 줄기세포로부터 유래된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 인슐린이 자연적으로 생성된 인슐린인 경우 보통 동물과 연관된 인슐린의 야생형 아미노산 서열을 갖는 인슐린을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 자연적으로 생성된 인슐린은 자연적으로 생성된 인슐린의 변이체를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 인슐린은 샤르코-마리-투스병 예방 또는 치료 효과를 달성하는 생물활성을 가진 한 당 분야의 알려진 방법으로 재조합된 단백질, 이들의 유사체, 유도체, 돌연변이체들을 제한 없이 포함할 수 있다.

본 발명에서 돌연변이는 자연계에서 발견되는 돌연변이 또는 인슐린을 코딩하는 핵산 서열에 하나 이상의 아미노산을 치환, 결실 또는 삽입한 효과를 갖거나 갖지 않는 인공적 돌연변이일 수 있다.

본 발명에 있어서 돌연변이는 인슐린 발현에 영향을 주지 않는 보존적 아미노산 치환을 가질 수 있으며, 자연계의 인슐린의 아미노산 서열과 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서 인슐린은 단편, 결실, 절두 등에 의한 폴리펩티드 변이체로 이루어진 것을 포함하며, 자연계의 인슐린으로부터 아미노산 잔기가 제거된 단편일 수 있다. 이러한 단편, 결실, 절두 등은 생성된 폴리펩티드의 활성에 사실상 부정적 영향을 주지 않는다. 구체적 양태에서, 인슐린의 단백질 도메인의 맵핑에 의해 또는 C-말단, N-말단, 또는 C-말단과 N-말단 단부 둘다로부터의 절두를 통해 인슐린의 활성화 도메인을 도출해 낼 수 있으며, 이러한 절두된 폴리펩티드는 활성에 사실상 부정적 영향을 주지 않거나 활성의 증가를 나타낼 수 있다.

본 발명에 있어서 "재조합"은 세포와 관련하여 사용될 때, 전형적으로 세포가 외래 핵산 서열의 도입에 의해 변형되었거나 세포가 그렇게 변형된 세포로부터 유래됨을 나타낸다. 예를 들어, 재조합 세포는 천연 (native; 비-재조합) 형태의 세포 내에서는 동일한 형태로 발견되지 않는 유전자를 포함할 수 있거나, 또는 재조합 세포는 (천연 형태의 세포에서 발견되는) 천연 유전자를 포함할 수 있지만, 그러나 이러한 유전자는 변형되어 세포 내로 재도입된 것이다. 재조합 세포는 세포로부터의 핵산의 제거 없이, 변형된 세포에 내재하는 핵산을 포함할 수 있으며 그러한 변형은 유전자 치환, 부위-특이적 돌연변이 및 당업자에게 공지된 관련 기술에 의해 얻어지는 것들을 포함한다. 재조합 DNA 기술은, 시험관 내에서 재조합 DNA를 생산하고, 그러한 재조합 DNA를 발현 또는 전파될 수 있는 세포 내로 전달하여 재조합 폴리펩티드를 생산하는 기술을 포함한다. 폴리뉴클레오티드 또는 핵산의 "재조합", "재조합하는", 및 "재조합된"은 일반적으로, 둘 이상의 핵산 또는 폴리뉴클레오티드 가닥들 또는 단편들을 조립 또는 조합하여 새로운 폴리뉴클레오티드 또는 핵산을 생성하는 것을 지칭한다. 재조합 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 때때로 키메라로 지칭된다. 핵산 또는 폴리펩티드는, 인공적이거나 또는 엔지니어링된 경우에, "재조합" 핵산 또는 폴리펩티드이다.

재조합 인슐린은 영장류, 인간, 원숭이, 토끼, 돼지, 설치류, 마우스, 랫트, 햄스터, 게르빌루스쥐, 개, 고양이로부터 유래된 임의의 멤버, 및 그의 생물학적 활성 유도체를 포함하는 것일 수 있으며, 활성을 갖는 돌연변이 및 변이형 인슐린이 인슐린의 기능적 단편 및 융합 단백질과 마찬가지로 포함된다.

