KR101739305B1 - 릴랙신을 유효성분으로 포함하는 항원 제시 세포의 성숙화 유도용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 릴랙신(Relaxin) 호르몬을 유효성분으로 포함하는 항원 제시 세포의 성숙화 유도용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 릴랙신 호르몬은 미성숙 항원 제시 세포의 분화를 촉진함으로써 항원 제시 세포, 특히 수지상 세포를 효과적으로 성숙시키는 우수한 효과를 가지고 있으며, 릴랙신 호르몬에 의해 성숙된 항원 제시 세포는 암 등 면역 질환 치료에 활용될 수 있다.

Description

릴랙신을 유효성분으로 포함하는 항원 제시 세포의 성숙화 유도용 조성물{Composition for inducing maturation of antigen-presenting cell comprising relaxin}

본 발명은 릴랙신(Relaxin) 호르몬을 유효성분으로 포함하는 항원 제시 세포(antigen-presenting cell)의 성숙화 유도용 조성물에 관한 것이다.

항원 제시 세포(Antigen-presenting cells; APC)는 단백질 항원을 세포 내 이입(endocytosis)한 후, 항원 유래 펩타이드 조각을 MHC Ⅱ형 분자와 함께 T 세포에 제시하여 이를 활성화하는 세포를 의미하는 것으로, 체내에서 세포성 면역을 담당한다.

수지상 세포(Dendritic cells; DCs)는 선천성(innate) 및 적응(adaptive) 면역 시스템의 교량 역할을 하는 가장 강력한 항원 제시 세포이다. 수지상 세포는 주로 피부, 코, 폐, 위 및 장의 내벽과 같이 외부 환경과 접하는 조직에 소량 존재하며 특히 피부에 있는 세포를 랑게르한스 세포라 한다. 수지상 세포는 혈액 중에서 미성숙한 상태로 발견될 수 있으며, 활성화되면 림프기관으로 이동하여 T 세포 및 B 세포와 상호작용하며, 이에 의해 면역반응이 시작된다.

또한, 수지상 세포는 조혈 골수 전구세포(hemopoietic bone marrow progenitor cells)로부터 유래할 수 있는데, 이 전구세포는 처음에는 미성숙 수지상 세포로 분화하며, 높은 엔도시토시스 활성 및 T 세포 활성 능력을 특징으로 한다. 미성숙 수지상 세포는 주변에 있는 바이러스 및 박테리아와 같은 병원체를 끊임없이 탐식한다. 이것은 TLR(toll-like receptor)과 같은 패턴 인식 수용체(pattern recognition receptor, PRR)를 통해서 가능하다. TLR은 병원체의 서브셋 상에서 발견되는 화학적 특징을 인식하며, 미성숙 수지상 세포는 살아있는 자가세포로부터 니블링(nibbling)이라는 과정을 통해 세포막을 탐식한다. 이들이 현존하는 항원과 접하게 되면, 성숙 수지상 세포로 활성화되어 림프절로 이동한다. 미성숙 수지상 세포는 병원체를 탐식하고 자신의 단백질을 작은 조각들로 분해하며, 성숙하였을 때 이 조각들이 MHC(Major Histocompatibility Complex) 분자를 통해 그 세포 표면에 나타나게 된다. 동시에, 상기 조각들은 CD(Cluster of Differentiation)80, CD86, 및 CD40과 같이 T 세포 활성화에서의 공동-수용체로 작용하는 세포 표면 수용체를 증가시킨다. 이들은 비 항원성 특정 공동자극 신호와 함께 병원체에서 유래한 항원을 나타냄으로써 헬퍼 T 세포, 킬러 T 세포뿐만 아니라, B 세포를 활성화시킨다.

성숙 수지상 세포는 신체를 순환하는 백혈구인 단핵구로부터 유래할 수 있는데, 단핵구는 적절한 신호에 따라 수지상 세포 또는 대식세포로 바뀔 수 있다. 단핵구 유래 수지상 세포는 실험실에서 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 생성될 수 있다. 구체적으로, PBMC를 조직 배양 플라스크에 심어서 단핵구가 부착되게 한 후, IL-4 및 GM-CSF (granulocyte-macrophage colony stimulating factor)를 처리함으로써 미성숙 수지상 세포로 분화시킬 수 있다. 이후에 TNF-α를 처리하면 미성숙 수지상 세포가 성숙 수지상 세포로 분화된다.

