JP6890096B2 - サンプルからのシーケンス - Google Patents
サンプルからのシーケンス Download PDFInfo
- Publication number
- JP6890096B2 JP6890096B2 JP2017561666A JP2017561666A JP6890096B2 JP 6890096 B2 JP6890096 B2 JP 6890096B2 JP 2017561666 A JP2017561666 A JP 2017561666A JP 2017561666 A JP2017561666 A JP 2017561666A JP 6890096 B2 JP6890096 B2 JP 6890096B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- stage
- amplification
- sample
- amplicon
- primer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 213
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 212
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 claims description 137
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 130
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 101
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 99
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 88
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 88
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 56
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 34
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 19
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 17
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 15
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 10
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 claims description 8
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 claims description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 6
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 5
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 claims description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 112
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 81
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 37
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 33
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 25
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 25
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 21
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 21
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 20
- 241000894007 species Species 0.000 description 20
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 19
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 18
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 18
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 18
- 239000000463 material Substances 0.000 description 16
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 16
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 14
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 13
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 13
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 13
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 13
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 13
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 12
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 12
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 11
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 11
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000007481 next generation sequencing Methods 0.000 description 10
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 9
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 8
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 8
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 7
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 6
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 6
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 6
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 6
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 6
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 6
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 5
- 241001134658 Streptococcus mitis Species 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 238000003491 array Methods 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 239000010408 film Substances 0.000 description 5
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 5
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 5
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 4
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101000865057 Thermococcus litoralis DNA polymerase Proteins 0.000 description 4
- 108010001244 Tli polymerase Proteins 0.000 description 4
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- -1 processes Substances 0.000 description 4
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 4
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 3
- 108010010677 Phosphodiesterase I Proteins 0.000 description 3
- 241000235645 Pichia kudriavzevii Species 0.000 description 3
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 3
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 3
- 241000222126 [Candida] glabrata Species 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 3
- 208000032343 candida glabrata infection Diseases 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 230000036267 drug metabolism Effects 0.000 description 3
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 3
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 3
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 3
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 3
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 3
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 3
- PJVWKTKQMONHTI-UHFFFAOYSA-N warfarin Chemical compound OC=1C2=CC=CC=C2OC(=O)C=1C(CC(=O)C)C1=CC=CC=C1 PJVWKTKQMONHTI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960005080 warfarin Drugs 0.000 description 3
- 102000002004 Cytochrome P-450 Enzyme System Human genes 0.000 description 2
- 108010015742 Cytochrome P-450 Enzyme System Proteins 0.000 description 2
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 101000740462 Escherichia coli Beta-lactamase TEM Proteins 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- 238000007397 LAMP assay Methods 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 241000588650 Neisseria meningitidis Species 0.000 description 2
- 239000012807 PCR reagent Substances 0.000 description 2
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000002730 additional effect Effects 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 2