본 발명에 있어서 "유도체"란 인슐린의 구조 일부를 다른 원자단, 치환기 등으로 치환하여 얻어지는 것 또는 다른 생물학적 물질과 결합 또는 융합된 하나 이상의 인슐린을 포함하는 것일 수 있으며, 당업계에 공지되어 있는 단백질의 개량 방법에 의해 개량된 단백질을 포함한다.

본 발명에 있어서 다른 생물학적 물질과 결합된 하나 이상의 인슐린은 항체, 항체의 절편, 면역 글로불린, 펩타이드, 효소, 성장인자 (growth factor), 사이토카인 (cytokine), 전사인자, 독소, 항원성 펩티드, 호르몬, 운반 단백질, 운동 기능 단백질, 수용체, 신호 (signaling) 단백질, 저장 단백질, 막 단백질, 막횡단 (transmembrane) 단백질, 내부 (internal) 단백질, 외부 (external) 단백질, 분비 단백질, 바이러스 단백질, 당 단백질, 절단된 단백질, 단백질 복합체, 또는 화학적으로 개질된 단백질 등이 융합된 인슐린 융합 단백질일 수 있다.

본 발명에 있어서 생물학적 물질은 결합된 폴리펩티드를 분리 또는 확인하는 데 유용한 다양한 작은 펩티드, 다른 단백질, 화학적 수단 (예를 들어, tag)을 제한 없이 포함한다.

본 발명에 있어서 생물학적 물질은 인슐린 아미노산 서열의 N 말단 및/또는 C 말단에 융합될 수 있으며, 당 업계에 공지된 방법에 의해서 제조될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 인슐린과 융합될 수 있는 일부 융합 도메인은 친화성 크로마토그래피에 의한 융합 단백질의 단리에 특히 유용하다. 친화도 정제의 목적상, 친화성 크로마토그래피를 위한 적절한 매트릭스, 예를 들어, 글루타티온-, 아밀라제- 및 니켈- 또는 코발트-접합 수지가 사용된다. 다수의 그러한 매트릭스는 파마시아 지에스티 (Pharmacia GST) 정제 시스템 및 (HIS6) 융합 파트너와 유용한 큐엘에이익스프레스 (QLAexpress)TM 시스템 (카이아진, Qiagen)과 같이 "키트" 형태로 이용 가능하다.

또 다른 예로서, 융합 도메인은 인슐린의 검출을 촉진하도록 선택될 수 있다. 그러한 검출 도메인의 예는 특정 항체가 이용 가능한 일반적으로 길이가 짧은 펩티드 서열인 "에피토프 태그"뿐만 아니라 다양한 형광 단백질 (예를 들어, GFP)도 포함한다. 특정 모노클로날 항체가 쉽사리 이용가능한 주지의 에피토프 태그는 FLAG, 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 (HA) 및 c-myc 태그를 포함한다. 일부 경우에 있어서, 융합 도메인은 적절한 프로테아제로 하여금 융합 단백질을 부분적으로 소화하도록 해주고 그리하여 그로부터 재조합 단백질을 유리시키게 해주는 프로테아제 절단 부위, 예를 들어, 인자 Xa 또는 트롬빈에 대한 프로테아제 절단 부위를 갖는다. 이어서 유리된 단백질은 후속 크로마토그래피 분리에 의하여 융합 도메인으로부터 단리시킬 수 있다.