완전히 성숙한 수지상 세포는 미숙한 수지상 세포와는 정성적 및 정량적으로 상이하다. 완전히 성숙한 수지상 세포는 고 수준의 MHC(Major Histocompatibility Complex) I형 및 II형 항원, 및 고수준의 T 세포 공동자극성 분자, 즉 CD80 및 CD86을 발현시킨다. 이와 같은 변화는 수지상 세포의 T 세포 활성화 능력을 증가시키는데, 이는 이들이 세포 표면상의 항원 밀도를 증가시킬 뿐만 아니라, 예를 들어 CD28과 같은 T 세포 상의 공동자극성 분자의 대응물을 통한 T 세포 활성화를 증가시키기 때문이다. 추가로, 성숙한 수지상 세포는 다량의 사이토카인을 생성하며, 이 사이토카인은 T 세포 반응을 자극하고 유도한다. 이들 사이토카인 중 대표적인 두 가지는 인터루킨 10(IL-10) 및 인터루킨 12(IL-12)이다.

한편, 암환자에서는 수지상 세포의 기능이 저하되어 있어 정상적인 항암 면역능을 유도하는 것이 어렵다. 현재까지 수지상 세포의 분화를 조절(활성화)하는 물질들에 대해 많은 연구가 진행되었으나 생체독성 등의 부작용으로 인해 직접적인 응용에 한계가 있었다. 그러나 상기와 같이 수지상 세포는 신체의 면역 기능을 높이는데 중요한 역할을 하고 있어, 수지상 세포의 분화를 촉진하여 이를 성숙시키고, 상기 강력한 면역 반응을 일으키는 성숙 수지상 세포를 이용하여 세포 면역 치료에 응용하는 것에 대한 연구가 계속되고 있다.

본 발명자들은 상기와 같은 요구를 충족시키기 위하여 연구를 거듭한 결과, 릴랙신 호르몬이 항원 제시 세포, 특히 수지상 세포를 효과적으로 성숙시키는 효과가 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 릴랙신을 유효성분으로 포함하는 항원 제시 세포의 성숙화 유도용 조성물 및 이를 이용한 미성숙 항원 제시 세포의 성숙화 유도 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 릴랙신을 유효성분으로 포함하는 항원 제시 세포의 성숙화 유도용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 미성숙 항원 제시 세포에 릴랙신을 처리하여 성숙 항원 제시 세포로 분화시키는 단계;를 포함하는 미성숙 항원 제시 세포의 성숙화 유도 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 릴랙신 호르몬은 미성숙 항원 제시 세포의 분화를 촉진함으로써 항원 제시 세포, 특히 수지상 세포를 효과적으로 성숙시키는 우수한 효과를 가지고 있으며, 릴랙신 호르몬에 의해 성숙된 항원 제시 세포는 암 등 면역 질환의 치료에 활용될 수 있다.

도 1은 릴랙신-1 호르몬을 처리한 수지상 세포에서 염증성 사이토카인(TNF-α, IL-1β, IL-6)의 분비량을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 릴랙신-1 호르몬을 처리한 수지상 세포에서 표면 인자인 CD80, CD86, MHC Ⅰ형 및 MHC Ⅱ형의 발현량을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3 및 도 4는 수지상 세포에서 릴랙신-1 수용체인 RXFP1의 발현 여부를 확인한 결과를 나타낸 도이다 (도 3: 유세포 분석, 도 4: 형광현미경).

이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.

본 발명은 릴랙신(Relaxin)을 유효성분으로 포함하는 항원 제시 세포의 성숙화 유도용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 '항원 제시 세포(Antigen-presenting cells; APC)'란 단백질 항원을 세포 내 이입(endocytosis)한 후, 항원 유래 펩타이드 조각을 MHC Ⅱ형 분자와 함께 T 세포에 제시하여 이를 활성화하는 세포를 의미한다.

상기 항원 제시 세포는 이에 제한되지 않으나 수지상 세포(dendritic cell), 랑게르한스 세포, 대식세포(macrophage), 단핵세포(mononuclear cell), B 세포 등을 포함하며, 바람직하게는 수지상 세포이다.

본 발명에서 '항원(antigen, antibody-generator)'은 항원 제시 세포에 의해 제시되어 T 세포를 활성화시킬 수 있는 모든 펩타이드 조각을 의미한다.