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 2
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 2
- 238000011880 melting curve analysis Methods 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 239000002911 sialidase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000010409 thin film Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 5-bromodeoxyuridine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710092462 Alpha-hemolysin Proteins 0.000 description 1
- 101100508411 Caenorhabditis elegans ifb-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100180402 Caenorhabditis elegans jun-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 229930186147 Cephalosporin Natural products 0.000 description 1
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 101100116914 Drosophila melanogaster shv gene Proteins 0.000 description 1
- 108091092584 GDNA Proteins 0.000 description 1
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102000004310 Ion Channels Human genes 0.000 description 1
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 1
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 229940123424 Neuraminidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 1
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000012805 animal sample Substances 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000001174 ascending effect Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 210000000941 bile Anatomy 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 229940124587 cephalosporin Drugs 0.000 description 1
- 150000001780 cephalosporins Chemical class 0.000 description 1
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000007847 digital PCR Methods 0.000 description 1
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J diphosphate(4-) Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 1
- 229940042406 direct acting antivirals neuraminidase inhibitors Drugs 0.000 description 1
- BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L disodium;(2',7'-dibromo-3',6'-dioxido-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-4'-yl)mercury;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Br)=C([O-])C([Hg])=C1OC1=C2C=C(Br)C([O-])=C1 BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 238000012165 high-throughput sequencing Methods 0.000 description 1
- 244000052637 human pathogen Species 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 1
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 210000004915 pus Anatomy 0.000 description 1
- 238000012175 pyrosequencing Methods 0.000 description 1
- 238000011897 real-time detection Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 238000004513 sizing Methods 0.000 description 1
- 239000010421 standard material Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 210000004243 sweat Anatomy 0.000 description 1
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 description 1
- 210000001138 tear Anatomy 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 239000006226 wash reagent Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6846—Common amplification features
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