또한, 상기 도메인은 예컨대 폴리아르기닌-태그 (Arg-tag), Strep-태그 (Strep-tag), S-태그 (S-tag), 칼모듈린-결합 펩티드 (calmodulin-binding peptide), 셀룰로오스-결합 도메인 (cellulose-binding domain), SBP-태그 (SBP-tag), 키틴-결합 도메인 (chitin-binding domain), 글루타티온 S-트랜스퍼라제-태그 (glutathione S-transferase-tag), 말토오스-결합 단백질 (maltose-binding protein), NusA, TrxA, DsbA, protein A, protein G, 인간 알부민 (human albumin) 등을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구체예이 있어서, 인슐린은 생체 내에서 인슐린을 안정화시키는 도메인 ("스태빌라이저" 도메인)과 융합될 수 있다.

본 발명에 있어서 "안정화시키는"이란 혈청 반감기 증가가 감소된 파괴, 신장에 의한 감소된 클리어런스 또는 다른 약동학적 효과 때문인지 여부에 관계 없이 혈청 반감기를 증가시키는 무언가를 의미한다.

이뮤노글로불린의 Fc 부분과의 융합은 광범위의 단백질에 바람직한 약동학적 특성을 부여하는 것으로 알려져 있다. 마찬가지로, 인간 혈청 알부민에의 융합은 바람직한 특성을 부여할 수 있다. 선택될 수 있는 융합 도메인의 다른 유형은 다량체화 (예를 들어, 이량체화, 사량체화) 도메인 및 (소망에 따라, 추가의 생물학적 기능을 부여하는) 기능적 도메인을 포함한다. 융합체는 이종 펩티드가 인슐린의 아미노 말단에서 및/또는 인슐린의 카르복시 말단에서 융합되도록 구축될 수 있다.

본 발명의 일 구체적인 양태에 있어서, 인슐린의 아미노산 서열은 그의 단편을 포함하는 재조합 폴리펩티드, 천연 폴리펩티드, 또는 합성 폴리펩티드일 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 다량체이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 이량체이다. 본원에 기재된 결합제의 일부 아미노산 서열은 단백질의 구조 또는 기능에 대해 유의한 영향을 미치지 않으면서 달라질 수 있다는 것이 관련 기술분야에서 인지될 것이다. 따라서, 본 발명은 실질적 활성을 나타내거나, 그의 단편의 영역을 포함하는 인슐린의 변이를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 아미노산 서열 변이는 결실, 삽입, 반전, 반복 및/또는 다른 유형의 치환을 포함한다.

본 발명에 있어서 인슐린은 통상적으로 폴리펩티드의 일부가 아닌 추가의 화학적 모이어티 (moiety)를 함유하도록 변형될 수 있다. 유도체화 모이어티는 폴리펩티드의 용해도, 생물학적 반감기 및/또는 흡수를 개선시키거나 또는 달리 조절할 수 있다. 모이어티는 또한 폴리펩티드 및 변이체의 바람직하지 않은 부작용을 감소시키거나 또는 제거할 수 있다. 화학적 모이어티에 대한 개관은 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22st Edition, 2012, Pharmaceutical Press, London]에서 찾아볼 수 있다.

본 발명의 인슐린은 치료 효과의 증진을 위하여 생물활성 화합물과 추가로 결합되어 존재할 수 있다.

본 발명에 있어서 용어 "생물활성 화합물"은 상기 질병을 갖는 포유류에 적용되었을 때 질병을 변형하는 화합물을 말한다. 생물 활성 화합물은 길항 (antagonistic) 또는 작용물질 (agonistic) 특성들을 포함할 수 있고, 또는 단백질성 생물활성 화합물 또는 비-단백질성 생물활성 화합물일 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 샤르코-마리-투스병 예방 및/또는 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 일예는 중간엽 줄기세포를 포함하는 샤르코-마리-투스병 치료용 줄기세포 치료제에 관한 것이다.

본 발명에 있어서 중간엽 줄기세포는 분화되지 않은 상태로 세포치료제 중에 함유된 것일 수 있다.

본 발명에서 용어 "세포 치료제"는 세포와 조직의 기능을 복원하기 위하여 살아있는 자가 (autologous), 동종 (allogenic), 혹은 이종 (xenogenic)의 세포를 체외에서 증식, 선별하거나 여러 가지 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 일련의 행위를 통하여 치료, 진단, 예방의 목적으로 사용하는 의약품 (KFDA가 고시한 생물학적 제재 등의 품목허가 심사고시(2008-78호) 제2조)를 의미한다.