본 발명에 따른 릴랙신(Relaxin)은 약 6000 Da 크기의 펩타이드 호르몬의 일종이다. 릴랙신은 두 개의 펩타이드 체인이 이황화결합으로 연결된 헤테로다이머의 구조를 가지며, 이의 프로호르몬인 프로릴랙신으로부터 제조된다. 릴랙신-유사 펩타이드 패밀리는 인슐린 슈퍼패밀리에 속하며, 높은 구조적 유사성 및 낮은 서열 유사성을 갖는 7개의 펩타이드(릴랙신-1(RLN1), 릴랙신-2(RLN2), 릴랙신-3(RLN3), 인슐린-유사(insulin-like, INSL) 펩타이드-3, INSL-4, INSL-5 및 INSL-6)로 구성된다. 본 발명에 있어서, 릴랙신은 바람직하게는 릴랙신-1이다.

본 발명의 릴랙신-1은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있으며, 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 암호화될 수 있고, 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. 상기 "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. 또한, 본 발명의 릴랙신-1에는 이의 천연형 아미노산 서열을 갖는 단백질뿐만 아니라 이의 아미노산 서열 변이체가 또한 본 발명의 범위에 포함된다. 상기 릴랙신-1의 변이체란 릴랙신-1 호르몬의 천연 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩타이드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 상기 릴랙신-1 또는 이의 변이체는 천연에서 추출하거나 합성(Merrifleld, J. Amer. chem. Soc. 85:2149-2156, 1963) 또는 DNA 서열을 기본으로 하는 유전자 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다 (Sambrook et al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, USA, 2판, 1989).

본 발명의 릴랙신-1은 서열번호 2의 염기서열로 암호화될 수 있으며, 상기 뉴클레오티드와 기능적으로 동일한 작용을 할 수 있는 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다.

또한, 본 발명은 미성숙 항원 제시 세포에 릴랙신을 처리하여 성숙 항원 제시 세포로 분화시키는 단계;를 포함하는 미성숙 항원 제시 세포의 성숙화 유도 방법을 제공한다.

상기 항원 제시 세포는 이에 제한되지 않으나 수지상 세포(dendritic cell), 랑게르한스 세포, 대식세포(macrophage), 단핵세포(mononuclear cell), B 세포 등을 포함하며, 바람직하게는 수지상 세포이다.

상기 릴랙신은 미성숙 항원 제시 세포에 0.1 ㎍/ml 내지 100 ㎍/ml 농도로 처리될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.

상기 미성숙 항원 제시 세포에 릴랙신을 처리하여 성숙화를 유도하기 위하여 릴랙신이 처리된 항원 제시 세포를 배양할 수 있으며, 상기 방법을 통해 수득된 성숙 항원 제시 세포는 성숙된 항원 제시 세포가 가지는 일반적인 특징을 발현할 수 있다. 예를 들어, 항원 제시 세포 중 수지상 세포의 성숙은 당해 기술분야에 공지된 방법으로 모니터링할 수 있으며 수지상 세포의 표면 마커를 유세포 분석기(flow cytometry), 면역조직화학법 등과 같은 당해 기술분야에 친숙한 검정으로 검출할 수 있다. 또한 상기 수지상 세포 내의 사이토카인 생성 정도 분석(예, ELISA, FACS 및 다른 면역 검정)을 통해 성숙화 정도를 모니터링할 수 있다.

본 발명에 따른 릴랙신 호르몬은 미성숙 항원 제시 세포의 분화를 촉진함으로써 항원 제시 세포, 특히 수지상 세포를 효과적으로 성숙시키는 우수한 효과를 가지고 있으며, 릴랙신 호르몬에 의해 성숙된 항원 제시 세포는 암 등 면역 질환의 치료에 활용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예들은 본 발명을 더욱 쉽게 이해할 수 있도록 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 릴랙신 -1 호르몬의 수득

실험에 이용된 릴랙신-1 호르몬은 마우스 유래 재조합 릴랙신-1으로 R&D systems (Cat# 6637-RN-025.CF)에서 구입하였으며, 이의 아미노산 서열은 서열번호 1과 같다.