- C12Q1/6874—Methods for sequencing involving nucleic acid arrays, e.g. sequencing by hybridisation
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Polarising Elements (AREA)
Description
U=ユニバーサルプライマー−特定の反応において全てのプライマーによって共有される共通配列
S=特異的なプライマー−所定の標的アッセイに特有
添字:
o=外側−外側アンプリコンを生成させるための第1段階の増幅で使用するプライマー
i=内側−第2段階のアンプリコン反応で使用するネステッドプライマー。このプライマーは、外側アンプリコンを生成させるのに使用された外側プライマーと部分的に重複することができるが、外側アンプリコンの部分的に又は完全に内部に存在する
ii=内側−内側−入れ子状の内側プライマーの内部で入れ子状になるプライマー。このプライマーは、この内側プライマーと部分的に重複することができるか、又は内側プライマーの完全に内部に位置していてもよい
F=フォワード及びR=リバースは、PCRアンプリコンを規定する2つのプライマーである。配向性は任意であることが理解される
x=マルチプレックスにおける特定の特異的なオリゴヌクレオチドの指数(1≦x≦n)
例えば:URSiR4は、アンプリコン数4のための特異的な内側リバースの5’末端上のユニバーサルリバースプライマーである。
例として、アンプリコンの一部をウェルに係留させることによって、例としては、当該技術分野で公知であるように、第2段階のプライマー又はアンプリコンをウェルの底部に共有結合させて、続いてIon Torrent、454、Illumina又はABI(SoLiD)のNGS技術、又は他の配列決定方法に基づき得る次世代配列決定方法を使用することによって、集団を配列決定することが可能であるはずである。他のシステムとは異なり、この続く配列決定は、第2の段階のウェルの1つ又は複数内で自動的に遂行されてもよい。
[0067] この実施例において、アンプリコンの1つの鎖は、配列決定に先立って、ウェルの底部に係留されている(図2A)。1つの例では、係留されたアンプリコンを供給する方法の1つは、一方が正常な5’OHを有し、且つ他方が、ウェル表面に架橋させることが可能である5’末端に供給される化学部分を有する5’伸長を有する、2つの形態のオリゴヌクレオチドの1つ(例として、フォワードプライマー)を合成することである。この目的で、当該技術分野で公知である様々な化学が存在する。これは、反応ウェルに係留されたフォワードプライマーの幾つか及び溶液中で遊離したフォワードプライマーの幾つかを供給する。溶液中で遊離したフォワードプライマーは、増幅反応の動態を改善するのに供給されることが理解される。第2段階のアレイ581に供給するための1つの例としての方法は、例として、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第2013/158740号及び米国特許第14/395,002号に記載されるデバイスなどを使用して、二度アレイをスポットすることである。例として、第1回のアレイ581をスポットして、化学的に修飾されたプライマー24を、アレイ581のウェル582のそれぞれに付加させる。続いて、化学的に修飾されたプライマー24をウェル582に架橋して、続いてカップリング反応をクエンチして、アレイへの分子のさらなる架橋を防止し得る。アレイ581を乾燥させて、次に、リバースプライマー32、及び任意選択により他のPCR構成成分で再びスポットし得る。任意選択により、未修飾のフォワードプライマー26をスポットして、プライマー濃度の増加を提供して、PCR増幅の動態を改善し得る。しかしながら、アレイ581をスポットするこの方法は、単なる例であり、化学的に修飾されたプライマー24(図2Aに示すような)、未修飾のフォワードプライマー26、及びリバースプライマー32に、一度に、又は任意の順序でスポットしてもよいことが理解される。他の実施形態において、化学的に修飾されたプライマー24は、リバースプライマー32をスポットするのと一緒に、又はそれに先立ってスポットしてもよく、未修飾のフォワードプライマー26を省略し得る。例として、リバースプライマー32は、アレイ581における全てのリバースプライマーに関して同じである5’伸長配列20を有し得る。この「ユニバーサルプライマー」は、後に配列決定反応中に使用されるように供給される。溶液中で遊離した幾つかのフォワードプライマーが供給される例としての実施形態において、PCR反応の大部分が溶液中で行われるが、アンプリコン28の一部は、アレイ581におけるウェル582に係留されている係留されたアンプリコン29の形態で存在する(図2Aを参照)。
本明細書中の実施例の多くは、1つ又は複数のプライマーをアレイ上の試料ウェル又はスポットに係留させることについて記載している。しかしながら、係留が論述される場合、これは、配列決定位置へ移動させることができるビーズを含む任意の固体表面へ係留させることを含み得ることが理解される。
[0069] この実施例において、配列決定チップとしての第2段階のPCRアレイ580の幾何学の例について記載する。図3は、例としてのアレイ581の部分的分解組立図を示す。この例としての実施形態において、ケイ素層589は、アレイ581の底部上に構築されて、例として、米国特許第8,895,295号で論述されるように第2の層587(図示せず)を置き換えて、ウェル582のそれぞれにおいて底部表面を形成する。
1)例として加熱することによって、係留されたアンプリコン29を変性させること、及びアレイから未結合の鎖30を洗浄すること(図2A(ii)及び(iii))。これもまた、未結合のアンプリコン28全てを洗い流すことが理解される。
2)配列決定プライマー32をユニバーサルテイル20へアニーリングさせること、及び開始複合体を形成するためにDNAポリメラーゼ34を供給すること。未結合の配列決定プライマー及び未結合のDNAポリメラーゼを洗い流すこと(図2B(iv)及び図2B(v))。
3)配列決定。DNAポリメラーゼが、結合鎖29に沿って移動して、結合鎖29の配列を増幅する合成によって、配列決定が実施され得る。ヌクレオチドA、T、C及びGはそれぞれ個々に供給され、個々のdNTPの組込みが測定されて、それにより結合鎖29のヌクレオチド配列が明らかとなる。個々のdNTPの組込みは、当該技術分野で公知の方法(例えば、プロトン生成(Ion Torrentと同様)、蛍光又は化学発光(Roche 454と同様)、又は配列決定方法に適切であるような任意の他のシグナル)によって測定することができる。アレイ581を洗浄して、配列が生成されるまで、これを繰り返す(図2B(vi)及び図2B(vii))。