본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.

본 발명은 중간엽 줄기세포 또는 중간엽 줄기세포에서 분비된 인슐린을 포함하는 샤르코-마리-투스병 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 중간엽 줄기세포 또는 중간엽 줄기세포에서 분비된 인슐린이 슈반세포의 증식능을 촉진하는 효과를 통해 통한 수초형성을 회복시키는 기전으로 샤르코-마리-투스병을 예방 또는 치료할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 편도 (Tonsil)에서 중간엽 줄기세포를 분리하여 줄기세포능 분석 진행 결과를 보여주는 그래프이다.
도 2a는 본 발명의 일 실시예에 따라 지방 분화능력을 확인한 결과 사진이다.
도 2b는 본 발명의 일 실시예에 따라 지방 분화능력을 확인한 결과 그래프이다.
도 2c는 본 발명의 일 실시예에 따라 조골 분화능력을 확인한 결과 사진이다.
도 2d는 본 발명의 일 실시예에 따라 조골 분화능력을 확인한 결과 그래프이다.
도 2e는 본 발명의 일 실시예에 따라 연골 분화능력을 확인한 결과 사진이다.
도 3a는 본 발명의 일 실시예에 따라 편도 유래 중간엽 줄기세포를 슈반세포와 공동배양하여 증가되는 분비 단백질을 분석하여 인슐린을 스크리닝한 결과를 보여주는 사진이다.
도 3b는 본 발명의 일 실시예에 따라 편도 유래 중간엽 줄기세포를 슈반세포와 공동배양하여 중간엽 줄기세포의 인슐린 유전자 발현을 비교한 결과 그래프이다.
도 4a는 본 발명의 일 실시예에 따라 슈반세포에 인슐린 단백질을 농도별로 처리하였을 때 슈반세포의 증식능이 증가하는 것을 확인한 그래프이다.
도 4b는 본 발명의 일 실시예에 따라 슈반세포에 인슐린 단백질을 농도별로 처리하였을 때 슈반세포의 증식능이 증가하는 것을 확인한 그래프이다.
도 4c는 본 발명의 일 실시예에 따라 슈반세포에 인슐린 단백질을 농도별로 처리하였을 때 슈반세포의 증식능이 증가하는 것을 확인한 그래프이다.
도 4d는 본 발명의 일 실시예에 따라 인슐린 단백질 100nM을 슈반세포에 처리하였을 때, ERK, Akt 경로를 통해 슈반세포의 증식능이 활성화 되는 것을 확인한 결과를 보여주는 사진이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예 따라 탯줄 유래 중간엽 줄기세포를 슈반세포와 공동 배양하였을 때 탯줄 유래 중간엽 줄기세포에서 인슐린 발현이 증가되는 것을 확인한 결과 그래프이다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 편도 유래 중간엽 줄기세포의 줄기세포능 분석

편도 유래 중간엽 줄기세포의 줄기세포능을 확인하기 위해 세포표면 마커 분석을 실시하였다.

구체적으로, 편도 유래 중간엽 줄기세포를 37℃, 포화된 습도 및 5% CO₂에서 FBS를 함유한 α-MEM에서 배양하여 얻은 세포를 80% 컨플루언스 (confluence)에서 수득하였다. 수득한 세포를 ISCT (International Society for Cellular Therapy)의 요건에 따라 중간엽 줄기세포 특이 세포표면 마커 (CD90, CD105, CD73, CD166 및 CD44)의 발현 양상을 분석하였고, 순도 분석을 위해 중간엽 줄기세포의 negative 마커 (CD34, CD45, CD19, CD11b, CD14 및 HLA-DR)을 발현하는 세포를 유세포분석기로 분석하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에서 확인할 수 있듯이, 편도 유래 중간엽 줄기세포는 95% 이상의 중간엽 줄기세포 특이 세포표면 마커를 발현하였고, 중간엽 줄기세포의 negative 마커는 발현하지 않는 것을 확인할 수 있었으며, 이를 통해 중간엽 줄기세포임을 확인하였다.