실시예 2. 릴랙신 -1 호르몬이 수지상 세포의 성숙화에 미치는 영향 분석

2-1. 마우스 유래 미성숙 수지상 세포의 분리

6~8주령된 C57BL/6 마우스로부터 골수 채취용 주사를 이용해 대퇴부 골수를 채취하였다. 채취한 골수를 세척한 후 염화암모늄을 이용하여 적혈구를 제거하였다. 분리한 세포를 RPMI 1640 (10% FBS(Fetal bovine serum, 송아지 혈청), 2 mM L-글루타민, 50 U/ml 페니실린/스트렙토마이신, 2 mM 비필수 아미노산, 1 mM 피루브산 나트륨, 및 GM-CSF(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor)를 포함)배지에서 37℃, 5% CO₂의 조건에서 배양하였으며, 마우스 유래 미성숙 수지상 세포를 수득하였다. 이때 GM-CSF는 수지상 세포로의 분화를 유도하기 위하여 사용하였다.

2-2. 릴랙신 -1 호르몬이 수지상 세포의 사이토카인 분비에 미치는 영향 분석

수지상 세포의 성숙 여부에 따라 이로부터 분비되는 사이토카인의 종류가 달라진다. 따라서 릴랙신-1 호르몬이 수지상 세포의 사이토카인 분비에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

상기 실시예 2-1에서 수득한 마우스 유래 미성숙 수지상 세포에 상기 실시예 1의 릴랙신-1 호르몬(0.5 μg/ml, 1 μg/ml) 또는 LPS(100 ng/ml)를 처리한 후 16 시간 동안 배양하였다. LPS는 수지상 세포의 성숙을 촉진하는 것으로 잘 알려진 물질로서 대조군으로 이용하였다. 이 후 세포 배양 상층액에서 전-염증성 사이토카인(TNF-α, IL-1β 및 IL-6)의 분비량을 ELISA를 이용하여 측정하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 릴랙신-1 호르몬을 처리한 미성숙 수지상 세포에서 아무것도 처리하지 않은 미성숙 수지상 세포에 비해 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 분비가 증가함을 확인하였다.

2-3. 릴랙신 -1 호르몬이 수지상 세포의 성숙과 관련된 표면 인자 발현에 미치는 영향 분석

릴랙신-1 호르몬이 수지상 세포의 성숙과 관련된 표면 인자 발현에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

상기 실시예 2-1에서 수득한 마우스 유래 미성숙 수지상 세포에 상기 실시예 1의 릴랙신-1 호르몬(0.5 μg/ml, 1 μg/ml) 또는 LPS(100 ng/ml)를 처리한 후 16 시간 동안 배양하였다. 상기 수지상 세포를 PBS로 세척한 후, CD80, CD86, MHC class Ⅰ 및 MHC class Ⅱ로 각각 염색하고, FACSCalibur를 사용하여 유세포 분석(flow cytometry)을 수행하였다. 아무것도 처리하지 않은 군(CON)과 Control IgG로서 PE-결합 항체만을 염색한 군(ISO)을 대조군으로 이용하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 릴랙신-1 호르몬을 처리한 미성숙 수지상 세포에서 아무것도 처리하지 않은 미성숙 수지상 세포(CON)에 비해 성숙한 수지상 세포의 표면 인자인 CD80, CD86, MHC class Ⅰ 및 MHC class Ⅱ의 발현이 증가함을 확인하였다.

이상의 실험 결과를 통하여, 릴랙신-1 호르몬이 수지상 세포의 성숙을 촉진하고 활성화시키는 작용을 함을 확인하였다.

실시예 3. 수지상 세포에서 릴랙신 -1 호르몬 수용체의 발현 여부 분석

상기 실시예 2의 결과를 통해, 수지상 세포에서 릴랙신-1 호르몬 수용체인 RXFP1이 발현되는지를 확인하기 위하여, 항-RXFP1 항체를 이용한 유세포 분석을 수행하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타낸 바와 같이, 수지상 세포에서 릴랙신-1 호르몬 수용체인 RXFP1이 발현됨을 확인하였다.

상기 실험 결과를 재 검증하기 위하여, 수지상 세포의 지표인 CD11c(PE 항-CD11c 항체 이용) 및 RXFP1(Alexa-488 항-RXFP1)에 대한 항체를 이용하여 세포를 표지한 후, 형광현미경으로 관찰하였다. 세포핵은 DAPI를 이용하여 표지하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 수지상 세포에서 릴랙신-1 호르몬 수용체인 RXFP1이 발현됨을 재확인하였다.