[0080] この実施例では、2工程PCRシステムにおけるヌクレオチド配列決定の例としての実施形態について記載する。ここで図4を参照すると、図4は、図1に類似しており、同様の参照数字は、類似した構成要素を示す。この実施形態において、ウェル582を有するアレイ580が、スポット682(多くの場合、フィーチャと称される)を有するマイクロアレイ680で置き換えられる。スポット682は、それらの上に堆積される少なくとも1つのオリゴヌクレオチドを有するアレイの領域である。スポット682の1個当たりに1つの均質な群のオリゴヌクレオチドでスポットしたことが、本明細書中で例として使用されるのに対して、スポット682のそれぞれが、プライマー対の両方のメンバーを有してもよく、又はその上にスポットされた1組のネステッドオリゴヌクレオチドを有してもよく、また他の形態が可能であることが理解される。したがって、各組が、1つ又は複数のオリゴヌクレオチド種であり、組が、標的に特異的である場合に、スポット682のそれぞれが、その上にスポットされた1組のオリゴヌクレオチドを有することが理解される。
[00105] ここでは、第1段階のPCRアンプリコン内で入れ子状の配列決定多重領域について記載する。幾つかの状況において、例として第1段階のPCR標的内で入れ子状の異なる第2段階のアンプリコンに由来する第1段階のPCRアンプリコンの多くの領域の配列を決定することは有利である。例えば、ESBL表現型を付与するTEMベータラクタマーゼにおける突然変異は、遺伝子にわたって散在し得る。第1段階の増幅反応において遺伝子の大部分を増幅することができ、続いて、第2段階のPCRにおいて、様々なより小さな領域を増幅することができる。
この問題は、2組の反応を用いて、第2段階のPCRを、ともに第2段階の増幅ゾーン680に類似した2つの区画へ分けることによって回避され得る(図7B及び図7C)。この遂行において、第1段階のAで生成されるアンプリコン(図7B(iv))は重複せず、その結果、望ましくない短いアンプリコンは最低限に抑えられるか、又は排除される。介在アンプリコンは、第2段階Bで生成され(図7B(v))、それらは同様に重複せず、その結果、望ましくない短いアンプリコンは同様に最低限に抑えられるか、又は排除される。
この遂行は、内側プライマーが全て、混合物中に存在することを除いて、上記実施例3に類似している(図8A)。これは、アレイ上での増幅を伴う溶液中での増幅が、迅速で且つ効率的であるという利点を有する(図8B)。アレイ681上で合成される単一の分子種の特異性に関する任意選択のフィルターを付加するために、捕捉プライマーは、「内側−内側」であり得る。内側−内側SiiFxは、外側プライマーSoFxに対して内部にある溶液ベースの内側プライマーSiFxに対して内部にある配列にハイブリダイズする(図8A(i)を参照)。数個の塩基(例として、少なくとも4個の塩基)が、SiFx配列に対して(又はその3’に対して)内部にある限りは、内側−内側プライマーSiiFxは、当該方向で内側プライマーSiFx配列と部分的に重複することができる。溶液ベースのPCRは、図8B(iv)に示すように、内側プライマーSiFn及びURSiRnを使用して、また図8B(iii)に示すようにアレイ682上で同時に行われ、図8C(v)に示すように、適切なユニバーサルプライマーを有する係留されたアンプリコンを生じる。この実施形態において、付加された特異性が、2組のネステッドプライマーSiFx及びSiiFxを使用して提供されるため、SoFxを用いた第1段階の増幅は任意選択的であり、増幅は全て、単一の増幅チャンバーにおいて行われ得ることが理解される。配列決定用のアレイ681を調製することは、上記で論述する本方法のいずれかに従うものであり得る。
Claims (47)
- 試料中の核酸の増幅及び配列決定のための方法であって、
(a)第1段階の増幅チャンバー中に試料を配置する工程であって、前記第1段階の増幅チャンバーが、前記試料中に存在し得る複数の個々の核酸を増幅するように構成されている、工程と、
(b)前記第1段階の増幅チャンバーを増幅条件下にする工程と、
(c)前記試料の一部が第2段階の増幅ウェルのそれぞれに移動されるように、前記試料を前記第2段階の増幅ウェルのアレイに移動させる工程であって、前記第2段階の増幅ウェルのそれぞれが前記試料中に存在し得る1つの個々の核酸をさらに増幅するように構成されている、工程と、
(d)前記第2段階の増幅ウェルにおいて第2段階の増幅を実施して、前記個々の核酸が前記試料中に存在する場合に、前記第2段階の増幅ウェルのそれぞれにおいてアンプリコンを生成させる工程と、
(e)前記第2段階の増幅を実施した後にフィルターを使用することなしに、少なくとも1つの前記第2段階の増幅ウェルの内容物を配列決定条件下にする工程と
を含む方法。 - 前記さらなる第2段階の増幅ウェルのそれぞれが、そこに係留されたプライマーを有し、配列決定が、前記第2段階の増幅ウェルで行われる、請求項1に記載の方法。
- 工程(a)から工程(e)が、単一の容器中で実施され、工程(d)及び工程(e)が、前記ウェル中で実施される、請求項1に記載の方法。
- 前記容器が、1つ又は複数の密封可能なポートを備えており、ここで1つ又は複数の密封可能なポートが密封されると前記容器が完全に閉鎖されるように、前記密封可能なポートは、前記容器の外面から前記第1段階の増幅チャンバー及び前記第2段階の増幅ウェルのアレイへの唯一の経路を提供する、請求項3に記載の方法。
- 工程(e)が、別の試料容器中で実施される、請求項1に記載の方法。
- 工程(a)から工程(e)が、約5時間又はそれ未満で実施される、請求項1に記載の方法。
- 全ての第2段階の増幅ウェルが配列決定条件下にされる、請求項1に記載の方法。
- 前記アンプリコンが前記第2段階の増幅ウェルのそれぞれにおいて生成され、前記アンプリコンが生成された前記第2段階の増幅ウェルのそれぞれについて陽性判定が生成したかどうかを検出する工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 工程(e)が、前記陽性判定が存在する第2段階の増幅ウェルに関してのみ実施される、請求項8に記載の方法。
- 前記第1段階の増幅チャンバーが、それぞれが前記試料中に存在し得る複数の前記個々の核酸の1つを増幅するように構成された複数の第1段階のプライマー対を含み、前記第2段階の増幅ウェルのそれぞれが前記試料中に存在し得る複数の個々の核酸の1つを増幅するように構成された第2段階のプライマー対を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記第2段階のプライマー対のそれぞれの少なくとも1つが、その対応する第1段階のプライマー内で入れ子状である、請求項10に記載の方法。
- 試料中の核酸の増幅及び配列決定のための方法であって、
(a)増幅チャンバー中に試料を配置する工程であって、前記増幅チャンバーが、前記試料中に存在し得る複数の個々の核酸を増幅するように構成されている、工程と、
(b)前記増幅チャンバーを増幅条件下にする工程と、
(c)前記試料をスポットのアレイに移動させる工程であって、それぞれのスポットが、それらに係留された第2段階の増幅プライマーの組を含み、前記第2段階の増幅プライマーの組のそれぞれが、前記個々の核酸の1つのさらなる増幅のために構成されている、工程と、
(d)前記アレイで第2段階の増幅を実施して、その個々の核酸が前記試料中に存在する場合に、前記スポットそれぞれでアンプリコンを生成させる工程と、