실시예 2. 편도 유래 중간엽 줄기세포의 지방세포, 조골세포 또는 연골세포 분화 능력 확인

편도 유래 중간엽 줄기세포를 배양 후 대표적인 중간엽세포인 지방세포 (adipocyte), 조골세포 (osteoblast) 또는 연골세포 (chondrocyte)로 분화시키는 분화배지를 이용하여 각각 분화시켰다.

구체적으로, 편도 유래 중간엽 줄기세포를 37℃, 포화된 습도 및 5% CO₂에서 FBS를 함유한 α-MEM에서 배양하여 얻은 세포를 80% 컨플루언스 (confluence)에서 수득하였다. 수득한 세포를 조골세포 (osteoblast), 연골세포 (chondrocyte) 또는 지방세포 (adipocyte)로 분화시키는 분화배지로 10 내지 30일 동안 배양 후 각 세포로 분화 여부를 확인하였다.

지방세포 분화를 위해 StemPro Adipogenesis Differentiation Kit을 사용하였고, 조골세포 분화를 위해 StemPro Osteogenesis Differentiation Kit을 사용하였고, 연골 세포 분화를 위해 DMEM 배지에 BMP-6, TGFβ3, ITS, dexamethasone, ascorbic acid, L-proline, sodium pyruvate를 포함한 배지를 사용하였다.

지방세포는 oil-red O로 염색하였고, 조골 세포는 Alizarin red S로, 연골세포는 Safranin-O로 염색하였고, 그 결과를 도 2a 내지 도 2d에 나타내었다.

또한, 지방세포, 연골세포로 분화시킨 세포들에서 각각의 분화된 세포들에서 관찰될 수 있는 특이 유전자들이 발현되는지를 qRT-PCR 분석을 이용하여 확인하였다. 분화시키지 않는 세포와 분화시킨 세포를 수득하여 펠렛에서 TRIZOL로 전체 RNA를 추출하였다. TRIZOL 1 ml에서 펠렛을 완전히 풀어준 뒤 클로로포름을 0.2 ml 넣어 15초간 흔들어 준 다음, 실온에서 3분간 두었다. 그 다음, 13,000 rpm으로 4℃에서 15분간 원심분리하면, 페놀-클로로포름 하층, 중간층, 무색의 수용액 상층으로 분리가 되는데, 이 중에서 무색의 수용액 상층만 따로 모아서 새로운 튜브로 이동시켰다. 상기 튜브에 0.5ml의 아이소프로필 알코올 (isopropyl alcohol)을 넣은 후 강하게 혼합한 다음 실온에서 5분간 방치한 후, 다시 13,000 rpm으로, 4℃에서, 10분간 원심분리하여 상층액은 버리고 펠렛에 75% 에탄올을 첨가하여 다시 강하게 혼합한 후, 원심분리하였다. 상층액은 버리고 RNA 펠렛은 5~10분간 건조시켜 RNase-free water에 녹였다.

cDNA 합성은 SuperScript IV Reverse Transcriptase Kit(Invitrogen)을 사용하여 전체 RNA 1 ug을 65℃ 5분, 23℃ 10분, 55℃ 10분, 80℃ 10분 반응시켰다.

합성된 cDNA 1 ug을 PPARG (지방세포), RUNX2 (연골세포)의 프라이머로 qRT-PCR 진행하였을 때 각각 분화된 세포에서 분화되지 않은 세포에 비해 60%, 13%정도 분화유전자 발현이 증가된 것을 확인하였다.

편도 유래 중간엽 줄기세포는 중간엽 세포인 지방세포, 조골세포 또는 연골세포로 적합한 분화배지 하에서 분화되는 것을 확인할 수 있었다.