이상의 실험 결과를 통하여, 수지상 세포에는 릴랙신-1 호르몬의 수용체인 RXFP1이 존재하며, 상기 수용체와의 결합을 통해 릴랙신-1이 수지상 세포의 성숙을 촉진할 수 있음을 확인하였다.

<110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp <120> Composition for inducing maturation of antigen-presenting cell comprising relaxin <130> 14P <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 185 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Met Ser Ser Arg Phe Leu Leu Gln Leu Leu Gly Phe Trp Leu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Gln Pro Cys Arg Thr Arg Val Ser Glu Glu Trp Met Asp Gly Phe 20 25 30 Ile Arg Met Cys Gly Arg Glu Tyr Ala Arg Glu Leu Ile Lys Ile Cys 35 40 45 Gly Ala Ser Val Gly Arg Leu Ala Leu Ser Gln Glu Glu Pro Ala Leu 50 55 60 Leu Ala Arg Gln Ala Thr Glu Val Val Pro Ser Phe Ile Asn Lys Asp 65 70 75 80 Ala Glu Pro Phe Asp Thr Thr Leu Lys Cys Leu Pro Asn Leu Ser Glu 85 90 95 Glu Leu Lys Ala Val Leu Ser Glu Ala Gln Ala Ser Leu Pro Glu Leu 100 105 110 Gln His Ala Pro Val Leu Ser Asp Ser Val Val Ser Leu Glu Gly Phe 115 120 125 Lys Lys Thr Leu His Asp Lys Leu Gly Glu Ala Glu Asp Gly Ser Pro 130 135 140 Pro Gly Leu Lys Tyr Leu Gln Ser Asp Thr His Ser Arg Lys Lys Arg 145 150 155 160 Glu Ser Gly Gly Leu Met Ser Gln Gln Cys Cys His Val Gly Cys Ser 165 170 175 Arg Arg Ser Ile Ala Lys Leu Tyr Cys 180 185 <210> 2 <211> 697 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 2 ggattgagca ctggggaagc agcaggagcc cagtcccgcc aaggctgagc cgcccagaag 60 cagcccagac cggaatgtcc agcagatttt tgctccagct cctggggttc tggctattgc 120 tgagccagcc ttgcaggacg cgagtctcgg aggagtggat ggacggattc attcggatgt 180 gcggccgtga atatgcccgt gaattgatca aaatctgcgg ggcctccgtg ggaagattgg 240 ctttgagcca ggaggagcca gctctgcttg ccaggcaagc cactgaagtt gtgccatcct 300 tcatcaacaa agatgcagag cctttcgata cgacgctgaa atgccttcca aatttgtctg 360 aagagctcaa ggcagtactg tctgaggctc aggcctcgct cccagagcta caacacgcac 420 ctgtgttgag cgattctgtt gttagcttgg aaggctttaa gaaaactctc catgataaac 480 tgggtgaagc agaagacggc agtcctccag ggcttaaata cttgcaatca gatacccatt 540 cacggaaaaa gagggagtct ggtggattga tgagccagca atgttgccac gtcggttgta 600 gcagaagatc tattgctaaa ctctattgct gatacggagc taattgtgta ccaccagtcc 660 agtgttcaca tgcattcttg ctacctggtt gatggcc 697

Claims (8)

1. 릴랙신(Relaxin)을 유효성분으로 포함하는, 수지상 세포의 성숙화 유도용 배지 조성물.
   
2. 삭제
3. 제1항에 있어서, 상기 릴랙신은 릴랙신-1인 것을 특징으로 하는, 수지상 세포의 성숙화 유도용 배지 조성물.
   
4. 제3항에 있어서, 상기 릴랙신-1은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 수지상 세포의 성숙화 유도용 배지 조성물.
   
5. 제3항에 있어서, 상기 릴랙신-1은 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 암호화되는 것을 특징으로 하는, 수지상 세포의 성숙화 유도용 배지 조성물.
   
6. 생체 외에서 미성숙 수지상 세포에 릴랙신을 처리하여 성숙 수지상 세포로 분화시키는 단계;를 포함하는, 수지상 세포의 성숙화 유도 방법.
   
7. 삭제
8. 제6항에 있어서, 상기 릴랙신은 릴랙신-1인 것을 특징으로 하는, 수지상 세포의 성숙화 유도 방법.

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