(e)前記第2段階の増幅を実施した後にフィルターを使用することなしに、前記スポットの少なくとも1つを配列決定条件下にする工程と
を含む方法。 - 工程(a)から工程(e)が、単一の容器中で実施される、請求項12に記載の方法。
- 前記容器が、1つ又は複数の密封可能なポートを備えており、前記1つ又は複数の密封可能なポートが密封されると前記容器が完全に閉鎖されるように、前記密封可能なポートは、前記容器の外面から前記増幅チャンバー及び前記第2段階の増幅ウェルのアレイへの唯一の経路を提供する、請求項13に記載の方法。
- 前記アレイが、入口チャネル及び出口チャネルを有し、前記入口チャネル及び前記出口チャネルの開放及び閉鎖が、前記アレイを通る流体の流量を制御する、請求項14に記載の方法。
- 流体を前記入口チャネルに進入させながら前記出口チャネルを閉鎖することにより、前記アレイ上に流体の泡を生じさせ、前記泡を攪拌することにより前記流体を均質化させる、請求項15に記載の方法。
- 前記アンプリコンがスポットのそれぞれで生成され、前記アンプリコンが生成されたウェルのそれぞれについて陽性判定を生成させたかどうかを検出する工程をさらに含む、請求項12に記載の方法。
- 前記スポットの数が、合計で512個以下である、請求項12に記載の方法。
- 前記スポットの数が、合計で256個以下である、請求項12に記載の方法。
- 前記組が、前記第2段階のプライマー対の両方を含む、請求項12に記載の方法。
- 工程(d)が、3’から5’へのエキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼの存在下で実施される、請求項12に記載の方法。
- 前記組が、前記第2段階のプライマー対の一方を含む、請求項12に記載の方法。
- 工程(d)が、前記第2段階のプライマー対の他方を含む溶液の存在下で実施される、請求項22に記載の方法。
- 前記試料が、工程(b)に続いて、3’から5’へのエキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼで処理される、請求項12に記載の方法。
- 前記第2段階のプライマー対の他方の全てが、ユニバーサルプライマーに相当する5’配列を備える、請求項23に記載の方法。
- 前記溶液が、前記ユニバーサルプライマーをさらに含む、請求項25に記載の方法。
- 前記第2段階のプライマー対の他方の全てが、前記ユニバーサルプライマーの約10分の1以下の濃度で供給される、請求項26に記載の方法。
- 前記試料が、工程(b)と工程(d)との間で希釈されない、請求項12に記載の方法。
- 前記第2段階のプライマー対の少なくとも1つが、ユニバーサルプライマーに相当するさらなる配列を有し、工程(e)が、前記ユニバーサルプライマーを使用した合成によって実施される、請求項12に記載の方法。
- 複数の核酸の増幅及び配列決定のための容器であって、
複数の第1段階のプライマー対を含む第1段階の増幅チャンバーであって、それぞれの第1段階のプライマー対が、第1段階のアンプリコンを生成させるための複数の核酸の1つの増幅用に構成されている、増幅チャンバーと、
複数の第2段階のプライマー対を含む第2段階の増幅チャンバーであって、それぞれの第2段階のプライマー対が、第2段階のアンプリコンを生成させるための前記第1段階のアンプリコンの1つの配列の少なくとも一部の増幅用に構成されている、増幅チャンバーと
を含み、
前記第2段階の増幅の後にフィルターを使用することなしに、前記第2段階の増幅チャンバーが、前記第2段階のアンプリコンを配列決定するようにさらに構成されている、容器。 - 前記第2段階のプライマー対のそれぞれの少なくとも1つのメンバーが、相当する第1段階のプライマー内で入れ子状である、請求項30に記載の容器。
- 前記第2段階のプライマー対それぞれの少なくとも1つのメンバーが、支持体に係留されている、請求項30に記載の容器。
- 前記第2段階のプライマー対それぞれの少なくとも1つのメンバーが、5’末端によって前記支持体に係留されている、請求項32に記載の容器。
- 前記第2段階のアンプリコンが、単一の分子種を含む、請求項30に記載の容器。
- 1つ又は複数の密封可能なポートをさらに備えており、前記1つ又は複数の密封可能なポートが密封されると前記容器が完全に閉鎖されるように、前記1つ又は複数の密封可能なポートは、前記容器の外面から前記増幅チャンバー及び前記第2段階の増幅チャンバーへの唯一の経路を提供する、請求項30に記載の容器。
- 前記第2段階の増幅チャンバーが、入口チャネル及び出口チャネルを含み、前記入口チャネル及び前記出口チャネルの開放及び閉鎖が、前記第2段階の増幅チャンバーを通る流体の流量を制御する、請求項30に記載の容器。
- 試料を受け取り、溶解した試料を調製するように構成されている溶解チャンバーをさらに含む、請求項30に記載の容器。
- 前記溶解した試料を受け取り、前記溶解した試料から核酸を抽出するように構成されている核酸抽出チャンバーをさらに含む、請求項37に記載の容器。
- 前記第2段階の増幅チャンバーが、それぞれが第2段階の増幅反応を実行するように構成されているウェルのアレイを含む、請求項30に記載の容器。
- 前記第2段階の増幅チャンバーが、それぞれが第2段階のプライマー対を含み、それぞれが第2段階の増幅反応を実行するように構成されているスポットのアレイを含む、請求項30に記載の容器。
- 前記第2段階のプライマーの少なくとも1つが、前記スポットに係留されている、請求項40に記載の容器。
- 前記スポットの数が、合計で512個以下である、請求項40に記載の容器。
- 前記スポットの数が、合計で256個以下である、請求項40に記載の容器。
- 試料中に存在し得る複数の核酸の2ステップ増幅及び配列決定のための方法であって、(a)それぞれが複数の核酸の1つの増幅用に構成される複数の第1段階のプライマー対を含む第1の混合物において核酸を増幅して、前記試料中に存在する前記核酸それぞれについて第1段階のアンプリコンを生成させる工程と、
(b)それぞれが前記第1段階のアンプリコンの1つの増幅用に構成される複数の第2段階のプライマー対を使用して、前記第1段階のアンプリコンを増幅する工程であって、第2段階のプライマー対それぞれの少なくとも1つが、その対応する第1段階のプライマー対内で入れ子状であり、前記試料中に存在する前記核酸のそれぞれについて単一の分子種を生成させる、工程と、
(c)工程(b)で生成される前記単一の分子種を配列決定する工程と
を含み、
正確なアンプリコンを同定するために、前記工程(b)と工程(c)の間にフィルターを使用しない、
方法。 - 工程(b)及び工程(c)が、単一の反応チャンバー中で実施される、請求項44に記載の方法。
- 前記第2段階のプライマー対のそれぞれの少なくとも1つが、固体支持体に係留されている、請求項44に記載の方法。
- 工程(b)及び工程(c)が、異なる反応容器中で実施される、請求項44に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201562169731P | 2015-06-02 | 2015-06-02 | |