PPARG
Control	1
Aipocyte	64.5

RUNX2
Control	1
Osteocyte	12.9

도 2a 내지 도 2d에서 확인할 수 있듯이, 지방, 조골 및 연골 분화 능력을 확인하였으며, 중간엽 줄기세포임을 확인하였다.

실시예 3. 인슐린 스크리닝 및 인슐린 유잔자 발현량 측정

3-1. 분비 단백질 분석

슈반세포와 편도 유래 중간엽 줄기세포의 공동배양 시 슈반세포의 증식을 촉진하는 분비 물질을 찾기 위하여 항체 어레이를 진행하였다. 구체적으로 단백질 분석을 위해 RayBio Biotin Label-based Human Antibody Array (#AAH-BLG-1-4, RayBiotech, Inc., GA, USA)를 이용하여 실험을 진행하였으며, Axon GenePix 4000B scanner (Molecular Devices, CA, USA)로 슬라이드를 스캔하고 GenePix Pro 6.0 (Molecular Devices, CA, USA)를 이용하여 분석하였다. 그 결과를 도 3a 및 표 3에 나타내었으며, 문헌 검색 등을 통하여 슈반세포의 증식을 유도할 가능성이 있는 물질로 인슐린을 스크리닝 하여, 그 결과를 도 3a 및 표 3에 나타내었다.

Antibody name	Genbank	Fold change
TMEFF1 / Tomoregulin-1	NM_003692	2.03
Insulin	NM_000207	1.82
IL-22	NM_020525	1.26
PF4	NM_002619	1.11
EDA-A2	NM_001399	1.10
CXCR4 (fusin)	NM_003467	1.06
sFRP-4	NM_003014	1.05
CCR7	NM_001838	1.05

3-2. 인슐린 유전자 발현량 측정

실시예 2에서 qRT-PCR을 통해 유전자 발현 분석과 동일한 방법으로 인슐린 프라이머를 사용해 공동배양한 중간엽 줄기세포에서 인슐린 발현을 확인하여, 그 결과를 도 3b 및 표 4에 나타내었다.

Human insulin
Tonsil-MSC	1
Tonsil-MSC + S16	2.0

도 3b 및 표 4에서 확인할 수 있듯이, 편도 유래 중간엽 줄기세포와 슈반세포와 공동배양하여 편도 유래 중간엽 줄기세포의 인슐린 유전자 발현의 비교분석 결과, 슈반세포와 공동배양한 편도 유래 중간엽 줄기세포에서 인슐린 유전자 발현이 증가한 것을 확인하였다.

실시예 3. 슈반세포 증식능 증가 확인

배양된 슈반세포에 인슐린을 0, 1, 10, 50, 100, 200, 500 또는 1000 nM을 처리한 후 세포의 증식정도를 CCK-8 (Dojindo) 실험법을 사용하여 분광광도계에서 450nM 흡광도를 측정하였다. 또한 CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (Promega Corporation)을 사용하여 ATP를 측정하였고, 마지막으로 세포의 DNA 합성시에 결합되는 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) 확인하였다. 이 실험법은 Cell Proliferation ELISA, BrdU (colorimetric) (Roche)를 사용하여 분석하였다. BrdU를 세포에 첨가하고 24시간 동안 반응시킨 후 세포를 고정하고 DNA를 변성시킨 다음, Anti-BrdU 항체를 처리하고, HRP가 연결된 2차 항체를 사용하여 TMB 기질과 반응시키고, 분광광도계에서 370 nM 흡광도를 측정하여, 그 결과를 도 4a 내지 4c에 나타내었다.