US62/169,731 | 2015-06-02 | ||
PCT/US2016/035567 WO2016196827A1 (en) | 2015-06-02 | 2016-06-02 | Sample to sequence |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2018519808A JP2018519808A (ja) | 2018-07-26 |
JP6890096B2 true JP6890096B2 (ja) | 2021-06-18 |
Family
ID=57441746
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2017561666A Active JP6890096B2 (ja) | 2015-06-02 | 2016-06-02 | サンプルからのシーケンス |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US10718013B2 (ja) |
EP (2) | EP3303637B1 (ja) |
JP (1) | JP6890096B2 (ja) |
CN (1) | CN107614704B (ja) |
CA (2) | CA2987633A1 (ja) |
ES (1) | ES2867949T3 (ja) |
WO (1) | WO2016196827A1 (ja) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2018125835A1 (en) * | 2016-12-29 | 2018-07-05 | Biofire Defense, Llc | Fast pcr with molecular crowding |
US11691152B2 (en) | 2017-08-31 | 2023-07-04 | Biofire Defense, Llc | Assay devices and methods of use thereof |
CN114134215A (zh) * | 2021-10-29 | 2022-03-04 | 江苏鹍远生物技术有限公司 | 一种多通道核酸二次扩增试剂盒及其检测方法 |
Family Cites Families (22)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7387887B2 (en) | 2004-04-20 | 2008-06-17 | University Of Utah Research Foundation | Nucleic acid melting analysis with saturation dyes |
US8354225B1 (en) | 2004-08-28 | 2013-01-15 | Steven Albert Benner | Amplification of oligonucleotides containing non-standard nucleobases |
EP1805318B1 (en) * | 2004-10-27 | 2014-09-03 | Cepheid | Closed-system multi-stage nucleic acid amplification reactions |
US8871469B1 (en) | 2004-11-13 | 2014-10-28 | Steven Albert Benner | Self-avoiding molecular recognition systems in DNA priming |
US7544794B1 (en) | 2005-03-11 | 2009-06-09 | Steven Albert Benner | Method for sequencing DNA and RNA by synthesis |
EP1920070B1 (en) | 2005-05-09 | 2019-08-07 | BioFire Diagnostics, LLC | Self-contained biological analysis |
WO2007011867A2 (en) | 2005-07-15 | 2007-01-25 | Applera Corporation | Fluid processing device and method |
PL1937834T3 (pl) | 2005-09-01 | 2014-11-28 | Mtpcr Pty Ltd | Sposoby wzmacniania, kwantyfikacji i identyfikacji kwasów nukleinowych |
AU2005205791B1 (en) * | 2005-09-01 | 2006-03-02 | Mtpcr Pty Ltd | Methods for the amplification and quantitation of nucleic acids |
US8895295B2 (en) | 2006-11-15 | 2014-11-25 | Biofire Diagnostics, Llc | High density self-contained biological analysis |
EP2145018A4 (en) * | 2007-04-02 | 2010-08-25 | Univ Utah Res Found | ORGANIZATION IDENTIFICATION PANEL |
WO2008157515A1 (en) * | 2007-06-16 | 2008-12-24 | Sacrab Genomics | Nucleic acid packaging system |
US9200329B2 (en) | 2008-05-19 | 2015-12-01 | Biofire Diagnostics, Llc | Rapid epidemiologic typing of bacteria |
JP2009284834A (ja) * | 2008-05-29 | 2009-12-10 | Hitachi Ltd | 大規模並列核酸分析方法 |
IN2012DN03430A (ja) * | 2009-09-21 | 2015-10-23 | Akonni Biosystems | |
EP2545365B1 (en) * | 2010-03-09 | 2020-04-29 | ANDE Corporation | Unitary biochip providing sample-in to results-out processing and methods of manufacture |
AU2011305445B2 (en) * | 2010-09-24 | 2017-03-16 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Direct capture, amplification and sequencing of target DNA using immobilized primers |