배양된 슈반세포에 100 nM의 인슐린 단백질을 처리한 후 24시간 후에 세포를 수득한 후 펠렛에 RIPA 버퍼에 넣어 초음파 분쇄기로 세포를 깬 다음, 13,000 rpm으로 4℃에서 15분간 원심분리하여, 상층액만을 위하여 단백질 정량 후 30ug의 단백질을 SDS-PAGE 젤에 로딩하였다. 그 후 PVDF에 로딩된 젤을 트랜스퍼 한 후 5% skim milk로 1시간 동안 블로킹한 다음, P-ERK1/2, ERK1/2, P-AKT, AKT, β-actin 항체를 4℃에서 24시간동안 붙였다. HRP가 부착된 2차 항체 반응과 세척과정을 거친 후 ECL 용약을 이용하여 단백질의 밴드를 확인하여, 그 결과를 도 4d에 나타내었다.

CCK-8	0 nM	1 nM	10 nM	50 nM	100 nM	200 nM	500 nM	1000 nM
CCK-8	1	1.03	1.09	1.16	1.18	1.19	1.21	1.21

ATP	0 nM	1 nM	10 nM	50 nM	100 nM	200 nM	500 nM	1000 nM
ATP	1	1.08	1.13	1.20	1.23	1.18	1.22	1.06

BrdU	0 nM	1 nM	10 nM	50 nM	100 nM	200 nM	500 nM	1000 nM
BrdU	1	1.13	1.32	1.39	1.51	1.50	1.36	1.44

도 4a 내지 도 4c에서 확인할 수 있듯이, 슈반세포에 인슐린 단백질을 농도별로 처리하였을 때 슈반세포의 증식능이 증가하는 것을 확인하였으며, 인슐린 단백질 100 nM을 슈반세포에 처리하였을 때, 슈반세포의 증식능 증가시키는 최적의 농도 임을 확인하였음.

또한, 도 4d에서 확인할 수 있듯이, 인슐린 단백질 100 nM을 슈반세포에 처리하였을 때, ERK, Akt 경로를 통해 슈반세포의 증식능이 활성화되는 것을 확인하였다.

실시예 4. 탯줄 유래 중간엽 줄기세포의 인슐린 발현 확인

실시예 2에서 qRT-PCR을 통해 유전자발현양 분석과 동일한 방법으로 탯줄 유래 중간엽 줄기세포에서 인슐린 프라이머를 사용해 슈반세포와 공동배양한 중간엽 줄기세포에서 인슐린 발현을 측정하여, 그 결과를 도 5 및 표 8에 나타내었다.

Human insulin
WK-MSC	1
WJ-MSC + S16	2.34

도 5 및 표 8에서 확인할 수 있듯이, 편도 유래 중간엽 줄기세포뿐만 아니라 탯줄 (Wharton's Jelly) 유래 중간엽 줄기세포 에서도 슈반세포와 공동배양 하였을 때, 인슐린 발현이 증가되는 것을 확인하였다.

Claims

중간엽 줄기세포를 포함하는 샤르코-마리-투스병 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 인슐린 분비능을 갖는 것인, 샤르코-마리-투스병 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 인슐린을 포함하는 것인, 샤르코-마리-투스병 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 인간 편도 또는 인간 탯줄 유래인 것인, 샤르코-마리-투스병 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
인슐린 또는 이의 유도체를 유효성분으로 포함하는 샤르코-마리-투스병 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제5항에 있어서, 상기 인슐린은 중간엽 줄기세포에서 분비된 인슐린인 것인, 샤르코-마리-투스병 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제5항에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 인간 편도 또는 인간 탯줄 유래인 것인, 샤르코-마리-투스병 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
중간엽 줄기세포를 포함하는 샤르코-마리-투스병 치료용 줄기세포 치료제.
제8항에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 인슐린 분비능을 갖는 것인, 샤르코-마리-투스병 치료용 줄기세포 치료제.
제8항에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 인슐린을 포함하는 것인, 샤르코-마리-투스병 치료용 줄기세포 치료제.
제8항에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 인간 편도 또는 인간 탯줄 유래인 것인, 샤르코-마리-투스병 치료용 줄기세포 치료제.