US8946397B1 (en) | 2011-04-04 | 2015-02-03 | Steven A. Benner | Tagged nucleosides that leave no scar upon cleavage |
EP3381562B1 (en) * | 2012-04-18 | 2022-07-06 | BioFire Diagnostics, LLC | Microspotting device |
PL3539666T3 (pl) | 2012-05-24 | 2022-01-31 | University Of Utah Research Foundation | Urządzenie do ekstremalnej pcr |
GB201212775D0 (en) * | 2012-07-18 | 2012-08-29 | Dna Electronics Ltd | Sensing apparatus and method |
JP6339787B2 (ja) * | 2013-10-09 | 2018-06-06 | 株式会社日立ハイテクノロジーズ | 核酸の分析方法 |
-
2016
- 2016-06-02 JP JP2017561666A patent/JP6890096B2/ja active Active
- 2016-06-02 CN CN201680032386.1A patent/CN107614704B/zh active Active
- 2016-06-02 EP EP16804463.4A patent/EP3303637B1/en active Active
- 2016-06-02 US US15/574,263 patent/US10718013B2/en active Active
- 2016-06-02 EP EP21160658.7A patent/EP3859013A1/en active Pending
- 2016-06-02 CA CA2987633A patent/CA2987633A1/en active Pending
- 2016-06-02 ES ES16804463T patent/ES2867949T3/es active Active
- 2016-06-02 WO PCT/US2016/035567 patent/WO2016196827A1/en active Application Filing
- 2016-06-02 CA CA3222708A patent/CA3222708A1/en active Pending
-
2020
- 2020-06-19 US US16/906,870 patent/US20200318160A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN107614704A (zh) | 2018-01-19 |
WO2016196827A1 (en) | 2016-12-08 |
ES2867949T3 (es) | 2021-10-21 |
EP3303637A1 (en) | 2018-04-11 |
US20180135101A1 (en) | 2018-05-17 |
EP3859013A1 (en) | 2021-08-04 |
US10718013B2 (en) | 2020-07-21 |
EP3303637B1 (en) | 2021-04-07 |
CN107614704B (zh) | 2021-08-10 |
JP2018519808A (ja) | 2018-07-26 |
EP3303637A4 (en) | 2019-02-13 |
CA2987633A1 (en) | 2016-12-08 |
US20200318160A1 (en) | 2020-10-08 |
CA3222708A1 (en) | 2016-12-08 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
AU2018259202B2 (en) | Compositions and methods for improving sample identification in indexed nucleic acid libraries | |
US20220033891A1 (en) | Amplification with primers of limited nucleotide composition | |
KR102628035B1 (ko) | 메틸화 서열결정을 위한 단일 세포 전체 게놈 라이브러리 | |
EP3601593B1 (en) | Universal hairpin primers | |
GB2533882A (en) | Compositions and methods for targeted nucleic acid sequence enrichment and high efficiency library generation | |
US20200318160A1 (en) | Sample to Sequence | |
JP2007530026A (ja) | 核酸配列決定 | |
KR102383799B1 (ko) | 서열-기반의 유전 검사용 대조군을 제조하기 위한 조성물 및 방법 | |
CA3176980A1 (en) | Quantitative blocker displacement amplification (qbda) sequencing for calibration-free and multiplexed variant allele frequency quantitation | |
CN104955962B (zh) | 核酸扩增方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20190322 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20200116 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20200122 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200417 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20200917 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20201216 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20210514 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20210524 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6890096 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |